Metody precyzyjnie zlokalizowanego transferu komórek lub DNA do wczesnych zarodków myszy po implantacji

Podsumowanie

Demonstrujemy metodę szczepienia hodowanych komórek w określone miejsca wczesnych embrionów myszy, aby określić ich potencjał in vivo. Wprowadzamy również zoptymalizowaną metodę elektroporacji, która wykorzystuje szklane naczynia włosowate o znanej średnicy, co pozwala na precyzyjne dostarczenie egzogennego DNA do kilku komórek w zarodkach.

Streszczenie

Manipulacja i hodowla wczesnych embrionów myszy to potężna, ale w dużej mierze niedostatecznie wykorzystywana technologia, zwiększająca wartość tego systemu modelowego. I odwrotnie, hodowla komórkowa jest szeroko stosowana w badaniach biologii rozwoju. Ważne jest jednak ustalenie, czy komórki hodowane in vitro rzeczywiście reprezentują typy komórek in vivo. Wszczepianie komórek do zarodków, a następnie ocena ich udziału w rozwoju jest użyteczną metodą określania potencjału komórek hodowanych in vitro. W tym badaniu opisujemy metodę przeszczepiania komórek w określone miejsce wczesnych zarodków myszy po implantacji, a następnie hodowli ex vivo. Wprowadzamy również zoptymalizowaną metodę elektroporacji, która wykorzystuje szklane kapilary o znanej średnicy, umożliwiając precyzyjną lokalizację i dostosowanie liczby komórek otrzymujących egzogenne DNA zarówno z wysoką wydajnością transfekcji, jak i niską śmiercią komórki. Techniki te, które nie wymagają żadnego specjalistycznego sprzętu, umożliwiają eksperymentalne manipulacje zarodkiem myszy w stadium gastrulacji i wczesnej organogenezy, umożliwiając analizę zaangażowania w subpopulacjach hodowanych komórek i wpływu manipulacji genetycznych in situ na różnicowanie komórek.

Wprowadzenie

Hodowla komórkowa była szeroko stosowana w badaniach biologii rozwojowej. Embrionalne komórki macierzyste myszy (ESC) i komórki macierzyste epiblastów (EpiSC) mogą różnicować się we wszystkie trzy listki zarodkowe in vitro i są użytecznym modelem różnicowania komórek we wczesnej embriogenezie ssaków. Wyprowadzenie tych linii komórkowych otworzyło możliwość manipulacji in vitro i szczegółowego badania zlokalizowanych zdarzeń sygnalizacyjnych i sieci transkrypcyjnych działających podczas wczesnego wzorcowania embrionalnego. Pozostaje jednak ważne określenie znaczenia in vivo wszelkich manipulacji przeprowadzanych w kulturze. Potencjał preimplantacyjnych mysich komórek macierzystych pochodzących z zarodków oceniono in vivo poprzez wprowadzenie ich z powrotem do zarodków preimplantacyjnych (morali lub blastocyst)¹. Jednak EpiSC, które reprezentują komórki epiblastu w zarodkach poimplantacyjnych, nie mogą skutecznie integrować się z zarodkami przedimplantacyjnymi^2,3. Nasze wcześniejsze odkrycia wykazały, że EpiSC mogą skutecznie generować chimery i przyczyniać się do rozwoju wszystkich listków zarodkowych po wszczepieniu do zarodków po implantacji⁴. Dlatego najlepszym sposobem oceny komórek hodowanych in vitro jest wprowadzenie ich do odpowiedniego środowiska in vivo.

Elektroporacja jest powszechnie stosowaną metodą dostarczania egzogennych cząsteczek do komórek docelowych zarówno w eksperymentach in vivo, jak i in vitro. Energia elektryczna może generować dużą liczbę porów w błonie komórkowej, co umożliwia wnikanie egzogennego kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA) lub kwasu rybonukleinowego (RNA) do komórek. Jednym z największych wyzwań związanych z tą techniką jest połączenie optymalnej żywotności ogniw z wysoką wydajnością elektrotransfekcji ^5,6. Do elektroporacji kwasów nukleinowych w tkankach embrionalnych najczęściej stosuje się elektrody pozłacane, pozwalające na celowanie w komórki w szerokim zakresie przestrzennym^7-9. Aby osiągnąć bardziej zlokalizowany transfer genów, wykorzystano elektrodę w kształcie igły, aby uzyskać ogniskowe pole elektryczne^10,11. Korzystając z tej metody, autorzy wykazali, że po elektroporacji około 30-60 komórek przyjęło konstrukt DNA¹¹. Niemniej jednak wydaje się, że dokładne dostosowanie liczby elektroporowanych ogniw pozostaje trudne w przypadku elektrody o stałej szerokości. Technika elektroporacji kapilarnej została wykorzystana do dostarczania plazmidów do pojedynczych komórek^12-14. Technika ta nie została jednak zastosowana do elektroportowania plazmidów do zarodków ex vivo. Niedawno doniesiono, że mikrourządzenie miejscowo elektrorazuje kilka dystalnych komórek endodermy trzewnej (mniej niż 4 komórki) we wczesnych zarodkach myszy po implantacji¹⁵. Jednak nadal nie wiadomo, czy urządzenie to może skutecznie celować w ektodermę i mezodermę ex vivo.

