Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wielokrotne pobieranie krwi do badań krwi u dorosłych danio pręgowanego

37.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53272

⸱

30 sierpnia 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Translational Medical Science, Graduate School of Medicine, Mie University, 2Department of Molecular and Cellular Pharmacology, Pharmacogenomics, and Pharmacoinformatics, Graduate School of Medicine, Mie University

W tym artykule

Podsumowanie

Wielokrotne pobieranie próbek krwi jest konieczne i ważne w badaniach na zwierzętach. Opracowaliśmy nową, nieśmiertelną i niezawodną metodę wielokrotnego pobierania krwi od dorosłych ryb danio pręgowanego i zastosowaliśmy tę metodę do badania biochemii krwi, w tym metabolizmu glukozy.

Streszczenie

Wielokrotne pobieranie krwi jest jedną z najczęstszych technik wykonywanych na zwierzętach laboratoryjnych. Nie ustalono jednak nieśmiertelnego protokołu pobierania krwi od danio pręgowanego. Dotychczasowe metody pobierania krwi od danio pręgowanego są śmiertelne, takie jak boczne nacięcie, dekapitacja i ablacja ogona. W związku z tym opracowaliśmy nowatorską metodę "powtarzalnego" pobierania krwi i przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół opisujący tę procedurę. Metoda ta jest minimalnie inwazyjna i skutkuje bardzo niską śmiertelnością (2,3%) u danio pręgowanego, umożliwiając w ten sposób wielokrotne pobieranie próbek krwi od tego samego osobnika. Maksymalna objętość próbki krwi zależy od masy ciała ryby. Objętość do wielokrotnego pobierania krwi w odstępach czasu powinna wynosić ≤0,4% masy ciała co tydzień lub ≤1% co 2 tygodnie, które oceniano za pomocą pomiarów hemoglobiny we krwi. Dodatkowo mierzono hemoglobinę, poziom glukozy we krwi na czczo, triacyloglicerol (TG) w osoczu oraz poziom cholesterolu całkowitego u samców i samic dorosłego danio pręgowanego. Zastosowaliśmy tę metodę również do zbadania rozregulowania metabolizmu glukozy w otyłości wywołanej dietą. Ta metoda pobierania krwi pozwoli na wiele zastosowań, w tym metabolizm glukozy i lipidów oraz badania hematologiczne, które zwiększą wykorzystanie danio pręgowanego jako organizmu modelowego choroby człowieka.

Wprowadzenie

Danio pręgowany zyskuje coraz większą popularność jako cenny model chorób ludzkich, ponieważ ich organy i genetyka są podobne do ludzkich1,2. W dziedzinie biologii rozwoju wiele badań wykazało, że danio pręgowany i człowiek wykazują wyraźne podobieństwo w hematopoezie3, hemostazie4,5 i mielopoezie6. Dorosłe rybo pręgowane są również wykorzystywane do badania chorób immunologicznych7, neurodegeneracyjnych8 i związanych z otyłością9 , ponieważ ten organizm modelowy ma wspólne szlaki z tymi, które są zaburzone w chorobach ludzkich. W przypadku otyłości i chorób związanych z otyłością (cukrzyca, stłuszczenie wątroby i niealkoholowe stłuszczeniowe zapalenie wątroby i miażdżyca), poziomy glukozy i lipidów we krwi danio pręgowanego zostały dokładnie zbadane w kilku transgenicznych i indukowanych dietą modelach otyłości10-13.

