Artykuł metodologiczny

Model płaskiej komórki śródbłonka do obrazowania dynamiki synaps immunologicznych

DOI:

10.3791/53288

⸱

24 grudnia 2015

 , 
1Department of Medicine, Harvard Medical School - BIDMC

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Odporność adaptacyjna jest kontrolowana przez dynamiczne 'synapsy immunologiczne' utworzone między limfocytami T a komórkami prezentującymi antygen. Protokół ten opisuje metody badania komórek śródbłonka zarówno jako niedostatecznie zbadane fizjologiczne APC, jak i jako nowy typ "płaskiego komórkowego modelu APC".

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Odporność adaptacyjna jest regulowana przez dynamiczne interakcje między limfocytami T a komórkami prezentującymi antygen ('APC'), zwane 'synapsami immunologicznymi'. W tych intymnych interfejsach komórka-komórka tworzą się i szybko przekształcają dyskretne subkomórkowe klastry MHC / Ag-TCR, F-aktyny, adhezji i cząsteczek sygnałowych. Uważa się, że dynamika ta jest krytycznym wyznacznikiem zarówno skuteczności, jak i jakości rozwijających się odpowiedzi immunologicznych, a tym samym odporności ochronnej i patologicznej. Obecna wiedza na temat synaps immunologicznych z fizjologicznymi APC jest ograniczona przez nieadekwatność możliwej do uzyskania rozdzielczości obrazowania. Chociaż sztuczne modele substratów (np. płaskie dwuwarstwy lipidowe) oferują doskonałą rozdzielczość i są niezwykle cennymi narzędziami, są one z natury niefizjologiczne i nadmiernie uproszczone. Komórki śródbłonka naczyń krwionośnych i limfatycznych stały się ważnym przedziałem tkankowym obwodowym (lub zrębowym) "półprofesjonalnych APC". Te APC (które wyrażają większość maszynerii molekularnej profesjonalnych APC) mają unikalną cechę tworzenia praktycznie płaskiej powierzchni komórki i są łatwo transfekcyjalne (np. za pomocą fluorescencyjnych reporterów białkowych). W niniejszym artykule opisane zostanie podstawowe podejście do implementacji komórek śródbłonka jako nowatorskiego i fizjologicznego "płaskiego komórkowego modelu APC" w celu poprawy obrazowania i badania podstawowych procesów sygnalizacji antygenowej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

T limfocyty są gałęzią adaptacyjnego układu odpornościowego, charakteryzującą się zdolnością do skutecznego rozpoznawania antygenu peptydowego (Ag) związanego z głównymi cząsteczkami kompleksu zgodności tkankowej (MHC) poprzez ich receptory limfocytów T (TCR) 1. Nieprawidłowo pobrane limfocyty konstytutywnie migrują i skanują "profesjonalne komórki prezentujące Ag" (APC; np. komórki dendrytyczne) w węzłach chłonnych, podczas gdy limfocyty T pamięci/efektorowe muszą skutecznie badać niezwykle szeroki zakres APC i potencjalnych komórek docelowych w tkankach obwodowych.

W ciągu minuty po początkowym rozpoznaniu pokrewnego Ag na APC, limfocyty zatrzymują swoją migrację i zaczynają tworzyć wyspecjalizowany intymny interfejs komórka-komórka, zwany 'synapsą immunologiczną' (IS). Przedłużone (tj. 30-60 min) styki IS są wymagane do wzmocnienia i podtrzymania sygnalizacji 2-7. Nowe badania wskazują, że w obrębie IS to ciągłe tworzenie i szybka przebudowa dyskretnych subkomórkowych mikroklastrów sygnałowych (tj. zawierających MHC/Ag-TCR, F-aktynę, cząsteczki adhezyjne i sygnałowe) decydują o sile i jakości powstałych odpowiedzi immunologicznych 2-7. Jednak szczegóły dynamiczne i mechanizm regulacyjny tego procesu nie są w pełni poznane 8,9. Wynika to w dużej mierze z wyzwań technicznych związanych z nieregularnymi topologiami powierzchni APC i słabo kontrolowaną orientacją płaszczyzn interakcji komórka-komórka, problemami, które znacznie ograniczają wymagane podejścia do obrazowania czasoprzestrzennego 8-10 (Rysunek 1A).

figure-introduction-1

Rysunek 1. Fizjologiczny model APC komórki planarnej do obrazowania dynamiki synaps immunologicznych. Schemat ilustruje tradycyjne obrazowanie synapsy immunologicznej między limfocytem T a profesjonalnym APC (A) i limfocytem T oraz tradycyjnym płaskim dwuwarstwowym lipidowym modelem APC (B) w porównaniu z tym nowym modelem APC płaskim śródbłonka (C). Profesjonalne APC zapewniają fizjologiczne synapsy immunologiczne, ale oferują słabo zorientowany interfejs komórka-komórka (tj. w odniesieniu do optymalnej płaszczyzny obrazowania x-y; rozdzielczość ~0,2 μm), co dramatycznie pogarsza przestrzenną (rozdzielczość płaszczyzny obrazowania z ~1 μm) i czasową (tj. ze względu na konieczność wielokrotnego skanowania przez wszystkie z płaszczyzny obrazowania) rozdzielczość obrazowania. Modele dwuwarstwowe mają topologię płaską, która zapewnia optymalną rozdzielczość obrazowania czasoprzestrzennego, ale są również bardzo uproszczone, niefizjologiczne i sztywne. Ten model komórek śródbłonka łączy płaską topologię dwuwarstw lipidowych z fizjologicznym substratem klasycznego APC, aby zapewnić optymalną rozdzielczość obrazowania przestrzennego i czasowego w warunkach fizjologicznych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Poprzednie prace częściowo obeszły te przeszkody, rozwijając płaskie modele substratów (tj. dwuwarstwy lipidowe i powierzchnie pokryte przeciwciałami), które zapewniają optymalną rozdzielczość czasoprzestrzenną (tj. poprzez ustalenie powierzchni aktywacji limfocytów T w pojedynczy plan, który jest równoległy do optymalnej płaszczyzny obrazowania x-y) 11-15 (Rysunek 1B). Modele te umożliwiły uzyskanie ważnych informacji na temat dynamiki subkomórkowej/molekularnej, która kontroluje sygnalizację antygenową w komórkach T, w tym odkrycie dynamicznych mikroklastrów sygnalizacyjnych aktyna/TCR 7,11-14. Modele te są jednak z natury nadmiernie uproszczone, a także sztywne (co uniemożliwia rozwój/badanie trójwymiarowych cech topologicznych) (rysunek 1B). W związku z tym nie ma pewności, w jaki sposób powiązać takie odkrycia z fizjologicznym nadzorem immunologicznym między komórkami.