W tym badaniu opisujemy dwie nowatorskie metody oceny funkcji komórek i genów we wczesnych zarodkach po implantacji. Najpierw pokazujemy, jak przeszczepiać komórki hodowane in vitro w określone miejsca we wczesnych zarodkach myszy, aby ocenić ich potencjał in vivo. Integracja przeszczepionych komórek i ich potomków, z których wszystkie są oznaczone znacznikiem genetycznym (np. zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP), może być dalej badana przez barwienie immunologiczne białek specyficznych dla tkanek⁴. Po drugie, opisujemy ulepszoną metodę precyzyjnego dostarczania DNA do zlokalizowanych miejsc w zarodku za pomocą elektroporacji. Zamiast używać elektrody w kształcie igły, umieściliśmy cienki drut w szklanej kapilarze z cienką końcówką i wykazaliśmy, że ta modyfikacja może dostarczyć DNA do niewielkiej liczby komórek z wysoką wydajnością i ograniczoną śmiercią komórki. Co więcej, pokazujemy, że stosując szklane kapilary o różnych rozmiarach otworów, możemy kontrolować liczbę elektroporowanych ogniw. Dlatego uważamy, że ta metoda może być bardzo przydatna do badania wczesnych wzorców embrionalnych obejmujących niewielką liczbę komórek.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z przepisami brytyjskiego Ministerstwa Spraw Wewnętrznych, określonymi w Ustawie o zwierzętach (procedurach naukowych) (1986) na podstawie licencji projektu o numerze 60/4435. W celu pobrania zarodków w określonych stadiach rozwojowych ustalono krycie w określonym czasie. Południe w dniu znalezienia czopa pochwowego wyznaczono dzień embrionalny (E) 0,5.

1. Sekcja zarodków poimplantacyjnych E7.5 lub E8.5 do hodowli ex vivo

1. Poświęć ciężarne samice myszy przez zwichnięcie szyjki macicy.
2. Odizoluj macicę nożyczkami, przytrzymując ją kleszczami i umieść w naczyniu o średnicy 30 mm wypełnionym podłożem M2.
3. Ostrożnie rozerwij mięśniówkę macicy za pomocą dwóch par cienkich kleszczy.
4. Oderwij decidua, uważając, aby nie przebić jam pozazarodkowych.
5. Usuń błonę Reicherta, ściskając ją kleszczami i powoli oddzielając od zarodka.
6. Sprawdź zarodki pod stereoskopowym mikroskopem, aby upewnić się, że woreczek żółtkowy, owodnia i stożek ektołożyskowy są nienaruszone.
7. Przenieść zarodki do czystego naczynia M2 za pomocą pipety i umieścić na 30 mm plastikowej pokrywce na szalkę Petriego na lodzie ("platformie lodowej") na zarodkach w celu częściowego schłodzenia zarodków.
8. W razie potrzeby przechowuj zarodki w M2 na platformie lodowej do 1,5 godziny, np. podczas przygotowywania pożywki lub manipulacji małymi partiami ~3-4 zarodków w RT.
   Uwaga: Odzyskiwanie i preparacja zarodków gryzoni została szczegółowo opisana wcześniej^7,8,16.

2. Przygotuj pożywkę do hodowli zarodków

1. Świeżo rozmrozić dostępną w handlu surowicę szczurów (patrz Glanville-Jones i wsp.¹³ dla specyfikacji) lub surowicy szczurzej przygotowanej we własnym zakresie zgodnie z Copp i Cockroft¹⁶, którą inaktywowano termicznie przez 30 minut w temperaturze 56 °C i zamrożono w 1 ml podwielokrotności w temperaturze -80 °C
   Uwaga: Dostępna na rynku surowica szczura jest dopuszczalna w okresach hodowli trwających 24-36 godzin, chociaż z naszego doświadczenia wynika, że surowica przygotowana we własnym zakresie jest lepsza w okresach hodowli do 48 godzin.
2. Świeżo przygotuj nadmiar (np. 10 ml) określonych suplementów składających się z Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM), 1% Non-Essential Amino Acids (NEAA), 2 mM L-glutaminy i 1 mM pirogronianu sodu.
3. Obliczyć potrzebną objętość pożywki hodowlanej w zależności od liczby zarodków w każdym stadium, które mają być hodowane (patrz sekcja 3). Wymieszaj surowicę szczura z określonymi suplementami, aby uzyskać 50% pożywki (1:1 (v/v) surowica szczura: zdefiniowane suplementy) i/lub 75% pożywki hodowlanej (surowica szczura 3:1 (v/v): określone suplementy).
4. Przepuścić pożywkę hodowlaną zarodków przez filtr 0,45 μm i dodać 10 000 j.m./ml penicyliny i 10 μg/ml streptomycyny.
   Uwaga: Świeżo rozmrożony roztwór L-glutaminy i pirogronianu sodu ma kluczowe znaczenie dla rozwoju zarodka podczas hodowli ex vivo.

