Tutaj prezentujemy mysi model niewydolności przetoki tętniczo-żylnej (AVF), w którym włączona jest klinicznie istotna konfiguracja zespolenia. Model ten może być wykorzystany do badania patofizjologii i testowania możliwych interwencji terapeutycznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Nowatorski mysi model niewydolności przetoki tętniczo-żylnej: procedura chirurgiczna w szczegółach
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Przetoka tętniczo-żylna (AVF) nadal cierpi z powodu dużej liczby niepowodzeń spowodowanych niedostateczną przebudową i przerostem błony wewnętrznej, z powodu którego dokładna patofizjologia pozostaje nieznana. W celu rozwikłania tej patofizjologii opracowano mysi model niewydolności AVF, w którym konfiguracja zespolenia przypomina preferowaną sytuację w warunkach klinicznych. Opisano model, w którym AVF powstaje poprzez połączenie żylnego końca gałęzi żyły szyjnej zewnętrznej z bokiem tętnicy szyjnej wspólnej za pomocą szwów przerywanych. Na poziomie histologicznym zaobserwowaliśmy postępujące zwężone zmiany błony wewnętrznej w drodze odpływu żylnego, które obserwuje się również w nieudanych ludzkich AVF. Chociaż procedura ta może być trudna technicznie ze względu na małe wymiary zwierzęcia, po wystarczającym szkoleniu udało nam się osiągnąć wskaźnik sukcesu chirurgicznego na poziomie 97%. Kluczową zaletą modelu mysiego jest dostępność zwierząt transgenicznych. Biorąc pod uwagę różne proponowane mechanizmy, które są odpowiedzialne za niewydolność AVF, wyłączenie genów, które mogą odgrywać rolę w przebudowie naczyń krwionośnych, może pomóc nam rozwikłać złożoną patofizjologię niewydolności AVF.
Wprowadzenie
Funkcjonalny kanał dostępu naczyniowego ma kluczowe znaczenie dla pacjentów z niewydolnością nerek, którzy są uzależnieni od przewlekłej hemodializy, aby pozostać przy życiu. Budowa przetoki tętniczo-żylnej (AVF) jest obecnie preferowanym wyborem w przypadku dostępu naczyniowego. Jednak powikłania związane z AVF stanowią główną przyczynę zachorowalności u pacjentów poddawanych przewlekłej hemodializie. Pomimo szeroko zakrojonych wysiłków naukowych żadne z nowatorskich podejść mających na celu zmniejszenie powikłań związanych z dostępem do AVF nie doprowadziło do znaczącej poprawy trwałości AVF. Część tego rozczarowującego postępu wiąże się z niepełnym zrozumieniem patofizjologii leżącej u podstaw nieprawidłowego dostępu do hemodializy.
Aby rozwikłać patofizjologię niepowodzeń w dostępie do AV, niezwykle ważne są modele zwierzęce, które ściśle naśladują ludzką patologię. W związku z tym należy wziąć pod uwagę nie tylko gatunek zwierzęcia, ale także miejsce zespolenia, wymagane leczenie przeciwzakrzepowe oraz czas obserwacji po operacji1. Podczas gdy duże zwierzęta są najbardziej odpowiednie do badań interwencyjnych mających na celu opracowanie nowych strategii terapeutycznych, modele mysie mają największy potencjał, aby uzyskać większy wgląd w mechanizmy molekularne leżące u podstaw niepowodzenia dostępu do AV ze względu na dostępność myszy transgenicznych. Ponadto do tego celu można wykorzystać dużą liczbę myszy przy niższych kosztach w porównaniu z większym wykorzystaniem zwierząt.