Chociaż wciąż niedostatecznie zbadane, komórki śródbłonka naczyniowego i limfatycznego pojawiają się jako duży (tj. liczniejszy niż wszystkie profesjonalne APC, o ~1,000-krotnie) przedział obwodowy 'półprofesjonalnych' APC 16-18. Komórki te wyrażają MHC-I-, MHC-II- i wiele cząsteczek kostymulujących (np. CD40, LFA3, ICOSL, 4-1BB, OX40L, TL1A, PD-L1; ale nie CD80 i CD86) i są strategicznie rozmieszczone na granicy krwi i tkanki, gdzie pełnią wyspecjalizowane funkcje wartownicze 16-18. Wcześniejsze badania wykazały, że komórki śródbłonka mogą skutecznie restymulować efektor/pamięć, ale nie naiwne, limfocyty T 19-25. W związku z tym komórki śródbłonka mogą odgrywać unikalne role APC w fazie efektywnej adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych w tkankach obwodowych, takich jak miejscowy wpływ na aktywację, różnicowanie, pamięć i tolerancję limfocytów T 16,17,26. Krytycznie, podczas hodowli in vitro, komórki śródbłonka tworzą praktycznie płaską powierzchnię komórek i są łatwo transfektoryjne (np. za pomocą fluorescencyjnych reporterów białkowych). Cechy te są idealne do obrazowania dynamiki topologicznej w wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej podczas interakcji komórka-komórka 19,27. W ten sposób komórki śródbłonka mogą służyć jako fizjologiczny model "płaskiego komórkowego APC", wyraźnie nadający się do badania subkomórkowych / molekularnych mechanizmów przebudowy, które napędzają rozpoznawanie antygenu i regulują odpowiedzi (Figura 1C) 19,20.

Wcześniej ustalone uzupełniające techniki obrazowania (w tym transfekcja komórek śródbłonka z fluorescencyjnymi twórcami białek błony plazmatycznej i cytozolu) do badania szczegółów interakcji leukocytów-śródbłonka podczas adhezji i migracji przezśródbłonkowej 27, pokazały, że leukocyty aktywnie badają powierzchnię śródbłonka poprzez dynamiczne wprowadzanie i wycofywanie submikronowych, bogatych w aktynę cylindrycznych wypukłości (~200-1,000 nm in średnicy i głębokości) określane jako wypukłości podobne do inwadosomów (tj. "ILP") 27,28. Te podejścia do obrazowania zostały jeszcze bardziej rozszerzone wraz z utworzeniem protokołów wykorzystujących funkcję śródbłonka APC w celu opracowania pierwszych metod obrazowania w wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej synapsy immunologicznej komórek T - śródbłonka, jak opisano w 19,20 i dalej opisano w niniejszym dokumencie. Głównym odkryciem wynikającym z tego nowatorskiego płaskiego komórkowego modelu APC jest to, że ILP komórek T działają zarówno w promowaniu początkowego wykrywania Ag, jak i w podtrzymywaniu późniejszej sygnalizacji. Rzeczywiście, macierze wielu ILP (które zostały ustabilizowane i zgromadzone w odpowiedzi na początkowy strumień wapnia) wykazują wzbogacenie w TCR i cząsteczki sugerujące aktywną sygnalizację, takie jak PKC-Q, ZAP-70, fosfotyrozyna i HS1. W związku z tym ILP wydają się reprezentować trójwymiarowy fizjologiczny odpowiednik mikroklastrów sygnalizacyjnych TCR obserwowanych w płaskich modelach dwuwarstwowych. Podejście to z wyczuciem ujawnia/raportuje molekularną i architektoniczną (oraz domniemaną biomechaniczną) dynamikę, która nie byłaby wykrywalna w inny sposób.

Metoda opisana tutaj powinna być przydatna do wypełnienia luki między profesjonalnymi i sztucznymi modelami substratów APC, aby zwiększyć naszą zdolność do badania podstawowych mechanizmów adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych. Chociaż tutaj nacisk kładziony jest na aktywację komórki efektorowej / pamięci typu Th1 CD4 +, to podstawowe podejście można łatwo zmodyfikować w celu zbadania szerokiego zakresu typów limfocytów T i Ag, jak omówiono poniżej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty opisane w tym protokole są przeprowadzane na pierwotnych ludzkich limfocytach T i dostępnych na rynku pierwotnych ludzkich komórkach śródbłonka (skórne lub płucne mikronaczyniowe EC). Każdy protokół badawczy z udziałem ludzi musi zostać zatwierdzony przez instytucjonalną komisję rewizyjną, a każdy dawca krwi musi uzyskać pisemną świadomą zgodę. Eksperymenty przeprowadzone przy użyciu tego protokołu zostały zatwierdzone przez IRB z Beth Israel Deaconess Medical Center.

