Artykuł metodologiczny

Obrazowanie bioluminescencyjne immunokompetentnego modelu zwierzęcego glejaka

16.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53287

⸱

15 stycznia 2016

 ,  ,  , 
1Department of Neurological Surgery, University of California San Francisco, 2Department of Neurological Surgery, Northwestern University Feinberg School of Medicine, 3Biochemistry and Molecular Genetics, Northwestern University Feinberg School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Komórki glejaka GL261 dostarczają użytecznego immunokompetentnego modelu zwierzęcego glejaka. Celem tego protokołu jest zademonstrowanie właściwych technik monitorowania wzrostu guza wewnątrzczaszkowego za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego in vivo oraz zweryfikowanie użyteczności komórek GL261 zmodyfikowanych lucyferazą do badania immunologii guza i podejść immunoterapeutycznych w leczeniu glejaka.

Streszczenie

W przeciwieństwie do powszechnie opisywanych modeli zwierzęcych ksenoprzeszczepów glejaka ludzkiego, ksenoprzeszczepy glejaka myszy GL261 podsumowują prawie wszystkie istotne kliniczne i histopatologiczne cechy choroby ludzkiej. Gdy komórki GL261 są wszczepiane wewnątrzczaszkowo syngenicznym myszom C57BL/6, model ma dodatkową zaletę w postaci utrzymania nienaruszonego mikrośrodowiska odpornościowego. Stabilna ekspresja lucyferazy w komórkach GL261 umożliwia nieinwazyjne, opłacalne monitorowanie bioluminescencji wzrostu guza wewnątrzczaszkowego. Niedawno wykazaliśmy, że ekspresja lucyferazy w komórkach GL261 nie wpływa na właściwości wzrostu guza, ekspresję cytokin immunomodulujących komórek nowotworowych, infiltrację komórek odpornościowych do guza lub całkowite przeżycie zwierząt z guzem wewnątrzczaszkowym. Dlatego wydaje się, że model glejaka lucyferazy GL261 może być przydatny w badaniu nowych metod chemioterapeutycznych i immunoterapeutycznych. Tutaj przedstawiamy technikę generowania stabilnej ekspresji lucyferazy w komórkach GL261 oraz sposób badania wzrostu komórek nowotworowych in vitro i in vivo za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego.

Wprowadzenie

Złośliwy glejak jest najczęstszym i najbardziej śmiertelnym nowotworem ludzkiego mózgu. Nawet w przypadku leczenia maksymalną resekcją chirurgiczną, radioterapią i chemioterapią, mediana przeżycia utrzymuje się na poziomie 15-20 miesięcy w głównych ośrodkach referencyjnych dla guzów mózgu1, 2, 3. Najbardziej agresywna postać glejaka złośliwego, glejak, charakteryzuje się postaciami mitotycznymi, neowaskularyzacją, inwazją do sąsiedniego mózgu i martwicą pseudopalisady. Ortotopowe ksenoprzeszczepy guza mózgu wykorzystujące ludzkie komórki guza mózgu pełniły istotną funkcję w badaniach neuroonkologicznych i ułatwiły translację przedkliniczną w celu testowania nowych środków przed rozpoczęciem badań klinicznych na ludziach. Podczas gdy większość modeli ksenoprzeszczepów ludzkich podsumowuje wiele cech choroby u ludzi, podstawowym ograniczeniem wszystkich systemów modelowych ksenoprzeszczepów opartych na ludziach jest wykorzystanie zwierząt z niedoborem odporności4.

Brak nienaruszonej odpowiedzi gospodarza wyraźnie modyfikuje wzrost guza, zarówno pod względem morfologii guza, jak i skuteczności wszczepienia. O ile pewne założenia są dopuszczalne w interpretacji wyników z modeli ksenoprzeszczepowanych, o tyle osiągnięcie odpowiednich wniosków w obszarze oceny terapeutycznej jest wyzwaniem. Niektóre podstawowe cechy biologiczne mogą być podobne u zwierząt z niedoborem odporności i immunokompetentnych, ale inne, takie jak zapalenie związane z nowotworem, inwazja tkanek, reakcja na uraz, są prawdopodobnie bardzo różne. W przeciwieństwie do tego, GL261 jest chemicznie indukowaną mysią linią komórkową glejaka, która dokładnie podsumowuje glejaka po wszczepieniu do mózgów immunokompetentnych syngenicznych myszy C57BL / 65. Podobnie jak w przypadku choroby ludzkiej, szybki i powtarzalny wzrost guza wewnątrzczaszkowego prowadzi do objawów neurologicznych i śmierci zwierzęcia6-10.