Pierwszy mysi model niepowodzenia AVF został opisany w 2004 roku przez Kwei i wsp.2 W tym modelu AVF zostały skonstruowane przy użyciu tętnicy szyjnej i żyły szyjnej w sposób end-to-end za pomocą cewnika wewnątrznaczyniowego. Model ten może być przydatny do badania wczesnej adaptacji żylnej w AVF, chociaż konfiguracja typu end-to-end i obecność cewnika wewnątrznaczyniowego ograniczają ważność tego modelu dla ludzkich AVF. Ulepszony model AVF został wprowadzony przez Castiera i wsp.3, w którym koniec tętnicy szyjnej jest połączony z bokiem żyły szyjnej. Jednak AVF u pacjentów hemodializowanych są zwykle konstruowane przez anatomizację końca żyły po stronie tętnicy. Dokładna konfiguracja AVF jest kluczową cechą modelu dostępu do AV, ponieważ określa profil hemodynamiczny w przewodzie4. Ten ostatni jest ważnym czynnikiem przyczyniającym się do dysfunkcji śródbłonka i późniejszego rozwoju przerostu błony wewnętrznej (IH)5.
Niedawno opracowano nowy model mysi o identycznej konfiguracji anatomicznej, jak u ludzi6. W tym modelu AVF są tworzone u myszy C57BL/6 poprzez zespolenie końca gałęzi żyły szyjnej zewnętrznej z boku tętnicy szyjnej wspólnej z przerwanymi szwami. W niniejszej pracy skupiamy się na procedurze mikrochirurgicznej tego modelu, aby ułatwić powszechne stosowanie tego mysiego modelu, mającego na celu rozwikłanie złożonej patofizjologii nieprawidłowego dostępu do hemodializy.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez komitet ds. dobrostanu zwierząt Centrum Medycznego Uniwersytetu w Lejdzie.
1. Przygotowanie i znieczulenie zwierząt
- Znieczulenie myszy (w wieku 1-3 miesięcy) w komorze indukcyjnej ciągłego znieczulenia wypełnionej 3-4% izofluranem.
- Ogol brzuszną stronę szyi i wewnętrzną część lewej górnej części nogi za pomocą elektrycznej maszynki do golenia i użyj kawałka taśmy, aby usunąć włosy.
- Nałóż maść do oczu na oba oczy.
- Ułóż zwierzę na kocu grzewczym, na którym zamocowana jest maska wentylacyjna na nos. Przymocuj głowę do maski na nos za pomocą taśmy klejącej.
- Dostarczyć izofluran w stężeniu 1,5-2,0% za pomocą powietrza wzbogaconego w tlen ustawionego na następujący przepływ: powietrze 0,3 l/min, 100% tlenu 0,2 l/min. Ściśnij skórę między palcami, aby ocenić głębokość znieczulenia i w razie potrzeby dostosować stężenie izofluranu.
- Przymocuj zwierzę do koca grzewczego za pomocą taśmy klejącej na wszystkich kończynach, która jest ustawiona w temperaturze około 37 °C w pozycji leżącej.
- Buprenorfinę rozpuszczoną w chlorku sodu (NaCl) 0,9% w dawce 0,1 mg/kg mc. należy wstrzyknąć podskórnie w bok zwierzęcia wraz z 0,5 ml jałowego NaCl 0,9%.
- Nałóż nalewkę z chlorheksydyny 0,5% na przygotowany obszar.
2. Nacięcie skóry
- Umieść zwierzę pod mikroskopem z głową skierowaną w stronę chirurga.
- Wykonaj podłużne nacięcie o długości około 1,5 cm w linii środkowej brzusznej szyi za pomocą mikronożyczek.
- Chwyć gruczoły ślinowe kleszczami i przemieszcz prawy gruczoł ślinowy w czaszce, aż znajdzie się częściowo poza raną.
3. Preparowanie i przygotowanie żyły
- Zidentyfikuj i tępo wypreparuj grzbietowo-przyśrodkową gałąź prawej zewnętrznej żyły szyjnej całkowicie z jej tkanki okołonaczyniowej, rozprzestrzeniając się tuż obok i w kierunku naczynia krwionośnego.