1. Przygotowanie ludzkich efektorów/komórek pamięci Th1 CD4+

  1. Przyłóż opaskę uciskową do ramienia dawcy, przetrzyj żyłę alkoholem i wbij igłę. Powoli pobrać 15 ml krwi do vacutainera, używając EDTA jako antykoagulantu. Po pobraniu krwi rozwiąż opaskę uciskową przed wyjęciem igły. Po wyjęciu igły natychmiast przyłożyć ucisk do rany sterylną gazą.
  2. Przenieść krew do probówki o pojemności 50 ml. Dodać RPMI-1640 w temperaturze pokojowej w rozcieńczeniu 1:1 (końcowa objętość 30 ml). Ostrożnie nałożyć rozcieńczoną krew na dwie probówki o pojemności 50 ml zawierające 15 ml wstępnie przefiltrowanego podłoża izolacyjnego limfocytów, takiego jak Ficoll-Paque w temperaturze pokojowej.
  3. Odwirować gradient w temperaturze pokojowej przez 30 minut przy 1 200 x g w obracającym się wirniku kubełkowym. Podczas wirowania przygotuj pożywkę z limfocytów T (500 ml RPMI-1640, 50 ml FCS, 5 ml penicyliny/streptomycyny).
  4. Po wyjęciu probówki o pojemności 50 ml z wirówki należy obserwować cztery warstwy: osad czerwonych krwinek na dnie, paque, warstwę komórek zawierającą białe krwinki (w tym limfocyty) i osocze. Ostrożnie usunąć warstwę białych krwinek za pomocą pipety Pasteura i przenieść do probówki Falcon o pojemności 50 ml.
  5. Przemyć warstwę białych krwinek, dodając RT RPMI-1460 (do 20 ml) i odwirowując w temperaturze pokojowej przez 5 minut przy 1,200 x g. Ponownie zawiesić białe krwinki w 1 ml pożywki z limfocytów T. Dodać 5 μl zawiesiny 1 ml komórek do 250 μl pożywki z limfocytów T w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml i delikatnie mieszać pipetą w górę i w dół.
  6. Dodać 25 μl rozcieńczonej zawiesiny komórek do 25 μl 0,4% błękitu trypanowego. Dodać 10 μl mieszaniny z każdej strony wzorcowego hemocytometru.
  7. Umieść hemocytometr na mikroskopie świetlnym małej mocy. Używając obiektywu 10X, policz liczbę żywych komórek, które wykluczyły niebieski barwnik trypanowy i są obecne w środkowym kwadracie po obu stronach hemocytometru.
  8. Aby obliczyć stężenie komórek, pomnóż średnią z 2 kwadratów przez 100 (współczynnik rozcieńczenia), a następnie pomnóż przez 104, aby uzyskać liczbę komórek/ml.
  9. Dostosuj końcowe stężenie do 0,5 x 106 komórek/ml w pożywce z komórek T. Dodać do komórek końcowe stężenie 1 μg/ml superantygenów bakteryjnych, enterotoksyny gronkowcowej B (SEB) i toksyny zespołu wstrząsu toksycznego 1 (TSST) do komórek. Hodowla przez 72 godziny (37 °C i 5% CO2 ) w celu rozszerzenia populacji limfocytów T CD4 +.
  10. Limfocyty T w osadach (1 200 x g, 5 min) i ponownie zawiesić w stężeniu 0,5 x 106 komórek/ml w pożywce z limfocytów T z dodatkiem ludzkiej IL-15 (20 ng / ml). Przenieść limfocyty do kolby T150. Kontynuuj rozwijanie/dzielenie komórek w pełnym podłożu-IL-15 co 24-48 godzin w razie potrzeby (w zależności od koloru podłoża; tj. za każdym razem, gdy nośnik zmieni kolor z różowego na lekko żółty). Utrzymuj powstałą populację limfocytów przez okres do 15 dni.
    UWAGA: Z założenia protokół ten aktywuje i rozszerza specyficzny podzbiór limfocytów T CD4 +, które są reaktywne na SEB i TSST, a następnie kieruje je w kierunku fenotypu efektora / pamięci podobnego do Th1. Inne białe krwinki nie są w stanie przetrwać i rosnąć w tych warunkach, tak że w kroku 1.10 komórki będą składać się w co najmniej 95% z limfocytów T CD4 +, CD45RO + 19, co można łatwo ocenić za pomocą cytometrii przepływowej. W razie potrzeby dalsze oczyszczanie można łatwo osiągnąć za pomocą dostępnych na rynku zestawów do selekcji pozytywnej lub ujemnej na bazie przeciwciał/kulek magnetycznych.

2. Rozpoczęcie podstawowej hodowli ludzkich komórek śródbłonka

  1. Pokryć kolbę T25 fibronektyną (FN) 20 μg/ml w PBS w sterylnych warunkach. Pozostaw w RT na 30-60 min. Usunąć FN i dodać 5 ml kompletnego podłoża (pożywki Endothelial Basal Medium (EBM-2) uzupełnionej pojedynczymi kwotami Endothelial Growth Medium (EGM-2)). Wstępną inkubację w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C przez co najmniej 30 minut.
  2. Rozmrozić fiolkę z zamrożonymi ludzkimi komórkami śródbłonka płuc lub mikronaczyniowymi naczyniami skórnymi (HLMVEC lub HDMVECs) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, od czasu do czasu delikatnie mieszając przez ~2-3 min. Natychmiast przenieść komórki do kolby T25 zawierającej wstępnie podgrzane podłoże. Delikatnie zamieszać i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
  3. Zmień nośnik po ~4-6 godzinach. Kontynuuj wymianę nośnika mniej więcej co 48 godzin (lub gdy nośnik stanie się lekko żółty), aż płyta osiągnie ~90-95% zbieżności.

3. Ogólne rozszczepianie i rozszerzanie komórek śródbłonka

  1. Hoduj komórki do ~90-95 zbiegów. Może to potrwać od 2 do 5 dni. W celu rozszczepienia usuń pożywkę i spłucz PBS. Usuń PBS i zastąp minimalną objętością świeżej 1x trypsyny (0,5 ml dla T25 lub 1,5 ml dla T75). Delikatnie zamieszaj, aby pokryć całą powierzchnię trypsyną. Inkubować w temperaturze 37 °C przez ~5 min. Monitoruj odklejanie się komórek od płytki za pomocą mikroskopu świetlnego o małej mocy.
  2. Gdy większość komórek wydaje się zaokrąglona lub oderwana, dodać 5 objętości (tj. w porównaniu z dodaną objętością trypsyny) wstępnie podgrzanej kompletnej pożywki EGM-2 i delikatnie pipetować powierzchnię kolby, aby odłączyć wszystkie komórki.
  3. Policz komórki śródbłonka za pomocą hemocytometru, jak opisano w 1.6-1.7. Granulować komórki przez odwirowanie (5 min, 1 200 x g). Usunąć supernatant. Dostosuj stężenie do 0,5 miliona komórek na ml przez dodanie wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki EGM-2 MV.
  4. Przenieść porcje komórek do odpowiednich szalek lub kolb pokrytych FN w celu konserwacji. Delikatnie zakręć i umieść w inkubatorze. Zmień nośnik w ciągu 6-12 godzin od poszycia. Następnie media należy wymieniać mniej więcej co 48 godzin.

4. Transfekcja komórek śródbłonka

UWAGA: Pierwotne komórki śródbłonka są oporne na transfekcję przy użyciu najpopularniejszych metod chemicznych i elektroporacji. Opisana poniżej metoda oparta na transfekcji jądrowej pozwala na uzyskanie stosunkowo wysokiej wydajności transfekcji (~50-70%). Skuteczną metodą alternatywną jest wykorzystanie infekcji odpowiednimi wektorami wirusowymi (patrz uwagi w Tabeli materiałów).

