Artykuł metodologiczny

Repopulacja komórek nabłonkowych i przygotowanie rusztowań macierzy zewnątrzkomórkowej gryzoni do rozwoju tkanki nerkowej

DOI:

10.3791/53271

⸱

10 sierpnia 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Comprehensive Transplant Center, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Surgery, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 3Department of Biomedical Engineering, Northwestern University, 4Simpson Querrey Institute for BioNanotechnology in Medicine, Northwestern University, 5Department of Internal Medicine, University of New Mexico HSC, 6Department of Pathology, University of New Mexico HSC, 7Department of Chemical and Biological Engineering, Northwestern University, 8Chemistry of Life Processes Institute, Northwestern University, 9Department of Surgery, Jesse Brown VA Medical Center

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje decelularyzację nerek szczura Sprague Dawley poprzez wstępną perfuzję detergentów przez układ krwionośny, wytwarzając bezkomórkowe matryce zewnątrzkomórkowe nerek, które służą jako szablony do ponownego zasiedlenia ludzkimi komórkami nabłonka nerkowego. Recelularyzacja i zastosowanie testu perfuzji resazuryny do monitorowania wzrostu odbywa się w specjalnie zaprojektowanych bioreaktorach perfuzyjnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół szczegółowo opisuje tworzenie bezkomórkowych, ale biofunkcjonalnych rusztowań nerkowej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), które są użyteczne jako małe substraty modelowe do rozwoju tkanek w skali narządów. Nerki szczurów Sprague Dawley są kaniulowane przez wprowadzenie cewnika do tętnicy nerkowej i perfundowane serią detergentów o niskim stężeniu (Triton X-100 i dodecylosiarczan sodu (SDS)) przez 26 godzin w celu uzyskania nienaruszonych, pełnych rusztowań nerkowych z nienaruszonymi przepuszczalnymi naczyniami krwionośnymi, kłębuszkami nerkowymi i kanalikami nerkowymi. Po decelularyzacji rusztowanie nerkowe umieszcza się w specjalnie zaprojektowanym naczyniu bioreaktora perfuzyjnego, a cewnikowaną tętnicę nerkową podłącza się do obwodu perfuzyjnego składającego się z: pompy perystaltycznej; Rury; oraz opcjonalne sondy pH, tlenu rozpuszczonego i ciśnienia. Po wyjałowieniu rusztowania kwasem nadoctowym i etanolem oraz zrównoważeniu pH (7.4), rusztowanie nerkowe przygotowuje się do wysiewu poprzez perfuzję pożywki hodowlanej w inkubatorze o dużej pojemności utrzymywanym w temperaturze 37 °C i 5%CO2. Czterdzieści milionów komórek nabłonka kanalików korowych nerki (RCTE) jest wstrzykiwanych przez tętnicę nerkową i szybko przetaczanych przez rusztowanie pod wysokim przepływem (25 ml / min) i ciśnieniem (~ 230 mmHg) przez 15 minut przed zmniejszeniem przepływu do fizjologicznej szybkości (4 ml / min). Komórki RCTE przede wszystkim wypełniają kanalikową niszę ECM w korze nerkowej, namnażają się i tworzą kanalikowe struktury nabłonkowe w ciągu siedmiu dni hodowli perfuzyjnej. Roztwór rezazuryny o stężeniu 44 μM w pożywce hodowlanej jest perfundowany przez nerkę przez 1 godzinę podczas wymiany pożywki w celu zapewnienia fluorometrycznej, opartej na redoks oceny metabolicznej żywotności i proliferacji komórek podczas tubulogenezy. Bioreaktor perfuzyjny nerki umożliwia nieinwazyjne pobieranie próbek pożywki w celu oceny biochemicznej, a wiele portów wlotowych umożliwia alternatywne wysiewanie wsteczne przez żyłę nerkową lub moczowód. Protokoły te mogą być stosowane do recelularizacji rusztowań nerkowych z różnymi typami komórek, w tym śródbłonkiem naczyniowym, nabłonkiem kanalikowym i fibroblastami zrębu, w celu szybkiej oceny w tym systemie.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ponieważ liczba pacjentów cierpiących na schyłkową niewydolność nerek stale rośnie, istnieje poważny i rosnący niedobór nerek dawców dostępnych do przeszczepu. Niemożność zaspokojenia popytu ze strony stale rosnącej liczby kandydatów oczekujących na przeszczep nerki skłoniła do badań w zakresie inżynierii narządów nerki, których ostatecznym celem jest opracowanie dostosowanych do potrzeb klienta, wszczepialnych przeszczepów nerekna żądanie 1,2. Zbudowanie funkcjonującej tkanki nerkowej z własnych komórek pacjenta wyeliminowałoby potrzebę immunosupresji przez całe życie, skróciłoby czas spędzany przez pacjentów na dializie w oczekiwaniu na przeszczep nerki i rozszerzyłoby ratujący życie przeszczep na większą liczbę pacjentów z przewlekłą chorobą nerek.

Pierwszym krokiem w kierunku inżynierii biologicznej tkanki nerkowej przy użyciu komórek pochodzących od pacjenta jest stworzenie rusztowania, które służy jako substrat pomocniczy dla miąższu nerki (np. nabłonka kanalików), fibroblastów zrębu i wzrostu komórek naczyniowych. Rusztowania biomateriałowe pochodzące z naturalnych matryc zewnątrzkomórkowych narządów (ECM) mają kilka cech, które sprawiają, że są pożądane do stosowania w inżynierii tkankowej, w tym ich naturalny skład biologiczny; odpowiednia makro- i mikrostruktura do nadania funkcji fizjologicznych; i biokompatybilność komórkowa, promowanie adhezji komórek, migracji i konstruktywnej przebudowy tkanek3. Obiecującą metodą produkcji rusztowań do regeneracji tkanki nerkowej jest decelularyzacja allogenicznych lub ksenogenicznych nerek, które zachowują większość złożonego naturalnego składu białkowego ECM4 nerki, zachowują nieodłączną złożoność architektoniczną narządu i przezwyciężają trudności związane z oddolną inżynierią grubych tkanek komórkowych poprzez zapewnienie zaopatrzenia naczyniowego do rozwijających się komórek po recelularizacji rusztowania5.