- Umieść pętlę (szew 10,0) wokół wyciętej żyły i załóż jeden węzeł bez jej blokowania.
4. Usuwanie mięśnia mostkowo-obojczykowo-sutkowego
- Za pomocą kleszczy tępo wypreparuj prawy mięsień mostkowo-obojczykowo-sutkowy z jego otoczenia, rozprzestrzeniając się wzdłuż jego granicy. Umieść parę otwartych kleszczy pod izolowanym mięśniem i podwiąż go proksymalnie i dystalnie za pomocą szwu 6,0. Następnie wytnij mięsień za pomocą kauteryzatora.
5. Preparowanie i przygotowanie tętnicy szyjnej wspólnej
- Zidentyfikuj i wypreparuj prawą tętnicę szyjną wspólną za pomocą kleszczy. Umieść nić do szwu 6.0 wokół tętnicy, aby pomóc w manipulacji tętnicą.
- Zaciski naczyniowe należy nakładać jak najdystalniej i proksymalniej.
- Wykonaj podłużne nacięcie w środku tętnicy o długości około 1 mm za pomocą specjalistycznych mikronożyczek.
- Przepłukać tętnicę roztworem heparyny [100 j.m./ml], aż naczynie będzie wolne od krwi.
- Zmierz i w razie potrzeby dostosuj długość nacięcia, aby dopasować ją do szerokości zacisku naczyniowego [1,1 mm].
6. Podwiązanie żyły
- Przyłóż zacisk naczyniowy proksymalnie do już przygotowanej żyły i umieść nić szwową wokół żyły.
- Zastosuj delikatną trakcję ogonową do żyły za pomocą hemostatu, który jest umieszczony na nici szwu i podwiąż żyłę tak dystalnie, jak to możliwe, za pomocą założonego wcześniej szwu 10,0.
- Przeciąć żyłę nożyczkami tuż proksymalnie do podwiązania.
- Za pomocą kleszczy naczyniowych delikatnie otwórz światło żyły i przepłucz je roztworem heparyny [100 j.m./ml].
7. Tworzenie zespolenia Część 1
- Połączyć żyłę z tętnicą za pomocą przerwanego szwu (10,0) za pomocą 2 węzłów kwadratowych w pozycji godziny dwunastej, a następnie szwu w pozycji godziny szóstej. Upewnij się, że połączyłeś żyłę z tętnicą, nie pozwalając jej obracać się wokół własnej osi. Obróć zwierzę, aby poprawić ekspozycję chirurgiczną.
- Umieść nić szwu wokół żyły i zastosuj delikatną trakcję boczną za pomocą hemostatu.
- Stosując te same szwy przerywane, należy uzupełnić zespolenie, zakładając około 3-4 dodatkowych szwów po widocznej brzusznej stronie zespolenia.
8. Podawanie heparyny
- Obróć koc grzewczy o 180° i ustaw ostrość mikroskopu na lewej górnej części nogi.
- Zidentyfikuj żyłę udową / tętnicę / wiązkę nerwową, szukając struktury naczyniowej, która biegnie podłużnie w środkowej części górnej części nogi i może być widoczna przez skórę. Wykonaj nacięcie mikronożyczkami o długości około 1 cm bezpośrednio nad żyłą udową wzdłuż.
- Ostrożnie wypreparować tkankę okołonaczyniową żyły udowej i wstrzyknąć heparynę w dawce 0,2 j.m./g masy ciała do żyły udowej.
9. Tworzenie zespolenia Część 2
- Wróć do obszaru szyi i usuń nić szwu, która została umieszczona wokół żyły.
- Umieścić nić do szwu (6.0), która następnie przechodzi poniżej tętnicy szyjnej, nad żyłą i ponownie poniżej tętnicy szyjnej. (Rysunek 1L)
- Usuń żylny zacisk naczyniowy.