Podskórny wzrost guza można bezpośrednio zmierzyć. Wzrost guza wewnątrzczaszkowego można zmierzyć tylko za pomocą uśmiercania zwierząt lub kosztownych badań obrazowych. Stabilna ekspresja enzymu lucyferazy umożliwia nieinwazyjne i opłacalne wewnątrzczaszkowe obrazowanie bioluminescencyjne11. Bioluminescencja transfekowanych komórek GL261 transfekowanych lucyferazem dobrze koreluje ze wzrostem guza wewnątrzczaszkowego. Niedawno bezpośrednio porównaliśmy GL261 z komórkami GL261 zmodyfikowanymi lucyferazy i nie wykazaliśmy żadnej różnicy we wzroście i inwazji in vitro, profilu cytokin immunologicznych, przeżyciu in vivo myszy z guzem wewnątrzczaszkowym C57BL / 6 lub nacieku komórek odpornościowych. Technika ta ma zastosowanie w badaniach przedklinicznych glejaka, które obejmują nieinwazyjne monitorowanie wzrostu guza.

Protokół

Wszystkie procedury opisane poniżej zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Użytkowania i Opieki nad Zwierzętami na Uniwersytecie Northwestern i zostały przeprowadzone w warunkach sterylizacji.

1. Modyfikacja komórek GL261 za pomocą Reportera Eksprymującego Lucyferazy świetlika

UWAGA: Wektory lentiwirusowe oparte na HIV-1 wyrażają lucyferazy świetlików (Fluc) pod kontrolą promotora wirusa tworzącego ognisko śledziony (SFFV). Gen reportera optycznego został sklonowany do plazmidu wektorowego pHRSIN-CSGW-dlNotI.

