Artykuł metodologiczny

Wykrywanie wewnątrzkomórkowej ekspresji genów w żywych komórkach pochodzenia mysiego, ludzkiego i świńskiego za pomocą nanocząstek znakowanych fluorescencyjnie

13.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53268

⸱

13 listopada 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiovascular Surgery, German Heart Center Munich, Technische Universität München, 2Institute for Medical Microbiology, Immunology, and Hygiene, Technische Universität München, 3Clinical Cooperation Groups: "Antigen-specific Immunotherapy" and "Immune Monitoring", Helmholtz Center Munich (Neuhererg), Technische Universität München, 4DZHK (German Center for Cardiovascular Research) – Partner site Munich Heart Alliance

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten manuskrypt opisuje nowatorską technikę, która pozwala na wykrywanie wewnątrzkomórkowej ekspresji genów po endocytozie nanocząstek znakowanych fluorescencyjnie bezpośrednio w żywych komórkach. Metoda nie wymaga manipulacji komórkami i nie jest ograniczona w odniesieniu do docelowego genu lub gatunku.

Streszczenie

Przeprogramowanie komórek somatycznych na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS) zostało pomyślnie przeprowadzone u różnych gatunków ssaków, w tym myszy, szczurów, ludzi, świń i innych. Weryfikacja klonów iPS opiera się głównie na wykryciu endogennej ekspresji różnych genów pluripotencji. Geny te reprezentują głównie czynniki transkrypcyjne, które znajdują się w jądrze komórkowym. Tradycyjnie, dowodem ich endogennej ekspresji jest barwienie immunohistochemiczne po utrwaleniu komórek. Podejście to wymaga replikacji kultur każdego klonu na tym wczesnym etapie, aby zachować zwalidowane klony do dalszych eksperymentów. Niniejszy protokół opisuje podejście z nanocząstkami specyficznymi dla genu, które umożliwia ocenę wewnątrzkomórkowej ekspresji genów bezpośrednio w żywych komórkach za pomocą fluorescencji. Nanocząstki składają się z centralnej cząstki złota sprzężonej z nicią wychwytującą zawierającą sekwencję komplementarną do docelowego mRNA, a także wygaszoną nicią reporterową. Te nanocząstki są aktywnie endocytozowane, a docelowe mRNA wypiera nić reporterową, która następnie zaczyna fluoryzować. W związku z tym specyficzną ekspresję genów docelowych można wykryć bezpośrednio pod mikroskopem. Ponadto emitowana fluorescencja pozwala na identyfikację, izolację i wzbogacenie komórek wyrażających określony gen za pomocą cytometrii przepływowej. Metodę tę można stosować bezpośrednio do żywych komórek w hodowli bez jakiejkolwiek manipulacji komórkami docelowymi.

Wprowadzenie

W 2006 roku opisano nowatorskie podejście do przeprogramowania komórek somatycznych do stanu pluripotencjalnego. Po wstępnym przeprowadzeniu badań przesiewowych szeregu potencjalnych czynników przeprogramowujących, mysie fibroblasty mogą zostać z powodzeniem przekształcone w tak zwane indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS) poprzez transdukcję retrowirusową i nadekspresję czterech czynników transkrypcyjnych (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc) 1. Następnie technika ta została skutecznie odtworzona przy użyciu komórek somatycznych różnych gatunków ssaków, w tym ludzi 2, małp 3, szczurów 4, psów 5, owiec 6 i świń 7. Ponadto opublikowano zmodyfikowane protokoły pomijające lub zastępujące potencjalnie onkogenny czynnik transkrypcyjny c-MYC 8, 9.

Niezależnie od początkowego podejścia do przeprogramowania, prawdziwa pluripotencja rosnących kolonii musi zostać potwierdzona, co jest pracochłonnym i czasochłonnym zadaniem. Główną wadą większości tych analiz jest to, że nie można ich przeprowadzić na żywych komórkach. Ustalone czynniki pluripotencji, takie jak OCT4, SOX2, NANOG lub REX1, reprezentują czynniki transkrypcyjne zlokalizowane w jądrze, a ich wykrycie wymaga utrwalenia komórek przed immunohistochemią lub lizą komórek do analizy RT-PCR 10 - 12. Następnie komórki te są tracone do przyszłych eksperymentów wymagających replikacji kultur każdej kolonii.

Dlatego bardzo pożądana jest technologia do analizy pluripotencji na żywych komórkach. Kilka podejść można rzeczywiście przeprowadzić bezpośrednio na żywych komórkach przy użyciu przeciwciał skierowanych przeciwko antygenom błonowym (np. TRA-1-60, SSEA4) 12, fluorescencyjne zgłosiły barwniki do wykrywania fosfatazy alkalicznej 13 lub małych cząsteczek, które specyficznie znakują embrionalne komórki macierzyste (ES) i iPS 14. Jednak przeciwciała mogą mimo to niekorzystnie wpływać na komórki, a każda metoda jest ograniczona do jednego markera pluripotencji. Na koniec opisano fluorescencyjne latarnie molekularne, oligonukleotydy o podwójnej antysensowności o strukturze spinki do włosów, które umożliwiają barwienie komórek na żywo 15. Chociaż podejście to można zastosować do wielu genów, technika ta wymaga nukleokcji zawiesiny pojedynczej komórki, która nie ma zastosowania do rosnących kolonii iPS.

