Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Stabilna i wydajna modyfikacja genetyczna komórek dorosłej myszy V-SVZ do analizy autonomicznych i nieautonomicznych efektów neuronalnych komórek macierzystych

9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53282

⸱

17 lutego 2016

 ,  ,  , 
1Cell Division and Cancer Group, Spanish National Cancer Research Centre (CNIO), 2Centro de Investigaciones Biomédicas en Red sobre Enfermedades Neurodegenerativas (CIBERNED), 3Departmento de Biologìa Celular, Universidad de Valencia, 4Institut de Biomedicina de la Universitat de Barcelona (IBUB), 5Department of Molecular and Translational Medicine, Fibroblast Reprogramming Unit, University of Brescia

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy procedurę opartą na wykorzystaniu cząsteczek lentiwirusowych do długoterminowej modyfikacji genetycznej nerwowych komórek macierzystych i/lub ich sąsiadujących komórek wyściółkowych w dorosłej komorowo-podkomorowej niszy neurogennej, która pozwala na oddzielną analizę autonomicznych i nieautonomicznych, zależnych od niszy efektów na neuronalne komórki macierzyste.

Streszczenie

Względnie spokojne somatyczne komórki macierzyste wspierają dożywotnią odnowę komórkową w większości dorosłych tkanek. Nerwowe komórki macierzyste w mózgu dorosłego ssaka są ograniczone do dwóch specyficznych nisz neurogennych: strefy podziarnistej zakrętu zębatego w hipokampie i strefy komorowo-podkomorowej (V-SVZ; zwanej również strefą podwyściółkową lub SEZ) w ścianach komór bocznych. Opracowanie strategii transferu genów in vivo dla populacji dorosłych komórek macierzystych (tj. populacji mózgu ssaków), skutkujące długotrwałą ekspresją pożądanych transgenów w komórkach macierzystych i ich pochodnym potomstwie, jest kluczowym narzędziem w obecnych badaniach biomedycznych i biotechnologicznych. W tym miejscu przedstawiono metodę bezpośredniego badania in vivo do stabilnej modyfikacji genetycznej dorosłych mysich komórek V-SVZ, która wykorzystuje niezależną od cyklu komórkowego infekcję przez LV i wysoce wyspecjalizowaną cytoarchitekturę niszy V-SVZ. W szczególności obecny protokół obejmuje wstrzyknięcie pustych LV (kontrolnych) lub LV kodujących specyficzne kasety ekspresji transgenu do samego V-SVZ, w celu ukierunkowania in vivo na wszystkie typy komórek w niszy, lub do światła komory bocznej, w celu ukierunkowania tylko na komórki wyściółki. Kasety ekspresyjne są następnie integrowane z genomem transdukowanych komórek, a białka fluorescencyjne, również kodowane przez LV, umożliwiają wykrycie transdukowanych komórek w celu analizy autonomicznych i nieautonomicznych, zależnych od niszy efektów komórkowych w znakowanych komórkach i ich potomstwie.

Wprowadzenie

Mysia strefa komorowo-podkomorowa (V-SVZ), w ścianach bocznej komory skierowanej do prążkowia, jest bardzo aktywnym obszarem zarodkowym, w którym ciągły proces replikacji i różnicowania komórek progenitorowych powoduje trwałą produkcję interneuronów opuszki węchowej (OB) i oligodendrocytów ciała modzelowatego1. Wytwarzanie tych komórek przez całe życie wydaje się być wspierane przez obecność w tym regionie nerwowych komórek macierzystych (NSC; zwanych również komórkami B1), które wyrażają antygen astrocytarny glejowy fibrylarne kwaśne białko (GFAP) i markery komórek macierzystych, takie jak nestyna, Id1 i Sox22. Komórki B1 wykazujące ekspresję GFAP generują komórki progenitorowe amplifikujące tranzyt (TAP) (komórki C), które wyrażają czynniki transkrypcyjne Dlx2 (homeobox 2 bez dystalu) i Ascl1 (homolog 1 ssaków achaete-schute) i dzielą się szybko kilka razy, zanim doprowadzą do powstania migrujących neuroblastów (komórki A) lub oligodendroblastów3. Nowo wytworzone neuroblasty proliferacyjne migrują do przodu, tworząc rostralny strumień migracyjny (RMS) do OB, gdzie integrują się z warstwami ziarnistymi i kłębuszkowymi jako zróżnicowane interneurony hamujące. Migrujące młode oligodendroblasty przemieszczają się do CC, gdzie stają się niedojrzałymi komórkami NG2-dodatnimi, które nadal dzielą się lokalnie lub różnicują w dojrzałe mielinizujące oligodendrocyty1,4.

B1 komórki, które wywodzą się z płodowych promienistych komórek glejowych, zachowują wydłużoną i spolaryzowaną morfologię swoich poprzedników i wykazują wysoce wyspecjalizowany związek ze swoją niszą. Rozciągają się między wyściółczką, która wyrównuje komorę, a siecią naczyń krwionośnych, które nawadniają niszę V-SVZ. Mały wyrostek wierzchołkowy komórek B1 interkaluje się między wielorzęskowymi ependymocytami i kończy się pojedynczą nieruchomą rzęską pierwotną, podczas gdy ich wyrostek podstawowy rozciąga się na duże odległości, aby zbliżyć się do płaskiego splotu naczyniowego, który nawadnia tę niszę, kończąc się blaszką podstawy naczyń włosowatych splotu2,5-8 .

Najbardziej niezawodnym sposobem na odróżnienie B1-NSC od nieneurogennych astrocytów, które również są GFAP+, w nienaruszonej niszy V-SVZ jest oparte na całościowych przygotowaniach ściany bocznej komory i ich analizie za pomocą mikroskopii konfokalnej 3D po barwieniu immunologicznym dla GFAP w celu oznaczenia cienkiego procesu wierzchołkowego B1-NSC, β-kateniny do wyznaczenia błon komórkowych, i albo γ-tubuliny jako markera rzęsek podstawnych, albo acetylowanej α-tubuliny do oznaczania zakresu każda rzęska5,8. Obserwacje tych całych wierzchowców z powierzchni komory wykazały, że komórki B1 i wyściółki są ułożone w "wiatraczki"5, w których jednorzęsowe wyrostki wierzchołkowe jednej lub kilku komórek GFAP+ B1 są otoczone rozetą wielorzęskowych komórek wyściółki.