- Następnie skręć w połowie ukończoną przetokę tętniczo-żylną o 180° wzdłuż osi tętnicy szyjnej w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara, jednocześnie skręcając oba zaciski naczyniowe i stosując trakcję przyśrodkową na końcach nici szwu.
- Uzupełnij zespolenie w taki sam sposób, jak opisano w kroku 7.2.
10. Usuwanie zacisków naczyniowych
- Usuń nić do szwów i obróć zaciski naczyniowe o 180° w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara.
- Usuń dystalny zacisk naczyniowy, a następnie bliższy zacisk naczyniowy.
- Ocenić drożność zespolenia, delikatnie zamykając drogę odpływu żylnego kleszczykami naczyniowymi. W przypadku zespolenia patentowego odcinek żylny przed okluzją będzie się rozszerzał w sposób pulsacyjny. Przenieś prawy gruczoł ślinowy do jego pierwotnej anatomicznej pozycji za pomocą kleszczy.
11. Zamykanie skóry i pielęgnacja pooperacyjna
- Zamknąć skórę górnej części nogi nieprzerwanym szwem (6.0).
- Zamknij skórę szyi nieprzerwanym szwem (6,0).
- Zdejmij zwierzę z koca grzewczego i wstrzyknij podskórnie 0,5 ml NaCl 0,9%.
- Umieść zwierzę w zaciemnionej klatce, która jest ogrzewana lampą grzewczą i pozwól mu w pełni się zregenerować. Kiedy zwierzę nie wraca w pełni do zdrowia, upewnij się, że nie cierpi na wstrząs hemodynamiczny z powodu krwawienia w okolicy operacyjnej. Zwróć uwagę na objawy, takie jak obrzęk szyi i wyciek krwi.
- Po około 6 godzinach od pierwszego wstrzyknięcia buprenorfiny należy wstrzyknąć podskórnie pojedynczą dawkę buprenorfiny o przedłużonym uwalnianiu w dawce zalecanej przez producenta, w celu zapewnienia odpowiedniej analgezji przez dodatkowe 72 godziny.
12. Zbieranie tkanek
- Znieczulić zwierzę mieszaniną znieczulającą zawierającą midazolam (5 mg/kg), medetomidynę (0,5 mg/kg) i fentanyl (0,05 mg/kg) podawaną dootrzewnowo.
- Unieruchom zwierzę w pozycji leżącej, wbijając igły przez jego łapy i policzki w nieogrzewaną matę silikonową.
- Wykonaj nacięcie o długości około 1,5-2,0 cm nad blizną na szyi za pomocą mikronożyczek.
- Rozwarstwić AVF i umieścić nici szwu (6.0) wokół bliższej, dalszej tętnicy i drogi odpływu żylnego, aby ułatwić identyfikację.
- Ocenić drożność AVF zgodnie z opisem w sekcji 10.3 protokołu.
- Otwórz jamę otrzewnej, wykonując laparotomię przyśrodkową za pomocą mikronożyczek.
- Przeciąć lewą i prawą brzuszną klatkę piersiową za pomocą nożyczek, zaczynając doogonowo w linii środkowej obojczyka. Za pomocą mikronożyczek przeciąć przeponę, która jest przymocowana do środkowej części brzusznej klatki piersiowej, a następnie przemieścić tę sekcję czaszki za pomocą kleszczy.
- Zlokalizuj dolną żyłę główną i przetnij ją mikronożycami.
- Wprowadzić igłę z igłą 23 do lewej komory i wykonać fuzję z PBS pod ciśnieniem około 100 mmHg, aż płyn wewnątrznaczyniowy będzie prawie czysty.
- Nie wyjmując igły, teraz perfuzjuj z 4% formaliną przez 10 minut pod ciśnieniem około 100 mmHg.
- Wytnij AVF, przecinając zarówno tętnice, jak i żyłę za pomocą mikronożyczek i zanurz go w 4% roztworze formaliny O/N.