Decelularyzacja perfuzyjna to proces, w którym detergenty, enzymy lub inne roztwory zakłócające działanie komórek są równomiernie dostarczane przez sieć naczyniową narządu6. Strategia ta została opracowana jako skuteczny proces uzyskiwania bezkomórkowych rusztowań ECM opartych na narządach jako trójwymiarowych (3D), biologicznych szablonów do inżynierii całego narządu6-8, czego dowodem jest opracowanie bezkomórkowych matryc nerkowych z odrzuconych nerekludzkich9 i ksenogenicznych nerek uzyskanych ze źródeł dużych zwierząt (np. świni10, kóz11) i gryzoni12. W szczególności wykorzystanie małych modeli zwierzęcych, takich jak gryzonie, wymaga mniejszej liczby komórek i pożywek hodowlanych, co jest szczególnie pomocne w badaniach nad recelularyzacją narządów, w których liczba komórek jest zwykle ograniczona, jak ma to miejsce w przypadku tkanek pochodzących z komórek macierzystych. Celem opisanego protokołu decelularyzacji jest wytworzenie bezkomórkowego nerkowego ECM, który może być wykorzystany jako system rusztowań 3D do regeneracji struktur nerkowych, w tym kanalików nefronowych, które w niniejszym przykładzie są ponownie zasiedlone ludzkimi komórkami nabłonka kanalików korowych nerki (RCTE). Wcześniej opisaliśmy naszą rygorystyczną ocenę optymalnego, opartego na detergentach protokołu decelularyzacji nerek szczurów7, który jest szybszy (około jednego dnia) niż inne wcześniej opisane metody (Ross i wsp. - 5 dni12, Song i wsp. - 4,5 dnia13) i wystawia narząd na znacznie niższe stężenie (0,1%) denaturantu dodecylosiarczanu sodu (SDS) podczas decelularyzacji niż wcześniejsze raporty12-15.

Ograniczona liczba badań opisała użycie nerek gryzoni do decelularyzacji i późniejszego użycia jako rusztowania 3D do ponownego zasiedlenia komórek (recenzowane gdzie indziej1)12-16. W tym protokole przedstawiamy szczegółowy opis naszej wcześniej ustalonej, optymalnej strategii decelularyzacji do produkcji bezkomórkowych rusztowań nerkowych z nerek szczurów Sprague Dawley7. Korzystając ze specjalnie zaprojektowanych bioreaktorów perfuzyjnych zdolnych do podwójnego wysiewu i konserwacji kultury perfuzyjnej17, recellularyzujemy bezkomórkowe rusztowania nerkowe ludzkimi komórkami RCTE, które konsekwentnie ponownie zasiedlają składnik rurkowy w tych zdecelularyzowanych matrycach, namnażają się i przeżywają w kulturze perfuzyjnej przez ponad tydzień. Ponadto demonstrujemy nasze zastosowanie testu perfuzji resazuryny – niedrogiej, niecytotoksycznej i nieinwazyjnej oceny metabolicznej stosowanej wcześniej w badaniach cytotoksyczności17 – w celu zapewnienia wskazania żywotności i proliferacji komórek w recelularnych nerkach w czasie7.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OŚWIADCZENIE ETYCZNE:Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi zatwierdzonymi przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Northwestern.