Charakterystyczna morfologia komórek B1 koreluje z dowodami eksperymentalnymi wskazującymi, że naczynia krwionośne/komórki śródbłonka i komorowy płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) stanowią regulowane źródła rozpuszczalnych sygnałów działających na NSC2,6,9-11. Na powierzchni komory homotypowe i heterotypowe interakcje wierzchołkowo-boczne obejmujące komórki wyściółki i B1 obejmują połączenia ścisłe i połączenia adherenowe5,12. Co więcej, wykazano, że cząsteczki adhezyjne zaangażowane w kompleksy połączeniowe między komórkami B1 a wyściółką, takie jak N-kadheryna i V-CAM, regulują nie tylko wysoce zorganizowane pozycjonowanie B1 w niszy V-SVZ, ale także ich spoczynek12,13. Monowarstwa komórek wyściółki-B1 wydaje się działać jako bariera dyfuzyjna, umożliwiając regulowany przepływ wody i małych cząsteczek z płynu mózgowo-rdzeniowego, ale ograniczając przejście międzykomórkowe dużych białek10,11. Dowody eksperymentalne wskazują, że unikalnie umiejscowiona rzęska wierzchołkowa komórki B1 może odgrywać rolę jako czujnik polipeptydów sygnałowych obecnych w płynie mózgowo-rdzeniowym2,5-7. Komórki wyściółki są same w sobie również źródłem rozpuszczalnych i związanych z błoną sygnałów, które odgrywają rolę w regulacji zachowania NSC14,15.

Identyfikowalne nukleozydy, takie jak bromo-deoksyurydyna (BrdU), lub retrowirusy były powszechnie używane do oznaczania komórek progenitorowych, w tym NSC, in vivo. Jednak metody te nie są optymalne do długoterminowego śledzenia losu, ponieważ sygnały BrdU rozcieńczają się poprzez powtarzające się podziały komórkowe, a retrowirusy wydają się preferencyjnie celować w przejściowo amplifikujące komórki ze względu na ich wymóg proliferacji komórek do transdukcji16,17. Aby zbadać fizjologię NSC in vivo, w tym interakcje ze składnikami niszowymi, kluczowe jest ustalenie metody znakowania i śledzenia rzadko dzielących się komórek, ponieważ B1-NSC są w dużej mierze w stanie spoczynku, a sąsiednie komórki wyściółki nigdy nie dzielą się w warunkach fizjologicznych3. Tutaj pokazujemy, że wektory lentiwirusowe (LV) pozwalają na wysokowydajne znakowanie genów i długoterminową modyfikację dorosłych NSC i niedzielących się komórek wyściółki, ze względu na ich zdolność do transdukcji i integracji z genomem komórek docelowych w sposób niezależny od cyklu komórkowego. Ponadto pokazujemy, w jaki sposób droga dostarczania i miano wirusa pomagają w specyficznej transdukcji komórek wyściółki, ale nie komórek B1, umożliwiając w ten sposób analizę zależnych od niszy, wyściółki efektów na NSC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

OŚWIADCZENIE ETYCZNE: Niniejszy protokół jest zgodny z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami Uniwersytetu w Walencji, zgodnie z dyrektywą europejską 2010/63/EU.

1. Generowanie LV do badań znakowania in vivo (patrz Rysunek 1a)

UWAGA: Opisana tutaj procedura odpowiada 2. poziomowi bezpieczeństwa biologicznego, dlatego wszystkie poniższe czynności należy wykonywać w komorze z laminarnym przepływem powietrza do pracy z materiałem biologicznym. Należy upewnić się, że personel badawczy posiada odpowiednie kwalifikacje i przeszkolenie w zakresie wszystkich procedur. Należy stosować środki ochrony indywidualnej, w tym fartuch, podwójne rękawiczki oraz odpowiednie ochronniki oczu. Na koniec należy dokładnie zdekontaminować wszystkie narzędzia i powierzchnie, które mogły mieć kontakt z wirusami, zgodnie z zatwierdzonymi praktykami dezynfekcji w placówce (poprzez przecieranie 70% ethanolem, 10% wybielaczem i/lub autoklawowanie).