3. Warunki hodowli ex vivo dla różnych stadiów embrionalnych

1. W przypadku zarodków E7,5: hodowla statyczna przy użyciu płytek 4-dołkowych w inkubatorze zaopatrzonym w 5% CO₂ w powietrzu w temperaturze 37 °C przez 24 godziny. Hodowla do dwóch zarodków na basenik w 1 ml 50% pożywki hodowlanej.
2. W przypadku zarodków E8,5: użyć aparatu do hodowli rolkowej⁸ obracającego się z prędkością 35 obr./min, obejmującego ciągłe gazowanie 5% CO₂ w powietrzu w temperaturze 37 °C przez 24 godziny (1 ml 50% pożywki hodowlanej na zarodek).
3. W przypadku zarodków E9,5: należy użyć rolkowego aparatu do hodowli obracającego się z prędkością 35 obr./min, zawierającego gazy dostarczane z 5% CO₂, 40 % O₂ 55% N₂ w temperaturze 37 °C przez 24 godziny (1 ml 75% pożywki hodowlanej na zarodek).
   Uwaga: Hodowla zarodków w ciągu 3 godzin po eutanazji myszy, ponieważ przedłużone okresy w M2 niekorzystnie wpływają na rozwój. Patrz Copp i Cockroft¹⁶ dla metody hodowli zarodków ex vivo.

4. Szczepienie hodowanych komórek do embrionów myszy E7.5 lub E8.5

1. Fizycznie zeskrobać EpiSC, które powszechnie wykazują ekspresję GFP, z 6-dołkowej płytki hodowlanej za pomocą końcówki pipety o pojemności 20-200 μl i umieścić je w 30-milimetrowym naczyniu zawierającym zarodki
   Uwaga: Aby wprowadzić grudki komórek do zarodków, komórki powinny być fizycznie złomowane, a nie trypsynizowane.
2. Przymocuj ręcznie pociągniętą kapilę do szczepienia do rurki aspiratora, aby zrobić pipetę doustną.
3. Delikatnie zassać pipetę ustną, aby pobrać jedną lub więcej grudek komórek o wielkości >20 komórek do naczynia włosowatego do szczepienia.
4. Delikatnie wydmuchaj komórki, aby częściowo rozproszyć duże grudki.
5. Wybierz jedną kępkę komórek zawierającą ~10-20 komórek i ponownie zassaj do naczynia włosowatego do szczepienia, trzymając je blisko otworu naczynia włosowatego. Uważaj, aby nie przesuwać wielokrotnie grudki komórek do i z kapilary, aby uniknąć rozpadu na mniejsze kawałki.
6. Przytrzymaj zarodek luźno na miejscu za pomocą kleszczy i włóż kapilarnę do szczepienia w obszar zainteresowania, aby utworzyć otwór.
7. Delikatnie wyrzuć grudkę z naczynia włosowatego do szczepienia, pozostawiając krótki sznurek 10-20 komórek osadzony w zarodku.
8. Powtórz procedurę szczepienia dla żądanej liczby zarodków. Dla wygody używaj partii o wielkości 3-4 zarodków.
9. Pozostawiając zarodki w tym samym naczyniu z pożywką M2, zobrazuj przeszczepione zarodki za pomocą mikroskopu preparacyjnego ze związkiem fluorescencyjnym z kamerą, skracając czas obrazowania do minimum, aby uniknąć wystawienia zarodków na nadmierne światło i ciepło.
   Uwaga: Czasy obrazowania należy określić empirycznie, ponieważ będą one zależeć od specyfikacji aparatu i mikroskopu, a także od charakteru i intensywności fluorescencji fluoroforu.
10. Natychmiast po obrazowaniu przenieść zarodek w pastetce o minimalnej objętości pożywki M2 do wstępnie zbilansowanej pożywki hodowlanej (patrz sekcja 3).
    Uwaga: Dokładnie zbadaj morfologię zarodków po szczepieniu. Hodowla tylko nienaruszonych zarodków.

5. Ręcznie robione materiały do elektroporacji i konfiguracja aparatury (przygotuj następujące elementy przed eksperymentami z elektroporacją):

1. W przypadku pipet do wstrzykiwań DNA: pociągnij pipety do wstrzykiwań DNA za pomocą poziomego ściągacza do mikropipet. Pipety iniekcyjne powinny mieć cienką końcówkę z otworem mniejszym niż 10 μm, aby uniknąć uszkodzenia tkanek podczas wstrzykiwania DNA do jam embrionalnych.
2. W przypadku elektroporacji kapilarnej szkła: za pomocą mikrokuźni wyciąć otwór pipet do iniekcji DNA na średnicę wewnętrzną 20 lub 30 μm. Aby uniknąć uszkodzenia komórek, gdy naczynia włosowate stykają się z zarodkiem w celu elektroporacji, końcówka szklanej kapilary musi być czysto przycięta i nie może zawierać ostrych, złamanych krawędzi.
3. W przypadku ręcznie robionej elektrody kapilarnej (anody) (ryc. 1): włóż drut platynowy o średnicy 0,2 mm do szklanej kapilary do elektroporacji ze stałym otworem o średnicy 20 lub 30 μm, aby skupić prąd elektryczny i dostarczyć plazmidowe DNA do małego obszaru zainteresowania zarodka.
4. W przypadku ręcznie robionej elektrody (katody) w kształcie litery L (rysunek 1): zegnij drut platynowy o średnicy 0,2 mm, tworząc kształt litery "L", z poziomą częścią "L" o długości około 1 mm.
5. Przymocuj każdą elektrodę platynową do cienkiego izolowanego drutu i włóż ją do uchwytu igły do mikroiniekcji pokrytego taśmą izolacyjną.
6. Zamontuj uchwyty igieł na standardowych uchwytach do narzędzi do mikromanipulacji.
7. Podłącz obwód, jak pokazano na rysunku 1: podłącz elektrodę kapilarną do anody zasilacza; podłącz elektrodę w kształcie litery L do anody multimetru; podłącz katodę mulimetru do katody zasilacza.