Kilka lat temu opisano nanocząstki specyficzne dla genu do analizy ekspresji surwiwiny w ludzkich komórkach raka piersi SKBR3 16. Niniejszy artykuł opisuje nowatorskie, innowacyjne podejście do wykrywania markerów pluripotencji w żywych komórkach ES i iPS poprzez zastosowanie koniugatów nanocząstek złota. Te nanocząstki składają się z centralnej cząstki złota ze sprzężoną nicią wychwytującą przenoszącą komplementarną sekwencję RNA i nicią reporterową znakowaną Cy3. Sygnał fluorescencyjny nici reporterowej jest tłumiony przez centralną cząstkę złota. Ponadto odpowiednie nanocząstki służą odpowiednio jako kontrola negatywna i pozytywna (ryc. 1). W celu zastosowania nanocząstki są po prostu dodawane do pożywki hodowlanej (ryc. 2) i wnikają do komórek przez endocytozę (ryc. 3). Jeśli docelowy RNA ulega ekspresji, przemieszcza nić reporterową, która następnie emituje sygnał fluorescencyjny. Metoda ta nie wymaga manipulacji komórką docelową, a ekspresja genu docelowego może być optycznie monitorowana pod mikroskopem fluorescencyjnym bezpośrednio w żywych komórkach. Co więcej, technologia ta może być zastosowana do dowolnego pożądanego genu docelowego u różnych gatunków w przypadku komórek iPS, a tym samym może być stosowana w wielu różnych obszarach badawczych. Wreszcie, analizy cytometrii przepływowej pozwalają na identyfikację i wzbogacenie komórek Cy3-dodatnich.

Protokół

1. Przygotowanie pożywki, odczynników i warunków hodowli komórkowej

  1. Ludzkie embrionalne komórki nerkowe HEK 293
    1. Hodowla komórek HEK 293 (CRL-1573, ATCC) w pożywce F-12 DMEM/Ham uzupełnionej 5% FCS, L-glutaminą (2 mM) i penicyliną (100 U/ml)/ streptomycyną (100 μg/ml).
    2. Aby przejść przez komórki, przemyj komórki raz PBS, dodaj 0,05% trypsyny/EDTA i inkubuj przez 3 minuty w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Przenieść komórki do probówki o pojemności 15 ml, wirować przez 5 minut przy 1 200 obr./min (300 x g) i przenieść około 5x105 komórek do świeżej kolby hodowlanej T25.
  2. Mysie fibroblasty embrionalne (MEF)
    1. Dodać 1 ml 0,1% roztworu żelatyny do poszczególnych 6-dołków i inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 1 godzinę. Odessać płyn i przechowywać w temperaturze pokojowej do czasu użycia.
    2. Hodowle MEF w DMEM uzupełnione 10% FCS, L-glutaminą (2 mM), L-glukozą (4,5 g / l), pirogronianem sodu (1 mM) i penicyliną (100 U/ml) / streptomycyną (100 μg / ml) na 6-dołkowych płytkach pokrytych żelatyną.
    3. Rozłóż MEF-y na 6-dołkowe płytki i pozwól im rosnąć aż do konfluencji. Dodaj mitomycynę (5 μg/ml) przez 2,5 godziny w celu zatrzymania komórek. Odessać pożywkę, przemyć komórki dwukrotnie kompletną pożywką MEF i dodać 3 ml pożywki MEF do każdej 6-dołkówki. Komórki te służą jako warstwa zasilająca dla mysich i świńskich komórek iPS.
  3. Hodowla mysich komórek ES i iPS
    1. Aby przygotować mysie pożywkę hodowlaną ES, uzupełnij pożywkę DMEM o 15% FCS, L-glutaminę (2 mM), L-glukozę (4,5 g/l), aminokwasy endogenne MEM (1X), β-merkaptoetanol (0,1 mM) i czynnik hamujący białaczkę (1,000 U/ml).
    2. Przepłukać 6 dołków MEF-ami z zatrzymanym wzrostem raz za pomocą DMEM bez surowicy, dodać 2 ml mysiej pożywki ES i mysich komórek iPS (20% komórek zlewającego się naczynia). Codziennie myj komórki raz DMEM bez serum i dodaj 2 ml świeżej pożywki ES dla myszy.
    3. Aby przejść przez komórki, przemyj każdą studzienkę raz DMEM bez surowicy, dodaj 0,25% trypsyny/EDTA i inkubuj przez 3 minuty w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Przenieść komórki do probówki o pojemności 15 ml, wirować przez 5 minut przy 1 200 obr./min (300 x g), ponownie zawiesić komórki w 500 μl mysiej pożywki ES i dodać 100 μl zawiesiny do 2 ml mysiej pożywki ES w świeżym 6-dołku z warstwą zasilającą MEF.
  4. Hodowla komórek iPS świni
    1. Aby przygotować pożywkę iPS dla świń, uzupełnij pożywkę F-12 DMEM/Ham 20% surowicą nokautującą, L-glutaminą (2 mM), aminokwasami endogennymi MEM (1X), β-merkaptoetanolem (0,1 mM) i penicyliną (100 U/ml)/streptomycyną (100 μg/ml). Przefiltrować przez filtr 0,22 μM i przechowywać w temperaturze 4 °C przez 2 do 3 tygodni. Przy pierwszym użyciu dodać bFGF (10 ng/ml stężenie końcowe).
    2. Przepłukać 6 dołków MEF-ami zatrzymanymi we wzroście raz za pomocą bezsurowicowego DMEM/Ham's F-12 i dodać 1,5 ml pożywki iPS świni i komórek iPS świni (10% komórek zlewającego się naczynia). Codziennie myj komórki jednym razem bez surowicy DMEM/Ham's F-12 i dodaj 1,5 ml świeżej pożywki iPS dla świń
      3. .
    3. Aby przygotować bufor dysocjacyjny, dodać 2,5% trypsyny, kolagenazę IV (10 mg / ml), surowicę nokautującą (20%) i CaCl2 (1 mM) do PBS wolnego od Ca2+. Przemyć komórki dwukrotnie PBS i inkubować z buforem dysocjacyjnym przez 5 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Przenieść komórki do probówki o pojemności 15 ml, wirować przez 5 minut przy 1 200 obr./min (300 x g).
    4. Ponownie zawiesić komórki iPS świni w 500 μl świeżej pożywki iPS dla świń i dodać 50 μl zawiesiny do 1,5 ml pożywki iPS dla świń w świeżej 6-studzienki z warstwą zasilającą MEF. Codziennie myj komórki jednym razem bez surowicy DMEM/Ham's F-12 i dodaj 1,5 ml świeżej pożywki iPS dla świń
      5. .
  5. Hodowla ludzkich komórek iPS bez podawania
    1. Rozmrozić oryginalną fiolkę zawierającą preparat błony podstawnej w temperaturze 4 °C i rozcieńczyć lodowato zimnym, pozbawionym surowicy DMEM/Ham's F-12 do 8 mg/ml, podwielokrotnością i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia.
    2. Rozmrozić podwielokrotność preparatu z błony podstawnej w temperaturze 4 °C i rozcieńczyć lodowato zimnym, wolnym od surowicy DMEM/Ham's F12 (90 μg/ml). Odmierzyć pipetą 1 ml tego roztworu do 3-centymetrowych naczyń hodowlanych i delikatnie zamieszać, aby upewnić się, że cała powierzchnia jest pokryta. Uszczelnić naczynia parafilmem i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia. Przed użyciem do hodowli komórkowej inkubować szalki przez 30 minut w temperaturze 37 °C lub 3 godziny w temperaturze pokojowej, aby umożliwić polimeryzację preparatu błony podstawnej.
    3. Odessać pożywkę z naczyń pokrytych preparatem z membraną podstawną i przemyć dwukrotnie bezsurowicowym DMEM/Ham's F-12. Dodać 1,5 ml pożywki E8 do szalki hodowlanej i ludzkich komórek iPS (10% komórek zlewającego się naczynia). Codziennie myj komórki raz bezsurowicowym DMEM/Ham's F-12 i dodaj 1,5 ml świeżej pożywki E8.
    4. Aby przejść przez komórki, należy dwukrotnie przepłukać naczynia PBS i dodać 1 ml PBS/0,5 mM EDTA. Inkubować szalki przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Monitorować komórki pod mikroskopem. Uwaga: Kiedy kolonie zaczynają się zaokrąglać i wydają się mieć, są gotowe do przeniesienia.
    5. Odessać płyn, dodać 1,5 ml pożywki E8 i odłączyć komórki, delikatnie pipetując w górę i w dół. Przenieść komórki do probówki o pojemności 15 ml, wirować przez 5 minut przy 1 200 obr./min (300 x g), ponownie zawiesić w 500 μl pożywki E8 i dodać 50 μl zawiesiny do 1,5 ml pożywki E8 w świeżym naczyniu hodowlanym pokrytym preparatem z błony podstawnej.

