Demonstrujemy metodę szczepienia hodowanych komórek w określone miejsca wczesnych embrionów myszy, aby określić ich potencjał in vivo. Wprowadzamy również zoptymalizowaną metodę elektroporacji, która wykorzystuje szklane naczynia włosowate o znanej średnicy, co pozwala na precyzyjne dostarczenie egzogennego DNA do kilku komórek w zarodkach.
Artykuł metodologiczny
Metody precyzyjnie zlokalizowanego transferu komórek lub DNA do wczesnych zarodków myszy po implantacji
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Manipulacja i hodowla wczesnych embrionów myszy to potężna, ale w dużej mierze niedostatecznie wykorzystywana technologia, zwiększająca wartość tego systemu modelowego. I odwrotnie, hodowla komórkowa jest szeroko stosowana w badaniach biologii rozwoju. Ważne jest jednak ustalenie, czy komórki hodowane in vitro rzeczywiście reprezentują typy komórek in vivo. Wszczepianie komórek do zarodków, a następnie ocena ich udziału w rozwoju jest użyteczną metodą określania potencjału komórek hodowanych in vitro. W tym badaniu opisujemy metodę przeszczepiania komórek w określone miejsce wczesnych zarodków myszy po implantacji, a następnie hodowli ex vivo. Wprowadzamy również zoptymalizowaną metodę elektroporacji, która wykorzystuje szklane kapilary o znanej średnicy, umożliwiając precyzyjną lokalizację i dostosowanie liczby komórek otrzymujących egzogenne DNA zarówno z wysoką wydajnością transfekcji, jak i niską śmiercią komórki. Techniki te, które nie wymagają żadnego specjalistycznego sprzętu, umożliwiają eksperymentalne manipulacje zarodkiem myszy w stadium gastrulacji i wczesnej organogenezy, umożliwiając analizę zaangażowania w subpopulacjach hodowanych komórek i wpływu manipulacji genetycznych in situ na różnicowanie komórek.
Wprowadzenie
Hodowla komórkowa była szeroko stosowana w badaniach biologii rozwojowej. Embrionalne komórki macierzyste myszy (ESC) i komórki macierzyste epiblastów (EpiSC) mogą różnicować się we wszystkie trzy listki zarodkowe in vitro i są użytecznym modelem różnicowania komórek we wczesnej embriogenezie ssaków. Wyprowadzenie tych linii komórkowych otworzyło możliwość manipulacji in vitro i szczegółowego badania zlokalizowanych zdarzeń sygnalizacyjnych i sieci transkrypcyjnych działających podczas wczesnego wzorcowania embrionalnego. Pozostaje jednak ważne określenie znaczenia in vivo wszelkich manipulacji przeprowadzanych w kulturze. Potencjał preimplantacyjnych mysich komórek macierzystych pochodzących z zarodków oceniono in vivo poprzez wprowadzenie ich z powrotem do zarodków preimplantacyjnych (morali lub blastocyst)1. Jednak EpiSC, które reprezentują komórki epiblastu w zarodkach poimplantacyjnych, nie mogą skutecznie integrować się z zarodkami przedimplantacyjnymi2,3. Nasze wcześniejsze odkrycia wykazały, że EpiSC mogą skutecznie generować chimery i przyczyniać się do rozwoju wszystkich listków zarodkowych po wszczepieniu do zarodków po implantacji4. Dlatego najlepszym sposobem oceny komórek hodowanych in vitro jest wprowadzenie ich do odpowiedniego środowiska in vivo.
Elektroporacja jest powszechnie stosowaną metodą dostarczania egzogennych cząsteczek do komórek docelowych zarówno w eksperymentach in vivo, jak i in vitro. Energia elektryczna może generować dużą liczbę porów w błonie komórkowej, co umożliwia wnikanie egzogennego kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA) lub kwasu rybonukleinowego (RNA) do komórek. Jednym z największych wyzwań związanych z tą techniką jest połączenie optymalnej żywotności ogniw z wysoką wydajnością elektrotransfekcji 5,6. Do elektroporacji kwasów nukleinowych w tkankach embrionalnych najczęściej stosuje się elektrody pozłacane, pozwalające na celowanie w komórki w szerokim zakresie przestrzennym7-9. Aby osiągnąć bardziej zlokalizowany transfer genów, wykorzystano elektrodę w kształcie igły, aby uzyskać ogniskowe pole elektryczne10,11. Korzystając z tej metody, autorzy wykazali, że po elektroporacji około 30-60 komórek przyjęło konstrukt DNA11. Niemniej jednak wydaje się, że dokładne dostosowanie liczby elektroporowanych ogniw pozostaje trudne w przypadku elektrody o stałej szerokości. Technika elektroporacji kapilarnej została wykorzystana do dostarczania plazmidów do pojedynczych komórek12-14. Technika ta nie została jednak zastosowana do elektroportowania plazmidów do zarodków ex vivo. Niedawno doniesiono, że mikrourządzenie miejscowo elektrorazuje kilka dystalnych komórek endodermy trzewnej (mniej niż 4 komórki) we wczesnych zarodkach myszy po implantacji15. Jednak nadal nie wiadomo, czy urządzenie to może skutecznie celować w ektodermę i mezodermę ex vivo.