6. Elektroporacja E7.5 lub E8.5 Embriony myszy

1. Napełnij szklaną kapilarnę do elektroporacji PBS z dokładnością do 1-2 mm od góry i włóż prostą elektrodę platynową (anodę) do szklanej kapilary, aż dotrze do dna kapilary.
2. Zakotwiczyć elektrodę w kształcie litery L (katodę) na powierzchni płytki Petriego o średnicy 30 mm wypełnionej PBS.
3. Przenieść zarodek z pożywki M2 do naczynia do elektroporacji wypełnionego PBS.
4. Wprowadzić igłę do wstrzykiwań z bocznego epiblastu do jamy owodniowej zarodka. Za pomocą pneumatycznej pompy pico wstrzyknąć roztwór DNA (pCAG-Cre:GFP lub pCAG-GFP 1-1,5 μg/ml z 0,01% zielonym barwnikiem spożywczym) do jamy, aż będzie całkowicie pełna. W przypadku zarodków E7,5-E8,5 na jeden zarodek potrzeba mniej niż 5 μl roztworu DNA. Używając zielonego barwnika jako wskaźnika, uważaj, aby nie rozsadzić zarodka.
5. Ostrożnie umieść zarodek między elektrodami i przesuń elektrodę kapilarną dokładnie w miejsce, w którym ma zostać dostarczone DNA.
   Uwaga: Orientacja zarodka zależy od obszaru, w którym DNA ma zostać poddane elektroporacji.
6. Elektroporację zarodka za pomocą 200 woltów (V) w 6 impulsach, z których każdy trwa 50 ms z 1-sekundowym odstępem między każdym impulsem.
7. Natychmiast po elektroporacji przenieść zarodek do wstępnie zbilansowanej pożywki hodowlanej. W razie potrzeby powtórz proces dla następnego zarodka.
   Uwaga: Dodaj pożywkę hodowlaną do sterylnego pojemnika i umieść ją w inkubatorze w celu wstępnego zrównoważenia pożywki.
8. Aby wykryć elektroporowane komórki 2 godziny po hodowli, należy przenieść zarodki na czystą 30-milimetrową szalkę Petriego z pożywką M2 za pomocą pastety. Zobrazuj zarodki jak w kroku 5.9 za pomocą mikroskopu preparacyjnego związków fluorescencyjnych.
9. Natychmiast po obrazowaniu należy przenieść zarodki z powrotem do hodowli za pomocą pastety.
10. Aby wykryć martwe komórki spowodowane elektroporacją, należy wybarwić zarodki barwnikiem jądrowym nieprzepuszczalnym dla błony komórkowej komórek dalekiej czerwieni (1:200 w pożywce do hodowli zarodków) w temperaturze 37 °C przez 10 minut 2 godziny po elektroporacji (opcjonalnie)
11. Aby policzyć elektroporowane komórki, utrwal zarodki w 4% paraformaldehydzie (PFA) przez 2-4 godziny w temperaturze 4 °C, zabarwić jądro ultrafioletowym lub dalekoczerwonym fluorescencyjnym przeciwbarwnikiem jądrowym i zobrazować zarodki za pomocą mikroskopu konfokalnego (opcjonalnie).
    Uwaga: Zbyt długi okres pozostawienia w PBS ma negatywny wpływ na wzrost zarodka. Dlatego należy upewnić się, że czas potrzebny do elektroporacji każdego zarodka jest zminimalizowany (<5 minuty na zarodek).

Wyniki

Szczepienie

EpiSCs, które powszechnie wyrażają EGFP (r04-GFP, pochodzące z epiblastu E6.5 i C2, pochodzące in vitro z mESC)⁴ zostały ręcznie zeskrobane z szalki hodowlanej i przeszczepione w różne miejsca zarodków E7.5 (Figura 2A). Zarodki hodowano ex vivo i analizowano po 24 godzinach. Rozmieszczenie komórek dawcy oceniano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Jeśli komórki dawcy zostały połączone, namnażały się, a ich pochodne rozpraszały się w zarodkach gospodarza (ryc. 2B). Zaobserwowano, że przeszczepy zawierające 10-16 komórek skutecznie wbudowują się w zarodki gospodarza (ryc. 2A i 2B), jednak przeszczepienie większej liczby komórek nie powoduje lepszego chimeryzmu. Zamiast tego przeszczepione komórki wytwarzały niewłączone grudki (ryc. 2C i 2D).