1. Decelularyzacja nerek

  1. Przygotuj roztwory decelularyzacyjne. Przygotować następujące objętości odczynników dla każdej nerki, która ma być pozbawiona komórek komórkowych, plus jedna dodatkowa objętość (np. dla 4 nerek przygotować 5 000 ml Triton X-100 dla kroku 1.1.3):
    1. Przygotuj 500 ml wody z odwróconej osmozy (ROH2O). Uwaga: Alternatywnie woda dejonizowana może być używana w etapach, w których wskazany jest ROH2O.
    2. Przygotować 1 000 ml Triton X-100, 1% (v/v) w ROH2O. Powoli dodawać 10 ml Triton X-100 do 990 ml wody w dużej zlewce, szybko mieszając na płytce mieszającej. Poczekaj, aż odczynnik całkowicie się rozpuści przed użyciem (co najmniej 10 minut).
    3. Przygotować 1 000 ml Triton X-100, 1% (v/v) w ROH2O (oddzielna objętość).
    4. Przygotować 1 000 ml dodecylosiarczanu sodu (SDS), 0,1% (v/v) w ROH2O. Powoli dodawać 5 ml SDS (20% roztwór podstawowy) do 995 ml wody w dużej zlewce, szybko mieszając na płytce mieszającej. Przed użyciem pozostawić odczynnik do równomiernego wymieszania (co najmniej 10 minut).
    5. Przygotować 500 ml ROH2O (oddzielna objętość).
  2. Przygotuj nerki do decelularyzacji.
    1. Odzyskaj nerkę od samca szczura Sprague Dawley (250-300 g), jak opisano wcześniej7.
      1. Znieczulić szczura przez dootrzewnowe wstrzyknięcie pentobarbitalu (50 mg/kg masy ciała). Często badaj głębokość znieczulenia (co 10-15 minut), monitorując funkcję oddechową, tętno i reakcję na szczypanie palca u nogi podczas operacji. Jeśli zwierzę ma podwyższoną częstość oddechów lub dodatni odruch pedałowania, należy podać dodatkową dawkę (z 1/3 do 1/4 dawki początkowej) pentobarbitalu.
      2. Wykonaj podłużne nacięcie brzucha w linii środkowej, aby odsłonić nerki, aortę brzuszną i żyłę główną dolną.
      3. Wstrzyknąć 2,000 jednostek heparyny USP / kg masy ciała do żyły prącia.
      4. Zmobilizuj obie nerki poprzez delikatne rozwarstwienie. Ostrożnie oddzielić nerkę od tłuszczu okołonerkowego, zachowując nienaruszoną torebkę nerkową otaczającą nerkę. Wykonać fuzję nerek zimnym roztworem soli fizjologicznej (10 ml) przez podnerkową aortę brzuszną.
    2. Wprowadzić cewnik o rozmiarze 24 do tętnicy nerkowej, mocno podwiązać cewnik do tętnicy i (za pomocą strzykawki) delikatnie przetoczyć nerkę 10 ml zimnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), aby całkowicie oczyścić narząd z krwi.
    3. Zanurzyć nerkę w 25 ml PBS na szalce Petriego i umieścić w zamrażarce o temperaturze -20 °C, aby stopniowo zamrozić narząd (wywołując w ten sposób lizę komórek) w celu przechowywania do momentu decelularyzacji.
      Uwaga: w razie potrzeby moczowód i/lub żyła nerkowa mogą być również kaniulowane w celu wysiewu wstecznego, chociaż nie jest to opisane w tym protokole.
    4. Całkowicie rozmrozić zamrożoną nerkę (zrównoważyć w temperaturze pokojowej (RT)) i delikatnie przelać 10 ml PBS, aby sprawdzić, czy podwiązana tętnica nerkowa nie przecieka. W przypadku zaobserwowania nieszczelności lub znacznego oporu należy ponownie cewnikować tętnicę nerkową.
  3. Przygotuj sprzęt do decelularyzacji. Zmontuj system perfuzji decelularyzacyjnej, jak pokazano na rysunku 1B.
    1. Podłącz jedną rurkę pompy perystaltycznej o długości 8" (Rysunek 1D, f) do dwóch wystarczających długości (zalecana >36") rurki z gumy silikonowej o średnicy wewnętrznej (ID) 1/16" (Rysunek 1D, h). Użyj dwóch męskich adapterów Luer lock do adapterów kolczastych 1/8" połączonych jednym żeńskim adapterem Luer x żeńskim Luer, aby połączyć segmenty rurki (Rysunek 1D, j). Włóż dodatkowy męski adapter Luer lock do adaptera kolczastego 1/8" (rysunek 1D, c) do dolnego końca linii perfuzyjnej w celu podłączenia do cewnika tętnicy nerkowej.
    2. Podłącz każdy segment rurki pompy perystaltycznej do 4-rolkowej głowicy pompy za pomocą dużego wkładu pompy.
    3. Po umieszczeniu górnego końca rurki z gumy silikonowej w pierwszym zbiorniku roztworu (ROH2O), przytrzymaj przycisk "Prime", aby całkowicie zalać każdy obwód perfuzyjny roztworem. KRYTYCZNE: Sprawdź, czy w rurce nie pozostały uwięzione żadne pęcherzyki i czy górny koniec (pozostawiony otwarty w celu pobrania płynu) rurki z gumy silikonowej jest zabezpieczony poniżej granicy faz ciecz-powietrze zbiornika odczynnika, jak pokazano na rysunku 1B.
  4. Wykonaj protokół decelularyzacji w RT7.
    1. Podłączyć cewnik do tętnicy nerkowej każdej rozmrożonej nerki do końca rurki obwodu perfuzyjnego znajdującej się za pompą, upewniając się, że w cewniku nie są uwięzione pęcherzyki powietrza. Pozwolić, aby nerka była zawieszona wzdłuż wewnętrznej ścianki pustej zlewki o pojemności 5 l (zbiornik na perfuzat, patrz rysunek 1B), tak aby tętnica nerkowa nie była zagięta ani zwinięta
    2. Ustaw napęd pompy na 5 ml/min i naciśnij przycisk "Start". Upewnij się, że każda nerka perfuzjonuje, obserwując roztwory kapiące z dna narządu.
    3. Przeprowadzić perfuzję każdej nerki za pomocą następujących odczynników, jak opisano na rysunku 1A
      1. Uzdatnianie 500 ml ROH2O przy 5 ml/min przez 1 godz., 40 min.
      2. Stosować perfuzję z 1 000 ml 1% Triton X-100 w dawce 5 ml/min przez 3 godziny, 20 minut.
      3. Stosować perfuzję z 1 000 ml 1% Triton X-100 w dawce 1 ml/min przez 16 godzin, 40 min.
      4. Stosować perfuzję z 1 000 ml 0,1% SDS w dawce 5 ml/min przez 3 godziny, 20 minut.
      5. Uzdatnianie 500 ml ROH2O przy 5 ml/min przez 1 godz., 40 min.
        Uwaga: Każda pozbawiona komórek nerka może być przechowywana w PBS (bez dodatków) w stożkowej probówce o pojemności 50 ml w temperaturze 4 °C przez maksymalnie dwa tygodnie przed użyciem.