Wielokrotne pobieranie próbek krwi od poszczególnych zwierząt zmniejszy wykorzystanie zwierząt i zmniejszy różnice międzyosobnicze. Jednak wielokrotne pobieranie próbek jest technicznie trudne w przypadku małych zwierząt, takich jak danio pręgowany, ze względu na ich stosunkowo małą objętość krwi i brak łatwo dostępnych naczyń. Opracowano kilka metod jednorazowego pobierania krwi od danio pręgowanego, chociaż metody te mają swoje wady, w tym śmiertelność, związane z tym uszkodzenie tkanek i ograniczoną objętość krwi. Na przykład 1–5 μl krwi można pobrać z bocznego nacięcia o długości około 0,3 cm w okolicy aortygrzbietowej 5. Ścięcie głowy nożyczkami poprzez przecięcie obręczy piersiowej może zebrać 5–10 μl krwi10. Inną wygodną metodą pobierania krwi jest ablacja ogona14. Nakłucie serca jest jedną z potencjalnych alternatywnych metod wielokrotnego pobierania krwi od tej samej ryby, ale bardzo mała ilość uzyskana (około 50 nl) dzięki tej procedurze ogranicza liczbę analiz, któremożna wykonać11. W związku z tym potrzebny jest nowy protokół, aby umożliwić wielokrotne pobieranie próbek krwi bez użycia środków do celów śmiertelnych, co byłoby krytycznym postępem niezbędnym do tego, aby organizm ten stał się standardowym organizmem modelowym dla chorób ludzkich. Technika ta pozwoliłaby na badanie odpowiedzi farmakologicznej, odkrycie biomarkerów molekularnych do diagnozy, określenie rokowania i monitorowanie różnych chorób, takich jak choroby metaboliczne, choroby zwyrodnieniowe i kilka rodzajów nowotworów złośliwych.

Dlatego opracowaliśmy minimalnie inwazyjną metodę pozyskiwania krwi od danio pręgowanegoseryjnie 15. Tutaj demonstrujemy procedurę wizualnie i przedstawiamy szczegółowy protokół dla tej techniki. Za pomocą tej metody oceniono normalną wartość opartą na różnych parametrach, w tym hemoglobinie, glukozie we krwi na czczo i lipidach we krwi zdrowych dorosłych danio pręgowanego. Dodatkowo oceniliśmy również, czy ta metoda jest odpowiednia dla badań, które wymagają seryjnych próbek, monitorując czasowe zmiany poziomu glukozy we krwi podczas eksperymentów z przekarmieniem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Uniwersytetu Mie i zostały przeprowadzone zgodnie z japońską ustawą o dobrostanie zwierząt 'Ustawa o dobrostanie i zarządzaniu zwierzętami' (Ministerstwo Środowiska Japonii) i były zgodne z międzynarodowymi wytycznymi.

1. Przygotowanie igły

UWAGA: Wszystkie eksperymenty były przeprowadzane pod narkozą, a wszelkie wysiłki zostały podjęte, aby zminimalizować cierpienie. W celu eutanazji ryby zanurzono w kąpieli lodowo-wodnej (5 części lodu / 1 część wody o temperaturze ≤4 °C) na ≥20 min.

  1. Przygotuj szklane igły do mikrokapilarnej, pociągając szklaną kapilę o średnicy zewnętrznej 1.0 mm za pomocą ściągacza do igieł (Rysunek 1A).
  2. Odetnij końcówki igieł ukośnie za pomocą cienkich nożyczek (Rysunek 1B). Idealna średnica końcówki powinna wynosić około 100 – 200 μm (rysunek 1C). Jeśli średnica końcówki jest zbyt wąska, krew nie dostanie się do igły.
  3. Rozpuścić heparynę w roztworze soli fizjologicznej do stężenia 5 mg/ml.
  4. Umieść wstępnie wyciętą igłę w końcówce końcówki nosa zespołu rurki aspiratora i przytrzymaj ustnik w ustach lub podłącz igłę do dozownika z żarówką. Zanurzyć końcówkę igły w roztworze heparyny i heparynizować igłę, odsysając i przedmuchując roztwór (Rysunek 1D i 1E).
    Uwaga: Zespół rurki aspiratora został użyty do kriokonserwacji nasienia danio pręgowanego16. Długa gumowa rurka może zatrzymać krew wpadającą do ust. Ustawienie filtra w połowie rurki może uniknąć zagrożeń.
  5. Przechowuj heparynizowane igły na 10-centymetrowej szalce Petriego i susz na powietrzu przez co najmniej 1 godzinę. Można wcześniej przygotować dużą liczbę igieł.