  1. Utrzymuj 293-T komórki w zmodyfikowanej pożywce Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i komórkami GL261 w pożywce RPMI uzupełnionej 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 95% powietrza i 5% dwutlenku węgla (CO2).
  2. Gdy hodowla komórek 293-T osiągnie 80% zbieżności w kolbie T-75, przemyć komórki raz solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS) bez Ca2+ i Mg2+, inkubować komórki z 3 ml trypsyny (0,05%) w temperaturze 37 °C przez 5 minut, rozcierać pipetą o pojemności 5 ml, trzymając kolbę lekko pochyloną i zebrać wszystkie komórki z dna kolby. Przenieść 3 ml trypsynizowanej zawiesiny komórkowej do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i dodać 7 ml pożywki RPMI w miąższu (w sumie 10 ml zawiesiny komórek).
  3. Dobrze wymieszać zawiesinę komórek za pomocą pipety o pojemności 5 ml. Pobrać 100 μl zawiesiny komórek z probówki i policzyć liczbę komórek za pomocą hemocytometru. W tym celu należy zmieszać 100 μl zawiesiny komórek z 300 μl roztworu błękitu trypanowego i wprowadzić 2 μl mieszaniny do hemocytometru. Policz liczbę komórek bez niebieskiego zabarwienia z czterech oddzielnych widoków pod mikroskopem. Uśrednij liczbę komórek z każdego widoku, ponieważ ta liczba reprezentuje 104 komórki/ml.
  4. W międzyczasie odwirować probówkę zawierającą zawiesinę komórek o stężeniu 300 x g przez 7 minut. Odessać pożywkę i ponownie zawiesić granulki komórek świeżą pożywką RPMI, aby uzyskać zawiesinę komórek GL261 o gęstości 1,0 x 106/ml. Zasiać 2,5 x 106 komórek GL261 z 2,5 ml pożywki RPMI do kolby T-175 z 27,5 ml DMEM (dzień 1).
  5. Po 24 godzinach zastąp pożywkę 20 ml świeżego DMEM (dzień 2).
  6. Aby wytworzyć wektor lentiwirusowy, należy zmieszać 54 μl odczynnika do transfekcji z 2 ml wolnego DMEM w surowicy przez 5 minut. Dodać 3 μg gag-pol, 3 μg otoczki wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej G (VSV-G) i 4,5 μg Fluc (pSIN-Fluc) do DMEM z odczynnikiem do transfekcji i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Wrzucić całą mieszaninę DNA do kolby 293-T (T-175) i inkubować w temperaturze 37°C w wilgotnym komora zawierająca 95% powietrza i 5% CO2 przez 48 godzin (dzień 2).
  7. Dodać 10 ml świeżego DMEM po 24 godzinach od transfekcji (całkowita objętość pożywki do hodowli komórek 293-T powinna wynosić około 30 ml) (dzień 3).
  8. Aby podzielić komórki GL261 na płytkę 24-dołkową, przemyć komórki raz PBS bez Ca2+ i Mg2+, inkubować komórki z 5 ml trypsyny (0,05%) w temperaturze 37 °C przez 5 minut, rozcierać pipetą o pojemności 5 ml trzymając kolbę lekko pochyloną, zebrać wszystkie komórki z dna kolby, i policz komórki za pomocą hemocytometru, jak w kroku 1.2. W międzyczasie odwirować probówkę o sile 300 x g przez 7 minut. Odessać pożywkę i ponownie zawiesić granulki komórek świeżą pożywką RPMI, aby uzyskać zawiesinę komórek GL261 o gęstości 2,5 x 104/ml. Zasiej 2,5 x 104 komórki GL261 z 1 ml pożywki RPMI na 24-dołkowej płytce (dzień 3).
  9. Zebrać 30 ml supernatantu lentiwirusowego za pomocą pipety o pojemności 10 ml z kolby 293-T (T-175) po 48 godzinach od transfekcji i przenieść supernatant do probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Odessać 30 ml supernatantu lentiwirusowego za pomocą strzykawki o pojemności 50 ml przez filtr strzykawkowy 0,22 μm i podzielić supernatant wirusa na 1 ml podwielokrotności (dzień 4).
  10. Zastąp 1 ml pożywki RPMI w płytce komórkowej GL261 (24-dołkowej) 1 ml supernatantu lentiwirusowego i inkubuj w temperaturze 37 °C w wilgotnej komorze (dzień 4).
  11. Po 48 godzinach od zakażenia lentiwirusem zastąp pożywkę 1 ml świeżego RPMI (dzień 6).
  12. Po 24 godzinach powtórzyć zakażenie lentiwirusowe komórek GL261 (dzień 7).
  13. Po 2i 48 godzinach infekcji lentiwirusowej zastąp pożywkę 1 ml świeżego RPMI (dzień 9).
  14. Kontynuuj wzrost zmodyfikowanych lucyferazy komórek GL261 (określanych jako komórki GL261.luc) i rozszerz hodowlę komórkową do kolby T-75.
  15. Gdy hodowla komórkowa GL261.luc osiągnie 70% konfluencji w kolbie T-75, zbierz komórki przez trypsynizację i policz za pomocą hemocytometru, jak w kroku 1.2. Umieścić komórkę GL261.luc na 24-dołkowej płytce o stopniowanej gęstości (1,0 x 106, 5,0 x 105, 2,5 x 105, 1,0 x 105, 5,0 x 104, 2,5 x 104 komórki/basenik) i inkubować w temperaturze 37°C w wilgotnej komorze zawierającej 95% powietrza i 5% CO2 przez 3 godziny.
  16. Zmierz aktywność lucyferazy komórkowej w stosunku do zmodyfikowanych lucyferazy komórek U-87 MG (U87.luc) za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego (ryc. 1).
    1. Uruchom oprogramowanie do obrazowania (kliknij ikonę na pulpicie) i zainicjuj system obrazowania (kliknij przycisk "Zainicjuj"). Inicjalizacja rozpocznie się automatycznie i może potrwać kilka minut, zanim sprawdzenie systemu i schłodzenie kamery do -90 °C.
    2. Dodać 25 μl lucyferyny (sól potasowa D-lucyferyny, 150 mg/kg) do każdej studzienki.
    3. Inkubować komórki z lucyferyną przez 1 minutę w temperaturze pokojowej i obrazować płytkę przez 10 sekund. Aby skonfigurować system obrazowania, wybierz "Luminescencyjny", "10 s" czasu ekspozycji i "Średni" bining. Umieść 24-dołkową płytkę na stacji obrazowania i kliknij przycisk "Pobierz", aby rozpocząć obraz.
    4. Po pomyślnym pobraniu obrazu na ekranie pojawi się okno obrazu i paleta narzędzi. Kliknij "Narzędzia ROI (obszary zainteresowania)" i wybierz 6 x 4 z ikony szczeliny. Utwórz szczeliny 6 x 4, aby zakryć obszar sygnału na obrazie płytki 24-dołkowej i kliknij zakładkę pomiarów (ikona ołówka). Obserwuj okno z tabelą pomiarów ROI jako jednostek fotonów na sekundę na steradian na cm kwadratowy (fotony/s/sr/cm2).
    5. Użyj komórek U87.luc, wcześniej zmodyfikowanych tym samym lentiwirusem, który został tutaj użyty do modyfikacji GL26111, jako kontroli do oceny aktywności lucyferazy w transdukowanych komórkach GL261.luc.

2. Test proliferacji in vitro

  1. Gdy hodowle komórkowe GL261 i GL261.luc osiągną 70% konfluencji w kolbie T-75, należy zebrać obie linie komórkowe przez trypsynizację i policzyć jak w kroku 1.2, a następnie umieścić komórki na 96-dołkowej płytce o gęstości 1500 komórek w 80 μl pożywki RPMI na dołek za pomocą pipety wielokanałowej, aby zminimalizować czas i błąd pipetowania. Zasiej każdą linię komórkową do łącznie 20 dołków. Aby ograniczyć parowanie w studzienkach wypełnionych komórkami, należy wypełnić puste studzienki 100 μl świeżej pożywki RPMI.
  2. Oceń proliferację komórkową za pomocą kolorymetrycznego testu proliferacji komórek. Tutaj używamy testu proliferacji komórek MTS. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 20 μl odczynnika MTS do każdego dołka 96-dołkowej płytki zawierającej komórki.
  3. Inkubować płytkę w temperaturze 37°C w wilgotnej komorze zawierającej 95% powietrza i 5%CO2 przez 3 godziny. Zmierzyć absorbancję przy 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Powtarza się to w dniach 1, 2, 4 i 7 po posiewaniu. Aby znormalizować wartości absorbancji, wartości każdego dnia są dzielone przez odpowiednie odczyty uzyskane w dniu 1 (rysunek 2).