W tym badaniu opisujemy dwie nowatorskie metody oceny funkcji komórek i genów we wczesnych zarodkach po implantacji. Najpierw pokazujemy, jak przeszczepiać komórki hodowane in vitro w określone miejsca we wczesnych zarodkach myszy, aby ocenić ich potencjał in vivo. Integracja przeszczepionych komórek i ich potomków, z których wszystkie są oznaczone znacznikiem genetycznym (np. zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP), może być dalej badana przez barwienie immunologiczne białek specyficznych dla tkanek4. Po drugie, opisujemy ulepszoną metodę precyzyjnego dostarczania DNA do zlokalizowanych miejsc w zarodku za pomocą elektroporacji. Zamiast używać elektrody w kształcie igły, umieściliśmy cienki drut w szklanej kapilarze z cienką końcówką i wykazaliśmy, że ta modyfikacja może dostarczyć DNA do niewielkiej liczby komórek z wysoką wydajnością i ograniczoną śmiercią komórki. Co więcej, pokazujemy, że stosując szklane kapilary o różnych rozmiarach otworów, możemy kontrolować liczbę elektroporowanych ogniw. Dlatego uważamy, że ta metoda może być bardzo przydatna do badania wczesnych wzorców embrionalnych obejmujących niewielką liczbę komórek.
Protokół
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z przepisami brytyjskiego Ministerstwa Spraw Wewnętrznych, określonymi w Ustawie o zwierzętach (procedurach naukowych) (1986) na podstawie licencji projektu o numerze 60/4435. W celu pobrania zarodków w określonych stadiach rozwojowych ustalono krycie w określonym czasie. Południe w dniu znalezienia czopa pochwowego wyznaczono dzień embrionalny (E) 0,5.
1. Sekcja zarodków poimplantacyjnych E7.5 lub E8.5 do hodowli ex vivo
- Poświęć ciężarne samice myszy przez zwichnięcie szyjki macicy.
- Odizoluj macicę nożyczkami, przytrzymując ją kleszczami i umieść w naczyniu o średnicy 30 mm wypełnionym podłożem M2.
- Ostrożnie rozerwij mięśniówkę macicy za pomocą dwóch par cienkich kleszczy.
- Oderwij decidua, uważając, aby nie przebić jam pozazarodkowych.
- Usuń błonę Reicherta, ściskając ją kleszczami i powoli oddzielając od zarodka.
- Sprawdź zarodki pod stereoskopowym mikroskopem, aby upewnić się, że woreczek żółtkowy, owodnia i stożek ektołożyskowy są nienaruszone.
- Przenieść zarodki do czystego naczynia M2 za pomocą pipety i umieścić na 30 mm plastikowej pokrywce na szalkę Petriego na lodzie ("platformie lodowej") na zarodkach w celu częściowego schłodzenia zarodków.
- W razie potrzeby przechowuj zarodki w M2 na platformie lodowej do 1,5 godziny, np. podczas przygotowywania pożywki lub manipulacji małymi partiami ~3-4 zarodków w RT.
Uwaga: Odzyskiwanie i preparacja zarodków gryzoni została szczegółowo opisana wcześniej7,8,16.
2. Przygotuj pożywkę do hodowli zarodków
- Świeżo rozmrozić dostępną w handlu surowicę szczurów (patrz Glanville-Jones i wsp.13 dla specyfikacji) lub surowicy szczurzej przygotowanej we własnym zakresie zgodnie z Copp i Cockroft16, którą inaktywowano termicznie przez 30 minut w temperaturze 56 °C i zamrożono w 1 ml podwielokrotności w temperaturze -80 °C
Uwaga: Dostępna na rynku surowica szczura jest dopuszczalna w okresach hodowli trwających 24-36 godzin, chociaż z naszego doświadczenia wynika, że surowica przygotowana we własnym zakresie jest lepsza w okresach hodowli do 48 godzin. - Świeżo przygotuj nadmiar (np. 10 ml) określonych suplementów składających się z Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM), 1% Non-Essential Amino Acids (NEAA), 2 mM L-glutaminy i 1 mM pirogronianu sodu.
- Obliczyć potrzebną objętość pożywki hodowlanej w zależności od liczby zarodków w każdym stadium, które mają być hodowane (patrz sekcja 3). Wymieszaj surowicę szczura z określonymi suplementami, aby uzyskać 50% pożywki (1:1 (v/v) surowica szczura: zdefiniowane suplementy) i/lub 75% pożywki hodowlanej (surowica szczura 3:1 (v/v): określone suplementy).
- Przepuścić pożywkę hodowlaną zarodków przez filtr 0,45 μm i dodać 10 000 j.m./ml penicyliny i 10 μg/ml streptomycyny.
Uwaga: Świeżo rozmrożony roztwór L-glutaminy i pirogronianu sodu ma kluczowe znaczenie dla rozwoju zarodka podczas hodowli ex vivo.
3. Warunki hodowli ex vivo dla różnych stadiów embrionalnych
- W przypadku zarodków E7,5: hodowla statyczna przy użyciu płytek 4-dołkowych w inkubatorze zaopatrzonym w 5% CO2 w powietrzu w temperaturze 37 °C przez 24 godziny. Hodowla do dwóch zarodków na basenik w 1 ml 50% pożywki hodowlanej.
- W przypadku zarodków E8,5: użyć aparatu do hodowli rolkowej8 obracającego się z prędkością 35 obr./min, obejmującego ciągłe gazowanie 5% CO2 w powietrzu w temperaturze 37 °C przez 24 godziny (1 ml 50% pożywki hodowlanej na zarodek).
- W przypadku zarodków E9,5: należy użyć rolkowego aparatu do hodowli obracającego się z prędkością 35 obr./min, zawierającego gazy dostarczane z 5% CO2, 40 % O2 55% N2 w temperaturze 37 °C przez 24 godziny (1 ml 75% pożywki hodowlanej na zarodek).
Uwaga: Hodowla zarodków w ciągu 3 godzin po eutanazji myszy, ponieważ przedłużone okresy w M2 niekorzystnie wpływają na rozwój. Patrz Copp i Cockroft16 dla metody hodowli zarodków ex vivo.