2. Projektowanie sekwencji docelowych ponad granicami gatunków

  1. Wybierz referencyjne sekwencje cDNA ludzkiego, mysiego i świńskiego docelowych genów (GAPDH, NANOG, GDF3) i przeprowadź analizę dopasowania wielosekwencyjnego CLUSTAL .
    Uwaga: Spowoduje to wskazanie sekwencji homologicznych między gatunkami.
    1. Użyj następujących ustawień dla wyrównania wielokrotnego: kara za przerwę (stała) 10, kara za przerwę (zmienna) 5, waga przejścia 0, zakres kary za separację odstępów 8, % tożsamości dla opóźnienia 40, maksymalna liczba iteracji do wykonania 3.
  2. Prześlij żądane sekwencje docelowe do producenta (patrz tabela materiałów) w celu zaprojektowania i wyprodukowania sondy.
    Uwaga: Producent potwierdzi wtedy kompatybilność żądanej sekwencji z technologią. Jeśli żądana sekwencja nie jest zgodna, producent zasugeruje alternatywne sekwencje.
    1. Upewnij się, że regiony homologiczne, które mogą być wykorzystane jako potencjalne sekwencje nici wychwytującej, mają długość 27 pz.
      Uwaga: Wskazane jest zamówienie kilku nanocząstek o różnych niciach wychwytywania dla wybranego genu docelowego, ponieważ tylko prawdziwy eksperyment komórkowy da ostateczny dowód funkcjonalności pojedynczej sekwencji. W związku z tym oceniono dwie różne sekwencje dla GAPDH i GDF3, podczas gdy trzy różne nanocząstki przetestowano w celu oceny ekspresji NANOG. Ich lokalizacja i dokładna sekwencja zostały opublikowane w innym miejscu 17. Producent komercyjnie wytwarza nanocząstki o pożądanych sekwencjach i dostarcza je w formie liofilizowanej.

3. Rekonstytucja nanocząsteczek i dodawanie do kultur komórkowych

  1. Liofilizowane nanocząstki należy przechowywać po otrzymaniu w temperaturze 4 °C w ciemności.
  2. Odtworzyć nanocząstki przez dodanie 50 μl podwójnie destylowanej wody, co daje końcowe stężenie 100 nM. Po rozpuszczeniu przechowuj nanocząstki w temperaturze pokojowej w ciemności. Uwaga: W tym stanie są stabilne przez co najmniej rok. Przechowywanie przygotowanych próbek w temperaturze 4 °C może niekorzystnie wpłynąć na ich stabilność.
  3. Wstępnie rozcieńczyć roztwór podstawowy nanocząstek PBS do stężenia 2 (komórki HEK 293) lub 8 nM (komórki iPS i ES) w dniu aplikacji. Uwaga: Stężenie to jest 20-krotnie wyższe niż stężenie końcowe w naczyniu hodowlanym. W komórkach ES i komórkach iPS 400 pM nanocząstek indukowało sygnał fluorescencyjny łatwo wykrywalny pod mikroskopem. W przypadku komórek HEK 293 wystarczające jest stężenie 100 pM.
  4. Odpipetować 12,5 μl wstępnie rozcieńczonych nanocząstek do 24-dołkowego zbiornika zawierającego 237,5 μl kompletnej pożywki do hodowli komórkowych. W przypadku studni o różnych rozmiarach odpowiednio dostosuj głośność. Ostrożnie zakręć płytką, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie nanocząstek. Inkubować komórki przez noc (O/N) w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w wilgotnej atmosferze.
  5. Następnego dnia przeanalizuj hodowle komórkowe pod kątem specyficznej dla genu fluorescencji Cy3 o długości fali wzbudzenia 546 nm (emisja 575 – 640 nm) pod mikroskopem fluorescencyjnym. Uwaga: Okres wymagany do uzyskania wystarczająco silnej fluorescencji może zależeć od typu komórki i genu docelowego. W tych eksperymentach zaobserwowano to między 16 a 20 godziną po zastosowaniu sondy.