3. Implantacja komórek nowotworowych

Uwaga: Sterylizuj wszystkie urządzenia w autoklawie. Przygotować obszar operacyjny, rozpylając środek dezynfekujący (2% roztwór chlorheksydyny) i przykryć chłonnymi obłożami. W celu utrzymania sterylnych warunków podczas operacji należy nosić sterylne rękawice chirurgiczne, a obszar operacyjny podzielić na dwa obszary za pomocą kolorowej taśmy. Obszar 1 jest oznaczony jako "Czysty" i zawiera wysterylizowane zapasy; Obszar 2 jest oznaczony jako "Brudny" i zawiera używane materiały.

  1. Przed zabiegiem chirurgicznym na zwierzętach należy przygotować zawiesinę komórkową do wstrzyknięcia wewnątrzczaszkowego. Zebrać komórki z 70% zlewającej się kolby T-75 przez trypsynizację i policzyć komórki za pomocą hemocytometru, jak w kroku 1.2, i wykonać zawiesinę komórek o gęstości 1,0 x 105 komórek/μl w zrównoważonym roztworze soli Hanksa bez Ca2+ i Mg2+ (HBSS).
  2. Znieczulić myszy wstrzyknięciem dootrzewnowym mieszaniny 200 μl zawierającej 100 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny w 0,9% soli fizjologicznej. Aby potwierdzić prawidłowe znieczulenie, uszczypnij palec u nogi myszy. Jeśli mysz jest całkowicie pod narkozą, mysz nie powinna reagować na bodziec.
  3. Podawać 0,1 mg/kg buprenorfiny we wstrzyknięciu podskórnym w celu złagodzenia bólu pooperacyjnego.
  4. Ogol czubek głowy zwierząt za pomocą maszynki do strzyżenia i wyczyść aplikatorem z bawełnianą końcówką zamoczonym w 2% roztworze chlorheksydyny. Zastosuj maść do oczu, aby utrzymać odpowiednie nawilżenie podczas zabiegu.
  5. Wykonaj strzałkowe nacięcie o długości około 1 cm nad kością ciemieniowo-potyliczną za pomocą sterylnego skalpela. Aby uwidocznić bregmę, przetrzyj powierzchnię czaszki aplikatorem z bawełnianą końcówką nasączonym 3% roztworem nadtlenku wodoru.
  6. Wywierć czaszkę sterylną igłą 25-G, aby zrobić mały otwór 3 mm po prawej stronie bregmy i tuż za szwem koronalnym.
  7. Aby upewnić się, że miejsce wstrzyknięcia wewnątrzczaszkowego znajduje się na głębokości 3 mm od czaszki, należy odciąć nożyczkami 3 mm spiczasty koniec końcówki pipety o pojemności 20 μl i włożyć strzykawkę do końcówki pipety.
  8. Włożyć strzykawkę prostopadle do wcześniej utworzonego otworu i powoli wstrzykiwać zawiesinę komórek nowotworowych zawierającą 3,0 x 105 komórek w 3 μl HBSS przez okres 1 minuty. Pozostaw igłę na miejscu na kolejną minutę, a następnie powoli wyciągnij igłę.
  9. Przetrzyj czaszkę aplikatorem z bawełnianą końcówką zamoczonym w 3% nadtlenku wodoru i 2% roztworze chlorheksydyny. Osusz powierzchnię czaszki za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką. Wytnij sterylny wosk kostny o rozmiarze około 3 mm3 i przymocuj wosk kostny na końcowej stronie aplikatora z bawełnianą końcówką. Nałóż wosk kostny, aby zakryć otwór za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką.
  10. Pociągnij obie strony skóry głowy razem nad czaszką za pomocą kleszczy i zszywki, aby zamknąć ranę. Oczyść ranę bawełnianą końcówką zamoczoną w 2% roztworze chlorheksydyny.
  11. Monitoruj wszystkie myszy po operacji, aż zaczną się poruszać i zachowają normalną aktywność. Zazwyczaj czas rekonwalescencji wynosi około 30 minut. Nie należy wkładać myszy do klatki z innymi zwierzętami, dopóki w pełni nie wyzdrowieją ze znieczulenia.