4. Szczepienie hodowanych komórek do embrionów myszy E7.5 lub E8.5
- Fizycznie zeskrobać EpiSC, które powszechnie wykazują ekspresję GFP, z 6-dołkowej płytki hodowlanej za pomocą końcówki pipety o pojemności 20-200 μl i umieścić je w 30-milimetrowym naczyniu zawierającym zarodki
Uwaga: Aby wprowadzić grudki komórek do zarodków, komórki powinny być fizycznie złomowane, a nie trypsynizowane. - Przymocuj ręcznie pociągniętą kapilę do szczepienia do rurki aspiratora, aby zrobić pipetę doustną.
- Delikatnie zassać pipetę ustną, aby pobrać jedną lub więcej grudek komórek o wielkości >20 komórek do naczynia włosowatego do szczepienia.
- Delikatnie wydmuchaj komórki, aby częściowo rozproszyć duże grudki.
- Wybierz jedną kępkę komórek zawierającą ~10-20 komórek i ponownie zassaj do naczynia włosowatego do szczepienia, trzymając je blisko otworu naczynia włosowatego. Uważaj, aby nie przesuwać wielokrotnie grudki komórek do i z kapilary, aby uniknąć rozpadu na mniejsze kawałki.
- Przytrzymaj zarodek luźno na miejscu za pomocą kleszczy i włóż kapilarnę do szczepienia w obszar zainteresowania, aby utworzyć otwór.
- Delikatnie wyrzuć grudkę z naczynia włosowatego do szczepienia, pozostawiając krótki sznurek 10-20 komórek osadzony w zarodku.
- Powtórz procedurę szczepienia dla żądanej liczby zarodków. Dla wygody używaj partii o wielkości 3-4 zarodków.
- Pozostawiając zarodki w tym samym naczyniu z pożywką M2, zobrazuj przeszczepione zarodki za pomocą mikroskopu preparacyjnego ze związkiem fluorescencyjnym z kamerą, skracając czas obrazowania do minimum, aby uniknąć wystawienia zarodków na nadmierne światło i ciepło.
Uwaga: Czasy obrazowania należy określić empirycznie, ponieważ będą one zależeć od specyfikacji aparatu i mikroskopu, a także od charakteru i intensywności fluorescencji fluoroforu. - Natychmiast po obrazowaniu przenieść zarodek w pastetce o minimalnej objętości pożywki M2 do wstępnie zbilansowanej pożywki hodowlanej (patrz sekcja 3).
Uwaga: Dokładnie zbadaj morfologię zarodków po szczepieniu. Hodowla tylko nienaruszonych zarodków.
5. Ręcznie robione materiały do elektroporacji i konfiguracja aparatury (przygotuj następujące elementy przed eksperymentami z elektroporacją):
- W przypadku pipet do wstrzykiwań DNA: pociągnij pipety do wstrzykiwań DNA za pomocą poziomego ściągacza do mikropipet. Pipety iniekcyjne powinny mieć cienką końcówkę z otworem mniejszym niż 10 μm, aby uniknąć uszkodzenia tkanek podczas wstrzykiwania DNA do jam embrionalnych.
- W przypadku elektroporacji kapilarnej szkła: za pomocą mikrokuźni wyciąć otwór pipet do iniekcji DNA na średnicę wewnętrzną 20 lub 30 μm. Aby uniknąć uszkodzenia komórek, gdy naczynia włosowate stykają się z zarodkiem w celu elektroporacji, końcówka szklanej kapilary musi być czysto przycięta i nie może zawierać ostrych, złamanych krawędzi.
- W przypadku ręcznie robionej elektrody kapilarnej (anody) (ryc. 1): włóż drut platynowy o średnicy 0,2 mm do szklanej kapilary do elektroporacji ze stałym otworem o średnicy 20 lub 30 μm, aby skupić prąd elektryczny i dostarczyć plazmidowe DNA do małego obszaru zainteresowania zarodka.
- W przypadku ręcznie robionej elektrody (katody) w kształcie litery L (rysunek 1): zegnij drut platynowy o średnicy 0,2 mm, tworząc kształt litery "L", z poziomą częścią "L" o długości około 1 mm.
- Przymocuj każdą elektrodę platynową do cienkiego izolowanego drutu i włóż ją do uchwytu igły do mikroiniekcji pokrytego taśmą izolacyjną.
- Zamontuj uchwyty igieł na standardowych uchwytach do narzędzi do mikromanipulacji.
- Podłącz obwód, jak pokazano na rysunku 1: podłącz elektrodę kapilarną do anody zasilacza; podłącz elektrodę w kształcie litery L do anody multimetru; podłącz katodę mulimetru do katody zasilacza.
6. Elektroporacja E7.5 lub E8.5 Embriony myszy
- Napełnij szklaną kapilarnę do elektroporacji PBS z dokładnością do 1-2 mm od góry i włóż prostą elektrodę platynową (anodę) do szklanej kapilary, aż dotrze do dna kapilary.
- Zakotwiczyć elektrodę w kształcie litery L (katodę) na powierzchni płytki Petriego o średnicy 30 mm wypełnionej PBS.
- Przenieść zarodek z pożywki M2 do naczynia do elektroporacji wypełnionego PBS.
- Wprowadzić igłę do wstrzykiwań z bocznego epiblastu do jamy owodniowej zarodka. Za pomocą pneumatycznej pompy pico wstrzyknąć roztwór DNA (pCAG-Cre:GFP lub pCAG-GFP 1-1,5 μg/ml z 0,01% zielonym barwnikiem spożywczym) do jamy, aż będzie całkowicie pełna. W przypadku zarodków E7,5-E8,5 na jeden zarodek potrzeba mniej niż 5 μl roztworu DNA. Używając zielonego barwnika jako wskaźnika, uważaj, aby nie rozsadzić zarodka.