2. Znieczulenie

  1. Przygotuj roztwór znieczulający w małym plastikowym pojemniku, mieszając 200 ml wody dla ryb ze 100 μl 2-fenoksyetanolu (2-PE). Końcowe stężenie środków znieczulających wynosi 500 ppm.
    OSTROŻNOŚĆ! 2-PE daje szybki efekt.
  2. Usuń żądaną liczbę ryb (szczep AB) z systemu krążenia.
  3. Użyj siatki, aby przenieść rybę do środka znieczulającego na 1 – 2 minuty (ryc. 1F). Obserwuj, jak ryby stopniowo pływają, rozkładają płetwy piersiowe poziomo, łapią oddech i wykonują szybkie ruchy wieczko w ciągu 1 minuty.
  4. W miarę upływu czasu obserwuj, jak ryba leży na dnie obudowy i w końcu przestań pływać. Chirurgiczna płaszczyzna znieczulenia osiągnie, gdy ryba przestanie sapać, a ruchy wieczka będą powolne. W tym momencie ryba jest gotowa do pobrania krwi.
  5. Za pomocą skimmera wyjmij znieczuloną rybę z 2-PE i delikatnie połóż ją na ręczniku papierowym nasączonym środkami znieczulającymi (ryc. 1G). Przykryj głowę ryby miękką bibułą, również nasączoną roztworem 2-PE, aby zapobiec wysuszeniu oczu, a następnie użyj innej suchej miękkiej bibuły, aby delikatnie osuszyć powierzchnię ciała.