4. Obrazowanie bioluminescencyjne wzrostu guza GL261

  1. Rozpyl dużą ilość środka dezynfekującego (0,05% roztworu chlorku dimetyloamonu) na czysty ręcznik papierowy. Użyj ręcznika papierowego nasączonego środkiem dezynfekującym, aby dokładnie wytrzeć czarne prześcieradło, stożki nosowe i przegrodę wewnątrz komory obrazowania, w której zwierzęta będą miały kontakt z urządzeniem. Dokładnie wytrzyj wszystkie powierzchnie czystym, suchym ręcznikiem papierowym. Powtórz to jeszcze raz i odczekaj 5 minut.
  2. Zainicjuj stację obrazowania w sposób opisany w kroku 1.14.1.
  3. Znieczulić mysz mieszaniną 300 μl zawierającą 200 μl ketaminy/ksylazyny i 100 μl lucyferyny (sól potasowa D-lucyferyny, 150 mg/kg) przez wstrzyknięcie dootrzewnowe.
  4. Odczekaj 10 minut po wstrzyknięciu i sprawdź, czy myszy są całkowicie pod narkozą, szczypiąc ogon. Aby skonfigurować system obrazowania, wybierz "Luminescencyjny", "Auto" czas ekspozycji i "Średni" bining. Umieść myszy na stacji obrazowania i kliknij przycisk "Pobierz", aby rozpocząć obraz. Upewnij się, że czas po wstrzyknięciu jest zgodny z każdą sesją obrazowania.
  5. Po pomyślnym pobraniu obrazu powinno pojawić się okno obrazu i paleta narzędzi. Kliknij "Narzędzia ROI" i wybierz "auto" z ikony koła. Aby zdefiniować ROI, okrąż obszar sygnału na obrazie, a następnie wykonaj pomiary ROI jako jednostkę fotonów/s/sr/cm2.
  6. Wyjmij myszy z komory obrazowania i monitoruj myszy, aż zaczną się poruszać i zachowają normalną aktywność. Zazwyczaj czas rekonwalescencji wynosi około 15 minut. Nie należy wkładać myszy do klatki z innymi zwierzętami, dopóki w pełni nie wyzdrowieją ze znieczulenia.
  7. Monitoruj wzrost guza za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego dwa razy w tygodniu, dopóki zwierzęta nie wykażą następujących objawów: utrata masy ciała (utrata ponad 20% w stosunku do masy przed implantacją), brak apetytu (całkowita anoreksja przez 24 godziny) i brak trwałej, celowej reakcji na delikatne bodźce (słaba próba wstania), w którym to czasie powinny zostać poddane eutanazji. Poddaj eutanazji zwierzęta z tymi objawami za pomocą komory CO2, a następnie zwichnięcie szyjki macicy.
    1. Umieść myszy w komorze eutanazyjnej (nie przepełniaj komory) i dopływaj sprężonego CO2 przez 5-6 minut. Obserwuj, że wszystkie zwierzęta są nieprzytomne i nie oddychają po około 5 minutach.
    2. Wyjmij myszy z komory. Upewnij się, że serce nie bije, wyczuwając klatkę piersiową między kciukiem a palcem wskazującym i sprawdź, czy nie ma odruchu mrugania.
    3. Unieruchom mysz w pozycji leżącej na płaskiej powierzchni i chwyć jedną ręką tył szyi u podstawy czaszki, a podstawę ogona kciukiem i pierwszym palcem drugiej ręki.
    4. Utrzymaj głowę i szybko pociągnij ogon do tyłu. Upewnij się, że czaszka jest oddzielona od pierwszego kręgu szyjnego za pomocą kciuka i pierwszego palca.
  8. Znormalizuj wartości luminescencji dla każdego dnia w stosunku do odpowiadających im odczytów uzyskanych w pierwszym dniu obrazowania bioluminescencyjnego, jak w kroku 2.3 (Rysunek 3A).
  9. Na potrzeby analizy statystycznej należy wygenerować krzywe przeżycia za pomocą estymatora Kaplana-Meiera12 i porównać różnice między krzywymi przeżycia za pomocą testu logarytmicznegorangi 13.

Wyniki

Komórki GL261 zainfekowano lentiwirusem zawierającym lucyferazę, zgodnie z opisem w kroku 1. Obrazowanie bioluminescencyjne in vitro wykazuje silną ekspresję lucyferazy, porównywalną z poziomami w pozytywnej kontroli – ludzkiej linii komórkowej glejaka U87.luc (Rycina 1). Zgodnie z oczekiwaniami, niezinfekowane komórki GL261 nie wykazują tła ekspresji lucyferazy. Krok ten jest prosty, lecz krytyczny do wykonania przed dalszymi badaniami z wykorzystaniem zainfekowanej linii komórkowej, aby potwierdzić stabilną ekspresję lucyferazy.