- Ostrożnie umieść zarodek między elektrodami i przesuń elektrodę kapilarną dokładnie w miejsce, w którym ma zostać dostarczone DNA.
Uwaga: Orientacja zarodka zależy od obszaru, w którym DNA ma zostać poddane elektroporacji. - Elektroporację zarodka za pomocą 200 woltów (V) w 6 impulsach, z których każdy trwa 50 ms z 1-sekundowym odstępem między każdym impulsem.
- Natychmiast po elektroporacji przenieść zarodek do wstępnie zbilansowanej pożywki hodowlanej. W razie potrzeby powtórz proces dla następnego zarodka.
Uwaga: Dodaj pożywkę hodowlaną do sterylnego pojemnika i umieść ją w inkubatorze w celu wstępnego zrównoważenia pożywki. - Aby wykryć elektroporowane komórki 2 godziny po hodowli, należy przenieść zarodki na czystą 30-milimetrową szalkę Petriego z pożywką M2 za pomocą pastety. Zobrazuj zarodki jak w kroku 5.9 za pomocą mikroskopu preparacyjnego związków fluorescencyjnych.
- Natychmiast po obrazowaniu należy przenieść zarodki z powrotem do hodowli za pomocą pastety.
- Aby wykryć martwe komórki spowodowane elektroporacją, należy wybarwić zarodki barwnikiem jądrowym nieprzepuszczalnym dla błony komórkowej komórek dalekiej czerwieni (1:200 w pożywce do hodowli zarodków) w temperaturze 37 °C przez 10 minut 2 godziny po elektroporacji (opcjonalnie)
- Aby policzyć elektroporowane komórki, utrwal zarodki w 4% paraformaldehydzie (PFA) przez 2-4 godziny w temperaturze 4 °C, zabarwić jądro ultrafioletowym lub dalekoczerwonym fluorescencyjnym przeciwbarwnikiem jądrowym i zobrazować zarodki za pomocą mikroskopu konfokalnego (opcjonalnie).
Uwaga: Zbyt długi okres pozostawienia w PBS ma negatywny wpływ na wzrost zarodka. Dlatego należy upewnić się, że czas potrzebny do elektroporacji każdego zarodka jest zminimalizowany (<5 minuty na zarodek).
Wyniki
Szczepienie
Komórki EpiSC wykazujące powszechną ekspresję EGFP (r04-GFP, pochodzące z epiblastu w stadium E6.5, oraz C2, pochodzące in vitro z mESC)4 zostały ręcznie zeskrobane z naczynia hodowlanego i przeszczepione w różne miejsca zarodków w stadium E7.5 (Rycina 2A). Zarodki hodowano ex vivo i poddano analizie po 24 hr. Rozkład komórek dawcy oceniono za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. W przypadku inkorporacji komórek dawcy, ulegały one proliferacji, a ich pochodne rozprzestrzeniały się w obrębie zarodków biorcy (Rycina 2B). Zaobserwowano, że przeszczepy zawierające 10-16 komórek efektywnie inkorporowały się w zarodkach biorcy (Rycina 2A i 2B), jednak przeszczepienie większej liczby komórek nie prowadziło do lepszej chimeryzmu. Zamiast tego, przeszczepione komórki tworzyły nieinkorporowane skupiska (Rycina 2C i 2D).
Elektroporacja
Aby ocenić wydajność naszego systemu elektroporacji, wprowadziliśmy plazmidy ekspresyjne GFP (pCAG-GFP i pCAG-Cre:GFP) do określonych miejsc w embrionie. Zgodnie z wcześniejszym badaniem11, komórki GFP+ wykryto w embrionach 1-2 h po elektroporacji (Rycina 2E i 2G). Po przeprowadzeniu elektroporacji dystalnych komórek epiblastu w embrionie na późnym etapie prążka pierwotnego, znakowane komórki przyczyniły się do powstania ektodermy neuronalnej po 24 h hodowli (Rycina 2E i 2F). Wynik ten dobrze odpowiada znanym mapom losów komórek epiblastu w embrionach na etapie gastrulacji17. Podobnie, gdy plazmid ekspresyjny GFP został wprowadzony drogą elektroporacji do prążka pierwotnego w dniu E8.5 (2-5 somytów), komórki GFP+ przyczyniły się do powstania mezodermy paraksjalnej (Rycina 2G i 2H), co jest zgodne ze znanymi mapami losów późnego prążka pierwotnego18. Ponadto zaobserwowaliśmy wkład elektroporowanych komórek we wszystkie trzy listki zarodkowe (Rycina 2I-K), co sugeruje, że procedura elektroporacji nie zaburza zachowania komórek in vivo. Zauważyliśmy jednak, że mimo celowania w komórki epiblastu (E7.5) lub prążka pierwotnego (E8.5), elektroporowane były również niektóre komórki endodermy (Rycina 3C i Tabela 1).