3. Pobieranie krwi

  1. Umieść igłę z heparyną w końcówce końcówki nosa zespołu rurki aspiratora (lub dozownika żarówki) i przytrzymaj końcówkę ustnika zespołu rurki aspiratora w ustach.
  2. Chwyć koniec końcówki nosa i igłę razem i ostrożnie usuń przeszkadzające łuski za pomocą końcówki igły. Wbić igłę pod kątem 30 – 45° do miejsca pobrania krwi. Unikaj nakłucia przewodu pokarmowego (ryc. 1H). W przypadku korzystania z dozownika do żarówek, naciśnij żarówkę kciukiem i środkowym palcem, a następnie zablokuj otwór na końcu żarówki pierwszym palcem, a następnie włóż igłę zgodnie z powyższym opisem.
    Uwaga: Miejsce pobrania krwi znajduje się wzdłuż osi ciała i za odbytem w okolicy aorty grzbietowej. Aorta grzbietowa (DA) i tylna żyła kardynalna (PCV) są tylko brzuszne w stosunku do kręgosłupa (ryc. 2).
  3. Zacznij ssać końcówkę ustnika zespołu rurki aspiracyjnej, gdy igła będzie dotykać kręgosłupa. Jeśli krew nie podnosi się, delikatnie przesuń końcówkę igły ręką, aby pobudzić przepływ krwi. Należy pamiętać, że gdy krew zacznie napływać do igły, natychmiast przestań potrząsać i delikatnie ssać (ryc. 1I). W przypadku korzystania z dozownika gruszki należy zwolnić ciśnienie gruszki, aby zassać krew.
  4. Obserwuj, że krew będzie powoli podnosić się do igły w sposób pulsacyjny bez ssania, co jest prawdopodobnie spowodowane ciśnieniem tętniczym krwi. W związku z tym nie jest konieczne ssanie, jeśli igła prawidłowo penetruje tętnicę.
  5. Przerwać ssanie po pobraniu odpowiedniej objętości krwi. Wyjmij igłę z ryby i uciskaj miejsce wkłucia miękką bibułą, aby zatrzymać krwawienie. Obserwuj zatrzymanie krwawienia po około 10 – 20 sekundach ucisku palca (Rysunek 1J).
  6. Po ustąpieniu krwawienia natychmiast przenieść rybę z powrotem do zbiornika z czystą ciepłą wodą (~ 28 °C). Pomóż rybie zregenerować się, delikatnie obracając wodę w kierunku skrzeli, aż zacznie pływać.
    Uwaga: Trzymaj do 5 ryb po pobraniu próbek w zbiorniku o pojemności 2 litrów i podłącz zbiornik do systemu cyrkulacyjnego w celu natlenienia ryb. Dodawanie antybiotyków do wody dla ryb nie jest konieczne. Utrzymuj ryby w normalnym trzymaniu i karmieniu.
  7. Wydalić krew z igły na czysty obszar kawałka parafilmu (ryc. 1K).
  8. Zmierz poziom glukozy we krwi za pomocą dowolnego komercyjnego glukometru ręcznego (Rysunek 1L).
    Uwaga: Glukometr wykorzystuje elektrodę dinukleotydową dehydrogenazy glukozowo-flawinoadeninowej i wymaga objętości próbki 0,6 μl.
    1. Włóż pasek testowy całkowicie do glukometru i bezpośrednio dotknij kropli krwi. Obserwuj, jak krew jest automatycznie pobierana do paska testowego i uzyskaj wynik stężenia glukozy we krwi po 5 sekundach na wyświetlaczu. Zapisz wynik i wyrzuć pasek testowy. Do każdego pomiaru używaj nowego paska testowego.
  9. (krok opcjonalny) Pobrać dokładne ilości krwi za pomocą pipetowania i przenieść krew do probówki mikrowirówkowej w celu dalszych analiz (hemoglobina, triacyloglicerol (TG), cholesterol całkowity itp.). W razie potrzeby rozcieńczyć pełną krew jednej ryby solą fizjologiczną. Odwirować próbki krwi przez 3 minuty przy 680 x g w temperaturze pokojowej i zebrać osocze. Przenieś osocze do nowej probówki. W tym momencie jest gotowy do wykorzystania w analizach biochemicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ta metoda pobierania krwi powoduje minimalny uraz u zebrafish (nakłucie o rozmiarze <1 mm; Rysunek 1J) i skutkuje bardzo niską śmiertelnością na poziomie 2,3%. Zbadaliśmy maksymalną objętość krwi, jaką można pobrać od jednej ryby, i oceniliśmy zależność od jej masy ciała (Rysunek 3). Stwierdzono, że maksymalna pobrana objętość krwi była liniowo skorelowana z masą ciała (R = 0,813). Największa objętość krwi pobrana od pojedynczej ryby (masa ciała = 1,071 g) wyniosła 25 µl, a najmniejsz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół seryjnego pozyskiwania krwi od dorosłego danio pręgowanego. Ta metoda jest prosta do przeprowadzenia i używamy jej na co dzień w laboratorium. Ta metoda pobierania krwi opiera się na wprowadzeniu szklanej igły kapilarnej do aorty grzbietowej danio pręgowanego. Podczas tej procedury bardzo ważne jest, aby nie dokonać ablacji kręgosłupa, ponieważ jest to kryterium poszukiwania aorty grzbietowej. Zmniejszenie urazu kręgosłupa poprawi wskaźnik przeżycia. Chociaż ta technika jest prost...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez JSPS KAKENHI Grant Number 25860294 i 25590073. Chcielibyśmy podziękować Pani Yui Namie za ręcznie narysowaną ilustrację oraz Panu Koshi Kataoka i Pani Sayuri Ichikawa za pomoc w utrzymaniu danio pręgowanego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kapilary szklane z żarnikiemNarishigeGD-1o średnicy zewnętrznej 1,0 mm.
Ściągacz do igiełNarishigePC-10Do produkcji igieł
HeparynaWako Pure Chemical Industries081-00136Do heparynizacji
Zespół rurki aspiratoraDrummond2-040-000Do pobierania krwi
Dozownik żarówekDrummond1-000-9000Do pobierania krwi
2-fenoksyetanolWako Pure Chemical Industries163-12075Do znieczulania ryb
DRI-CHEM3500VFujifilm-Dopomiaru hemoglobiny
Slajdy DRI-CHEMFujifilmHb-WIIDo pomiaru hemoglobiny
Glutest Neo SuperSanwa Kagaku Kenkyusho-Dopomiaru stężenia glukozy w organizmie
Wako L-type TGkit Wako Pure Chemical Industries464-44201Dla TG pomiar
Zestaw CHO typu LWako Wako Pure Chemical Industries460-44301Do pomiaru cholesterolu całkowitego
Parafilm MAlcan PackagingPM996Aby usunąć krew z