4. Identyfikacja populacji komórek Cy3 dodatnich za pomocą cytometrii przepływowej

  1. Hodować HEK 293 lub mysie komórki ES, stosując warunki określone odpowiednio w sekcji 1.1 lub 1.3. Na dzień przed analizą FACS dodać nanocząstki specyficzne dla GAPDH w różnych stężeniach do komórek HEK 293 (patrz rysunek 6A) i w temperaturze 400 pM do mysich komórek ES. Inkubować komórki O/N w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w wilgotnej atmosferze.
  2. Analizuj kultury komórkowe pod kątem specyficznej dla genu fluorescencji indukowanej Cy3 pod mikroskopem fluorescencyjnym.
  3. Odłączyć ogniwa HEK 293 zgodnie z pkt 1.1.2. Odwirować, przenieść do probówki o pojemności 1,5 ml i ponownie zawiesić w 200 μl lodowatego PBS/0,5% BSA/2 mM EDTA (bufor FACS). Utrzymuj ciemne komórki na lodzie do czasu analizy cytometrii przepływowej.
  4. Odłączyć mysie komórki ES zgodnie z pkt 1.3.3. Odwirować, przenieść do probówki o pojemności 1,5 ml i ponownie zawiesić w 200 μl lodowatego PBS/0,5% BSA/2 mM EDTA. Utrzymuj ciemne komórki na lodzie do czasu analizy cytometrii przepływowej.
  5. Przeciśnij komórki przez filtr 30 μM, aby zapobiec agregacji komórek i dodaj jodek propidyny (stężenie końcowe 2 μg/ml) 2 minuty przed analizą FACS, aby wykluczyć martwe komórki.
  6. Aby przeanalizować komórki Cy3-dodatnie, najpierw ustaw bramki hierarchiczne w podzbiorze FSC-A / SSC-A, FSC-H / FSC-W-zbiorze i podzbiorze SSC-H / SSC-W. Użyj rozproszenia do przodu i z boku, aby wykluczyć resztki komórek i komórki, które nie są rozproszone. Wyklucz martwe komórki przez ich barwienie jodkiem propidyny, wykazując PE w stosunku do PE-Texas Red. Wykonaj końcową bramkę sortowania na komórkach Cy3-PE dodatnich (Rysunek 4).

Wyniki

W pierwszej próbie weryfikacji i ustanowienia wewnątrzkomórkowej detekcji specyficznej ekspresji genów w żywych komórkach przy użyciu nanocząsteczek zdecydowano o przeprowadzeniu eksperymentów pilotażowych z wykorzystaniem konstytutywnie ekspresowanego genu gospodarza (GAPDH) w ludzkich komórkach HEK 293. Stężenie nanocząsteczek zastosowane w tych eksperymentach wybrano zgodnie z zaleceniem producenta. Dodanie sondy specyficznej dla GAPDH do pożywki hodowlanej w końcowym stężeniu 100 pM wywołało wyraźną fluorescencję Cy3 w tych komórkach, która była widoczna pod mikroskopem fluorescencyjnym po inkubacji przez noc (Rysunek 5A). W celu potwierdzenia wyniku w eksperymentach uwzględniono dwie kontrole. Jedna kontrola obejmuje tzw. nanocząsteczkę „scramble”, w której nić raportująca nie posiada sekwencji komplementarnej w komórkach ssaków lub eukariotów. Nanocząsteczka „scramble” pozwala określić niespecyficzną fluorescencję tła wynikającą z możliwej degradacji sondy lub niepełnego wygaszenia fluorescencji. Dodanie sondy scramble wywołało jedynie marginalny sygnał fluorescencyjny, który jest pomijalny (Rysunek 5B). Kontrola „uptake” z trwałą fluorescencją pomaga określić zdolność komórek do włączania nanocząsteczek drogą endocytozy, która może różnić się w zależności od typu komórek. Te cząsteczki kontrolne dodatnie wywołały jasny sygnał fluorescencyjny w komórkach HEK 293 (Rysunek 5C). Tym samym potwierdzono wykonalność technologii zapisu specyficznego sygnału fluorescencyjnego wewnątrzkomórkowego genu przy pomijalnym sygnale tła. Należy wspomnieć, że różnica między sygnałem tła a fluorescencją specyficzną zmniejsza się z czasem. Tło zwiększa się z powodu degradacji sondy lub niepełnego wygaszenia, podczas gdy fluorescencja specyficzna stopniowo zanika (Rysunek 5D). Te same nanocząsteczki specyficzne dla GAPDH zostały przetestowane w pierwotnych kulturach fibroblastów mysich, świńskich i owczych 17. Komórki te wykazują znacznie wyższy sygnał tła niż komórki HEK 293, podczas gdy fluorescencja specyficzna dla celu jest raczej słaba, co prawdopodobnie wynika z relatywnie niskiej zdolności proliferacyjnej tych kultur.