Elektroporacja

Aby ocenić skuteczność naszego systemu elektroporacji, dostarczyliśmy plazmidy wykazujące ekspresję GFP (pCAG-GFP i pCAG-Cre:GFP) do określonych miejsc w zarodku. Zgodnie z poprzednim badaniem¹¹, komórki GFP⁺ wykryto w zarodkach 1-2 godziny po elektroporacji (ryc. 2E i 2G). Gdy dystalne komórki epiblastu w późnym stadium prymitywnej smugi zarodka zostały poddane elektroporacji, znakowane komórki przyczyniły się do ektodermy nerwowej po 24 godzinach w hodowli (ryc. 2E i 2F). Wynik ten dobrze koresponduje ze znanymi mapami losów komórek epiblastów w zarodkach w stadium gastrulacji¹⁷. Podobnie, gdy plazmid ekspresji GFP był elektroporowany w prymitywnej smugi przy E8,5 (2-5 somitów), komórki GFP⁺ przyczyniły się do mezodermy przyosiowej (Figura 2G i 2H), zgodnie ze znanymi mapami losów późnej prymitywnej smugi¹⁸. Co więcej, zaobserwowaliśmy udział komórek poddanych elektroporacji we wszystkich trzech listkach rozrodczych (ryc. 2I-K), co sugeruje, że procedura elektroporacji nie wpływa negatywnie na zachowanie komórek in vivo. Jednak zauważyliśmy również, że podczas gdy epiblast (E7.5) lub prymitywne komórki smugowe (E8.5) były celowane, niektóre komórki endodermy były również elektroporowane (Figura 3C i Tabela 1).

Jedną z głównych zalet korzystania z elektrody kapilarnej jest to, że można kontrolować liczbę elektroporowanych komórek, po prostu zmieniając średnicę jej otworu. Aby określić liczbę komórek poddanych elektroporacji, zarodki utrwalono 2 godziny po elektroporacji i zobrazowano w całości pod mikroskopem konfokalnym. Liczba komórek GFP⁺ została ręcznie zliczona w konfokalnych stosach z. Tabela 1 pokazuje, że na danym etapie zwiększenie wielkości otwarcia szklanej kapilary z 20 do 30 μm powoduje wychwyt DNA przez większą liczbę komórek. Gdy porównano pojedynczy rozmiar otworu między etapami (E7,5 kontra E8,5), okazało się, że więcej ogniw jest elektroporowanych na ostatnim etapie. Efekt ten może być spowodowany wyższym stężeniem DNA obecnego w jamie owodniowej w E8,5. Ponieważ roztwór DNA został zmieszany z zielonym barwnikiem spożywczym, możemy użyć zielonego koloru do oceny stężenia DNA w jamie owodniowej. W mikroskopie widać wyraźnie, że w porównaniu z zarodkami E8,5 zielony kolor po wstrzyknięciu DNA jest znacznie jaśniejszy w jamie zarodków E7,5. Chociaż roztwór DNA o tym samym stężeniu wstrzyknięto do zarodków E7,5 i E8,5, więcej roztworu DNA znajdowało się w jamie owodniowej zarodków E8,5 w celu jej całkowitego wypełnienia, ponieważ są one większe. Po wyjęciu igły do wstrzykiwań zawsze dochodzi do pewnego stopnia wycieku roztworu DNA z jamy owodniowej, a ponieważ otwór do wkłucia jest większy w porównaniu z rozmiarem jamy owodniowej u wcześniejszych zarodków, jest prawdopodobne, że wyciek z zarodków E7,5 był proporcjonalnie większy niż z zarodków E8,5, co prowadzi do niższego stężenia DNA. Różna liczba transfekowanych komórek może być również spowodowana różnymi średnicami lub progami indukowanego napięcia transbłonowego (ITV) komórek na różnych etapach.

Wadą elektroporacji jest związana z nią śmierć komórki. Podobnie jak w przypadku tradycyjnych elektrod pozłacanych lub w kształcie igły, elektroporacja za pomocą elektrody kapilarnej również powoduje śmierć komórki. Po elektroporacji obszar docelowy wydawał się ciemniejszy w porównaniu z sąsiednimi obszarami (ryc. 3A i 3B), co wskazuje, że w tym obszarze musiał wystąpić pewien stopień śmierci komórki. Aby dokładniej określić liczbę martwych komórek spowodowanych procedurą elektroporacji, zarodki barwiono barwnikiem jądrowym nieprzepuszczalnym dla błony komórkowej fluorescencyjnym. Jądra martwych komórek znakowano nieprzepuszczalnym dla błony barwnikiem fluorescencji dalekiej czerwieni. Barwienie potwierdziło, że ta technika elektroporacji kapilarnej powoduje jedynie niewielką liczbę martwych komórek w pobliżu miejsca elektroporacji (ryc. 3D i tabela 1).