Jedną z głównych zalet stosowania elektrody kapilarnej jest możliwość kontrolowania liczby elektroporowanych komórek poprzez prostą zmianę średnicy jej otworu. Aby określić liczbę elektroporowanych komórek, embriony utrwalono 2 hr po elektroporacji i poddano obrazowaniu całych preparatów za pomocą mikroskopu konfokalnego. Liczbę komórek GFP+ policzono ręcznie w stosach obrazów z-stack z mikroskopu konfokalnego. Tabela 1 pokazuje, że dla danego stadium zwiększenie rozmiaru otworu szklanej kapilary z 20 do 30 µm skutkuje pobraniem DNA przez większą liczbę komórek. Przy porównaniu tego samego rozmiaru otworu pomiędzy stadiami (E7.5 a E8.5) stwierdzono, że w tym późniejszym stadium elektroporowano więcej komórek. Efekt ten może wynikać z wyższego stężenia DNA obecnego w jamie owodniowej w stadium E8.5. Ponieważ roztwór DNA zmieszano z zielonym barwnikiem spożywczym, można wykorzystać zielony kolor do oceny stężenia DNA w jamie owodniowej. W mikroskopie wyraźnie widać, że w porównaniu z embrionami E8.5, zielony kolor po wstrzyknięciu DNA jest znacznie jaśniejszy w jamie embrionów E7.5. Chociaż do embrionów E7.5 i E8.5 wstrzykiwano roztwór DNA o tym samym stężeniu, w jamie owodniowej embrionów E8.5 znajdowało się więcej roztworu DNA w celu jej całkowitego wypełnienia, ponieważ są one większe. Po wycofaniu igły iniekcyjnej zawsze dochodzi do pewnego stopnia wycieku roztworu DNA z jamy owodniowej, a ponieważ otwór po nakłuciu jest większy w stosunku do wielkości jamy owodniowej u wcześniejszych embrionów, prawdopodobnie w stadium E7.5 wyciek był proporcjonalnie większy niż w E8.5, co prowadziło do niższego stężenia DNA. Różna liczba przetransfekowanych komórek może być również wynikiem różnych średnic lub różnych progów indukowanego napięcia przezbłonowego (ITV) komórek w różnych stadiach.
Wadą elektroporacji jest związana z nią śmierć komórek. Podobnie jak w przypadku tradycyjnych elektrod pozłacanych lub igłowych, elektroporacja z użyciem elektrody kapilarnej również powoduje śmierć komórek. Po elektroporacji obszar docelowy przybrał ciemniejszy kolor w porównaniu do obszarów sąsiednich (Rycina 3A i 3B), co wskazuje, że w tym obszarze musiało dojść do śmierci komórek w pewnym stopniu. Aby dokładniej określić liczbę komórek martwych spowodowanych procedurą elektroporacji, zarodki zabarwiono fluorescencyjnym barwnikiem jądrowym, nieprzenikającym przez błonę komórkową. Jądra martwych komórek zostały oznakowane nieprzenikającym przez błony barwnikiem fluorescencyjnym w zakresie dalekiej czerwieni. Barwienie potwierdziło, że technika elektroporacji kapilarnej skutkuje powstaniem jedynie niewielkiej liczby martwych komórek w pobliżu miejsca elektroporacji (Rycina 3D i Tabela 1).
Zauważyliśmy, że mimo pojawienia się martwych komórek w miejscu elektroporacji, komórki GFP+ oraz komórki martwe są od siebie w większym stopniu odseparowane (Rysunek 3E i 3F). Ponadto, gdy w stadium E8.5 przeprowadzono elektroporację tylnej bocznej części epiblastu z użyciem pCAG-GFP i otworu kapilary szklanej o średnicy 20µm, po 48 h hodowli wykryto dużą liczbę komórek GFP+ (Rysunek 3G i 3H). Biorąc to wszystko pod uwagę, wyniki te sugerują, że większość komórek GFP+ wykrytych 2 h po elektroporacji pozostaje żywotna podczas dalszej hodowli.
Zliczono liczbę komórek GFP+ po 24 h hodowli ex vivo. Sześć embrionów poddano elektroporacji pCAG-GFP w stadium E7.5, wykorzystując kapilarę o średnicy 20µm. Wykryto 107±31 (średnia ± s.d.) komórek GFP+/embrion. Ponieważ na początku hodowli (2 h) średnio 9 komórek na embrion zostało poddanych elektroporacji (Tabela 1), sugeruje to, że elektroporowane komórki przeszły 3-4 podziały w ciągu 2 h. Średni czas podwojenia liczby komórek w embrionach od stadium E7.5 do E8.5 wynosi około 6-7 h we wszystkich komórkach z wyjątkiem tych w węźle brzusznym19,20. Sugeruje to, że procedura elektroporacji nie hamuje normalnego wzrostu komórek.
Rycina 1. Schemat obwodu przedstawiający układ do elektroporacji. Zarodek z roztworem DNA w jamie owodniowej został umieszczony pomiędzy dwiema elektrodami. Prąd o wybranych parametrach był dostarczany przez generator impulsów prostokątnych (zasilacz). Multimetr został podłączony szeregowo w celu wykrycia prądu elektrycznego przepływającego przez zarodek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 2. Rozkład komórek przeszczepionych lub poddanych elektroporacji w embrionach gospodarza. (A-H) Nałożenie fluorescencji GFP (zielona) na obrazy w jasnym polu całych embrionów (skala szarości) (A) 10-16 komórek GFP+ EpiSCs przeszczepiono do regionu dystalnego embrionu w późnej fazie prążka. (C) Większy skup komórek GFP+ EpiSCs przeszczepiono do regionu dystalnego embrionu w środkowej fazie prążka. (B i D) Rozkład komórek pochodzących z EpiSCs (zielone) w embrionach gospodarza (pokazanych w A i C) po 24 h hodowli. (B) Komórki GFP+ rozproszone w embrionie gospodarza, co sugeruje prawidłową integrację komórek