13. Osadzanie i cięcie tkanek
- Przetworzyć tkankę na parafinę zgodnie z protokołem producenta. Zastosowany protokół składał się z następujących elementów:
- Zanurz w etanolu 70% na 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Powtórz 2x.
- Zanurz w etanolu 96% na 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Powtórz 2x.
- Zanurz w etanolu 99,5% na 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Powtórz raz.
- Zanurz się w etanolu 99,5% na 1,5 godziny w temperaturze pokojowej.
- Zanurz w ksylenie 100% na 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Powtórz raz.
- Zanurzyć w parafinie na 1 godzinę w temperaturze 62 °C. Powtórzyć 2x.
- Zanurzyć AVF w parafinie tak, aby żylna droga odpływowa była zorientowana prostopadle do kasety zatapiającej.
- Za pomocą mikrotomu utwórz 12 sekcji szeregowych, z których każda składa się z 30 sekcji o grubości 5 μm. Następnie, z każdej sekcji szeregowej, umieść jedną sekcję na pojedynczej szybie montażowej, zaczynając od pozycji pierwszej do dwunastej w uporządkowany sposób, zaczynając od obszaru najbliższego zespoleniu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Po utworzeniu anastomozy (Rysunek 1), należy ocenić jej drożność poprzez krótkotrwałe zamknięcie odpływu żylnego za pomocą kleszczyków naczyniowych. W przypadku drożnej anastomozy, odcinek naczyniowy proksymalnie względem zamknięcia powinien wyraźnie rozszerzać się w sposób pulsujący. Dodatkowo drożność potwierdza się za pomocą fluoroskopii w bliskiej podczerwieni (NIRF), która pełni funkcję angiografii (Rysunek 2). Błąd w procedurze chirurgicznej może doprowadzić do zamknięcia anastomoz...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
AVF jest uważany za piętę achillesową w leczeniu hemodializą. Niestety, AVF nadal cierpi z powodu dużej liczby awarii8-10. Pomimo szeroko zakrojonych badań nad mechanizmami leżącymi u podstaw tego zjawiska, dokładna patofizjologia pozostaje nieznana. Liczne mysie modele niepowodzenia AVF zostały już opisane w literaturze2,3,11,12. Jednak żaden z tych modeli nie zawiera konfiguracji zespolenia żylno-tętniczego, która jest najczęściej stosowana w sytuacji klinicznej. Jest to bardzo istotne, ponieważ w...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez grant z Dutch Kidney Foundation (KJPB 08.0003).
Carolien Rothuizen została doceniona za swój wkład w badania. Hoang Pham jest doceniany za pomoc w badaniu patologii.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Mikrosocpe | Leica | M80 | |
| Kleszcze | Medicon | 07.61.25 | |
| Kleszcze naczyniowe | S& T | JFL-3D.2 | |
| Kleszcze naczyniowe | S& T | D-5a.2 | |
| Kleszcze | Roboz | SS/45 | |
| Mikro nożyczki 5 mm ostrze | Narzędzia do precyzyjnego | nauki 15000-08 | |
| Mikro nożyce Ostrze 2 mm | Narzędzia do nauki precyzyjnej | 15000-03 | |
| Nożyczki | Medicon | 05.12.21 | |
| Aplikator klipsów 1 | S& T | CAF-4 | |
| Zacisk naczyniowy 1 | S& T | B-1V | |
| Clip Applier 2 | BBraun | FE572K | |
| Zacisk naczyniowy 2 | BBraun | FE740K | |
| Kleszcze hemostatyczne | BBraun | BH110 | |
| 10.0 szwy | BBraun | G1117041 | |
| 6.0 Szwy | BBraun | 768464 | |
| Cauterizer | Narzędzia do nauki precyzyjnej | 18010-00 | |
| Uchwyt igły | Medicon | 11.82.18 | |
| Maść do oczu | Pharmachemie | 41821101 | |
| Nalewka z chlorheksydyny 0,5% | Centrum Medyczne Uniwersytetu w Lejdzie | NA | |
| Heparyna | Leo Pharma | 012866-08 | |
| Buprenorphin | RB Pharmaceuticals | ||
| Isoflurane | Pharmachemie | 45,112,110 | |
| Maska anestezjologiczna | Uniwersytet w Maastricht | wykonany na zamówienie | |
| Midazolam | Actavis | AAAC6877 | |
| Deksmedetomidyna | Orion | 141-267 | |
| Fentanyl | Bipharma | 15923002 | |
| Komora indukcyjna do ciągłego znieczulenia | Rozwiązania weterynaryjne | AN010R |
Bibliografia
- Rotmans, J. I. Animal Models for Studying Pathophysiology of Hemodialysis Access. The Open Urology & Nephrology Journal. 7, 14-21 (2014).