  1. Produkcja LV w komórkach ludzkiej nerki embrionalnej 293T
    1. Protokół należy rozpocząć od przygotowania czystego DNA do transfekcji. Każdy plazmid należy przygotować i oczyścić za pomocą podwójnej wirówki w gradiencie CsCl lub innych dostępnych komercyjnie metod kolumnowych, pozwalających na uzyskanie DNA wolnego od endotoksyn. W tym protokole zastosowano plazmid wektora transferowego pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre. Rekomendowane plazmidy opakowujące (core packaging plasmids) to pMDLg/pRRE i pRSV.REV oraz plazmid otoczki pMD2G13,18,19.
    2. Na 24 h przed transfekcją wysiać 5 x 106 komórek 293T w zmodyfikowanej pożywce Dulbecco (IMDM) (patrz Tabela materiałów) w plastikowej szalce 10 cm, aby uzyskać kulturę o konfluencji około 1/4 do 1/3 przed transfekcją. Inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnej inkubatorze w atmosferze 5-7% CO2.
    3. Na 2 h przed transfekcją wymienić pożywkę na świeżą.
    4. W sterylnej probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml wymieszać 10 µg plazmidu wektora transferowego (zawierającego cDNA transgenu lub shRNA do dostarczenia) z 2,5 µg plazmidu pRSV.REV, 5 µg plazmidu opakowującego pMDLg/pRRE oraz 3,5 µg plazmidu otoczki pMD2G. Roztwór plazmidów uzupełnić do końcowej objętości 450 µl buforem 0,1x TE (patrz Tabela materiałów) /dH20 (2:1). Następnie dodać 50 µl 2,5 M CaCl2.
    5. Osad utworzyć poprzez kroplowe dodanie 500 µl 2x roztworu soli buforowanej Hepes (HBS, patrz Tabela materiałów) do 500 µl mieszaniny DNA-TE-CaCl2 podczas mieszania w vortexerze z maksymalną prędkością.
    6. Osad natychmiast dodać do komórek 293T. Delikatnie zakręcić szalką, aby wymieszać. Przenieść komórki do inkubatora i wymienić pożywkę 14-16 h po transfekcji.
    7. Nadnadkliny zebrać 30 h po wymianie pożywek. Nadnadklinic przefiltrować przez filtr nitrocelulozowy o rozmiarze porów 0,22 µm i przystąpić do zagęszczania.
  2. Zagęszczanie LV
    1. Kondycjonowaną pożywkę zagęścić metodą ultrawirowania przy 50 000 x g (19 000 rpm z rotorem ultrawirówki SW-28) przez 2 h w temperaturze pokojowej (RT) w przezroczystej stożkowej probówce z polipropylenu o pojemności 30 ml.
      Uwaga: Należy użyć adapterów ultrawirówki do stożkowych probek rotora (patrz Tabela materiałów).
    2. Nadnadkliny usunąć przez odlanie, a osady resuspendować w małej objętości (200 µl lub mniej, jeśli wykonano tylko jedno wirowanie) soli fizjologicznej z fosforanem (PBS; patrz Tabela materiałów). Następnie pipetować roztwór w górę i w dół około 20 razy.
    3. Połączyć zawiesiny i ponownie zagęścić metodą ultrawirowania, również przy 50 000 x g (23 000 rpm z rotorem ultrawirówki SW-55) przez 2 h w temperaturze pokojowej. Użyć przezroczystych probek rotora z polipropylenu o nominalnej objętości 5 ml (patrz Tabela materiałów).
    4. Końcowy osad resuspendować w bardzo małej objętości (1/500 lub 1/1000 objętości początkowej pożywki) sterylnego PBS i mieszać na rotatorze przez 1 h w RT. Rozdzielić na małe alikwoty (5-20 µl) i zamrozić w temperaturze -80 °C.
    5. Wszystkie puste probówki przed wyrzuceniem potraktować 10% roztworem wybielacza.
  3. Miareczkowanie lentiwirusów za pomocą cytometrii przepływowej
    1. Dzień wcześniej wysiać 5 x 104 komórek HeLa na dołek w 6-dołkowych płytkach do hodowli tkankowej w 2 ml pożywki DMEM (patrz Tabela materiałów). Inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze w atmosferze 5-7% CO2 przez 24 h.
    2. W dniu miareczkowania rozmrozić alikwot zapasu wirusa i przygotować rozcieńczenia szeregowe, od 10-3 do 10-8, w pożywce DMEM.
      1. W tym celu użyć płytki 24-dołkowej, dodać 2 ml DMEM do pierwszego dołka i 1,8 ml do kolejnych dołków. Następnie do pierwszego dołka dodać 2 µl zagęszczonego zapasu wirusa (do końcowego rozcieńczenia 1:1 000 lub 10-3).
      2. Po kilkukrotnym pipetowaniu w celu dokładnego wymieszania roztworu, zmienić końcówkę i przenieść 200 µl rozcieńczenia 10-3 do drugiego dołka. Powtarzać procedurę seryjnie w kolejnych dołkach, aż do uzyskania rozcieńczenia 10-8.
    3. Wyjąć z inkubatora komórki HeLa wysiane poprzedniego dnia. Ostrożnie usunąć pożywkę z dołków. Do dołków z komórkami HeLa dodać 1 ml każdego rozcieńczenia wirusa wraz z 1 µl bromku heksadymetryny w stężeniu 8 mg/ml. Delikatnie zakręcić płytką, aby wymieszać.
      Uwaga: Bromek heksadymetryny jest dodawany w celu zwiększenia adsorpcji wirusa do komórek w kulturze.
    4. Przenieść komórki do inkubatora i pozwolić infekcji postępować przez 72 h. Następnie usunąć pożywkę, raz wypłukać komórki PBS i dodać 200 µl trypsyny-EDTA (patrz Tabela materiałów) do każdego dołka.
    5. Po 5 min w temperaturze 37 °C dodać 2 ml PBS do każdego dołka i zebrać komórki do probówek do cytometrii przepływowej.
    6. Wirować przy 300 x g przez 5 min w RT i odessać nadnadklinic.
    7. Osad resuspendować w 1 ml roztworu utrwalającego (1% formaldehydu klasy do mikroskopii elektronowej i 2% płodowej surowicy bydlęcej w PBS), a następnie wymieszać probówki w vortexerze.
    8. Komórki analizować w cytometrze przepływowym przy użyciu argonowego lasera jonowego 488 nm o mocy 15 mW.
    9. Skonfigurować instrument zgodnie ze standardowymi ustawieniami: rozproszenie przednie (FS), rozproszenie boczne (SS) oraz fluorescencja dla GFP (525/40 nm). Wyznaczyć bramkowanie (gating) populacji komórek na wykresie kropkowym FS vs. SS, aby wykluczyć agregaty komórkowe i szczątki. Zbierać fluorescencję w skali logarytmicznej. Obliczyć liczbę komórek GFP+ w każdej próbce.
    10. Obliczyć miano wektora korzystając z następującego wzoru: % GFP+/100 x liczba zainfekowanych komórek x czynnik rozcieńczenia (DF) = jednostki transdukcyjne (TU)/ml.