2. Montaż bioreaktora perfuzyjnego, sterylizacja nerek i przygotowanie do recelularyzacji

  1. Przygotuj zbiorniki bioreaktora.
    1. Umyj szklane zbiorniki bioreaktora (element korpusu) i głowice bioreaktora ciepłymi, rozcieńczonymi roztworami płynu do mycia naczyń (np. 1% roztworem płynu do mycia naczyń w wodzie z kranu) i dokładnie spłucz wodą z kranu, a następnie ROH2O. Pozostaw elementy do całkowitego wyschnięcia.
    2. Nałóż niewielką objętość (~5 ml) odczynnika silikonowego na dno każdego zbiornika. Upewnij się, że odczynnik zwilży całą powierzchnię dna przez kilka sekund, a następnie spuść nadmiar płynu.
    3. Pozostawić zbiorniki do wyschnięcia w dygestorium w temperaturze RT O/N. Alternatywnie, zbiorniki można suszyć w piecu w temperaturze 100 °C przez 30 minut, aby przyspieszyć suszenie i zwiększyć trwałość powłoki, co ma na celu zapobieżenie przywieraniu komórek do dna szklanego zbiornika bioreaktora.
  2. Przygotuj elementy obwodu perfuzyjnego do sterylizacji (rysunek 1D).
    1. Wytnij następujące odcinki rurek (dla każdego bioreaktora):
      1. Wytnij dwie rurki z gumy silikonowej 1/16" ID o długości 25" (Rysunek 1D, h).
      2. Wytnij jedną rurkę pompy perystaltycznej o długości 8 cali (rysunek 1D, f).
      3. Wytnij jedną rurkę z gumy silikonowej 1/16" ID o długości 4,25 cala.
      4. Wytnij dwie długości 1" grubościennej rurki z gumy silikonowej 1/16" ID (Rysunek 1D, g).
      5. Wytnij jedną rurkę z gumy silikonowej o długości 2 cali o średnicy wewnętrznej 1/4 'ID x 0.5' (OD) (Rysunek 1D, e).
    2. Przygotuj następujące adaptery Luer (dla każdego bioreaktora):
      1. Przygotuj 10 męskich adapterów Luer lock do zadziorów 1/8' (Rysunek 1D, c)
      2. Przygotuj 2 męskie wtyki Luer (Rysunek 1D, a)
      3. Przygotuj 2 żeńskie nasadki Luer (Rysunek 1D, b)
      4. Przygotuj 5 żeńskich adapterów Luer x żeńskich Luer (x5; Rysunek 1D, d)
    3. Umyj wszystkie rurki i adaptery Luer ciepłymi, rozcieńczonymi roztworami płynu do mycia naczyń, dokładnie spłucz w wodzie z kranu, a następnie ROH2O i pozostaw do wyschnięcia.
  3. Zmontuj obwody perfuzyjne.
    1. Wsuń grubościenną rurkę z gumy silikonowej 1/16' ID o długości 1" na wlotowy akceptor Luer przymocowany do głowicy bioreaktora. Umieść męski zamek Luer na adapterze kolczastym 1/8" ID w otwartym końcu rurki. Powtórz tę czynność dla drugiego akceptora Luer na wlocie i podłącz żeńską nasadkę Luer w celu uszczelnienia portu (przeznaczonego do technik wysiewu moczowodu lub żył nieopisanych w niniejszym protokole).
    2. Podłącz każdy 25-calowy segment rurki z gumy silikonowej 1/16" ID do 8-calowego segmentu rurki pompy perystaltycznej za pomocą męskiego zamka Luer do kranka ID 1/8' i żeńskich adapterów Luer x żeńskich Luer (Rysunek 1D, j).
    3. Podłącz jeden otwarty koniec rurki z gumy silikonowej do wylotu perfuzatu mediów na zewnątrz głowicy bioreaktora. Podłącz rurkę ID 1/16" o długości 4.25 cala do przeciwnej (wewnętrznej) strony wylotu perfuzatu mediów po wewnętrznej stronie głowicy bioreaktora.
    4. Podłącz męski zamek Luer do adaptera kolczastego 1/8' ID do pozostałego otwartego końca rurki obwodu perfuzyjnego. Podłącz żeński adapter Luer x żeński Luer do męskiego zamka Luer. Podłącz żeński adapter Luer x żeński Luer do otwartego męskiego zamka Luer prowadzącego do wlotowego akceptora Luer w bioreaktorze. Będzie to służyć jako wlot perfuzatu mediów prowadzący bezpośrednio do cewnikowanej tętnicy nerkowej.
    5. Upewnij się, że żadne porty w pokrywie bioreaktora nie są otwarte ani odsłonięte. Szczelnie zamknij zawór podciśnieniowy na korpusie bioreaktora.
    6. Zamontuj głowicę bioreaktora na korpusie zbiornika, z pierścieniem uszczelniającym o przekroju okrągłym umieszczonym pomiędzy identycznymi rowkami wyściełającymi każdy element. Umieść metalowy zacisk nad interfejsem, aby utrzymać oba elementy razem.
    7. Zamontuj otwór odpowietrzający w głowicy bioreaktora z filtrem odpowietrzającym 0,2 mikrona, łącząc oba elementy za pomocą rurki z gumy silikonowej o długości 2 cali i średnicy wewnętrznej 1/4' x 0,5' średnicy zewnętrznej (rysunek 1D, e). Otwórz zawór odpowietrzający.
    8. Lekko poluzuj czerwoną nakrętkę na głowicy bioreaktora.
    9. Umieść pozostałe adaptery Luer i 6-calowe ząbkowane kleszczyki do próbek w autoklawowalnej torebce i zamknij.
  4. Autoklawować zmontowane bioreaktory i męskie wtyki Luer.
  5. Przygotuj następujące odczynniki do sterylizacji rusztowania i perfuzji pożywki przed wysiewem (objętości są podane na pozbawioną komórek nerkę):
    1. W dygestorium przygotuj 50 ml 0,1% roztworu kwasu nadoctowego, 4% roztworu etanolu, dodając 2,56 ml roztworu kwasu nadoctowego (stężenie podstawowe 39%) i 40 ml 200-procentowego etanolu do ~957 ml ROH2O w butelce o pojemności 1 l. Dokładnie wymieszaj, wielokrotnie odwracając butelkę i umieść w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
    2. Przygotować 150 ml 1x PBS roztworu, wstępnie wysterylizowanego w autoklawie.
    3. Przygotować 50 ml pożywki DMEM/F12 uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną-streptomycyną (Pen-Strep).
  6. Zbierz pozostałe elementy do montażu bioreaktora perfuzyjnego. Umieść wszystkie przedmioty w komorze bezpieczeństwa biologicznego. KRYTYCZNE: Upewnij się, że szafa bezpieczeństwa biologicznego jest wyposażona w działające gniazdka elektryczne do zasilania cyfrowego napędu pompy. Alternatywnie można użyć przedłużacza, aby podłączyć napęd pompy do zewnętrznych gniazdek elektrycznych na zewnątrz szafy.
    1. Zbierz pozbawione komórek nerki.
    2. Zebrać autoklawowane bioreaktory z dołączonymi obwodami perfuzyjnymi.
    3. Zebrać autoklawowaną torebkę zawierającą adaptery Luer i kleszcze.
    4. Zbierz cyfrowy napęd pompy z dołączoną 4-rolkową głowicą i dużymi wkładami pompy (1 na obwód perfuzyjny).
  7. Wykonać obwód perfuzyjny zgodnie z opisem na rysunku 1C w sterylnych warunkach w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
    1. Podłącz 3-drogowy kran odcinający (Rysunek 1D, i) między męskim zamkiem Luer a adapterem kolczastym ID 1/8' w pobliżu wlotu perfuzatu mediów a żeńskim adapterem Luer x żeńskim Luer. Pozostaw wszystkie trzy porty na kurku otwartym.
    2. Zdjąć czerwoną nakrętkę z głowicy bioreaktora i odpipetować 50 ml 0,1% roztworu kwasu nadoctowego i 4% etanolu do zbiornika pożywki przez otwór.
    3. Podłącz segment rurki pompy perystaltycznej do głowicy pompy za pomocą dużego wkładu pompy. Ustaw natężenie przepływu na 5 ml/min, naciśnij "Start" i pozwól obwodowi się zalać.
      1. Gdy ciecz wypełni linię perfuzyjną i dotrze do pozostałego otwartego portu trójdrogowego zaworu odcinającego, zatkaj port za pomocą męskiej wtyczki Luer (Rysunek 1D, a).
      2. Pozwól, aby obwód całkowicie się zalał, aż nie zaobserwuje się przepływu powietrza w rurce obwodu perfuzyjnego lub po wewnętrznej stronie wlotowego akceptora Luer. W razie potrzeby tymczasowo zwiększ natężenie przepływu, aby usunąć pęcherzyki z linii perfuzyjnej. Po całkowitym zalaniu zatrzymaj napęd pompy.
    4. Ostrożnie podłącz żeński koniec Luer cewnika tętnicy nerkowej do męskiego akceptora Luera na wewnętrznej powierzchni głowicy bioreaktora za pomocą wysterylizowanych 6-calowych kleszczy. Upewnij się, że połączenie jest szczelne i że w cewniku nie pozostało powietrze. Pozwól, aby nerka delikatnie zwisała z cewnika tętnicy nerkowej, aby tętnica nerkowa nie skręcała się ani nie załamywała.
    5. Dokręć metalowy zacisk łączący głowicę i korpus bioreaktora, tak aby zbiornik bioreaktora był szczelnie zamknięty. Zamknij czerwoną nakrętkę na głowicy bioreaktora.
  8. Sterylizować nerki w temperaturze pokojowej przez perfuzję 0,1% roztworem alkoholu nadoctowego, 4% roztworem etanolu w dawce 5 ml/min przez 1 godzinę, a następnie trzy sekwencyjne perfuzje w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej z 50 ml PBS w dawce 5 ml / min.
    1. Zmieniające się rozwiązania:
      1. Po 1 godzinie zatrzymaj pompę i otwórz czerwoną nakrętkę. Za pomocą sterylnej (autoklawowanej) pipety Pasteura ostrożnie odessać cały roztwór ze zbiornika bioreaktora. Pozostaw obwód perfuzyjny całkowicie zalany.
      2. Odpipetować pipetą 50 ml świeżego roztworu do zbiornika bioreaktora, zamknąć nakrętkę i uruchomić pompę.
  9. Po ostatnim płukaniu PBS odessać PBS ze zbiornika i odpipetować w 50 ml pożywki DMEM/F12 uzupełnionej 10% FBS i 1% Pen-Strep. Zamknąć nakrętkę i przenieść bioreaktor z dołączonym obwodem perfuzyjnym do inkubatora o dużej pojemności utrzymywanego w temperaturze 37 °C i 5%CO2.
  10. W razie potrzeby przenieś napęd pompy do inkubatora. Podłączyć obwód perfuzyjny bioreaktora do pompy i perfować nerki z prędkością 4 ml/min przez co najmniej 1 godzinę przed wysiewem.