Wstępne eksperymenty skłoniły nas do wykorzystania tej technologii do wykrywania ekspresji genów pluripotencji w komórkach iPS pochodzących z różnych gatunków. W tym celu przeanalizowano geny NANOG oraz GDF3, o których wiadomo, że są one ekspresowane w komórkach pluripotencjalnych 18. W pierwszej kolejności zbadano komórki iPS pochodzące z fibroblastów koniuszka ogona myszy transgenicznej z enhancerem sercowym Nkx2.5 19. Dla obu genów uzyskano silny sygnał fluorescencyjny (Ryc. 6A) oraz pomijalną fluorescencję Cy3 w kontroli scramble (dane niepokażano). Podobne wyniki uzyskano w przypadku ludzkich i świńskich komórek iPS (Ryc. 6B i C). Co istotne, sygnał fluorescencyjny ograniczał się do kolonii iPS i nie znakował fibroblastów wykorzystywanych jako warstwa pożywna dla mysich i świńskich iPS (patrz strzałki na Ryc. 6A i C). Analiza ekspresji genu NANOG ujawniła również, że nie każda sekwencja przewidywana in silico jako „dobra” okazuje się ostatecznie funkcjonalna. Jeden z trzech wariantów nanocząsteczek specyficznych dla NANOG nie wywołał niemal żadnego sygnału fluorescencyjnego w porównaniu z kontrolą scramble, mimo 100% zgodności sekwencji w mysich komórkach iPS (Ryc. 6D). Podobny wynik uzyskano przy użyciu tej sondy w komórkach iPS pochodzenia ludzkiego i świńskiego (dane niepokażano). Zatem nanocząsteczki mogą być wykorzystywane do wykrywania ekspresji genów pluripotencji międzygatunkowo, przy czym funkcjonalność każdej zaprojektowanej sondy musi zostać wcześniej oceniona.

Obiecujące wyniki znakowania in situ żywych komórek w naczyniach hodowlanych skłoniły nas do ilościowej analizy ekspresji genów za pomocą cytometrii przepływowej. W tym celu do monowarstw komórek HEK 293 dodano nanocząsteczki specyficzne dla GAPDH w stopniowanych stężeniach, aby porównać wydajność znakowania w obrębie populacji komórek docelowych. W ocenie mikroskopii fluorescencyjnej zaobserwowano wzmożoną fluorescencję indukowaną przez Cy3 przy najniższym stężeniu w porównaniu z komórkami, które nie otrzymały nanocząsteczek. Zwiększanie stężeń nanocząsteczek indukowało wyraźnie zależną od stężenia fluorescencję komórek HEK 293 in situ (Rysunek 7A). Analiza cytometryczna tych komórek potwierdziła zależną od stężenia wydajność znakowania. Częstość występowania komórek pozytywnych pod kątem Cy3 wzrosła znacząco (ponad siedmiokrotnie) po zastosowaniu najwyższego stężenia nanocząsteczek (Rysunek 7B). W dalszych eksperymentach do analizy ekspresji genów pluripotencji za pomocą cytometrii przepływowej wykorzystano komórki ES z transgenicznej linii myszy z wzmacniaczem sercowym Nkx2.5 19. Eksperymenty pilotażowe z zastosowaniem 400 pM pozytywnej kontroli poboru dały wyraźnie pozytywne pod kątem Cy3 żywe kolonie ES pod mikroskopem, a cytometria przepływowa wykryła prawie 40% komórek pozytywnych pod kątem Cy3 (Rysunek 7C). W przeciwieństwie do tego, podobnie jak w przypadku komórek nieleczonych, około 0,1% komórek traktowanych sekwencją kontrolną (scramble) okazało się pozytywnych (dane niepokażane). Analogicznie, dodanie nanocząsteczek specyficznych dla Gapdh, Nanog i Gdf3 wywołało wyraźny sygnał fluorescencyjny w poszczególnych koloniach w naczyniu hodowlanym. Częstość występowania komórek pozytywnych pod kątem Cy3 dla Gapdh, określona za pomocą cytometrii przepływowej, była porównywalna do tej zaobserwowanej dla obu genów pluripotencji (Rysunek 7C). Wynik ten był przewidywalny, ponieważ uważa się, że Nanog i Gdf3 są również konstytutywnie ekspresowane w pluripotencyjnych komórkach ES. Zatem dane te wyraźnie wskazują, że komórki wykazujące ekspresję konkretnego genu mogą być identyfikowane za pomocą analiz cytometrycznych, jakościowo oraz pod kątem ich względnej ilości.

Schemat nanocząsteczek złota do detekcji mRNA z uwolnieniem fluorescencji, analiza reportera specyficznego dla genu.
Rysunek 1: Schematyczny opis struktury nanocząsteczek. (A) Struktura nanocząsteczki specyficznej dla genu. (B) Nanocząsteczka kontrolna (scramble, kontrola negatywna). (C) Nanocząsteczka do badania poboru (kontrola pozytywna). Adaptacja z Lahm et al. 17, przedrukowano za zgodą wydawnictwa Wiley.

Mikroskopia nanocząstek; rozcieńczanie, inkubacja, ocena fluorescencji (schemat, eksperyment).
Rysunek 2: Aplikacja nanocząstek do kultur komórkowych. Odpowiednio rozcieńczony roztwór nanocząstek jest pipetowany bezpośrednio do pożywki hodowlanej. Po inkubacji przez noc (O/N) fluorescencyjne komórki specyficzne dla danego genu są widoczne pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Proces detekcji mRNA; schemat; nanogwiazdy z reporterami fluorescencyjnymi; pobieranie przez komórki i emisja.
Rysunek 3: Aktywne pobieranie nanocząsteczek przez komórki poprzez endocytozę. (A) Komórki aktywnie pochłaniają nanocząsteczki w procesie endocytozy. (B) Docelowe mRNA wiąże się z nicią przechwytującą i wypiera fluorescencyjny reporter.

Schematy cytometrii przepływowej, komórki HEK 293 i mysie komórki ES, porównanie nanocząsteczek GAPDH, analiza danych.
Rysunek 4: Strategia bramkowania dla cytometrii przepływowej. (A) Strategia dla komórek HEK 293. (B) Strategia dla mysich komórek ES. Dane zostały zebrane przy użyciu urządzenia 1 dla komórek HEK 293 lub urządzenia 2 dla mysich komórek ES, a następnie przeanalizowane za pomocą narzędzia programistycznego (patrz Tabela Materiałów).