Przygotowanie wektora lentiwirusowego, schemat wstrzykiwania do mózgu myszy, dane z cytometrii przepływowej, rozcieńczenia seryjne.
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie poszczególnych etapów procedury. (a) Część 1 protokołu: generowanie LV do badań znakowania in vivo, od transfekcji komórek HEK293T odpowiednimi plazmidami w celu wytworzenia LV, po oznaczenie miana wirusa za pomocą cytometrii przepływowej z wykorzystaniem wskazanej formuły. Podano nazwy plazmidów oraz rotory wirówki. (b i c) Część 2 protokołu: stereotaktyczne wstrzykiwanie LV. „b” przedstawia przykład noniusza, urządzenia będącego częścią instrumentów stereotaktycznych, służącego do precyzyjnych pomiarów. Przykładowo, strzałki wskazują 4,23 cm. Noniusz jest używany do wyznaczania współrzędnych w osi przednio-tylnej (AP), przyśrodkowo-bocznej (ML) i grzbietowo-brzusznej (DV), co pokazano na widoku z góry (lewo) oraz na przekroju strzałkowym (prawo) mózgu. „c” wskazuje pozycję bregmy jako przecięcia szwów strzałkowego i czołowego. LV są wstrzykiwane za pomocą strzykawki. (d) Rysunki schematyczne pokazujące sposób przygotowania mózgu do analizy. Dwie półkule są rozdzielane, a każda z nich podzielona na dwa bloki. Blok „a”, zawierający OBs, powstaje poprzez cięcie czołowe na poziomie AP bezpośrednio za miejscem połączenia OB z telencefalonem (bregma 2,46 mm; jako referencję zobacz Atlas Paxinosa). Blok „b” powstaje w wyniku dwóch cięć czołowych: jednego na poziomie tuż przed najbardziej rostralną częścią corpus callosum (bregma 1,7 mm) oraz drugiego na poziomie połączenia dwóch komór bocznych (bregma -0,22 mm). GL, warstwa kłębuszkowa; GCL, warstwa komórek ziarnistych; st, prążkowie; cc, corpus callosum; ac, spoina przednia; lv, komora boczna.

2. Stereotaktyczne wstrzyknięcie LV do obszaru granicznego V-SVZ/prążkowie lub do komory bocznej (patrz Rycina 1b)

  1. Przygotowanie
    1. Sterylizować 5 µl strzykawkę z igłą o rozmiarze 33 G, spryskując korpus i igłę 70% etanolem przy całkowicie wyciągniętym tłoku. Kilkukrotnie aspiruj etanol z probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml i całkowicie go wydmuchuj, a następnie dokładnie wypłucz strzykawkę sterylną wodą. Odstaw strzykawkę w bezpieczne miejsce w komorze laminarnej i pozostaw do wyschnięcia.
    2. Przygotować pojemnik na odpady biologiczne z 10% roztworem wybielacza w objętości odpowiedniej do zanurzenia wszystkich odpadów powstałych w wyniku tej procedury (zazwyczaj 200 ml w pojemniku o pojemności 500 ml).
    3. Przygotować i wstępnie podgrzać 37 °C materac wodny poprzez napełnienie szczelnej plastikowej torby do przechowywania wodą i ogrzanie jej do 37 °CPozwoli to myszom na regenerację po iniekcji.
    4. Wyjąć zapasy wirusa z -80 °C przechowywać w zamrażarce przez 1 h przed rozpoczęciem iniekcji, a następnie umieścić fiolkę na wirówce/rotatorze w temperaturze pokojowej. Po rozmrożeniu przechowywać zapas wirusa w lodzie podczas przeprowadzania iniekcji. Przed stereotaksyczną iniekcją LV rozcieńczyć skoncentrowane zapasy wirusa do 106 TU/μl użycie PBS w komorze laminarnej.
    5. Zdezynfekuj obszar wybrany do przeprowadzenia operacji za pomocą 70% etanolu.
  2. Mikroiniekcja LV
    1. Należy wybrać i wysterylizować narzędzia niezbędne do operacji (skalpel, wiertarkę oraz małą pincetę).
    2. Zanurzyć w znieczuleniu mysz w wieku 6–8 tygodni poprzez dożylne (ip) wstrzyknięcie mieszaniny ketaminy i medetomidyny pod nadzorem lekarza weterynarii. Zważyć każde zwierzę i podać dawkę 50–75 mg ketaminy oraz 0,5–1 mg medetomidyny. na kg masy ciała myszy (około 100-125 µl roztworu roboczego ketaminy/medetomidyny na mysz).
    3. Oceń głębokość znieczulenia, uciskając palce u stóp, ogon lub ucho i upewniając się, że zwierzę nie wykazuje reakcji.
    4. Po znieczuleniu myszy, wstrzyknąć podskórnie butorfanol w dawce końcowej 0,4–0,5 mg na kg masy ciała myszy w celu zminimalizowania bólu pooperacyjnego.
    5. Wygolić obszar między uszami i zdezynfekować skórę za pomocą jodoforu, takiego jak powidon jodowy, lub 70% etanolu. Oczyścić miejsce za pomocą sterylnych aplikatorów z watką. Należy uważać, aby nie nadmiernie zmoczyć zwierzęcia, ponieważ może to nasilić hipotermię.
    6. Umieść zwierzę w pozycji brzusznej na aparacie stereotaksycznym i ostrożnie unieruchom głowę za pomocą prętów usznych i wspornika podniebiennego urządzenia. Utrzymuj mysz na podkładce grzewczej ustawionej na 37 °C i zastosować środek nawilżający do oczu.
    7. Za pomocą skalpela należy wykonać podłużne nacięcie skóry głowy o długości 1 cm, a następnie delikatnie odsunąć skórę za pomocą precyzyjnej pęsety, aby odsłonić czaszkę.
    8. Starannie oczyść powierzchnię kości za pomocą sterylnego aplikatora z bawełnianą końcówką. Usuń z odsłoniętej kości czaszki wszelkie pozostałości tkanki.
    9. Zamocuj wysterylizowaną strzykawkę w urządzeniu stereotaktycznym za pomocą uchwytu do strzykawki.
    10. Przesuń uchwyt strzykawki w osiach x, y i z, aż końcówka igły strzykawki zostanie ustawiona na bregmie, czyli w punkcie przecięcia szwu strzałkowego (podłużnego i przyśrodkowego) z prostopadle przebiegającym szwem czołowym (Rycina 1b). Należy upewnić się, że pozycja „zero” osi grzbietowo-brzusznej (DV) znajduje się na powierzchni czaszki na wysokości bregmy.
    11. Przenieś strzykawkę do docelowych współrzędnych x i y (patrz Tabela 1 i Rycina 1b).
Region iniekcjiWspółrzędne
Przednio-tylna (AP)Przyśrodkowo-boczna (ML)Grzbietowo-brzuszna (DV)
granica SEZ/prążkowia+0.6 mm+1.2 mm-3.0 mm
komora boczna-0.3 mm+1.0 mm-2.6 mm