Zauważyliśmy, że chociaż martwe komórki pojawiają się w miejscu elektroporacji, ogniwa GFP⁺ i martwe komórki są również najbardziej oddalone od siebie (Rysunek 3E i 3F). Ponadto, gdy epiblast ogonowy boczny w E8,5 został elektroporowany pCAG-GFP i szklanym otworem kapilarnym 20 μm, po 48 godzinach w hodowli wykryto dużą liczbę komórek GFP⁺ (ryc. 3G i 3H). Podsumowując, wyniki te sugerują, że większość komórek GFP⁺ wykrytych 2 godziny po elektroporacji jest nadal żywotna podczas dalszej hodowli.

Oceniliśmy liczbę komórek GFP⁺ po 24 godzinach hodowli ex vivo. Sześć zarodków poddano elektropostacji pCAG-GFP w temperaturze E7,5, przy użyciu otworu kapilarycznego o średnicy 20 μm. 107±31 (średnia ± s.d.) Wykryto komórki/zarodki GFP⁺. Ponieważ na początku hodowli (2 godziny) średnio 9 komórek na zarodek było elektroporowanych (Tabela 1), sugeruje to, że komórki poddane elektroporacji uległy 3-4 podziałom w ciągu 2 godzin. Średni czas podwajania komórek od zarodków E7,5 do E8,5 wynosi około 6-7 godzin we wszystkich komórkach z wyjątkiem tych w węźle brzusznym^19,20. Sugeruje to, że procedura elektroporacji nie hamuje normalnego wzrostu komórek.

Rysunek 1. Schemat obwodu przedstawiający konfigurację elektroporacji. Zarodek zawierający roztwór DNA w jamie owodniowej umieszczono między dwiema elektrodami. Prąd o zadanych parametrach dostarczany był przez generator impulsów (zasilacz) o fali prostokątnej. Multimetr został połączony szeregowo, aby wykryć prąd elektryczny przepływający przez zarodek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Rozmieszczenie przeszczepionych lub elektroporowanych komórek w zarodkach gospodarza. (A-H) Nakładki fluorescencyjne GFP (zielone) na obrazach w jasnym polu zarodków pełnoziarnistych (skala szarości) (A) 10-16 EpiSC GFP⁺ wszczepiono do dystalnego obszaru zarodka w późnym stadium smugowym. (C) Większe skupisko EpiSC GFP⁺ zostało przeszczepione do dystalnego obszaru zarodka w połowie fazy. (B i D) Rozmieszczenie komórek pochodzących z EpiSC (kolor zielony) w zarodkach gospodarza (pokazanych w A i C) po 24 godzinach w hodowli. (B) Komórki GFP⁺ rozproszone w zarodku gospodarza, co sugeruje prawidłową integrację komórek dawcy. (D) Szczepienie większych grudek komórek powodowało tworzenie się nieinkorporowanych grudek w zarodku gospodarza. (E-K) plazmid pCAG-Cre:GFP elektroporowany do określonych obszarów zarodków typu dzikiego. Elektroporacja dystalnego obszaru zarodka we wczesnym stadium zarodka (E) lub prymitywnej smugi zarodka w stadium 2-5 somitów (G) spowodowała pojawienie się komórek GFP⁺ w tych regionach 2 godziny po zabiegu. (F i H) Rozmieszczenie komórek GFP⁺ w zarodkach gospodarza po 24 godzinach hodowli, pokazujące, że komórki elektroporowane przyczyniają się do neuroektodermy (strzałka) (F) i mezodermy przyosiowej (biała strzałka) (H). (I-K) Barwienie immunologiczne DAB dla komórek GFP⁺ pokazujące, że elektroporowane komórki mogą dać początek neuroektodermie (I), mezodermie (J) i endodermie (J i K) po 24 godzinach w hodowli. Podziałka skali (A-H) = 250 μm; podziałka liniowa (I-K) = 100 μm. Uwaga: Rysunki 1A i 1B są przedrukowane z naszej poprzedniej publikacji⁴. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Dystrybucja komórek GFP⁺ i martwych komórek w zarodkach po elektroporacji. (AC) plazmid pCAG-Cre:GFP elektroporowany do ogonowych bocznych komórek epiblastu zarodka E8,5 (stadium 2-5 somitu) (wielkość otworu naczynia włosowatego: 20 μm). (A) 2 godziny po zabiegu obszar docelowy miał ciemny kolor (biała strzałka) w porównaniu z innymi częściami zarodka. Wstawka pokazuje powiększenie obszaru poddanego elektroporacji. (B) Obraz w jasnym polu (skala szarości) pokryty zielonym kanałem fluorescencyjnym pokazującym elektroporowane ogniwa (zielony). (C) Konfokalny plaster Z pokazujący, że dwie komórki endodermy (zielone) również wchłonęły plazmid, gdy celowane były komórki epiblastu ogonowego bocznego. Jądra komórkowe są pokazane na czerwono. (D-F) plazmid pCAG-Cre:GFP poddano elektropostacji w ogonowej części węzła zarodka E8,5 (wielkość otworu naczynia włosowatego: 30 μm). Zarodek hodowano przez 2 godziny. Ogniwa elektroporowane są pokazane na zielono, a martwe ogniwa na czerwono. (D) Obszar elektroporowany zawiera zarówno ogniwa GFP⁺, jak i martwe ogniwa. Obszar w białym pudełku był dalej analizowany w mikroskopie konfokalnym. Ręczne liczenie stosu z wykazało, że w tym obszarze znajdowały się 33 komórki GFP⁺ i 23 martwe komórki. Tylko dwie komórki były dodatnie dla obu fluoroforów. (E i F) Widok XYZ konfokalnego wycinka Z białego obszaru ramki w D, pokazujący, że komórki GFP⁺ są oddzielone od martwych komórek. Jądra są pokazane na niebiesko. (G i H) plazmid pCAG-Cre:GFP poddano elektropostacji kilku komórkom w ogonowym bocznym epiblastie zarodka E8.5 (wielkość otworu naczynia włosowatego: 20 μm) i zobrazowano po dwóch (G) i 48 (H) godzinach hodowli ex vivo Uwaga: (H) Zarodek został przecięty na dwie części po hodowli. Usunięto okolice głowy i serca. Podziałka liniowa (A, B, D, G i H) = 250 μm; Podziałka skali (C, E i F) = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Średnica otworu rurki kapilarnej Stadium zarodkowe Wydajność elektroporacji: liczba zarodków zawierających komórki GFP⁺ po 2 godzinach / całkowita liczba zarodków poddanych elektroporacji (liczba zarodków poddanych elektroporacji). Zarodki GFP⁺, które rozwinęły się normalnie po 24 lub 48 godzinach posiewu) Średnia liczba komórek GFP⁺ na zarodek ±s.d. (n = liczba badanych zarodków) Liczba komórek endodermy GFP⁺ na każdy zarodek ±s.d. (n = liczba badanych zarodków) 20 μm E7.5 (LS-LB) 7 / 9 (7) 9±3 (n=4) 4±2 (n=4) 30 μm E7.5 (LS-LB) 13 / 15 (12) 17±2(n=4) 6±1 (n=4) 20 μm E8.5 (2-5 somitów) 12 / 13 (10) 21±4 (n=4) 11±4 (n=4) 30 μm E8.5 (2-5 somitów) 2 / 2 (2) 33 i 26 (n=2) 14 i 16 (n=2)