3. Recelularyzacja nerek komórkami nabłonka kanalików korowych nerek

  1. Ciepłe wystarczające ilości DMEM/F12 (uzupełnione 10% FBS i 1% Pen-Strep) oraz enzym dysocjujący komórki do podniesienia komórek do 37 °C. Sugerowane objętości są wymienione poniżej:
    1. Przygotować 10 ml enzymu dysocjującego komórki i 10 ml DMEM/F12 na 175 cm2 kolbę hodowlaną do podnoszenia.
    2. Przygotuj 5-10 ml DMEM/F12 na nerkę do wysiewu.
  2. Zebrać wystarczającą liczbę kolb hodowlanych dla pożądanego stężenia wysiewu (4 x 10,7 unieśmiertelnionych ludzkich komórek RCTE18 na nerkę powoduje maksymalne wszczepienie komórek RCTE przy użyciu tej strategii wysiewu).
  3. Podnieś komórki z kolb za pomocą enzymu dysocjującego komórki. Odessać pożywkę z kolby, a następnie odpipetować 10 ml enzymu dysocjującego komórki do kolby. Umieścić kolbę w inkubatorze o temperaturze 37 °C w celu przyspieszenia dysocjacji.
  4. Sprawdzaj kolbę pod mikroskopem z kontrastem fazowym co 2 minuty, aż do momentu zaobserwowania pełnej dysocjacji komórek z powierzchni kolby. Uwaga: Czas inkubacji będzie się różnił w zależności od poziomu konfluencji komórek, ale komórki RCTE będą potrzebowały około 15 minut, aby w pełni się zdysocjować.
  5. Pobrać próbkę zdysocjowanej zawiesiny komórek do policzenia przed granulowaniem. Rozcieńczyć zawiesinę komórek równą objętością wstępnie podgrzanego podłoża DMEM/F12 i odwirować przy względnej sile odśrodkowej (RCF) 232 x g przez 5 minut.
  6. Policz komórki podczas wirowania. Rozcieńczyć otrzymaną próbkę równą objętością błękitu trypanowego i odpipetować po 10 μl na każdy koniec hemacytometru w celu zliczenia. Obliczyć niezbędną objętość rozcieńczenia osadu, aby uzyskać pożądane stężenie wysiewu (2 x 107 komórek/ml).
  7. Po odwirowaniu rozcieńczyć osad odpowiednią objętością pożywki hodowlanej, aby uzyskać końcowe stężenie 2 x 10 7 komórek/ml. Pobrać 2 ml zawiesiny do wysiewu do sterylnej strzykawki o pojemności 5 ml.
  8. Przenieść bioreaktor perfuzyjny do komory bezpieczeństwa biologicznego. Przekręć zawór odcinający, aby zamknąć przepływ do portu wysiewu. Wyjąć męską zatyczkę poślizgową Luer z zaworu odcinającego i podłączyć strzykawkę załadowaną zawiesiną wysiewu.
  9. Szybko przenieś obwód perfuzyjny z powrotem do inkubatora i użyj dużego wkładu pompy, aby przymocować segment rurki pompy perystaltycznej do głowicy pompy.
  10. Wysiew komórek: Zamknij port zaworu odcinającego skierowany w stronę pompy. Powoli wstrzykiwać zawiesinę komórkową do nerki, upewniając się, że cała zawiesina została przeniesiona ze strzykawki do zaworu odcinającego i przewodu perfuzyjnego. Przekręcić zawór odcinający, aby zamknąć przepływ ze strzykawki i uruchomić pompę z prędkością 25 ml/min przez 15 minut.
  11. Po 15 minutach zmniejszyć przepływ pompy do 4 ml/min. Wymienić pożywkę (objętość 100 ml na kolejne zmiany) następnego dnia, a następnie co dwa dni.