Bibliografia

  1. Lieschke, G., Currie, P. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
  2. Penberthy, W. T., Shafizadeh, E., Lin, S. The zebrafish as a model for human disease. Front Biosci. 7, d1439-d1453 (2002).
  3. Stachura, D. L., Traver, D. Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis. Methods Cell Biol. 101, 75-110 (2011).
  4. Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P. Analysis of blood coagulation in the zebrafish. Blood Cells Mol Dis. 25 (3-4), 239-249 (1999).
  5. Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P., Craig, F. E., Troyer, D. Identification and characterization of zebrafish thrombocytes. Br J Haematol. 107 (4), 731-738 (1999).
  6. Lieschke, G. J., Oates, A. C., Crowhurst, M. O., Ward, A. C., Layton, J. E. Morphologic and functional characterization of granulocytes and macrophages in embryonic and adult. Blood. 98 (10), 3087-3096 (2001).
  7. Iwanami, N. Zebrafish as a model for understanding the evolution of the vertebrate immune system and human primary immunodeficiency. Exp Hematol. 42 (8), 697-706 (2014).
  8. Babin, P. J., Goizet, C., Raldua, D. Zebrafish models of human motor neuron diseases: advantages and limitations. Prog Neurobiol. 118, 36-58 (2014).
  9. Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Dis Mod Mech. 6 (5), 1080-1088 (2013).
  10. Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E., Kinkel, M. D. Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostasis. Zebrafish. 7 (2), 205-213 (2010).
  11. Moss, J. B., et al. Regeneration of the pancreas in adult zebrafish. Diabetes. 58 (8), 1844-1851 (2009).
  12. Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC Physiol. 10 (21), (2010).
  13. Chu, C. Y., et al. Overexpression of Akt1 enhances adipogenesis and leads to lipoma formation in zebrafish. PLoS One. 7 (5), e36474(2012).
  14. Velasco-Santamaría, Y. M., Korsgaard, B., Madsen, S. S., Bjerregaard, P. Bezafibrate, a lipid-lowering pharmaceutical, as a potential endocrine disruptor in male zebrafish (Danio rerio). Aquat Toxicol. 105 (1-2), 107-118 (2011).
  15. Zang, L., Shimada, Y., Nishimura, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. A novel, reliable method for repeated blood collection from aquarium fish. Zebrafish. 10 (3), 425-432 (2013).
  16. Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. Cryopreservation and in vitro fertilization at the zebrafish international resource center. Methods Mol Biol. 546, 45-65 (2009).
  17. Thorson, T. B. The partitioning of body water in Osteichthyes: phylogenetic and ecological implications in aquatic vertebrates. Biol Bull-US. 120, 238-254 (1961).
  18. Conte, F. P., Wagner, H. H., Harris, T. O. Measurement of blood volume in the fish (Salmo gairdneri gairdneri). Am J Physiol. 205, 533-540 (1963).
  19. Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. J Appl Toxicol. 21 (1), 15-23 (2001).
  20. Nahas, K., Provost, J. -P., Baneux, P. H., Rabemampianina, Y. Effects of acute blood removal via the sublingual vein on haematological and clinical parameters in Sprague-Dawley rats. Lab Anim. 34 (4), 362-371 (2000).
  21. Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. DevDyn. 236 (4), 1025-1035 (2007).
  22. Andersson, O., et al. Adenosine signaling promotes regeneration of pancreatic beta cells in vivo. Cell Metab. 15 (6), 885-894 (2012).
  23. Hiramitsu, M., et al. Eriocitrin ameliorates diet-induced hepatic steatosis with activation of mitochondrial biogenesis. Sci Rep-UK. 4, 3708(2014).
  24. Zang, L., Shimada, Y., Kawajiri, J., Tanaka, T., Nishimura, N. Effects of Yuzu (Citrus junos Siebold ex Tanaka) peel on the diet-induced obesity in a zebrafish model. J Funct Foods. 10, 499-510 (2014).
  25. Schlegel, A. Studying non-alcoholic fatty liver disease with zebrafish: a confluence of optics, genetics, and physiology. Cell Mol Life Sci. 69 (23), 3953-3961 (2012).
  26. Stoletov, K., et al. Vascular lipid accumulation, lipoprotein oxidation, and macrophage lipid uptake in hypercholesterolemic zebrafish. Circ Res. 104 (8), 952-960 (2009).
  27. Thomas, C. D., et al. Nutrient balance and energy expenditure during ad libitum feeding of high-fat and high-carbohydrate diets in humans. Am J Clin Nutr. 55 (5), 934-942 (1992).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Pobieranie krwi z rybek zebrafishprotokół pobierania krwiszklane kapilaryigły heparynowanetechnika małoinwazyjnawielokrotne pobieranie krwipomiar hemoglobinyanaliza poziomu glukozymetabolizm lipidówotyłość indukowana dietą
Wielokrotne pobieranie krwi do badań krwi u dorosłych danio pręgowanego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.