Tabela 1: Współrzędne stereotaktyczne dla iniekcji. Dla osi AP i ML współrzędne x i y podano jako odległość (w mm) od bregmy. Znak „-” oznacza „w kierunku tylnym”. Dla współrzędnych DV za „zero” przyjęto powierzchnię czaszki w punkcie bregmy, a współrzędne DV wskazują odległość (w mm) w dół od tego punktu.

  1. Zanotuj współrzędne docelowe x, y i z na skali noniusza, aby móc później wrócić do miejsca wstrzyknięcia. Zaznacz kość na współrzędnych x i y za pomocą chirurgicznego pisaka.
  2. Odsuń strzykawkę z obszaru roboczego.
  3. Za pomocą wiertarki elektrycznej wykonaj otwór w czaszce, uważając, aby nie uszkodzić mózgu. Nie wierć powierzchni opony miękkiej, ponieważ może to uszkodzić powierzchnię mózgu.
  4. Napełnij strzykawkę 1 µl roztworu wirusowego o stężeniu 106 TU/µl. Użyj ostrej igły ściętej o rozmiarze 33G, której końcówka ma kąt 10-12°. Ustaw igłę strzykawki pod kątem 90° względem powierzchni mózgu.
  5. Przesuń strzykawkę z powrotem do miejsca wstrzyknięcia i opuść ją, aż końcówka dotknie powierzchni opony miękkiej.
  6. Wprowadź strzykawkę do mózgu do współrzędnej z w osi DV.
  7. Powoli podawaj zawiesinę wirusową z prędkością 0,2 µl/min, aby zminimalizować uszkodzenia tkanki mózgowej spowodowane nadmiernym ciśnieniem płynu.
  8. Odczekaj 5-10 min, aby zminimalizować cofanie się zawiesiny wirusowej, a następnie bardzo powoli wycofaj strzykawkę. Nadmiar cieczy, który może pojawić się na powierzchni w wyniku wycofania strzykawki, odsącz chusteczką laboratoryjną i natychmiast umieść ją w pojemniku na odpady biologiczne zawierającym wybielacz.
  9. Wyjmij zwierzę z zestawu stereotaktycznego, połóż je na ciepłej podkładce i zamknij ranę za pomocą kleju skórnego. Odwróć działanie sedacji, podając 0,1-1,0 mg/kg masy ciała atipamezolu.
  10. Wstrzyknij Buprenorfinę podskórnie w dawce końcowej 0,1 mg na kg masy myszy co 12 h, zaczynając 4 h po podaniu krótko działającego leku przeciwbólowego Butorfanolu.
  11. Umieść zwierzę w indywidualnej klatce z ciepłą podkładką i ściśle monitoruj, aż mysz wybudzi się z narkozy. Włóż do klatki jedną torebkę hydrożelu, aby pomóc zwierzęciu w nawodnieniu po wybudzeniu.
  12. Wszystkie odpady skażone biologicznie zutylizuj w pojemniku na odpady biologiczne z płynnym wybielaczem. Oczyść strzykawkę poprzez aspirację i wtryskiwanie etanolu, a następnie wypłucz wodą. Zdezynfekuj obszar, zestaw stereotaktyczny oraz użyty sprzęt chirurgiczny wybielaczem i 70% etanolem.
  13. Utrzymuj wstrzyknięte myszy w izolacji w pomieszczeniu o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 przez 24-48 h, po czym mogą zostać przeniesione do konwencjonalnej hodowli.

3. Analiza histologiczna

  1. Perfuzja, pobieranie tkanek i sekcjonowanie
    1. Głęboko znieczulić myszy, stosując mieszankę medetomidyny i ketaminy pod nadzorem weterynaryjnym (poziom znieczulenia ocenić poprzez uszczypnięcie palców, ogona lub ucha), zgodnie z wcześniejszym opisem.
    2. Przeprowadzić perfuzję transkardialną myszy za pomocą 25 ml roztworu soli fizjologicznej, a następnie 75 ml 4% PFA w PB z tą samą prędkością17.
    3. Wyjąć mózg i poddać go postfiksacji poprzez zanurzenie w zimnym 4% PFA w PB w objętości co najmniej 10-krotnie większej niż objętość tkanki przez 1-16 h (wydłużenie czasu postfiksacji może zmniejszyć immunoreaktywność niektórych antygenów). Pozostałe PFA dokładnie wypłukać roztworem PB.
    4. Przeciąć mózg zgodnie ze wskazówkami na Rysunku 1d i przykleić otrzymany blok do uchwytu wibratomu za pomocą cyjanoakrylanu.
    5. Pobrać seryjne przekroje coronalne o grubości 30 µm za pomocą wibratomu. Przechowywać plastry mózgu w 24-dołkowych płytkach z PB w temperaturze 4 °C. Aby zapobiec kontaminacji, do roztworu PB można dodać 0,05% azotku sodu.
  2. Immunohistochemia
    1. Inkubować swobodnie pływające przekroje w buforze blokującym (PB z 0,05% azotku sodu, 1% glicyny, 5% normalnego surowicy koziej i 0,1% Triton X-100) przez 1 h w RT przy delikatnym wstrząsaniu na platformie kołyszącej.
    2. Ostrożnie usunąć bufor blokujący pipetą, dodać odpowiednie rozcieńczenie przeciwciała pierwszorzędowego królika anty-GFP (patrz Tabela materiałów) w buforze blokującym i inkubować tkankę w tym rozcieńczeniu przez 48 h w 4 °C przy delikatnym wstrząsaniu.
    3. Wypłukać roztwór przeciwciał pierwszorzędowych co najmniej 3 razy roztworem PB, wykonując jedno płukanie co 10 min.
    4. Inkubować swobodnie pływające przekroje z odpowiednim rozcieńczeniem przeciwciał wtórnych sprzężonych z fluoroforem w roztworze blokującym (patrz Tabela materiałów) przez 1 h w RT przy delikatnym wstrząsaniu. Chronić przekroje przed bezpośrednim światłem podczas inkubacji.
    5. Wypłukać roztwór przeciwciał wtórnych roztworem PB 3 razy, raz co 10 min, a następnie przeprowadzić barwienie kontrastowe tkanki, inkubując przekroje z DAPI (4',6-diamidino-2-fenyloindol) w stężeniu 1 mg/ml w wodzie przez 5 min. Usunąć roztwór DAPI poprzez dwukrotne, szybkie płukanie wodą.
    6. Ostrożnie umieścić przekroje na szkiełku przedmiotowym za pomocą cienkiego pędzla. Nalać kilka kropli medium montażowego do preparatów fluorescencyjnych (patrz Tabela materiałów) na tkankę i ostrożnie nałożyć szkiełko nakrywkowe, sprawdzając, czy roztwór montażowy jest prawidłowo rozprowadzony na całej powierzchni i czy nie ma pęcherzyków powietrza. Delikatnie docisnąć szkiełko nakrywkowe, aby odprowadzić nadmiar medium montażowego.
    7. Po wyschnięciu roztworu montażowego (2-16 h) przeanalizować próbkę za pomocą konfokalnej skaningowej mikroskopii laserowej z laserem 488 nm.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