Tabela 1. Wydajność elektroporacji plazmidu pCAG-Cre:GFP w zarodkach myszy.
Skrót: LS, późna prymitywna faza smugowa; LB: późna faza pąków. Zarodki są klasyfikowane według Downsa i Daviesa¹²

Dyskusja

Szczepienia

Krytycznym krokiem w eksperymentach z przeszczepianiem komórek jest wstawienie spójnego ciągu komórek, najlepiej w jednym działaniu, aby uniknąć rozpadu grudki. Ta technika wymaga pewnej praktyki w kontrolowaniu pipety do jamy ustnej. Jeśli komórki dawcy dobrze wbudują się w gospodarza, ich pochodne rozproszą się w zarodku. Aby dokładniej określić, czy rozproszone komórki pochodzące od dawcy odpowiednio różnicują się w organizmie gospodarza, można przeprowadzić barwienie immunologiczne na skrawkach zarodka. Jeśli komórki dawcy nie są kompatybilne ze środowiskiem gospodarza, albo nie mogą być wykryte (ponieważ są wydalane z zarodka), albo tworzą niewłączone grudki w zarodkach po hodowli. Jeśli zaobserwowano zarówno rozproszone komórki, jak i skupiska komórek, może to oznaczać, że przeszczepiono zbyt wiele komórek, a nadmiar komórek dawcy, które nie mogą wchodzić w interakcje z otaczającymi komórkami gospodarza, spowodował tworzenie się grudek. W takim przypadku można wykonać dodatkowe przeszczepy zawierające mniejszą liczbę komórek.

Głównym ograniczeniem techniki przeszczepiania komórek jest to, że nie jest możliwe określenie pełnego potencjału komórek in vivo , ponieważ nie osiągnięto hodowli ex vivo myszy w okresie dłuższym niż 48 godzin. Jednak w połączeniu z wstrzyknięciem komórek pod kontrolą ultradźwięków możliwe jest przeniesienie hodowanych komórek do zarodków w macicy. Podsumowując, eksperymenty z przeszczepami komórek były szeroko stosowane w naszej grupie i dały nam cenne wskazówki na temat potencjału in vivo różnych typów komórek^4,21,22. Jest to technika ogólnego zastosowania służąca do oceny potencjału in vivo komórek hodowanych in vitro we wczesnych zarodkach poimplantacyjnych.

Elektroporacja

Chociaż w tym badaniu wykazaliśmy jedynie, że skuteczne jest stosowanie techniki elektroporacji kapilarnej do celowania w epiblast, możliwe jest również celowe celowanie w inne listki rozrodcze, takie jak komórki endodermy. Krytycznym krokiem w technice elektroporacji kapilarnej jest zminimalizowanie czasu potrzebnego do elektroporacji każdego zarodka (< 5 minut na zarodek), ponieważ PBS jest bardzo nieoptymalny dla wczesnych zarodków myszy. Nasze powyższe dane wykazały, że w większości obszarów zarodków elektroporacja nie wpływa na wzrost zarodka. Jednak elektroporacja w węźle spowodowała nieprawidłowy rozwój i doprowadziła do przedwczesnej śmierci zarodka. Jest to prawdopodobnie spowodowane uszkodzeniem lub śmiercią komórek, które tworzą ważne centra sygnalizacyjne²³. W związku z tym za pomocą tej techniki należałoby unikać tego regionu. Kolejnym zastrzeżeniem jest to, że, jak wspomniano w sekcji wyników, podczas gdy celem były komórki epiblastu lub prymitywne smugi, niektóre komórki endodermy zostały również poddane elektroporacji. Może to być spowodowane tym, że DNA dociera do endodermy przez szczeliny pod nabłonkiem epiblastu. Endoderma składa się z komórek nabłonkowych i z naszego doświadczenia wynika, że komórki te mają większą skłonność do pobierania DNA. Dlatego stosując tę technikę do mapowania losu, ważne jest, aby ocenić, które komórki początkowo pobierają DNA.