donora. (D) Przeszczepienie większych skup komórek doprowadziło do powstania niezintegrowanych skup w embrionie gospodarza. (E-K) Plazmid pCAG-Cre:GFP wprowadzony metodą elektroporacji do specyficznych obszarów embrionów typu dzikiego. Elektroporacja regionu dystalnego embrionu we wczesnej fazie pączka (E) lub prążka pierwotnego embrionu w fazie 2-5 somytów (G) zaowocowała obecnością komórek GFP+ w tych regionach 2 h po zabiegu. (F i H) Rozkład komórek GFP+ w embrionach gospodarza po 24 h hodowli, wykazujący, że komórki poddane elektroporacji przyczyniają się do tworzenia neuroektodermy (czarna strzałka) (F) oraz mezodermy paraksjalnej (biała strzałka) (H). (I-K) Immunobarwienie DAB dla komórek GFP+ wykazujące, że komórki poddane elektroporacji mogą dawać początek neuroektodermie (I), mezodermie (J) i endodermie (J i K) po 24 h hodowli. Pasek skali (A-H) = 250 µm; pasek skali (I-K) = 100 µm. Uwaga: Rycina 1A i 1B zostały przedrukowane z naszej poprzedniej publikacji4. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 3. Rozkład komórek GFP+ i martwych komórek w embrionach po elektroporacji. (A-C) Plazmid pCAG-Cre:GFP elektroporowany do komórek tylno-bocznego epiblastu embrionu w stadium E8.5 (stadium 2-5 somytów) (rozmiar otworu kapilary: 20 µm). (A) 2 h po zabiegu obszar docelowy wykazywał ciemniejszy kolor (biała strzałka) w porównaniu do innych części embrionu. Wstawka przedstawia powiększenie regionu elektroporowanego. (B) Obraz w polu jasnym (skala szarości) nałożony na kanał fluorescencji zielonej, ukazujący komórki elektroporowane (zielone). (C) Przekrój z-slice z mikroskopu konfokalnego pokazujący, że dwie komórki endodermy (zielone) również pobrały plazmid podczas celowania w komórki tylno-bocznego epiblastu. Jądra komórkowe są zaznaczone na czerwono. (D-F) Plazmid pCAG-Cre:GFP został elektroporowany do tylnej części węzła embrionu w stadium E8.5 (rozmiar otworu kapilary: 30 µm). Embrion hodowano przez 2 h. Komórki elektroporowane są zaznaczone na zielono, a martwe komórki na czerwono. (D) Obszar elektroporowany zawiera zarówno komórki GFP+, jak i martwe komórki. Obszar w białej ramce został poddany dalszej analizie w mikroskopie konfokalnym. Ręczne liczenie stosu z-stack wykazało obecność 33 komórek GFP+ i 23 martwych komórek w tym obszarze. Tylko dwie komórki były dodatnie dla obu fluoroforów. (E i F) Widok XYZ przekroju z-slice z mikroskopu konfokalnego z obszaru zaznaczonego białą ramką w D, pokazujący, że komórki GFP+ są oddzielone od martwych komórek. Jądra są zaznaczone na niebiesko. (G i H) Plazmid pCAG-Cre:GFP został elektroporowany do kilku komórek w tylno-bocznym epiblastcie embrionu w stadium E8.5 (rozmiar otworu kapilary: 20 µm) i zobrazowany po dwóch (G) oraz 48 (H) godzinach hodowli ex vivo. Uwaga: (H) Embrion został przedzielony na pół po hodowli. Regiony głowy i serca zostały usunięte. Pasek skali (A, B, D, G i H) = 250 µm; pasek skali (C, E i F) = 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
| Średnica otworu rurki kapilarnej | Stadium zarodka | Wydajność elektroporacji: liczba zarodków zawierających komórki GFP+ po 2h / całkowita liczba elektroporowanych zarodków (liczba zarodków GFP+, które rozwijały się prawidłowo po 24 lub 48h hodowli) | Średnia liczba komórek GFP+ na zarodek ±s.d. (n= liczba badanych zarodków) | Liczba komórek endodermy GFP+ na każdy zarodek ±s.d. (n= liczba badanych zarodków) |
| 20μm | E7.5 (LS-LB) | 7 / 9 (7) | 9±3 (n=4) | 4±2 (n=4) |
| 30μm | E7.5 (LS-LB) | 13 / 15 (12) | 17±2(n=4) | 6±1 (n=4) |
| 20μm | E8.5 (2-5 somites) | 12 / 13 (10) | 21±4 (n=4) | 11±4 (n=4) |
| 30μm | E8.5 (2-5 somites) | 2 / 2 (2) | 33 i 26 (n=2) | 14 i 16 (n=2) |
Tabela 1. Efektywność elektroporacji plazmidu pCAG-Cre:GFP w embrionach myszy.
Skróty: LS, późny etap pręgi pierwotnej; LB: późny etap pąka. Embriony są klasyfikowane zgodnie z etapami Downs i Davies12
Dyskusja
Szczepienia
Krytycznym krokiem w eksperymentach z przeszczepianiem komórek jest wstawienie spójnego ciągu komórek, najlepiej w jednym działaniu, aby uniknąć rozpadu grudki. Ta technika wymaga pewnej praktyki w kontrolowaniu pipety do jamy ustnej. Jeśli komórki dawcy dobrze wbudują się w gospodarza, ich pochodne rozproszą się w zarodku. Aby dokładniej określić, czy rozproszone komórki pochodzące od dawcy odpowiednio różnicują się w organizmie gospodarza, można przeprowadzić barwienie immunologiczne na skrawkach zarodka. Jeśli komórki dawcy nie są kompatybilne ze środowiskiem gospodarza, albo nie mogą być wykryte (ponieważ są wydalane z zarodka), albo tworzą niewłączone grudki w zarodkach po hodowli. Jeśli zaobserwowano zarówno rozproszone komórki, jak i skupiska komórek, może to oznaczać, że przeszczepiono zbyt wiele komórek, a nadmiar komórek dawcy, które nie mogą wchodzić w interakcje z otaczającymi komórkami gospodarza, spowodował tworzenie się grudek. W takim przypadku można wykonać dodatkowe przeszczepy zawierające mniejszą liczbę komórek.