Analiza poboru nanocząsteczek, mikroskopia fluorescencyjna, GAPDH, Scramble, kontrast fazowy, time-lapse.
Rysunek 5: Analiza ekspresji GAPDH w komórkach HEK 293. Do komórek dodano nanocząsteczki specyficzne dla GAPDH w stężeniu 100 pM (stężenie końcowe), a fluorescencję zarejestrowano po inkubacji przez noc (O/N). (A) Nanocząsteczka specyficzna dla GAPDH. (B) Scramble (kontrola negatywna). (C) Uptake (kontrola pozytywna). (D) Kinetyka kontroli scramble i uptake. Fluorescencję określono w zaznaczonych punktach czasowych po dodaniu nanocząsteczek specyficznych dla GAPDH. Paski skali odpowiadają 50 µM.

Porównanie komórek iPS, markery Nanog i GDF3, mikroskopia kontrastowa, komórki mysie, ludzkie i świńskie.
Rycina 6: Analiza ekspresji genów pluripotencji w komórkach iPS różnych gatunków. Nanocząsteczki specyficzne dla NANOG lub GDF3 dodano do komórek w stężeniu 400 pM (stężenie końcowe), a fluorescencję zarejestrowano po inkubacji przez noc. (A) Mysie komórki iPS. (B) Ludzkie komórki iPS. (C) Świńskie komórki iPS. Strzałki w punktach (A) i (C) wskazują nieoznaczone komórki warstwy zasilającej fibroblastów. (D) Fluorescencja w mysich komórkach iPS po dodaniu nanocząsteczki SF3 zaprojektowanej dla NANOG. Paski skali reprezentują 50 µM.

Wpływ nanocząsteczek na komórki HEK 293 i mysie komórki ES; obrazy fluorescencyjne, wykres słupkowy, cytometria przepływowa.
Rysunek 7: Żywe komórki znakowane nanocząsteczkami można zidentyfikować za pomocą cytometrii przepływowej. (A) Widok mikroskopowy komórek HEK 293 pozytywnych pod kątem Cy3 po dodaniu różnych stężeń nanocząsteczek. (B) Częstość występowania komórek pozytywnych pod kątem Cy3 wyznaczona metodą cytometrii przepływowej. (C) Barwienie żywych kolonii mysich komórek ES i wyznaczenie częstości występowania komórek pozytywnych pod kątem Cy3. Nanocząsteczki dodano w stężeniu końcowym 400 pM. Paski skali odpowiadają 50 µM.

Dyskusja

W niniejszej pracy opisano zastosowanie nanocząstek znakowanych fluorescencyjnie, które pozwalają na wiarygodną ocenę wewnątrzkomórkowej ekspresji genów bezpośrednio w żywych komórkach różnych gatunków ssaków o różnym pochodzeniu histogenetycznym pod mikroskopem fluorescencyjnym. Takie podejście ma kilka zalet w porównaniu z innymi opublikowanymi metodami. Po pierwsze, badacz nie jest ograniczony ani pod względem docelowego genu, ani typu komórki. Wszystkie metody wykrywania oparte na przeciwciałach są ograniczone do jednego epitopu. Chociaż fluorescencyjne latarnie molekularne mogą być również zaprojektowane dla szerokiego spektrum genów, metoda ta wymaga dysocjacji komórek i późniejszej nukleofekcji 15. W przeciwieństwie do tego, zastosowanie nanocząstek specyficznych dla genu nie wymaga żadnej manipulacji komórką docelową, która aktywnie pochłania nanocząstki przez endocytozę. Podczas kolejnego pasażowania cząsteczki złota stopniowo opuszczają komórki, a kultura może być wykorzystana w dalszych eksperymentach.

Niemniej jednak technologia ta ma również pewne ograniczenia. Niektóre markery są oczywiście niewykrywalne ze względu na ich węglowodanowy charakter, takie jak SSEA-1 lub TRA-1-81 20. Obecnie na rynku dostępna jest szeroka gama nanocząstek. Cząstki te zostały wstępnie przetestowane pod kątem ich funkcjonalności w eksperymentach komórkowych. Celem niniejszej pracy było zaprojektowanie niestandardowych sond, które mogą być używane ponad granicami gatunków. Stosując takie podejście lub projektując sondę dla nowego genu docelowego, należy mieć świadomość, że funkcjonalność sondy przewidywanej in silico musi być dokładnie oceniona in vitro. Sonda NANOG-SF3, która wykazała 100% homologię do homologii sekwencji, w ogóle nie działała, podczas gdy NANOG-SF1 z jedną niedopasowaną zasadą w sekwencji mysiej i świńskiej wytwarzała ładny sygnał fluorescencyjny. Kolejne pytanie dotyczy skutecznego wchłaniania nanocząstek. Cząstki dostają się do komórek w wyniku endocytozy, procesu, na który wpływa wielkość nanocząstek 21, typ komórki i stan różnicowania 22 oraz zdolność komórkowa do wykonywania fago- i makropinocytozy 23. Optymalne stężenie do uzyskania satysfakcjonującego sygnału fluorescencji musi być testowane dla każdej indywidualnej aplikacji lub linii komórkowej. W tym celu pierwszym eksperymentem powinno być zawsze zastosowanie kontroli wychwytu w celu oceny kompatybilności sond w obrębie typów komórek i warunków hodowli przed przejściem do wykrywania ekspresji genów specyficznych dla celu.