  1. Przygotować kolby T25 lub T75 (w zależności od potrzeb) HLMVEC lub HDMVEC do końcowej gęstości 90-95% zgrywania. Pokryć fibronektyną (FN) 20 ug/ml w PBS w sterylnych warunkach na płytkach do hodowli mikroskopowej, takich jak płytki Delta-T (dla kroku 5) lub 12 mm okrągłych szklanych szkiełkach nakrywkowych umieszczonych w studzience 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej (dla kroku 6) w sposób opisany powyżej (2.1).
  2. Dodać 1 ml kompletnej pożywki hodowlanej EGM-2 do mikroskopowych płytek hodowlanych lub 0,5 ml do każdej z 24 studzienek i wyrównać płytki w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO2 .
  3. Zebrać i policzyć komórki śródbłonka jak w krokach 3.1-3.3. Odwirować wymaganą objętość komórek (0,5 miliona komórek na próbkę) przy 1 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie zawiesić osad komórek w 100 μl roztworu do transfekcji jądrowej RT na próbkę.
  4. Połącz 100 μl zawiesiny komórkowej z 1-5 μg DNA. Przenieś zawiesinę komórki/DNA do certyfikowanej kuwety; próbka musi pokrywać dno kuwety bez pęcherzyków powietrza.
    UWAGA: Konstrukty ukierunkowane na YFP lub DsRed do błony komórkowej (poprzez N-końcowe 20 aminokwasów neuromoduliny, która zawiera sygnał do potranslacyjnej palmitoilacji) stosowano samodzielnie (sama błona-YFP lub sama membrana-DsRed) lub współtransfekowane z cytoplazmatycznym markerem objętościowym (np. błona-YFP i rozpuszczalny DsRed). Można zastosować wiele permutacji fluorescencyjnych markerów białkowych.
  5. Zamknij kuwetę nakrętką. Włóż kuwetę z zawiesiną komórki/DNA do uchwytu kuwety elektroporatora i zastosuj program do elektroporacji S-005. Wyjmij kuwetę z uchwytu po zakończeniu programu.
  6. Dodaj ~ 500 μl wstępnie zbilansowanej pożywki hodowlanej do kuwety i delikatnie usuń zawiesinę komórek z kuwety za pomocą plastikowych pipet transferowych dostarczonych w zestawie do transfekcji jądrowej.
  7. W przypadku eksperymentów z użyciem mikroskopowych płytek hodowlanych należy równo podzielić zawiesinę komórkową z jednej reakcji między dwie szalki zawierające wstępnie podgrzane pożywki (kroki 4.2-4.3). W przypadku eksperymentów z użyciem 24 dołków / płytki, podziel jedną reakcję równo między 3 dołki.
  8. Inkubować komórki w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO2 i zmieniać pożywkę przez 4-6 godzin, a następnie ponownie po 12-16 godzinach po transfekcji.