4. Ocena żywotności i proliferacji komórek za pomocą testu perfuzji resazuryny

  1. Przygotować odczynnik rezazurynowy. Rozpuścić 110,5 mg soli sodowej rezazuryny w 100 ml PBS podczas mieszania i rozcieńczyć w stosunku 1:10, dodając 5 ml otrzymanego roztworu do 45 ml świeżego PBS, aby utworzyć roztwór podstawowy rezazuryny o stężeniu 440 μM. Wysterylizować filtrem (przy użyciu filtra strzykawkowego 0,2 μm) i przechowywać roztwór podstawowy w chronionej przed światłem stożkowej probówce o pojemności 50 ml w temperaturze 4 °C.
  2. Przygotować kontrole pożywek uzupełnione resazuryną. Przygotować 10% roztwór odczynnika do resazuryny w pożywce hodowlanej (np. 5 ml roztworu podstawowego rezazuryny + 45 ml pożywki hodowlanej) w celu wytworzenia roztworu roboczego rezazuryny. Roztwór roboczy rezazuryny o objętości 10 ml należy umieścić w autoklawie w pojemniku zabezpieczonym przed światłem. Uwaga: Spowoduje to całkowite zredukowanie związku rezazuryny do rezorufiny i posłuży jako kontrola pozytywna do obliczenia procentowej redukcji resazuryny.
  3. Podwielokrotność po 1 ml roztworu roboczego resazuryny (utlenionej), autoklawowanego roztworu roboczego rezazuryny (zredukowanej) i samej pożywki hodowlanej (ślepa próba) do oddzielnych probówek zbiorczych o pojemności 1,5 ml. Umieść otwarte probówki w tym samym inkubatorze, co bioreaktory perfuzyjne.
  4. Przenieść obwód perfuzji nerek z inkubatora do komory bezpieczeństwa biologicznego. Zdejmij nakrętkę z głowicy bioreaktora i odessaj pożywkę hodowlaną ze zbiornika bioreaktora za pomocą pipety Pasteura.
  5. Pobrać pipetą 10 ml roztworu roboczego resazuryny do zbiornika, zamknąć nakrętkę i przenieść obwód perfuzji nerek z powrotem do inkubatora.
  6. Uruchomić pompę z prędkością 4 ml/min i pozwolić odczynnikowi przenikać przez nerki dokładnie przez 1 godzinę.
  7. Po 1 godzinie zatrzymaj pompę i przenieś obwód perfuzji nerek do szafy bezpieczeństwa biologicznego.
  8. Zebrać kondycjonowany (częściowo zredukowany) roztwór rezazuryny i dodać 100 ml pożywki hodowlanej do zbiornika bioreaktora. Przenieść obwód perfuzyjny do inkubatora i wznowić przepływ (4 ml/min).
  9. Odpipetować 100 μl (x 3 powtórzenia) kondycjonowanego roztworu rezazuryny, roztworu roboczego rezazuryny, autoklawizowanego roztworu roboczego i ślepej próby pożywki hodowlanej na czarną (nieprzezroczystą) 96-dołkową płytkę testową. Odczyt intensywności fluorescencji (wzbudzenie: 540/35; emisja: 590/20) za pomocą spektrofotometru.
  10. Obliczać procentową redukcję jako stosunek intensywności fluorescencji znormalizowanej przez intensywność fluorescencji (FI) generowaną przez utlenione podłoże rezazuryny (ORM lub roztwór roboczy resazuryny nienarażony na działanie komórek) lub zredukowane podłoże rezazurynowe (RRM lub autoklawowany roztwór roboczy): % redukcji = 100 x {[FI(FI(kondycjonowany roztwór resazuryny) - FI(ORM)] / [FI(RRM) - FI(ORM)]}. Aby znormalizować wyniki, pomnóż % redukcji przez objętość krążącą (10 ml) i podziel przez czas inkubacji (1 godzina).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nerki sekwencyjnie perfundowane wodą i rozcieńczonymi roztworami detergentów (1% Triton X-100, 0,1% SDS) zgodnie z wcześniej ustalonym, optymalnym protokołem decelularyzacji (patrz Rysunek 1A, B)7, stają się stopniowo bardziej przezroczyste w ciągu 26 godzin, jak pokazano na rysunku 2A. Powstałe w ten sposób bezkomórkowe rusztowanie nerkowe jest pozbawione komórek i zachowuje spójny nerkowy ECM wspierany przez nienaruszoną torebkę nerkową, która nie jest uszkodzona zgodnie z p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany protokół decelularyzacji konsekwentnie wytwarza całkowicie bezkomórkowy ECM nerki, który służy jako szablon 3D do hodowli ludzkich komórek nabłonka kanalików korowych nerek (zarówno proksymalnych, jak i dystalnych pochodzących z kanalików), oprócz komórek śródbłonka naczyń7,17. Kaniulowane unaczynienie nerek służy jako kluczowa cecha zapewniająca równomierne dostarczanie odczynników i komórek przez rusztowanie w konfiguracji bioreaktora, umożliwiając w ten sposób decelularyzację perfuzyjną, wysiewanie ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują za wsparcie Fundacji Rodziny Zell. Doceniamy wsparcie ze strony Northwestern Memorial Foundation Dixon Translational Research Grants Initiative, American Society of Transplant Surgeon's Faculty Development Grant oraz Research Grant for the Young Investigator z National Kidney Foundation of Illinois. Dziękujemy za wsparcie ze strony Fundacji Roberta R. McCormicka. Prace te były również wspierane przez NIDDK K08 DK10175 J.A.W. Rdzenie obrazowania i histologii wykorzystane w tych badaniach są wspierane przez Laboratorium Histologii i Fenotypowania Myszy, Centrum Oprzyrządowania Sondy Elektronowej (EPIC) i Simpson Querrey Institute Equipment Core na Uniwersytecie Northwestern oraz Grant Wsparcia Centrum Onkologii (NCI CA060553). Autorzy chcieliby podziękować Northwestern University Microsurgery Core do pobierania nerek gryzoni. Ocena morfologii nabłonka kanalików nerkowych po recelularyzacji przeprowadzona w Fluorescence Microscopy Shared Resource wspieranym przez P30 CA118100.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynniki
TRITON X-100, klasa proteomiczna, AMRESCOVWRM143-4L
Roztwór dodecylosiarczanu sodu, BioUltra, do biologii molekularnej, 20% w H2OSigma-Aldrich05030
Roztwór kwasu nadoctowego, purum, ~ 39% w kwasie octowym (RT)Sigma-Aldrich77240Nadoctowy jest łatwopalny i. Przygotować pod wyciągiem przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej (np. rękawic, okularów).
200-procentowy etanolVWRV1001TP
Sigmacote, odczynnik silikonowy do szkła i innych powierzchniSigma-AldrichSL2Do uzdatniania zbiorników bioreaktorów. Określany w tekście jako odczynnik silikonowy.
DMEM/F12 mediaLife Technologies11320-033