Punktem krytycznym dla uzyskania wiarygodnych wyników przy zastosowaniu tego protokołu do nowej linii komórkowej lub populacji komórek jest włączenie odpowiednich kontroli. Stale fluoryzująca kontrola wychwytu dostarczy wskazówek, które stężenia nanocząstek wywołają wystarczający sygnał fluorescencyjny w docelowej populacji komórek. Fluorescencja musi zostać oceniona następnego dnia, ponieważ sygnał zaniknie z czasem 17. W tym samym czasie kontrola mieszania bez odpowiednika w genomie eukariotycznym zastosowana w identycznym stężeniu musi indukować znikomy sygnał tła. Jako trzecią kontrolę zaleca się użycie nanocząstki specyficznej dla genu porządkowego (np. GAPDH, β-aktyna). Te nanocząstki służą jako pozytywna kontrola, dzięki której podejście to można wykorzystać do wykrycia określonej ekspresji genów w wybranej populacji komórek docelowych. Jeśli te kontrole okażą się zadowalające, można oczekiwać uzyskania wiarygodnych specyficznych sygnałów fluorescencyjnych przy użyciu nanocząstek specyficznych dla innych docelowych genów. Stężenie zastosowanych nanocząstek może być również krytyczne, ponieważ wykazano, że regulują one w dół sekwencję docelową 24. Efekt ten wymaga jednak znacznie wyższych stężeń (5 nM) niż stężenia stosowane w prezentowanych tu doświadczeniach (400 pM). Przy tym stężeniu nanorozbłyski nie wpływają na poziomy mRNA ani białka docelowego genu, a stężenia tak wysokie jak 2 nM nie upośledzają proliferacji HEK293 i mysich komórek ES 17. Ponadto analiza ekspresji całego genomu nie wykazała żadnych istotnych zmian w ekspresji genów 25. W związku z tym przy stężeniach do 1 nM nanorozbłyski nie powinny wykazywać żadnych istotnych działań niepożądanych.

Bardzo obiecującym zastosowaniem tej technologii jest możliwość znakowania dowolnej populacji komórek, która jest oznaczona określonym genem. Ostatnio nanocząstki specyficzne dla genów zostały z powodzeniem wykorzystane do selektywnego barwienia żywych miocytów komorowych 26, subpopulacji komórek czerniaka 27, monocytów 28 i kultur komórek móżdżku 29. Takie oznaczone fluorescencją populacje komórek można sortować i oczyszczać za pomocą cytometrii przepływowej jako żywe komórki. W dziedzinie onkologii można sobie wyobrazić wyizolowanie żywych przerzutowych komórek nowotworowych w modelach zwierzęcych na podstawie ich ekspresji CEA, co jest najcenniejsze dla poszukiwania potencjalnych genów lub struktur docelowych sprzyjających przerzutom. Niedawno wykazaliśmy, że naprawdę przeprogramowane mysie kolonie iPS można zidentyfikować in situ za pomocą nanocząstek specyficznych dla Nanog na podstawie wykrytej intensywności fluorescencji 17. W związku z tym identyfikacja naprawdę przeprogramowanych kolonii iPS może być prowadzona na platformach o wysokiej przepustowości, które wykorzystują zrobotyzowane urządzenia do wykrywania i wybierania fluorescencji w celu identyfikacji najbardziej obiecujących kolonii. Technologia ta wydaje się być odpowiednia w wielu obszarach badawczych do selekcji określonych subpopulacji komórkowych i wydaje się, że możliwe jest zastosowanie nanocząstek w platformach o wysokiej przepustowości. Podsumowując, protokół ten reprezentuje nowatorskie podejście wykorzystujące nanocząstki znakowane fluorescencją, które umożliwia wykrywanie wewnątrzkomórkowej ekspresji genów bezpośrednio w żywych komórkach. Technologia ta może być cennym narzędziem do oczyszczania, rozszerzania i dalszej charakterystyki rzadkich subpopulacji komórkowych w wielu obszarach badawczych.

Oświadczenia

H.L. otrzymał nanocząstki od EMD Millipore Corporation bezpłatnie. Wszyscy pozostali autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Lynette Henkel za jej doskonałe wsparcie w przeprowadzaniu analizy cytometrii przepływowej. Dziękujemy dr Donowi Weldonowi i dr Victorowi Koongowi (Temecula, Kalifornia) za krytyczną lekturę manuskryptu i pomocne komentarze. Prace te były wspierane przez granty Niemieckiej Fundacji Badawczej, KR-3770-7/1 i KR-3770-9/1 (M. K.), Deutsche Stiftung für Herzforschung, F/37/11 (M. K.), Dr. Rusche Research Grant 2014 z Deutsche Stiftung für Herzforschung i Deutsche Gesellschaft für Thorax-, Herz- und Gefässchirurgie (M.-A. D.), oraz Deutsches Zentrum für Herz- und Kreislaufforschung Säule B Projekt, DZHK B 13-050A i DZHK B 14-013SE (M. K.).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pożywka F12 DMEM/Ham's ze stabilną glutaminąBiochrome GmbHFG4815
Surowica cielęca płoduLife TechnologiesSV30160.03
Penicylina/Streptomycyna (100x)MiliporianA2213
Pirogronian sodu (100x)Life Technologies11360-039
DMEM wysoka glukoza ze stabilną glutaminąBiochrome GmbHFG0435
Mitomycyna CRoche10 107 409 001zapobiega podziałom komórkowym MEF
Aminokwasy endogenne MEM (100x)Life Technologies11140-050
b-merkaptoetanolSigmaM3148
Czynnik hamujący białaczkę (107 U/ml)Miliporowyczynnik wzrostu ESG1107dla mysich komórek ES i iPS, zapobiega różnicowaniu
0,25% Trypsyna/EDTA (1x)Life Technologies25200-056odłącza przylegające kultury komórkowe
Surowica nokautującaInvitrogen10828-028suplement do hodowli komórek iPS u ludzi i świń
Czynnik wzrostu bFGFPeprotech100-18Bdla komórek iPS ludzkich i świńskich
Kolagenaza IVWorthingtonLS004188dysocjacja komórek iPS świni
MatrigelCorning354277efektywna powierzchnia do hodowli ludzkich komórek iPS bez karmienia, określana w manuskrypcie jako błona przygotowawcza podstaw
Pożywka E8Stem Cell Technologies05940zdefiniowana pożywka do hodowli ludzkich komórek iPS bez karmienia na
15575-038
SmartFlareFirma EMD Millipore Corporationdostosowała wykrywaniewewnątrzkomórkowej ekspresji genów w żywych komórkach, określanych w manuskrypcie jako nanocząstki
Mikroskop fluorescencyjnyZeissAxiovert 200M
HeraCell 150i Inkubator CO2Thermo Scientific51026282
Żelatyna (ze skóry świniSigmaG6144zwiększa przyczepność MEF do powierzchni
Jodek propidyny (1 mg / ml)SigmaP4864oznacza martwe komórki w analizach cytometrii przepływowej
BD FACS Aria IlluBecton DickinsonA4544określany jako urządzenie 1 na rysunku 4
NaviosBeckman Coulter775213określany jako urządzenie 2 na rysunku 4
Oprogramowanie FloJo vX 10.0.7r2Treestardo analizy danych cytometrii przepływowej
sondach Matrigel EDTA 0,5 M Invitrogen )