Ekspresja lucyferazy po implantacji wewnątrzczaszkowej.

Przed implantacją wewnątrzczaszkową wykazaliśmy brak różnic w tempie wzrostu in vitro komórek GL261.luc w porównaniu z komórkami GL261 (Rysunek 2). W celu analizy wzrostu wewnątrzczaszkowego i przeżywalności, komórki wstrzyknięto do mózgów myszy C57BL/6 zgodnie z krokiem 3 protokołu. Wzrost guza u myszy z nowotworami GL261.luc analizowano seryjnie za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego zgodnie z krokiem 4 protokołu, co wykazało wykrywalny wzrost guza (Rysunek 3A). Myszy z guzami GL261.luc szybko i konsekwentnie wchodziły w stan agonalny i zostały poddane eutanazji. Co ważne, nie ma różnic w całkowitej przeżywalności między zwierzętami z guzami GL261.luc a tymi z guzami GL261 (Rysunek 3B). Obrazowanie bioluminescencyjne in vivo może zatem służyć do monitorowania odpowiedzi na eksperymentalne metody leczenia glejaka wielopostaciowego. Szybki, niezawodny wzrost guza i krótka całkowita przeżywalność pozwalają na uzyskanie dużej ilości danych w stosunkowo krótkim czasie.

Wyniki testu bioluminescencji; gęstość komórek vs. luminescencja, skala kolorystyczna, schemat płytki wielodołkowej.
Rysunek 1. Aktywność lucyferazy w komórkach GL261.luc.  Komórki U87.luc, GL261.luc oraz GL261 (kontrola negatywna) wysiano z gęstościami 1.0 x 106, 5.0 x 105, 2.5 x 105, 1.0 x 105, 5.0 x 104 oraz 2.5 x 104 komórek/dołek, patrząc od lewej do prawej. Luminescencję (photon/sec/sr/cm2) zmierzono za pomocą stacji obrazowania lumina. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres znormalizowanej absorbancji w funkcji czasu, porównanie GL261 i GL261.luc, wynik danych naukowych.
Rycina 2. Ekspresja lucyferazy nie wpływa na proliferację komórek GL261. Komórki GL261.luc nie powodują różnic w proliferacji, co wykazano w teście proliferacji komórek MTS. Wykres przedstawia krotność wzrostu względem dnia 1., wyznaczoną poprzez porównanie średniej wartości absorbancji (średnia ± SEM) w określonym punkcie czasowym do wartości średniej w dniu 1. (wartości nieparzystego testu t dla porównań między każdą linią komórkową: P = 0.7796)14. Słupki błędów reprezentują wartości średnie (średnia ± SEM) z próbek czterokrotnych dla każdego dnia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Analiza wzrostu guza i przeżywalności; wykres przedstawiający luminescencję, przeżywalność po implantacji, model GL261.luc.
Rycina 3. Ekspresja lucyferazy nie wpływa na in vivo wzrost guza i przeżywalność zwierząt. (A) Monitorowanie bioluminescencji wykazuje progresywny wzrost wewnątrzczaszkowego guza GL261.luc u myszy C57BL/6. (B) Analiza przeżywalności Kaplana-Meiera nie wykazuje różnic w całkowitej przeżywalności myszy z implantacją wewnątrzczaszkową komórek GL261 (linia ciągła) lub GL261.luc (linia przerywana). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Mysie komórki glejaka GL261, po wszczepieniu wewnątrzczaszkowym do syngenicznych immunokompetentnych myszy C57BL / 6, oferują kilka zalet w porównaniu z ludzkimi modelami ksenoprzeszczepu glejaka. Wiele ksenoprzeszczepowanych guzów rośnie jako zamknięte zmiany, które nie oddają dokładnie inwazyjnej choroby ludzkiej. W przeciwieństwie do tego, guz GL261 nie tylko wykazuje inwazję do sąsiedniego mózgu, ale także neowaskularyzację, figury mitotyczne i głęboką martwicę7. Co najważniejsze, podczas badania immunologii nowotworów lub strategii immunoterapeutycznych15, 16, mysz C57BL/6 zachowuje nienaruszony układ odpornościowy8. Wcześniejsze badania wykazały silną ekspresję immunosupresyjnej cytokiny TGF-β, a guzy wewnątrzczaszkowe zawierają immunosupresyjne komórki regulatorowe T, podobne do ludzkiego glejaka9, 10.