5. Obrazowanie i analiza żywych komórek

  1. Przygotowanie śródbłonka
    1. Dzień 0: Kotransfekcja pierwotnych HLMVEC z błoną YFP i rozpuszczalnym DsRed za pomocą technologii nukleofekcji, jak opisano w kroku 4, i umieszczenie na płytkach do obrazowania żywych komórek.
    2. Dzień 1: Zastąp pożywkę świeżą pożywką zawierającą IFN-γ (100 ng/ml) w celu wywołania ekspresji MHC-II. W dniu 2. Stymulować transfekowane komórki przez dodanie 20 ng/ml TNF-α do istniejących pożywek.
    3. W dniu 3 inkubować śródbłonek z 1 μg/ml każdego z superantygenów bakteryjnych: enterotoksyny gronkowcowej B (SEB) i toksyny zespołu wstrząsu toksycznego 1 (TSST) w temperaturze 37 °C przez 30-60 minut bezpośrednio przed eksperymentami. Pomiń ten krok dla warunków kontrolnych '-Ag'
      4. .
  2. Przygotowanie limfocytów
    1. Równolegle z etapem 5.1.3 przygotować bufor A (HBSS wolny od czerwieni fenolowej) uzupełniony 20 mM Hepes, pH 7,4 i 0,5% v/v albuminy surowicy ludzkiej podgrzanej wstępnie do 37 °C. Pobrać próbkę hodowanych limfocytów i określić gęstość, licząc za pomocą hemocytometru (krok 1.12-1.17).
    2. Odwirować 2 miliony komórek na próbkę przy 1 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Odessać pożywkę i delikatnie zawiesić osad komórkowy w 2 ml buforu A, tak aby nie pozostały żadne skupiska komórek.
    3. Usunąć świeżą porcję barwnika wapniowego Fura-2 i ponownie zawiesić w DMSO, aby uzyskać stężenie wyjściowe 1 mM.
    4. Dodać 2 μl roztworu podstawowego Fura-2 do zawiesiny limfocytów T (stężenie końcowe 2 μM), zakryć probówkę i natychmiast wymieszać, odwracając probówkę, aby zapewnić równomierne rozproszenie barwnika. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
    5. Odwirować jak w kroku 5.2.2. Odessać Buffer-A i delikatnie, ale dokładnie zawiesić limfocyty w 20-40 μl świeżego Buffer-A.
  3. Konfiguracja i akwizycja obrazowania żywych komórek
    UWAGA: Do obrazowania fluorescencji żywych komórek w mikroskopach ze światłem pionowym i odwróconym można zastosować szeroką gamę systemów. Podstawowe wymagania obejmują fluorescencyjne źródło światła i filtry, kamerę CCD, zmotoryzowane przełączanie filtrów i żaluzje, podgrzewany stolik (lub podgrzewaną komorę montowaną w mikroskopie) oraz oprogramowanie do automatycznej akwizycji obrazu. Dla tego protokołu wymagana jest duża przysłona numeryczna, soczewki immersyjne o dużym powiększeniu (tj. 40X, 63X), aby osiągnąć niezbędną rozdzielczość przestrzenną. Należy zachować szczególną ostrożność przy wyborze odpowiedniego źródła fluorescencji i soczewek do obrazowania wapnia na bazie Fura-2, ponieważ nie wszystkie są zgodne z wymaganymi długościami fal wzbudzenia 340/380 nm. Alternatywne podejście (kompatybilne ze standardowymi zestawami filtrów fluorescencyjnych zielonej i czerwonej) można zastosować w przypadku barwników nieratiomentycznych wrażliwych na wapń (np. Fluo-4, Rhod-3), chociaż nie mogą one dokładnie określić ilościowo strumienia wapnia i zapewniają jedynie względny/ilościowy odczyt.
    1. Włącz system mikroskopowy (komputer do obsługi, mikroskop, kamera CCD, koło filtrów i lampa ksenonowa).
    2. Otwórz wyznaczone oprogramowanie.
    3. Skonfiguruj mikroskop/oprogramowanie do automatycznego wielokanałowego obrazowania poklatkowego. Obejmują sekwencyjną akwizycję różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC), standardowej zielonej fluorescencji, standardowej czerwonej fluorescencji oraz standardowych obrazów Fura-2 wzbudzenia 340 i 380 nm. Ustaw interwał akwizycji na 10-30 sekund i łączny czas trwania ~20-60 minut.
      1. Ustaw czasy naświetlania dla obrazowania Fura-2.
        1. Dodaj świeży olej do obiektywów i zamontuj naczynie mikroskopowe zawierające tylko 0,5 ml buforu-A na podgrzewaniu stage adapter i natychmiast włącz, aby zrównoważyć do 37 °C (zajmie to ~ 2-3 min).
        2. Dodać spoczynkowe limfocyty obciążone Fura2 do zamontowanej komory czaszy mikroskopu za pomocą pipety o pojemności 20 μl.
        3. Włącz obrazowanie w jasnym polu. Wybierz drogę światła do okularów. Użyj pokrętła zgrubnej ostrości, aby zetknąć obiektyw z dnem czaszy miskoskopowej. Użyj okularu i precyzyjnego pokrętła ostrości, aby ustawić ostrość na limfocytach T osadzonych na dnie naczynia.
        4. Użyj kontrolek stołu montażowego x-y, aby zaznaczyć pole zawierające co najmniej 10 komórek. Unikaj nadmiernie zatłoczonych pól i zagęszczeń komórek, ponieważ będą one tworzyć artefakty obrazowania.
        5. Przełącz z jasnego pola na fluorescencyjne źródło światła. Przełącz się z obrazowania okularu na kamerę CCD. Ustaw parametry akwizycji (np. czas ekspozycji, wzmocnienie detektora i binning). Za pomocą oprogramowania można uzyskać spoczynkowe obrazy Fura2-340 i Fura2-380 (zaczynając od identycznego czasu naświetlania dla każdego z nich, zwykle w zakresie ~200-1,000 ms).
        6. Użyj metod opisanych w kroku 5.4.1, aby obliczyć Fura2-340/Fura2-380 dla każdego limfocytu. Wykonuj wielokrotne iteracje dostosowywania czasów ekspozycji Fura2-340 i Fura2-380, uzyskując obrazy i obliczając współczynniki, aż średnie wartości zbliżą się do 1.
      2. Ustaw czasy ekspozycji dla mem-YFP i DsRed.
        1. Zastąp czaszę mikroskopu użytą w kroku 5.3.3.1 szalką miskopisową zawierającą transfekowane, aktywowane i poddane działaniu SAg (lub niepoddane obróbce; kontrola) HLMVEC lub HDMVEC z inkubatora do hodowli komórkowych (kroki 4.5.1). Użyj jednorazowej pipety transferowej, aby szybko usunąć pożywkę, spłukać jeden raz, dodając ~1 ml wstępnie podgrzanego buforu-A. Odessać, a następnie dodać 0,5 ml buforu A.
        2. Zidentyfikuj pola, w których obecne są jaskrawo fluorescencyjne dodatnie transfektanckie komórki śródbłonka i wydają się zdrowe z dobrze uformowanymi połączeniami międzykomórkowymi.
        3. Dostosuj parametry akwizycji (np. czas ekspozycji, wzmocnienie detektora i binning) dla mem-YFP i DsRed. Upewnij się, że średnie natężenie sygnału fluorescencji w każdym kanale mieści się w przedziale od 25% do 75% zakresu dynamiki detektora.
    4. Przeprowadź eksperyment z obrazowaniem żywych komórek.
      1. Użyj zautomatyzowanego oprogramowania, aby rozpocząć akwizycję obrazu i przechwycić kilka interwałów obrazów w celu ustalenia linii bazowej.