Głównym ograniczeniem techniki przeszczepiania komórek jest to, że nie jest możliwe określenie pełnego potencjału komórek in vivo , ponieważ nie osiągnięto hodowli ex vivo myszy w okresie dłuższym niż 48 godzin. Jednak w połączeniu z wstrzyknięciem komórek pod kontrolą ultradźwięków możliwe jest przeniesienie hodowanych komórek do zarodków w macicy. Podsumowując, eksperymenty z przeszczepami komórek były szeroko stosowane w naszej grupie i dały nam cenne wskazówki na temat potencjału in vivo różnych typów komórek4,21,22. Jest to technika ogólnego zastosowania służąca do oceny potencjału in vivo komórek hodowanych in vitro we wczesnych zarodkach poimplantacyjnych.
Elektroporacja
Chociaż w tym badaniu wykazaliśmy jedynie, że skuteczne jest stosowanie techniki elektroporacji kapilarnej do celowania w epiblast, możliwe jest również celowe celowanie w inne listki rozrodcze, takie jak komórki endodermy. Krytycznym krokiem w technice elektroporacji kapilarnej jest zminimalizowanie czasu potrzebnego do elektroporacji każdego zarodka (< 5 minut na zarodek), ponieważ PBS jest bardzo nieoptymalny dla wczesnych zarodków myszy. Nasze powyższe dane wykazały, że w większości obszarów zarodków elektroporacja nie wpływa na wzrost zarodka. Jednak elektroporacja w węźle spowodowała nieprawidłowy rozwój i doprowadziła do przedwczesnej śmierci zarodka. Jest to prawdopodobnie spowodowane uszkodzeniem lub śmiercią komórek, które tworzą ważne centra sygnalizacyjne23. W związku z tym za pomocą tej techniki należałoby unikać tego regionu. Kolejnym zastrzeżeniem jest to, że, jak wspomniano w sekcji wyników, podczas gdy celem były komórki epiblastu lub prymitywne smugi, niektóre komórki endodermy zostały również poddane elektroporacji. Może to być spowodowane tym, że DNA dociera do endodermy przez szczeliny pod nabłonkiem epiblastu. Endoderma składa się z komórek nabłonkowych i z naszego doświadczenia wynika, że komórki te mają większą skłonność do pobierania DNA. Dlatego stosując tę technikę do mapowania losu, ważne jest, aby ocenić, które komórki początkowo pobierają DNA.
Należy również zauważyć, że chociaż plazmidy pCAG-GFP i pCAG-Cre:GFP mogą być skutecznie dostarczane przy użyciu parametrów elektroporacji pokazanych w tym badaniu, wydajność innych konstruktów DNA może się różnić i wymagać indywidualnej optymalizacji. Zmiany w stężeniu DNA, napięciu elektroporacji lub liczbie impulsów mogą być dokonane, jeśli plazmidy okażą się trudne do transfekcji.
Podsumowując, nasz zoptymalizowany system elektroporacji kapilarnej może skutecznie i powtarzalnie dostarczać plazmidy GFP lub Cre:GFP do bardzo niewielu komórek w zarodku przy ograniczonej śmierci komórki. Ponieważ metoda ta nie wymaga drogiego ani wysoce specjalistycznego sprzętu, może być bardzo przydatna do badań śledzenia komórek lub do testowania efektu ekspresji ektopowej lub warunkowej delecji genów we wczesnych zarodkach, jeśli elektroporacja jest wykonywana w zarodkach zawierających floksowane warunkowe zmutowane allele. W związku z tym ta technika elektroporacji stanowi użyteczne narzędzie funkcjonalne do zrozumienia roli czynników wewnętrznych komórki w kontekście zlokalizowanych środowisk embrionalnych typu dzikiego.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów finansowych lub innych.
Podziękowania
Dziękujemy Filipowi Wymeerschowi i Anestisowi Tsakiridisowi za komentarze do manuskryptu, pracownikom jednostki ds. zwierząt SCRM za pomoc w utrzymaniu zwierząt oraz prof. Stuartowi Forbesowi za odczynniki immunohistochemiczne. Praca ta była wspierana przez grant MRC Mr/K011200/1 oraz Chińską Radę Stypendialną
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kleszcze | Dumostar | T5390 | |
| Preparacyjny mikroskop stereoskopowy | System stereomikroskopu Zeiss | Stemi 2000-C | |
| z fluorescencją | Nikon | AZ100 | |
| Mikroskop odwrócony z aparatem cyfrowym | Olympus | Olympus BX61 | |
| Odwrócony mikroskop konfokalny | Leica Microsystems | Leica TCS SP8 | |
| Agaroza o niskiej temperaturze topnienia | Life Technologies | 16520-050 | |
| Pipety Pasteura | Fisher Scientific | 11397863 | |
| szalki Petriego 30 mm | Fisher Scientific | 121V | |
| płytki 4-dołkowe | Thermo scientific | 179820 | |
| M2 średnie | Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS) | Life Technologies | 10010015 | |
| Paraformaldehyd (PFA) | Pipety Sigma-Aldrich | P6148 | |
| NICHIRYO | Nichipet | ||
| wskazówki | Greiner Bio One | 685280 | |
| Inkubator do hodowli komórkowych | SANYO | MCO-17AIC | |
| Aparatura do hodowli rolkowej | BTC Engineering | ||
| Filtry strzykawkowe 0,45 i mikro; m, sterylne | Sigma-Aldrich | 10462100 | |
| Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM) | Sigma-Aldrich | G5154 | |
| aminokwasy endogenne (NEAA) | Life Technologies | 11140050 | |
| L-glutamina | Fisher Scientific | SH30549.01 | |
| Roztwór pirogronianu sodu | Fisher Scientific | SH30239.01 | |
| Penicylina i Streptomycyna 10.000UI/ml | Lonza | DE17-602E | |