Opisana tutaj prosta technika pozwala na stabilną ekspresję lucyferazy przez komórki GL261. Niedawno odnotowaliśmy podobny wzrost komórek GL261.luc in vitro i in vivo w porównaniu z komórkami GL261, oprócz podobnych cech histologicznych guza i nacieku komórek odpornościowych17. Komórki GL261.luc stabilnie eksprymują lucyferazy, która katalizuje utlenianie substratu lucyferyny, przekształcając energię chemiczną w fotony, a tym samym wykrywalne światło. Lucyferyna może być bezpiecznie podawana zwierzętom i przenika przez barierę krew-mózg po wstrzyknięciu dootrzewnowym lub dożylnym. U małych zwierząt badawczych, takich jak myszy, bioluminescencję można wykryć zewnętrznie w sposób nieinwazyjny11. W związku z tym wzrost guza można oceniać seryjnie bez konieczności składania ofiar ze zwierząt lub kosztownych obrazowań MRI lub CT.

Krytyczne kroki w protokole obejmują nie tylko transdukcję lentiwirusa, ale także weryfikację stabilnej ekspresji lucyferazy in vitro przed rozpoczęciem jakichkolwiek eksperymentów in vivo . Utrata transdukcji może wymagać ponownego zakażenia lentiwirusem. Wprowadzenie genu oporności na antybiotyki do wektora ekspresji może być również wykorzystane do selekcji ekspresji lucyferazy. Do implantacji wewnątrzczaszkowej wymagana jest skrupulatna technika, która pozwala na powtarzalne umieszczenie stałej liczby komórek w precyzyjnym miejscu anatomicznym, aby umożliwić porównanie różnych grup leczenia. Główną różnicą między obecnym badaniem a poprzednimi badaniami nad ekspresją komórek GL261 lucyferazy jest zastosowanie techniki wolnej ręki do implantacji komórek w porównaniu z użyciem ramy stereotaktycznej18. Wcześniej wykazaliśmy spójne wyniki implantacji techniką wolnej ręki19. Zaletą techniki wolnej ręki jest możliwość wykonywania wysokoprzepustowych analiz różnych środków zabiegowych. W nasze ręce możemy wszczepić około 60 zwierząt w ciągu 1 godziny.

Po opanowaniu techniki przyszłe zastosowania tej techniki są nieograniczone. Ponieważ GL261 wykazuje podwyższone mitozy i szybki wzrost guza, podobnie jak u człowieka, można ocenić leczenie antyproliferacyjne. Podobnie można stosować terapie przeciwinwazyjne i antyangiogenne, ponieważ guzy GL261 są inwazyjne i angiogenne. Należy zachować ostrożność podczas oceny działania chemioterapeutyków skierowanych do ludzi. W porównaniu z poprzednimi badaniami wykorzystującymi ksenoprzeszczepy ludzkiego glejaka wielopostaciowego z ekspresją lucyferazy20, byłoby to uważane za ograniczenie naszego modelu. Również wpływ strategii immunoterapeutycznych na wzrost guza można badać w modelu ksenoprzeszczepu GL261.

Oświadczenia

Nie ma żadnych konfliktów interesów, które można by ujawnić.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Rajwantowi Kaurowi za pomoc techniczną. Chcielibyśmy podziękować Maxwellowi Tomowi za pomoc w przygotowaniu lentiwirusa. Praca ta była wspierana przez Reza and Georgianna Khatib Endowed Chair in Skull Base Tumor Surgery na UCSF oraz Michaela J. Marchese, profesora i kierownika katedry na Northwestern University.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
D-Lucyferyna, Sól potasowa ZłotoBiotechonologiaLUCK-100Przechowywać z dala od światła
Oprogramowanie do żywego obrazuCaliper Nauki przyrodniczeKontakt w celu wycenybrak
XenogenLumina Caliper Life SciencesKontakt w celu wycenybrak
24-well; Standardowa hodowla tkankowa; płaskodennyFalcon353047
CellTiter 96 AQueous One Solution Test proliferacji komórek PromegaG3582brak
Synergy 2 Multi-Mode ReaderBioTekKontakt w celu wycenybrak
96 dołków Płytka testowa, płytka, Przezroczyste dno z pokrywką, Hodowla tkankowa TretaedCoster3603brak
KetasetPfizerNDC 0856-2013-01Substancja kontrolna
KsylazynaSigma-Aldrich23076-35-9brak
28G Igła (ze strzykawką) Rybacy   22-004-270AKA Strzykawka insulinowa
2% chlorheksydynaFisherNC9756995AKA " Nolvasan"
3% Nadtlenek wodoruFisherH312P-4Przechowywać z dala od światła
Maść okulistycznaCardinal Health1272830AKA " Akwa Łzy"
25G 1 1/2 igłyBD Becton Dickinson305127brak
Jednorazowe skalpeleFeather2975No. 21
GauzeFisher22028563Autoklaw przed użyciem
Poduszka grzewczaDunlapHP950brak
Zszywacz do skóry, zszywki, zmywaczStoelting59020brak
PDI Alchol Podkładki przygotowawczeFisher23-501-711none
Reflex 7 mm Spinki do ran 100 sztBrain Tree Scientific, INC203 1000Autoklaw przed użyciem
Reflex 7 mm Brain TreeScientific, INC204 1000Autoklaw przed użyciem
Reflex 7 mm Spinka do usuwania ranekBrain Tree Scientific, INC205 1000brak
Wacik z okrągłą końcówką z pojedynczą końcówką z drewnianym uchwytemQosmedix10107Autoklaw przed użyciem
Zbilansowany roztwór soli Hanksa bez Ca2+ i Mg2+ (HBSS)Gibco14170-112brak
Strzykawka HamiltonHamilton80300brak
Odczynnik do transfekcji FuGENE 6PromegaE2961brak
Wosk kostnyAparat Harvard599864brak
.