      2. Podczas akwizycji nałóż ~ 5 μl skoncentrowanych limfocytów obciążonych Fura-2 (z kroku 5.2) do środka pola obrazowania czaszy mikroskopu, wkładając końcówkę pipety o małej objętości (P-5 lub P-20) do pożywki w pobliżu środka obiektywu i powoli wyrzucając.
      3. Gdy limfocyty osiadają w polu obrazowania, dokonaj precyzyjnych regulacji ostrości, aby upewnić się, że interfejs komórek T-śródbłonek (synapsy immunologiczne) jest utrzymywany w płaszczyźnie ogniskowej. W przypadku obiektywów 40 i 63X optymalna jest ~10-20 komórek na pole. Jeśli w polu obrazowania zaobserwuje się mniejszą liczbę komórek, powtórz krok 5.3.4.2.
      4. Po osiągnięciu pożądanego interwału obserwacji w doświadczeniu, kontynuować obrazowanie i natychmiast pipetować jonomycynę bezpośrednio do czaszy miskoskopowej (stosując technikę jak w ppkt 5.3.4.2) do końcowego stężenia 2 μM w celu wywołania maksymalnego strumienia wapnia/sygnału sygnalizacyjnego Fura-2 (tj. sposób kalibracji, patrz analiza 5.4.).
      5. Jako alternatywę dla ppkt 5.3.4.4 po przeprowadzeniu pożądanego interwału obserwacji w doświadczeniu, natychmiast odessać bufor-A i zastąpić go 0,5 ml roztworu utrwalającego (3,7% formaldehydu w PBS) przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie trzykrotnie przepłukać PBS. Następnie przejdź do kroku 6.
  4. Analiza obrazowania żywych komórek
    UWAGA: Po zapisaniu pozyskanych plików można je bezpośrednio analizować lub eksportować do analizy za pomocą szerokiej gamy aplikacji do analizy obrazu w trybie off-line. ImageJ to szczególnie cenny, bardzo wszechstronny pakiet, który jest swobodnie dostępny i kompatybilny z prawie każdym pakietem oprogramowania do akwizycji. Projekt eksperymentów obrazowych opisanych w krokach 5.1-5.3 zapewni wysoką dynamikę rozdzielczości przestrzennej i czasowej interakcji między limfocytami a śródbłonkowym APC przy braku i obecności pokrewnego SAg. Niemal nieograniczone analizy są możliwe w przypadku danych obrazowych dotyczących dynamiki morfometrycznej/sygnalizacyjnej komórek. Szczegółowe cele opisane w tym konkretnym protokole to skoordynowane ilościowe określenie migracji i sygnalizacji limfocytów (tj. kinetyki i poziomów wewnątrzkomórkowego strumienia wapnia) wraz z dynamicznymi zmianami w architekturze synaps immunologicznych z naciskiem na określone cechy (tj. ILP/odciski podo). Poniżej znajdują się przykłady oddzielnych analiz standardowych i niestandardowych (tj. opracowanych specjalnie na potrzeby tych eksperymentów/pytań).
    1. Zmierz strumień wapnia w limfocytach
      1. Wybierz początkowe obrazy Fura2-340 (340nmEX-510nmEM) i Fura2-380 (380nmEX-510nmEM), które zostały uzyskane przed dodaniem limfocytów. Użyj ich jako obrazów tła i odejmij je cyfrowo od wszystkich obrazów w szeregach czasowych dla każdego odpowiedniego kanału.
      2. Dla każdego punktu czasowego utwórz obraz o cyfrowych proporcjach obrazów Fura2-340 z odjętym tłem i odjętymi z tła Fura2-380 (tj. 340nmEX-510nmEM-tło / 380nmEX-510nmEM-tło).
      3. Wybierz odpowiednie narzędzie do rysowania oprogramowania. Kliknij na ekranie, aby narysować okrągły obszar zainteresowania (ROI) wokół każdego limfocytu. Będą one generować wartość współczynnika uśrednioną pikselowo dla każdego limfocytu i przedziału czasowego.
      4. Wykreśl obliczony współczynnik w funkcji czasu za pomocą odpowiedniej aplikacji (np. arkusza kalkulacyjnego). Obliczyć uśredniony strumień wapnia dla eksperymentu, sumując wartości stosunków wszystkich limfocytów na pole i dzieląc tę wartość przez całkowitą liczbę limfocytów dla każdego punktu czasowego
    2. Przeprowadź analizę śledzenia migracji limpocytów.
      1. Analizuj migrację komórek T za pomocą odpowiedniej aplikacji do śledzenia komórek (np. ImageJ) przy użyciu kanału DIC z każdego filmu. Korzystając z wtyczki ImageJ Cell Tracking Plugin, zidentyfikuj w każdej klatce środek ciężkości każdej komórki ręcznie, klikając go w każdej progresywnej klatce.
      2. Wynikowe współrzędne szeregowe x-y (tj. ślady ścieżek migracji) należy wykorzystać do obliczenia średniej prędkości (całkowita odległość migrowana/całkowity interwał obrazowania) i krętości (całkowita odległość migrowana/liniowa odległość od końca do końca między lokalizacją komórki na pierwszym i ostatnim obrazie).
      3. Skorelować te parametry z dynamiką strumienia wapnia (5.4.1) dla każdej komórki.
    3. Oceń gęstość druku Podo/ILP w IS
      1. Policz całkowitą liczbę ILP utworzonych w każdym limfocytach T zdefiniowanych interwałach (np. 5 minut po dodaniu limfocytów T). Można je zidentyfikować dyskretne pierścienie fluorescencyjne błony YFP w skali mikronów, które kolokalizują się z cieniami w cytoplazmatycznym DsRed na śródbłonkowym APC w miejscu adhezji limfocytów.
      2. Wynikowe "wskaźniki ILP" należy skorelować z dynamiką strumienia wapnia (5.4.1) dla poszczególnych komórek.
    4. Zmierz czas życia podo-print/ILP.
      1. Dla każdego podo-printu/ILP w danym IS oblicz jego czas życia jako ostatni punkt czasowy, w którym ILP był widoczny - punkt czasowy, w którym ten podo-print/ILP pojawił się po raz pierwszy. Średnie okresy istnienia ILP dla poszczególnych IS.
      2. Skoreluj te czasy życia z dynamiką strumienia wapnia (5.4.1) dla każdej komórki.
    5. Oceń związek czasowy między początkowym tworzeniem ILP a strumieniem wapnia.
      1. Dla każdego limfocytu zidentyfikuj punkt czasowy (ramkę), w którym wapń po raz pierwszy wzrasta powyżej linii podstawowej 19.
      2. Dla każdego limfocytu zidentyfikuj punkt czasowy, w którym pojawia się pierwszy odcisk podo/ILP.
      3. Dla każdego limfocytu należy obliczyć "czas przesunięcia", odejmując początkowy punkt czasowy strumienia wapnia od początkowego punktu czasowego odcisku podo/ILP. Uśrednij wartości dla wszystkich limfocytów w polu. Wartości dodatnie wskazują, że tworzenie ILP poprzedza strumień wapnia, podczas gdy liczby ujemne wskazują na coś przeciwnego.
        UWAGA: Eksperymenty te można łatwo przeprowadzić przy fizjologicznie istotnym laminarnym przepływie ścinającym przy użyciu dostępnych na rynku komór do obrazowania przepływu o równoległych ściankach, jak opisano 19.