System dostarczania genów za pomocą LV może być wykorzystywany do długotrwałej transdukcji in vivo komórek w obszarze V-SVZ u dorosłych myszy, co umożliwia ich śledzenie oraz modyfikację genetyczną podczas proliferacji, migracji i różnicowania. Infekcja i ekspresja są bardzo skuteczne i dają liczne komórki, które można łatwo odróżnić od pozostałych, niezinfekowanych komórek dzięki ekspresji zawartego w systemie raportera. Do tej pory wizualizowaliśmy transdukowane komórki za pomocą fluorescencyjnych raporterów G...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Lewa grupa wirusowa oferuje istotne korzyści w porównaniu z innymi systemami wirusowymi w zakresie modyfikacji genetycznej dorosłych NSC16,18. Stereotaktyczne dostarczanie lentiwirusów do niszy V-SVZ stanowi skuteczną metodę znakowania i śledzenia rzadko dzielących się B1-NSC, pokonując ograniczenia innych powszechnie stosowanych metod, takich jak BrdU, który jest rozcieńczany po wielu podziałach komórkowych, lub retrowirus, który celuje tylko w komórki, które proliferują w momencie aplikacji. Lewa dawka wraz ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Wszystkie manipulacje zostały wykonane w pomieszczeniu o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2. Protokoły na zwierzętach zostały zatwierdzone przez komisję etyczną Uniwersytetu w Walencji i wszystkie były zgodne z dyrektywą europejską 2010/63/UE.