Corning cellgro Płodowa surowica bydlęca Premium, MediatechCorning35-010-CV
Roztwór penicyliny-streptomycyny, 100X 10 000 I.U. Penicylina 10 000 i mikro; g/ml StreptomycynaCorning30-002-CI
TrypLE Express (1X), Phenol RedLife Technologies12605-028Określany w tekście jako enzym dysocjujący komórki.
Niebieska plama trypanowa (0,4%)Life Technologies15250-061
Sól sodowa rezazurynySigma-AldrichR7017
Sprzęt:
Napęd cyfrowy Masterflex L/S, 600 obr./min, 115/230 VACCole-ParmerEW-07522-20
Masterflex L/S duże wkłady do głowic pomp 07519-05 i -06.Cole-ParmerEW-07519-70Określany w tekście jako duży wkład pompy.
8-kanałowa, 4-rolkowa głowica pompy nabojowej Masterflex L/S.Cole-ParmerEW-07519-06
Proste 6-calowe kleszczyki do próbek, ząbkowaneVWR82027-438
* Bioreaktor perfuzyjnynerek WilMad Labglass* Projekty niestandardoweBioreaktory są produkowane zgodnie z opisem WilMad Labglass. Projekty zostały szczegółowo opisane w poprzedniej publikacji.
obwodu perfuzyjnego
24 G x 0,75 cala Osłonięty cewnik dożylny BD Insyte Autoguard (0,7 mm x 19 mm) wykonany z biomateriału BD Vialon Posiada igłę z karbem. (50/os., 200/ca)BD Biosciences381412Określany w tekście jako cewnik o rozmiarze 24.
Rurka Masterflex PharMed BPT, L/S #14, 25'Cole-ParmerHV-06508-14Określana w tekście jako rurka do pompy perystaltycznej.
Rurka silikonowa utwardzana nadtlenkiem, 1/16" ID X 1/8" OD, 25 stóp/opakowanieCole-ParmerHV-06411-62Określane w tekście jako rurka z gumy silikonowej 1/16" ID.
Rurka silikonowa utwardzana platyną Masterflex, L/S 14, 25 ft.Cole-ParmerHV-96410-14Określany w tekście jako grubościenna rurka z gumy silikonowej 1/16" ID.
Rurka silikonowa VWR, 1/4" ID x 0,5" ODVWR89068-484
Acro 50 Filtry odpowietrzające, Pall Life SciencesVWR28143-558Określana w tekście jako filtr odpowietrzający 0,2 mikrona.
Cole-Parmer Luer Adapters, męski Luer Lock do 1/8" ID, nylon, 25/pkCole-ParmerT-45505-11Określany w tekście jako męski Luer lock do adaptera kolczastego 1/8".
Cole-Parmer Luer Akcesorium, męska wtyczka Luer, nylon, 25/pkCole-ParmerEW-45505-58
żeński adapter luer x żeński, nylon, 25/pkCole-ParmerEW-45502-22Określany w tekście jako żeński adapter Luer x żeński Luer.
Cole-Parmer Luer Accessory, żeńska nasadka Luer, nylon, 25/pkCole-ParmerEW-45502-28
Kranki odcinające Hi-Flo Smiths Medical o dużym otworze # MX4311L - 3-drożny kran Hi-Flo z przedłużoną męską blokadą Luer Lock, formuła bez DEHP, bez lateksu (LF), Odporny na lipidy, Bez PVD, 50/csCareforde Healthcare10254821Smiths Medical (dostawca) to #MX4311L.
Pozostałe składniki
Jednorazowa strzykawka 5 ml BD Luer-Lok z końcówką BD Luer-Lok&trade.BD Biosciences309646
35 mm x 10 mm Easy Grip Culture DishBD Biosciences353001Służy do pobierania zawiesiny komórkowej do strzykawki w celu wysiewu komórek.
Elementy Numer katalogowy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Uzarski, J. S., Xia, Y., Belmonte, J. C., Wertheim, J. A. New strategies in kidney regeneration and tissue engineering. Current opinion in nephrology and hypertension. 23, 399-405 (2014).
  2. Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand. J Clin Invest. 122, 3817-3823 (2012).
  3. Badylak, S. F. Decellularized allogeneic and xenogeneic tissue as a bioscaffold for regenerative medicine: factors that influence the host response. Ann Biomed Eng. 42, 1517-1527 (2014).
  4. Miner, J. H. Renal basement membrane components. Kidney Int. 56, 2016-2024 (1999).
  5. Nichol, J. W., Khademhosseini, A. Modular Tissue Engineering: Engineering Biological Tissues from the Bottom Up. Soft matter. 5, 1312-1319 (2009).
  6. Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14, 213-221 (2008).
  7. Caralt, M., et al. Optimization and critical evaluation of decellularization strategies to develop renal extracellular matrix scaffolds as biological templates for organ engineering and transplantation. American Journal of Transplantation. 15, 64-75 (2015).
  8. Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu Rev Biomed Eng. 13, 27-53 (2011).
  9. Orlando, G., et al. Discarded human kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration technologies. Biomaterials. 34, 5915-5925 (2013).
  10. Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33, 7756-7764 (2012).
  11. Vishwakarma, S. K., et al. Preparation of natural three-dimensional goat kidney scaffold for the development of bioartificial organ. Indian journal of nephrology. 24, 372-375 (2014).
  12. Ross, E. A., et al. Embryonic stem cells proliferate and differentiate when seeded into kidney scaffolds. J Am Soc Nephrol. 20, 2338-2347 (2009).
  13. Song, J. J., et al. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nat Med. 19, 646-651 (2013).
  14. Bonandrini, B., et al. Recellularization of well-preserved acellular kidney scaffold using embryonic stem cells. Tissue Eng Part A. 20, 1486-1498 (2014).
  15. Burgkart, R., et al. Decellularized kidney matrix for perfused bone engineering. Tissue Eng Part C Methods.2. 20, 553-561 (2014).
  16. Ross, E. A., et al. Mouse stem cells seeded into decellularized rat kidney scaffolds endothelialize and remodel basement membranes. Organogenesis. 8, 49-55 (2012).
  17. Uzarski, J. S., et al. Dual-purpose bioreactors to monitor non-invasive physical and biochemical markers of kidney and liver scaffold recellularization. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
  18. Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. European journal of biochemistry / FEBS. 267, 5421-5426 (2000).
  19. Loghman-Adham, M., Nauli, S. M., Soto, C. E., Kariuki, B., Zhou, J. Immortalized epithelial cells from human autosomal dominant polycystic kidney cysts. American journal of physiology. Renal physiology. 285, F397-F412 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Sprostowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development
Posted by JoVE Editors on 3/03/2017. Citeable Link.