6. Obrazowanie i analiza komórek stałych

  1. Stały punkt końcowy tworzenia i barwienia IS śródbłonka komórek T
    1. Przygotuj limfocyty T zgodnie z opisem w 1. Przygotuj komórki śródbłonka (-/+ SAg) jak w kroku 5.1 (transfekcja, krok 5.1.1 jest opcjonalny). Pobrać próbkę hodowanych limfocytów i określić gęstość, licząc za pomocą hemocytometru (sekcja 1).
    2. Przenieść objętość hodowli limfocytów odpowiadającą co najmniej 3 x 105 limfocytów/próbkę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 200 x g przez 3 minuty. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad limfocytów w buforze A (etap 5.2.1) o stężeniu 6 x 105 limfocytów/ml.
    3. Usunąć komórki śródbłonka z inkubatora do hodowli komórkowych i (kolejno pobierając jedną próbkę na raz) odessać pożywkę i zastąpić 0,5 ml zawiesiny limfocytów (3 x 105 limfocytów/próbkę) i umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
    4. Po odpowiednim czasie inkubacji, o którym mowa powyżej, należy odessać pożywkę z dołków i dodać wystarczającą ilość roztworu utrwalającego (3,7% formaldehydu w PBS), aby całkowicie pokryć próbkę (np. w płytce 24-dołkowej ~300-500 μl). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5-10 minut.
    5. Przepłukać próbkę 3 razy za pomocą PBS. Barwienie, dodając przeciwciało pierwszorzędowe przez 60 minut w temperaturze pokojowej (patrz lista). Jeśli przeciwciało pierwszorzędowe jest skierowane na białko wewnątrzkomórkowe, należy przeprowadzić dodatkowy etap permeabilizacji poprzez dodanie wystarczającej ilości roztworu do przepuszczalności (0,01% TritonX-100 w PBS), aby całkowicie pokryć próbkę przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Przepłukać próbkę 3 razy PBS. Dodać odpowiednie przeciwciała drugorzędowe (w niektórych przypadkach jednocześnie fluorescencyjną falloidynę) przez 60 minut w temperaturze pokojowej.
    6. Zamontuj okrągłe szklane szkiełko nakrywkowe na szkiełku obrazowym. Stały punkt końcowy tworzenia i barwienia IS komórek T i śródbłonka. Aby rozpocząć obrazowanie, umieść szkiełko obrazowe zawierające próbki na stoliku mikroskopu i wybierz obiektyw olejowy 63X. Nałóż świeży olejek immersyjny.
  2. Użyj trybu obrazowania w jasnym polu i soczewek okularowych, aby zlokalizować płaszczyznę ogniskowej. Przełącz się na epifluorescencję i sprawdź próbkę przez soczewki okularowe. Wybierz pole zainteresowania. Przełącz na tryb skanowania laserowego.
  3. Korzystając z trybu szybkiego skanowania i pracując w jak najszerszym polu, indywidualnie dostosuj moc lasera i wzmocnienie każdego kanału, aby zoptymalizować sygnał tak, aby w idealnym przypadku określone natężenie sygnału osiągało co najmniej ~25% i nie więcej niż 75% zakresu dynamiki detektorów.
  4. Korzystając z ręcznych elementów sterujących ostrością, szybko przeskanuj oś Z i zidentyfikuj górną i dolną granicę przekroju (zazwyczaj wszystkie informacje powinny być zawarte w grubości ~15 μm). Wybierz grubość przekroju osi Z w zakresie ~0,2-1,0 μm.
  5. Na koniec powiększ/przytnij pole obrazowania do określonego obszaru zainteresowania i przeprowadź skanowanie. Oprócz bardzo jasnego i specyficznego sygnału fluorescencyjnego w próbce, uzyskanie obrazowania 3D o wysokiej rozdzielczości wymaga iteracji skanowania i wprowadzania korekt parametrów akwizycji. Celem jest uzyskanie maksymalnej rozdzielczości osi x-y i z, bez odczuwalnego fotowybielania.
  6. Jakościowa analiza topologii topologii 3D stabilności obrazu poprzez przeprowadzenie cyfrowej rekonstrukcji 3D powstałych przekrojów optycznych za pomocą odpowiedniej aplikacji programowej (np. Obraz J). Dzięki podobnym aplikacjom ilościowo oceniaj rozkład sygnału fluorescencji (np. kolokalizacja Pearsona i korelowana analiza liniowa intensywności fluorescencji oraz oglądanie ortogonalne).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowano nowatorskie podejście do obrazowania wykorzystujące komórki śródbłonka i łączące zalety rozdzielczości płaskiego modelu dwuwarstwowego lipidu z fizjologiczną złożonością i odkształcalnością profesjonalnych APC (Rysunek 1). Rysunek 2 przedstawia przykłady typowej migracji, strumienia wapnia i dynamiki topologicznej obserwowanej przy tym podejściu. W przypadku braku SAg na śródbłonku, specyficzne dla SAg limfocyty CD4 + Th1 szybko rozp...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten opisuje metody badania komórek śródbłonka jako i) niedostatecznie zbadane fizjologiczne APC oraz ii) jako nowy typ "płaskiego komórkowego modelu APC". W odniesieniu do tych pierwszych, coraz bardziej docenia się, że niehematopoetyczne obwodowe (lub "zrębowe") APC odgrywają krytyczną, nieredundantną rolę (tj. w porównaniu z krwiotwórczymi APC) w kształtowaniu adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych 16-18. Wśród takich "półprofesjonalnych" APC, komórki śródbłonka nac...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Dr. Peterowi T. Sage'owi za pomoc w wygenerowaniu niektórych reprezentatywnych obrazów. Praca ta była wspierana przez grant NIH R01 dla C.V.C. (HL104006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BD Vacutainer rozciągliwa bezlateksowa opaska uciskowaBD Biosciences367203
waciki nasączone alkoholem BDBiosciences326895
BD Vacutainer Safety-LokBD Biosciences367861K2 EDTA
BD Vacutainer Zestaw do pobierania krwi z przyciskiemBD Biosciences367335
RPMI-1640Sigma-AldrichR8758-1L
Ficoll-PaqueSigma-AldrichGE17-1440-02Przynieś do RT przed użyciem
FCS-OptimaAtlanta Biologicss12450Inaktywowana termicznie
Penicylina-StreptomycynaSigma-AldrichP4458-100ML
Błękit trypanowySigma-AldrichT8154-20ML
enterotoksyna gronkowcowaB TechnologiatoksynBT202REDRoztwór podstawowy 1 mg / ml w zespole wstrząsu toksycznego PBS
toksyna 1Technologia toksynTT606REDRoztwór podstawowy 1 mg / ml w PBS
ludzka IL-15R& D Systems247-IL-025Roztwór podstawowy 50ug/ml w PBS
PBSLife Technologies10010-049
FibronectinLife Technologies33016-015Roztwór podstawowy 1mg/ml w H20
HMVEC-d Ad-Dermal MV Endo CellsLonzaCC-2543Można stosować inne ludzkie mikronaczyniowe EC, tj. HLMVECs
EGM-2 MV bullet kitLonzaCC-3202
Trypsin-EDTASigma-AldrichT-4174Roztwór podstawowy 10x, rozcieńczony w PBS
amaxa-HMVEC-L Zestaw NucleofectorLonzavpb1003Wymagany zestaw do kroku 4
IFN-gSigma-AldrichI3265Roztwór podstawowy 1mg/ml w H20
TNF-alpha 10ug, humanLife TechnologiesPHC3015Roztwór podstawowy 1mg/ml w fenolu H20
HBSS bez czerwieniLife Technologies14175-103
HepesFisher ScientificBP299-100
Chlorek wapniaSigma-AldrichC1016-100GRoztwór podstawowy 1M w H20
Chlorek magnezuSigma-Aldrich208337Roztwór podstawowy 1M w H20
Albumina surowicy ludzkiejSigma-AldrichA6909-10ml
Immersol 518 F Bezfluorescencyjny olejek immersyjnyFisher Scientific12-624-66A
Fura-2 AM 20x50ugLife TechnologiesF1221Roztwór podstawowy 1mM w DMSO
pEYFP-Mem (Mem-YFP)Clontech6917-1
pDsRed-Monomer (rozpuszczalny cytoplazmatyczny DsRed)Clontech632466
pDsRed-Membrana monomerowa (Mem-DsRed)Clontech632512
pEGFP-ActinClontech6116-1
Alexa Fluor 488 PhalloidinLife TechnologiesA12379
Roztwór formaldehydu 37%Fisher ScientificBP531-500Toksyczny, użyj oparów
Triton X-100Sigma-AldrichX100-5ML
  Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 15 mlFisher Scientific14-959-70C
Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 50 mlFisher Scientific14-959-49A 
Kolby poddane hodowli tkankowej Falcon T25Fisher Scientific10-126-9
  Kolby poddane hodowli tkankowej Falcon T75Fisher Scientific  13-680-65
  Hodowla komórek Corning traktowana T175Fisher Scientific10-126-61 
Szkiełka nakrywkowe szklane Fisher Naukowy12-545-85 Średnica 12 mm
  Płytki do hodowli tkankowych Falcon 24-dołkoweFisher Scientific08-772-1
Płytki Delta-TBioptechs04200415B
Jednorazowe pipety PasteuraWheaton Fisher Scientific13-678-8D
1,5 ml probówka Eppendorf Fisher Naukowy05-402-25
  ICAM1 mysz anty-ludzkaBD Biosciences555509
HS1 mysz anty-ludzkaBD Biosciences610541
Anti-Human CD11a (LFA-1alpha) OczyszczonaebioscienceBMS102
Anti-Human CD3 Alexa Fluor® 488ebioscience53-0037-41
Przeciwciało anty-MHC klasy II Abcamab55152
Przeciwciało anty-Talin 1Abcamab71333
Przeciwciało anty-PKC theta Abcamab109481
fosfotyrozyna (4G10 Platinum)Millipore50-171-463
Nucleofector IIAmaxa BiosystemsWymagany elektroporator do kroku 4
Zeiss AxiovertCarl Zeiss MicroImaging
Zeiss LSM510 Carl Zeiss MicroImaging
Oprogramowanie Zeiss AxiovisonCarl Zeiss MicroImaging
NU-425 (seria 60) Szafa bezpieczeństwa biologicznegoNuAIRENu-425-600
  Forma STRCYCLE 37 ° C, 5% CO2 Inkubator do hodowli komórkowychFisher Scientific202370
Wirówka 5810EppendorfEW-02570-02
HemocytometrSigma-Aldrich  Z359629Hemocytometr Bright-Line
Izotemp Kąpiel wodna model 202Fisher Scientific15-462-2