Podziękowania

Dziękujemy za pomoc M.J. Palopa i wsparcie techniczne SCSIE z Universidad de Valencia. Dziękujemy również Antonii Follenzi za pomocne komentarze i dyskusję na temat manuskryptu. I.F jest wspierany przez Fundaciòn Botìn, przez Banco Santander za pośrednictwem Globalnego Oddziału Uniwersytetów Santander oraz przez granty z Generalitat Valenciana (Programa Prometeo, ACOMP i ISIC) i Ministerio de Economìa y Competitividad (MINECO: SAF2011-23331, CIBERNED i RETIC TerCel). Prace te były również wspierane przez granty BFU2010-21823 i RETIC TerCel od MINECO i Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (ERC) 2012-StG (311736- PD-HUMMODEL) dla A.C. B.M-P. jest stypendystą hiszpańskiego stypendium FPI MINECO.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Część 1: Generacja LV do dostarczania in vivo.
Sprzęt:
UltrawirówkaBeckman CoulterOptima XL-100K
UltrawirówkaBeckman CoulterSW-28
Ultrawirówka rotorBeckman CoulterSW-55
Ultrawirówki rurowe Beckman Coulter35812625 mm x 89 mm
Probówki ultrawirówkowe Beckman Coulter32681913 mm x 51 mm
Adaptery do ultrawirówekBeckman Coulter358156
płytka 6-dołkowaSPLPLC-30006
Płytka 24-dołkowaSPLPLC-30024
Naczynie 10 cmSPLPLC-20101100 x 20 style
AforaDE40080012 mm x 75 mm, 5 ml
Sterylny filtr kubkowy FACSBD34062630 & micro; m
Filtr nitrocelulozowyMilliporeSCGPU05RE0,22 μ m 
Cytometr przepływowyBDLSR FortessaNiebieski laser 488 nm
Filtr SteritopBiofilFPE-204-500 0,22 &mikro; Odczynniki m
Odczynniki:
pMDLg/pRRE plazmid Addgene#12251Plazmid opakowania rdzeniowego plazmid
pRSV.REV Addgene#12253Plazmid opakowania rdzenia
pMD2G plazmid Addgene#12259Plazmid kopertowy
pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre plazmid Addgene#12252Wektor transferowy plazmid
Zmodyfikowany Medium Orła Dulbecco BiowestL0101-500Do hodowli komórkowych HeLa
Zmodyfikowane podłoże Dulbecco firmy Isco Technologie życiowe12440-053Do hodowli komórek 293T
Tris-EDTA (TE)Tris-HCl (sigma, T5941), 0,1 mM EDTA (sigma, E5134), pH 7,6,  Bez DNAzy/RNAzy, 0,2 i mikro; m sterylnie filtrowany
2x HBS0,28 M NaCl (Sigma, S7653), 0,05 M HEPES (Sigma, H7523), 1,5 mM bezwodny Na2HPO4 (Sigma, S7907) w dH2O (najlepiej nie MilliQ). Dostosuj pH do 7,0 za pomocą roztworu NaOH (Calbiochem, 567530).
Płodowa surowica bydlęca (FBS)BiowestS181B-500Roztwór podstawowy o stężeniu 100x, używany do przygotowania pożywki hodowlanej HeLa i 293T o końcowym stężeniu 10x.
GlutaminaSigma-AldrichG7513-100Roztwór podstawowy o stężeniu 200 mM, używany do przygotowania pożywki hodowlanej HeLa i 293T o końcowym stężeniu 6 mM.
Pirogronian sodutechnologies11360-039Roztwór podstawowy o stężeniu 100 mM, używany do przygotowania pożywki hodowlanej HeLa i 293T o końcowym stężeniu 1 mM.
GlutaMAX SuplementLife technologie35050-061Służy do przygotowania pożywki hodowlanej 293T o końcowym stężeniu 1%.
Penicylina/streptomycynaSigma-AldrichP4458Roztwór podstawowy zawiera 5 000 jednostek/ml penicyliny i 5 mg/ml streptomycyny. Służy do przygotowania pożywki HeLa i 293T o końcowym stężeniu 1%.
Trypsin-EDTALife Technologies25200-056Z czerwienią fenolową, zawiera 2,5 g trypsyny wieprzowej i 0,2 g EDTA 4Na/L HBSS.
Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami  (PBS)Sigma-AldrichD1408Bez chlorku wapnia i chlorku magnezu, 10x, płynny, sterylnie filtrowany, odpowiedni do hodowli komórkowych. Roztwór podstawowy używany do przygotowania 1x PBS w wodzie klasy do hodowli komórkowych.
Polibren (bromek heksadimetryny) Proszek Sigma-AldrichH9268. Przygotuj 1,000x roztwór podstawowy o stężeniu 8 mg/ml w dHO
Paraformaldehyd EM grade 16%EM Sciences15710
NazwaCompanyNumer katalogowyKomentarze
Część 2: Sterotoksyczne wstrzykiwanie LV do SSE właściwej lub komory bocznej.
Sprzęt:
Vernier stereotaktycznyinstrument NeuroLab, Leica39463001http://www.leicabiosystems.com/
adaptor myszy i noworodka szczuraNeuroLab, Leica39462950
Uchwyt na strzykawkęKD ScientificKDS-311-CE
33 strzykawkaHamiltonP/N      84851/00#85RN
Wiertarka elektrycznaFine Science Tool98096
Koc termicznyUfesaAL5512/01230-240 V, 100-110 W, typ C_AL01
Golarka JataMP373NModel: piękny, 3 V, 300 mA, typ HT-03.
Odczynniki:
MedetomidineEsteveDOMTOR Roztwór handlowy o stężeniu 1 mg/ml.
KetaminaMerialImalgene 500 Roztwór handlowy o stężeniu 50 mg/ml
medetomidyny i ketaminyPrzygotować mieszaninę roboczą medetomidyny w końcowym stężeniu 0,2 mg/ml rozcieńczenia i ketaminy w końcowym stężeniu 15 mg/ml w roztworze soli fizjologicznej. Stosować jako znieczulenie, wstrzykując objętość, aby uzyskać końcowe stężenie 0,5-1 mg medetomidiny na kg masy ciała i 50-75 mg ketaminy na kg masy ciała
ButorfanolPfizerTorbugesicRoztwór podstawowy w stężeniu 10 mg / ml. Stosowany jako środek przeciwbólowy w stężeniu 1 mg / ml w roztworze soli fizjologicznej.
AtipamezoleEsteveAntisedanRoztwór podstawowy w dawce 5 mg/ml, stosowany w końcowym stężeniu 0,5 mg/ml w roztworze soli fizjologicznej do wyjścia ze znieczulenia.
0,9% roztwór soli fizjologicznejBraun13465412
HistoacrylBraun1050052Miejscowy klej do skóry
HydroGelClear H2O70-01-5022
KimwipesKimberly-Clark3412011 cm x 21 cm
Wybielacz/VirkonDupont
Marker chirurgicznyStaedler313-9Trwały lubrykant okulistyczny lumocolor
 SICCAFLUID0,5 g/dawkę, karbomer 974P
Powidon-jodBetadine694109.610% powidonu-jodu
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
Część 3: Analiza histologiczna.
Sprzęt: < / em>< / strong>
Automatyczna pompa perystaltycznaCole-Parmer Inst. Co.HV-07524-55Masterflex L/S ekonomiczny napęd o zmiennej prędkości, 1,6-100 obr./min, 230 V
Głowica pompyCole-Parmer Inst. Co.HV-07518-00Głowica pompy Masterflex L/S Easy-Load do przewodów precyzyjnych; Obudowa PSF, wirnik CRS Rurka
silikonowaCole-Parmer Inst. Co.HV-96410-16Platinum L/S 16
Zestaw żyłskóry głowy Vygon V-green70246.05T25 G, długość rurki 30 cm
VibratomeLeicaVT1000
OlympusFluoView FV10i
Płyta grzejnaTehtnicaSHP-10
Odczynniki:
Bufor fosforanowy (PB)0,2 M Na2HPO4 (Sigma, S7907) i 0,2 M NaH2PO4 (Panreac, 141965.1211) w dH2O, dostosuj pH do 7,2-7,4
Paraformaldehyd (PFA)Panreac141451.1211Przygotuj świeże za każdym razem. Podgrzewanie dH2O do 55– 60 stopni Celsjusza; C za pomocą płyty grzejnej umieszczonej w dygestorii i wsypać proszek PFA, mieszając, aby uzyskać 8% roztwór. Roztwór jest mętno-biały, ponieważ PFA nie rozpuszcza się łatwo. Dodawaj 1N NaOH kropla po kropli, aż roztwór się usunie. Ostudzić, przefiltrować przez papier Whatman i dodać równoważną objętość 0,2 M PB.
Roztwórfizjologicznej 0,9% NaCl w dH2O
SuperglueLOCTITE767547
Azydek soduPanreac122712.1608
GlicynaSigma-AldrichG7126-100
Normalna surowica koziaMilliporeS30-100
Triton X-100Sigma-AldrichT9284Detergent
Przeciwciało królika anty-GFPROCKLAND600-401-215Stosować w rozcieńczeniu 1:500
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Przeciwciało Sondy molekularneA-21206Stosować w rozcieńczeniu 1:750
Hydrat dichlorowodorku 6-diamindino-2-fenyloindolu (DAPI)Sigma-AldrichD9542Fluorescencyjne barwienie jądrowe. Stosować w dawce 2 mg/ml w ddH2O. Przechowywać w ciemności w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Fluoromount-GEM Sciences17984-25Podłoże montażowe do preparatów fluorescencyjnych
Probówki FACS Life Cunningham Mieszanina Mikroskop konfokalny 0,2 M PB: soli