Bibliografia

  1. Clark, A. J., et al. Neurosurgical management and prognosis of patients with glioblastoma that progresses during bevacizumab treatment. Neurosurgery. 70 (2), 361-370 (2012).
  2. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med. 352 (10), 987-996 (2005).
  3. Grossman, S. A., et al. Survival of patients with newly diagnosed glioblastoma treated with radiation and temozolomide in research studies in the United States. Clin Cancer Res. 16 (8), 2443-2449 (2010).
  4. Sughrue, M. E., et al. Immunological considerations of modern animal models of malignant primary brain tumors. J Transl Med. 7 (84), (2009).
  5. Ausman, J. I., Shapiro, W. R., Rall, D. P. Studies on the chemotherapy of experimental brain tumors: development of an experimental model. Cancer Res. 30 (9), 2394-2400 (1970).
  6. Zagzag, D., Zhong, H., Scalzitti, J. M., Laughner, E., Simons, J. W., Semenza, G. L. Expression of hypoxia-inducible factor 1alpha in brain tumors: association with angiogenesis, invasion, and progression. Cancer. 88 (11), 2606-2618 (2000).
  7. Cha, S., et al. Dynamic, contrast-enhanced perfusion MRI in mouse gliomas: correlation with histopathology. Magn Reson Med. 49 (5), 848-855 (2003).
  8. Ksendzovsky, A., et al. Investigation of immunosuppressive mechanisms in a mouse glioma model. J Neurooncol. 93 (1), 107-114 (2009).
  9. Biollaz, G., et al. Site-specific anti-tumor immunity: differences in DC function, TGF-beta production and numbers of intratumoral Foxp3+ Treg. Eur J Immunol. 39 (5), 1323-1333 (2009).
  10. El Andaloussi, A., Han, Y., Lesniak, M. S. Prolongation of survival following depletion of CD4 + CD25+ regulatory T cells in mice with experimental brain tumors. J Neurosurg. 105 (3), 430-437 (2006).
  11. Dinca, E. B., et al. Bioluminescence Monitoring of Intracranial Glioblastoma Xenograft Response to Primary and Salvage Temozolomide Therapy. J. Neurosurg. 107 (3), 610-616 (2007).
  12. Kaplan, E. L., Meier, P. Non-parametric estimation from incomplete observations. J. Am. Stat. Assoc. 53, 457-481 (1958).
  13. Peto, R., Peto, J. Asymptotically efficient rank invariant procedures. J. R. Stat. Soc. Ser. A. Stat. Soc. 135, 185207(1972).
  14. Armitage, P., Berry, G., Matthews, J. N. S. Statistical Methods in Medical Research. , 4th ed, Blackwell Science. Oxford. (2001).
  15. Newcomb, E. W., et al. The combination of ionizing radiation and peripheral vaccination produces long-term survival of mice bearing established invasive GL261 gliomas. Clin Cancer Res. 12 (15), 4730-4737 (2006).
  16. Pellegatta, S., et al. Neurospheres enriched in cancer stem-like cells are highly effective in eliciting a dendritic cell-mediated immune response against malignant gliomas. Cancer Res. 66 (21), 10247-10252 (2006).
  17. Clark, A. J., et al. Stable luciferase expression does not alter immunologic or in vivo growth properties of GL261 murine glioma cells. J Transl Med. 12, 345-34 (2014).
  18. Abdelwahab, M. G., Sankar, T., Preul, M. C., Scheck, A. C. Intracranial implantation with subsequent 3D in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas. J Vis Exp. (57), e3403(2011).
  19. Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. J Vis Exp. (41), (2010).
  20. Baumann, B. C., Dorsey, J. F., Benci, J. L., Joh, D. Y., Kao, G. D. Stereotactic intracranial implantation and in vivo bioluminescent imaging of tumor xenografts in a mouse model system of glioblastoma multiforme. J Vis Exp. (67), (2012).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Model glejaka GL261mysz immunokompetentnaguz wewn trzczaszkowyekspresja lucyferazymonitorowanie in vivotest proliferacji guzawstrzykiwanie stereotaktyczneobszar zainteresowaniabadanie immunoterapii
Obrazowanie bioluminescencyjne immunokompetentnego modelu zwierzęcego glejaka
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.