| Nabój gazowy do przenośnego palnika Meker | COLEMAN | COLEMAN 250 | |
| Cienkościenne borokrzemianowe szkło kapilarne z Fillamentem, OD 1,0 mm, ID 0,78 mm | Aparat Harvard | 640798 | |
| Zespoły probówek aspiratora do kalibrowanych pipet mikrokapilarnych | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Ściągacz do mikropipet płomieniowych/brązowych | Firma Sutter Instrument | P-97 | |
| Mikrokuźnia | De Fonbrune | BS030301 | |
| Pneumatyczna pompa pico | Końcówki do mikroładowarek World Precision Instruments | PV830 | |
| Eppendorf | 5242956.003 | ||
| Generator impulsów prostokątnych ECM 830 | BTX | 45-0002 | |
| Zielony barwnik spożywczy | Sigma-Aldrich | CI 42053 | |
| Dalekoczerwony barwnik jądrowy nieprzepuszczalny dla błony komórkowej | Biotium | 40060-T | |
| pCAG-Cre:GFP | Addgene | #13776 | |
| pCAG-GFP | Addgene | #16664 | |
| Multimetr | Excel | XL830L | |
| Mikromanipulatory | Leitz | ||
| Drut platynowy o średnicy 0,2 mm | Agar Scientific | E404-2 | |
| Przeciwciało anty-GFP | Abcam | ab13970 | |
| Kozioł anty-IgY kurczaka, HRP | Santa Cruz | sc-2428 | |
| Płynny system chromogenów substratowych DAB+ | Dako | K3467 | |
| 4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI) | Life Technologies | D21490 | |
| Dalekoczerwone fluorescencyjne przeciwbarwienie jądrowe | Life Technologies | T3605 |
Bibliografia
- O'Hagan, A. R., Morton, R., Eid, N. Loss of asthma control in pediatric patients after discontinuation of long-acting Beta-agonists. Pulmonary med. , 894063(2012).
- Brons, I. G., et al. Derivation of pluripotent epiblast stem cells from mammalian embryos. Nature. 448, 191-195 (2007).
- Tesar, P. J., et al. New cell lines from mouse epiblast share defining features with human embryonic stem cells. Nature. 448, 196-199 (2007).
- Huang, Y., Osorno, R., Tsakiridis, A., Wilson, V. In Vivo differentiation potential of epiblast stem cells revealed by chimeric embryo formation. Cell rep. 2, 1571-1578 (2012).
- Sadik, M. M., et al. Scaling relationship and optimization of double-pulse electroporation. Biophys. J. 106, 801-812 (2014).
- Kaestner, L., Scholz, A., Lipp, P. Conceptual and technical aspects of transfection and gene delivery. Bioorg. Med. Chem. Lett. , (2015).
- Soares, M. L., Torres-Padilla, M. E., Zernicka-Goetz, M. Bone morphogenetic protein 4 signaling regulates development of the anterior visceral endoderm in the mouse embryo. Dev. Growth Differ. 50, 615-621 (2008).
- Pierreux, C. E., Poll, A. V., Jacquemin, P., Lemaigre, F. P., Rousseau, G. G. Gene transfer into mouse prepancreatic endoderm by whole embryo electroporation. JOP. 6, 128-135 (2005).
- Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Dev. Biol. 7, 107(2007).
- Davidson, B. P., Tsang, T. E., Khoo, P. L., Gad, J. M., Tam, P. P. Introduction of cell markers into germ layer tissues of the mouse gastrula by whole embryo electroporation. Genesis. 35, 57-62 (2003).
- Khoo, P. L., Franklin, V. J., Tam, P. P. Fate-Mapping Technique: Targeted Whole-Embryo Electroporation of DNA Constructs into the Germ Layers of Mouse Embryos 7-7.5 Days Post-coitum. CSH protocols. 2007. , pdb.prot4893(2007).
- Tawk, M., Bianco, I. H., Clarke, J. D. Focal electroporation in zebrafish embryos and larvae. Methods Mol Biol. 546, 145-151 (2009).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo--from single cells to the entire brain. Differentiation. 70, 148-154 (2002).
- Nolkrantz, K., et al. Electroporation of single cells and tissues with an electrolyte-filled capillary. Anal. Chem. 73, 4469-4477 (2001).
- Mazari, E., et al. A microdevice to locally electroporate embryos with high efficiency and reduced cell damage. Development. 141, 2349-2359 (2014).
- Copp, A. J., Cockroft, D. L. Postimplantation mammalian embryos : a practical approach. , IRL Press. (1990).
- Tam, P. P., Behringer, R. R. Mouse gastrulation: the formation of a mammalian body plan. Mech. Dev. 68, 3-25 (1997).
- Wilson, V., Beddington, R. S. Cell fate and morphogenetic movement in the late mouse primitive streak. Mech. Dev. 55, 79-89 (1996).
- Tzouanacou, E., Wegener, A., Wymeersch, F. J., Wilson, V., Nicolas, J. F. Redefining the progression of lineage segregations during mammalian embryogenesis by clonal analysis. Dev Cell. 17, 365-376 (2009).
- Bellomo, D., Lander, A., Harragan, I., Brown, N. A. Cell proliferation in mammalian gastrulation: the ventral node and notochord are relatively quiescent. Dev. Dynam. 205, 471-485 (1996).
- Tsakiridis, A., et al. Distinct Wnt-driven primitive streak-like populations reflect in vivo lineage precursors. Development. 141, 1209-1221 (2014).
- Gouti, M., et al. In vitro generation of neuromesodermal progenitors reveals distinct roles for wnt signalling in the specification of spinal cord and paraxial mesoderm identity. PLoS biology. 12, e1001937(2014).
- Beddington, R. S. Induction of a second neural axis by the mouse node. Development. 120, 613-620 (1994).
Przedruki i uprawnienia