- Kwei, S., et al. Early adaptive responses of the vascular wall during venous arterialization in mice. Am.J.Pathol. 164 (1), 81-89 (2004).
- Castier, Y., et al. Characterization of neointima lesions associated with arteriovenous fistulas in a mouse model. Kidney Int. 70 (2), 315-320 (2006).
- Krishnamoorthy, M. K., et al. Hemodynamic wall shear stress profiles influence the magnitude and pattern of stenosis in a pig AV fistula. Kidney Int. 74 (11), 1410-1419 (2008).
- Ene-Iordache, B., Cattaneo, L., Dubini, G., Remuzzi, A. Effect of anastomosis angle on the localization of disturbed flow in 'side-to-end' fistulae for haemodialysis access. Nephrol. Dial. Transplant. 28 (4), 997-1005 (2013).
- Wong, C. Y., et al. Vascular remodeling and intimal hyperplasia in a novel murine model of arteriovenous fistula failure. J.Vasc.Surg. 59 (1), 192-201 (2014).
- Rekhter, M., Nicholls, S., Ferguson, M., Gordon, D. Cell proliferation in human arteriovenous fistulas used for hemodialysis. Arterioscler. Thromb. 13 (4), 609-617 (1993).
- Falk, A. Maintenance and salvage of arteriovenous fistulas. J. Vasc. Interv. Radiol. 17 (5), 807-813 (2006).
- Tordoir, J. H., et al. Prospective evaluation of failure modes in autogenous radiocephalic wrist access for haemodialysis. Nephrol. Dial. Transplant. 18 (2), 378-383 (2003).
- Dixon, B. S., Novak, L., Fangman, J. Hemodialysis vascular access survival: upper-arm native arteriovenous fistula. Am. J. Kidney Dis. 39 (1), 92-101 (2002).
- Yang, B., Shergill, U., Fu, A. A., Knudsen, B., Misra, S. The mouse arteriovenous fistula model. J. Vasc. Interv. Radiol. 20 (7), 946-950 (2009).
- Kang, L., et al. Regional and systemic hemodynamic responses following the creation of a murine arteriovenous fistula. Am. J. Physiol Renal Physiol. 301 (4), F845-F851 (2011).
- Wong, C. Y., et al. Elastin is a key regulator of outward remodeling in arteriovenous fistulas. Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 49 (4), 480-486 (2015).
- Kennedy, R., et al. Does renal failure cause an atherosclerotic milieu in patients with end-stage renal disease. Am. J. Med. 110 (3), 198-204 (2001).
- Cheung, A. K., et al. Atherosclerotic cardiovascular disease risks in chronic hemodialysis patients. Kidney Int. 58 (1), 353-362 (2000).
- Lee, T., et al. Severe venous neointimal hyperplasia prior to dialysis access surgery. Nephrol. Dial. Transplant. 26 (7), 2264-2270 (2011).
- Kokubo, T., et al. CKD accelerates development of neointimal hyperplasia in arteriovenous fistulas. J. Am. Soc. Nephrol. 20 (6), 1236-1245 (2009).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