Bibliografia

  1. Fuentealba, L. C., Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. Adult neural stem cells bridge their niche. Cell Stem Cell. 10 (6), 698-708 (2012).
  2. Silva-Vargas, V., Crouch, E. E., Doetsch, F. Adult neural stem cells and their niche: a dynamic duo during homeostasis, regeneration, and aging. Curr Opin Neurobiol. 23 (6), 935-942 (2013).
  3. Ponti, G., Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. Lineage progression from stem cells to new neurons in the adult brain ventricular-subventricular zone. Cell Cycle. 12 (11), 1649-1650 (2013).
  4. Menn, B., Garcia-Verdugo, J. M., Yaschine, C., Gonzalez-Perez, O., Rowitch, D., Alvarez-Buylla, A. Origin of oligodendrocytes in the subventricular zone of the adult brain. J Neurosci. 26 (30), 7907-7918 (2006).
  5. Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell Stem Cell. 3 (3), 265-278 (2008).
  6. Shen, Q., et al. Adult SVZ stem cells lie in a vascular niche: a quantitative analysis of niche cell-cell interactions. Cell Stem Cell. 3 (3), 289-300 (2008).
  7. Tavazoie, M., et al. A specialized vascular niche for adult neural stem cells. Cell Stem Cell. 3 (3), 279-288 (2008).
  8. Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal flow. J Vis Exp. (39), (2010).
  9. Ramirez-Castillejo, C., et al. Pigment epithelium-derived factor is a niche signal for neural stem cell renewal. Nat Neurosci. 9 (3), 331-339 (2006).
  10. Falcao, A. M., Marques, F., Novais, A., Sousa, N., Palha, J. A., Sousa, J. C. The path from the choroid plexus to the subventricular zone: go with the flow! Front Cell Neurosci. 6, (2012).
  11. Delgado, A. C., et al. Endothelial NT-3 delivered by vasculature and CSF promotes quiescence of subependymal neural stem cells through nitric oxide induction. Neuron. 83 (3), 572-585 (2014).
  12. Kokovay, E., et al. VCAM1 is essential to maintain the structure of the SVZ niche and acts as an environmental sensor to regulate SVZ lineage progression. Cell Stem Cell. 11 (2), 220-230 (2012).
  13. Porlan, E., et al. MT5-MMP regulates adult neural stem cell functional quiescence through the cleavage of N-cadherin. Nat Cell Biol. 16 (7), 629-638 (2014).
  14. Ihrie, R. A., Alvarez-Buylla, A. Lake-front property: a unique germinal niche by the lateral ventricles of the adult brain. Neuron. 70 (4), 674-686 (2011).
  15. Porlan, E., Perez-Villalba, A., Delgado, A. C., Ferròn, S. R. Paracrine regulation of neural stem cells in the subependymal zone. Arch Biochem Biophys. 1-2 (534), 11-19 (2013).
  16. Mamber, C., Verhaagen, J., Hol, E. M. In vivo targeting of subventricular zone astrocytes. Prog Neurobiol. 92 (1), 19-32 (2010).
  17. Ferron, S. R., Andreu-Agullo, C., Mira, H., Sanchez, P., Marques-Torrejon, M. A., Fariñas, I. A combined ex/in vivo assay to detect effects of exogenously added factors in neural stem cells. Nat Protoc. 2 (4), 849-859 (2007).
  18. Consiglio, A., et al. Robust in vivo gene transfer into adult mammalian neural stem cells by lentiviral vectors. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (41), 14835-14840 (2004).
  19. Dull, T., et al. A Third-Generation Lentivirus Vector with a Conditional Packaging System. J. Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
  20. Bomsel, M., Alfsen, A. Entry of viruses through the epithelial barrier: pathogenic trickery. Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (1), 57-68 (2003).
  21. Castellani, S., Di Gioia, S., Trotta, T., Maffione, A. B., Conese, M. Impact of lentiviral vector-mediated transduction on the tightness of a polarized model of airway epithelium and effect of cationic polymer polyethylenimine. J Biomed Biotechnol. , (2010).
  22. Bonazzi, M., Cossart, P. Impenetrable barriers or entry portals? The role of cell-cell adhesion during infection. J Cell Biol. 195 (3), 349-358 (2011).
  23. Padmashali, R., You, H., Karnik, N., Lei, P., Andreadis, S. T. Adherens junction formation inhibits lentivirus entry and gene transfer. PLoS One. 8 (11), (2013).
  24. Yamashita, T., et al. Subventricular zone-derived neuroblasts migrate and differentiate into mature neurons in the post-stroke adult striatum. J Neurosci. 26 (24), 6627-6636 (2006).
  25. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Iniekcja wektora lentiwirusowegokomorowa strefa podkomorowatransfer gen w in vivoniezale ny od cyklu kom rkowegodetekcja bia ek fluorescencyjnychcelowanie w kom rki ependymalnemetoda modyfikacji genetycznejm zg doros ej myszystabilna ekspresja transgenu
Stabilna i wydajna modyfikacja genetyczna komórek dorosłej myszy V-SVZ do analizy autonomicznych i nieautonomicznych efektów neuronalnych komórek macierzystych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.