An erratum was issued for Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development.

The human RCTEC/RCTE cell stocks used here and in Caralt et al., 2015, Uzarski et al., 2015 were originally provided by Dr. Loghman-Adham (then at St. Louis University) to co-author Dr. Wandinger-Ness (University of New Mexico) through an MTA in 2001. The SV40 immortalized human RCTEC/RCTE cells were characterized as being of distal tubule cell line as detailed in Loghman-Adham et al., 2003. On the basis of recent short tandem repeat (STR) DNA sequencing (Performed by IDEXX BioResearch) of the earliest passages of the RCTEC/RCTE cell stocks it became evident the cells were of mixed lineage. Further analyses of PCR products using QIAxcel capillary electrophoresis demonstrated the presence of a canine product. The product was sequenced and established to be of canine origin. A set of canine specific STR markers were compared to the sample and showed that the sample had a genetic profile with 92% identity to the MDCK cell line.  Later cell stocks that were used in the present publication were STR profiled and showed drift to 100% MDCK lineage. Despite being of canine origin, rather than human as was previously thought, MDCK is similarly a distal tubule epithelial cell line. For this reason, previous interpretation and conclusions drawn using these cells here and in Caralt et al., 2015, Uzarski et al., 2015 remain sound, but for purposes of rigor, reproducibility and experimental validation by others we report on this misidentification. This information will also be reported for listing on the International Cell Line Authentication Committee (ICLAC) database (http://iclac.org).

Tagi

Zewn trzkom rkowa macierz nerekprotok decelularyzacjibioreaktor perfuzyjnyzasiew kom rek nab onkowychrusztowanie nerki gryzonialudzkie kom rki nerkoweproces sterylizacjiocena metabolicznahodowla tubulogenezyrecelularyzacja rusztowania

Powiązane artykuły