Bibliografia

  1. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  3. Liu, H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from adult rhesus monkey fibroblasts. Cell Stem Cell. 3 (6), 587-590 (2008).
  4. Liao, J., et al. Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells. Cell Stem Cell. 4 (1), 11-15 (2009).
  5. Luo, J., et al. Generation of leukemia inhibitory factor and basic fibroblast growth factor-dependent induced pluripotent stem cells from canine adult somatic cells. Stem Cells Dev. 20 (10), 1669-1678 (2011).
  6. Bao, L., et al. Reprogramming of ovine adult fibroblasts to pluripotency via drug-inducible expression of defined factors. Cell Res. 21 (4), 600-608 (2011).
  7. Esteban, M. A., et al. Generation of induced pluripotent stem cell lines from Tibetan miniature pig. J. Biol. Chem. 284 (26), 17634-17640 (2009).
  8. Nakagawa, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts. Nat. Biotechnol. 6 (1), 101-106 (2008).
  9. Maekawa, M., et al. Direct reprogramming of somatic cells is promoted by maternal transcription factor Glis1. Nature. 474 (7350), 225-229 (2011).
  10. Marti, M., et al. Characterization of pluripotent stem cells. Nat. Protoc. 8 (2), 223-253 (2013).
  11. Wada, N., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human gingival fibroblasts and periodontal ligament fibroblasts. J. Periodontal Res. 46 (4), 438-447 (2011).
  12. Chan, E. M., et al. Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells. Nat. Biotechnol. 27 (11), 1033-1037 (2009).
  13. Singh, U., et al. Novel alkaline phosphatase substrate for identification of pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. Rep. 8 (3), 1021-1029 (2012).
  14. Kang, N. -Y., et al. Embryonic and induced pluripotent stem cell staining and sorting with the live-cell fluorescence imaging probe CDy1. Nat. Protoc. 6 (7), 1044-1052 (2011).
  15. Ban, K. B., et al. Purification of cardiomyocytes from differentiating pluripotent stem cells using molecular beacons targeting cardiomyocyte-specific mRNA. Circulation. 128 (17), 1897-1909 (2013).
  16. Seferos, D. S., Giljohann, D. A., Hill, H. D., Prigodich, A. E., Mirkin, C. A. Nano-flares: probes for transfection and mRNA detection in living cells. J. Am. Chem. Soc. 129 (50), 15477-15479 (2007).
  17. Lahm, H., et al. Live fluorescent RNA-based detection of pluripotency gene expression in embryonic and induced pluripotent cells of different species. Stem Cells. 33 (2), 392-402 (2015).
  18. Clark, A. T., et al. NANOG and GDF3 genes are expressed in pluripotent cells and map to chromosome 12p13, a hotspot for teratocarcinoma. Stem Cells. 22 (2), 169-179 (2004).
  19. Wu, S. M., et al. Developmental origin of a bipotential myocardial and smooth muscle cell precursor in the mammalian heart. Cell. 127 (6), 1137-1150 (2006).
  20. Reubinoff, B. E., et al. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat. Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
  21. Yue, T., Zhang, X. Cooperative effect in receptor-mediated endocytosis of multiple nanoparticles. ACS Nano. 6 (4), 3196-3205 (2012).
  22. Andersson, L. I., Hellman, P., Eriksson, H. Receptor-mediated endocytosis of particles by peripheral dendritic cells. Hum. Immunol. 60 (10), 625-633 (2008).
  23. Weissleder, R., Nahrendorf, M., Pittet, M. J. Imaging macrophages with nanoparticles. Nat. Mater. 13 (2), 125-138 (2014).
  24. Prigodich, A. E., Seferos, D. S., Massich, M. D., Giljohann, D. A., Lane, B. C., Mirkin, C. A. Nano-flares for mRNA regulation and detection. ACS Nano. 3 (8), (2009).
  25. Weldon, D., Williams, Y., Ko, A. Cell sorting based on RNA detection in living cells using SmartFlareTM RNA detection reagents.. , EMD Millipore Application Note. Available from: http://www.emdmillipore.com/ (2013).
  26. Mehta, A., et al. Re-trafficking of hERG reverses long QT syndrome 2 phenotype in human iPS-derived cardiomyocytes. Cardiovasc. Res. 102 (3), 497-506 (2014).
  27. Seftor, E. A., et al. Melanoma tumor cell heterogeneity: a molecular approach to study subpopulations expressing the embryonic morphogen Nodal. Sem. Oncol. 41 (2), 259-266 (2014).
  28. Khare, S., et al. The PYRIN domain-only protein POP3 inhibits ALR inflammasomes and regulates responses to infection with DNA virus. Nat. Immunol. 15 (4), 343-353 (2014).
  29. Kratz, A., et al. Digital expression profiling of the compartmentalized translatome of Purkinje neurons. Genome Res. 24 (8), 1396-1410 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Detekcja ekspresji gen wfluorescencyjne nanocz steczkianaliza ywych kom rekcytometria przep ywowamikroskopia fluorescencyjnasynteza nanocz steczekdetekcja docelowego mRNAmarkery pluripotencjiinkubacja hodowli kom rkowychkwantyfikacja fluorescencji

Powiązane artykuły