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. von Andrian, U. H., Mackay, C. R. T-cell function and migration. Two sides of the same coin. N. Engl. J. Med. 343 (14), 1020-1034 (2000).
  2. Springer, T. A. Adhesion receptors of the immune system. Nature. 346 (6283), 425-434 (1990).
  3. Shaw, A. S., Dustin, M. L. Making the T cell receptor go the distance: a topological view of T cell activation. Immunity. 6 (4), 361-369 (1997).
  4. Monks, C. R., Freiberg, B. A., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).
  5. Delon, J., Stoll, S., Germain, R. N. Imaging of T-cell interactions with antigen presenting cells in culture and in intact lymphoid tissue. Immunol Rev. 189, 51-63 (2002).
  6. Brossard, C., et al. Multifocal structure of the T cell - dendritic cell synapse. Eur J Immunol. 35 (6), 1741-1753 (2005).
  7. Dustin, M. L. The cellular context of T cell signaling. Immunity. 30 (4), 482-492 (2009).
  8. Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).
  9. Cebecauer, M., Spitaler, M., Serge, A., Magee, A. I. Signalling complexes and clusters: functional advantages and methodological hurdles. J Cell Sci. 123, 309-320 (2010).
  10. Oddos, S., et al. High-speed high-resolution imaging of intercellular immune synapses using optical tweezers. Biophys J. 95 (10), L66-L68 (2008).
  11. Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
  12. Bunnell, S. C., et al. T cell receptor ligation induces the formation of dynamically regulated signaling assemblies. J Cell Biol. 158 (7), 1263-1275 (2002).
  13. Yokosuka, T., et al. Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76. Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).
  14. Seminario, M. C., Bunnell, S. C. Signal initiation in T-cell receptor microclusters. Immunol Rev. 221, 90-106 (2008).
  15. Dustin, M. L. Supported bilayers at the vanguard of immune cell activation studies. J Struct Biol. 168 (1), 152-160 (2009).
  16. Martinelli, R., Carman, C. V. Lymphocyte Endothelilal Interactions. Encyclopedia of Cell Biology. Bradshaw, R. A., Stahl, P. , Elsevier. London. (2015).
  17. Choi, J., Enis, D. R., Koh, K. P., Shiao, S. L., Pober, J. S. T lymphocyte-endothelial cell interactions. Annu Rev Immunol. 22, 683-709 (2004).
  18. Marelli-Berg, F. M., Jarmin, S. J. Antigen presentation by the endothelium: a green light for antigen-specific T cell trafficking? Immunol Lett. 93 (2-3), 109-113 (2004).
  19. Sage, P. T., et al. Antigen recognition is facilitated by invadosome-like protrusions formed by memory/effector T cells. J Immunol. 188 (8), 3686-3699 (2012).
  20. Kumari, S., et al. Actin foci facilitate activation of the phospholipase C-gama in primary T lymphocytes via the WASP pathway . eLife. , (2015).
  21. Marelli-Berg, F. M., et al. Major histocompatibility complex class II-expressing endothelial cells induce allospecific nonresponsiveness in naive T cells. J Exp Med. 183 (4), 1603-1612 (1996).
  22. Ma, W., Pober, J. S. Human endothelial cells effectively costimulate cytokine production by, but not differentiation of, naive CD4+ T cells. J Immunol. 161 (5), 2158-2167 (1998).
  23. Perez, V. L., Henault, L., Lichtman, A. H. Endothelial antigen presentation: stimulation of previously activated but not naive TCR-transgenic mouse T cells. Cell Immunol. 189 (1), 31-40 (1998).
  24. Epperson, D. E., Pober, J. S. Antigen-presenting function of human endothelial cells. Direct activation of resting CD8 T cells. J Immunol. 153 (12), 5402-5412 (1994).
  25. Shiao, S. L., et al. Human effector memory CD4+ T cells directly recognize allogeneic endothelial cells in vitro and in vivo. J Immunol. 179 (7), 4397-4404 (2007).
  26. Marelli-Berg, F. M., Okkenhaug, K., Mirenda, V. A two-signal model for T cell trafficking. Trends Immunol. 28 (6), 267-273 (2007).
  27. Carman, C. V., et al. Transcellular diapedesis is initiated by invasive podosomes. Immunity. 26 (6), 784-797 (2007).
  28. Carman, C. V. Mechanisms for transcellular diapedesis: probing and pathfinding by 'invadosome-like protrusions'. J Cell Sci. 122 ((Pt 17)), 3025-3035 (2009).
  29. Dustin, M. L., Tseng, S. Y., Varma, R., Campi, G. T. T cell-dendritic cell immunological synapses. Curr Opin Immunol. 18 (4), 512-516 (2006).
  30. Saito, T., Yokosuka, T. Immunological synapse and microclusters: the site for recognition and activation of T cells. Curr Opin Immunol. 18 (3), 305-313 (2006).
  31. Gomez, T. S., et al. HS1 functions as an essential actin-regulatory adaptor protein at the immune synapse. Immunity. 24 (6), 741-752 (2006).
  32. Burbach, B. J., Medeiros, R. B., Mueller, K. L., Shimizu, Y. T-cell receptor signaling to integrins. Immunol Rev. 218, 65-81 (2007).
  33. Vicente-Manzanares, M., Sanchez-Madrid, F. Role of the cytoskeleton during leukocyte responses. Nat Rev Immunol. 4 (2), 110-122 (2004).
  34. Ma, Z., Janmey, P. A., Finkel, T. H. The receptor deformation model of TCR triggering. Faseb J. 22 (4), 1002-1008 (2008).
  35. Ma, Z., Sharp, K. A., Janmey, P. A., Finkel, T. H. Surface-anchored monomeric agonist pMHCs alone trigger TCR with high sensitivity. PLoS Biol. 6 (2), e43(2008).
  36. Groves, J. T. Bending mechanics and molecular organization in biological membranes. Annu Rev Phys Chem. 58, 697-717 (2007).
  37. Xu, C., et al. Regulation of T cell receptor activation by dynamic membrane binding of the CD3epsilon cytoplasmic tyrosine-based motif. Cell. 135 (4), 702-713 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Aktywacja limfocyt w Tkom rki prezentuj ce antygenobrazowanie fluorescencyjneobrazowanie ywych kom rekYFP b onoweDS Redprzep yw jon w wapniastymulacja superantygenem

Powiązane artykuły