Należy również zauważyć, że chociaż plazmidy pCAG-GFP i pCAG-Cre:GFP mogą być skutecznie dostarczane przy użyciu parametrów elektroporacji pokazanych w tym badaniu, wydajność innych konstruktów DNA może się różnić i wymagać indywidualnej optymalizacji. Zmiany w stężeniu DNA, napięciu elektroporacji lub liczbie impulsów mogą być dokonane, jeśli plazmidy okażą się trudne do transfekcji.

Podsumowując, nasz zoptymalizowany system elektroporacji kapilarnej może skutecznie i powtarzalnie dostarczać plazmidy GFP lub Cre:GFP do bardzo niewielu komórek w zarodku przy ograniczonej śmierci komórki. Ponieważ metoda ta nie wymaga drogiego ani wysoce specjalistycznego sprzętu, może być bardzo przydatna do badań śledzenia komórek lub do testowania efektu ekspresji ektopowej lub warunkowej delecji genów we wczesnych zarodkach, jeśli elektroporacja jest wykonywana w zarodkach zawierających floksowane warunkowe zmutowane allele. W związku z tym ta technika elektroporacji stanowi użyteczne narzędzie funkcjonalne do zrozumienia roli czynników wewnętrznych komórki w kontekście zlokalizowanych środowisk embrionalnych typu dzikiego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kleszcze	Dumostar	T5390
Preparacyjny mikroskop stereoskopowy	System stereomikroskopu Zeiss	Stemi 2000-C
z fluorescencją	Nikon	AZ100
Mikroskop odwrócony z aparatem cyfrowym	Olympus	Olympus BX61
Odwrócony mikroskop konfokalny	Leica Microsystems	Leica TCS SP8
Agaroza o niskiej temperaturze topnienia	Life Technologies	16520-050
Pipety Pasteura	Fisher Scientific	11397863
szalki Petriego 30 mm	Fisher Scientific	121V
płytki 4-dołkowe	Thermo scientific	179820
M2 średnie	Sigma-Aldrich	M7167
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)	Life Technologies	10010015
Paraformaldehyd (PFA)	Pipety Sigma-Aldrich	P6148
	NICHIRYO	Nichipet
wskazówki	Greiner Bio One	685280
Inkubator do hodowli komórkowych	SANYO	MCO-17AIC
Aparatura do hodowli rolkowej	BTC Engineering
Filtry strzykawkowe 0,45 i mikro; m, sterylne	Sigma-Aldrich	10462100
Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM)	Sigma-Aldrich	G5154
aminokwasy endogenne (NEAA)	Life Technologies	11140050
L-glutamina	Fisher Scientific	SH30549.01
Roztwór pirogronianu sodu	Fisher Scientific	SH30239.01
Penicylina i Streptomycyna 10.000UI/ml	Lonza	DE17-602E
Nabój gazowy do przenośnego palnika Meker	COLEMAN	COLEMAN 250
Cienkościenne borokrzemianowe szkło kapilarne z Fillamentem, OD 1,0 mm, ID 0,78 mm	Aparat Harvard	640798
Zespoły probówek aspiratora do kalibrowanych pipet mikrokapilarnych	Sigma-Aldrich	A5177-5EA
Ściągacz do mikropipet płomieniowych/brązowych	Firma Sutter Instrument	P-97
Mikrokuźnia	De Fonbrune	BS030301
Pneumatyczna pompa pico	Końcówki do mikroładowarek World Precision Instruments	PV830
	Eppendorf	5242956.003
Generator impulsów prostokątnych ECM 830	BTX	45-0002
Zielony barwnik spożywczy	Sigma-Aldrich	CI 42053
Dalekoczerwony barwnik jądrowy nieprzepuszczalny dla błony komórkowej	Biotium	40060-T
pCAG-Cre:GFP	Addgene	#13776
pCAG-GFP	Addgene	#16664
Multimetr	Excel	XL830L
Mikromanipulatory	Leitz
Drut platynowy o średnicy 0,2 mm	Agar Scientific	E404-2
Przeciwciało anty-GFP	Abcam	ab13970
Kozioł anty-IgY kurczaka, HRP	Santa Cruz	sc-2428
Płynny system chromogenów substratowych DAB+	Dako	K3467
4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)	Life Technologies	D21490
Dalekoczerwone fluorescencyjne przeciwbarwienie jądrowe	Life Technologies	T3605