Danio pręgowany jest ważnym organizmem modelowym do badania homeostazy energetycznej. Wykorzystując czuły na NADH2 wskaźnik redoks, alamar Blue, opracowaliśmy test, który mierzy tempo metabolizmu larw danio pręgowanego w formacie 96-dołkowej płytki i może być stosowany do odkrywania leków lub genów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wysokoprzepustowy test wydatku energetycznego Danio Rerio
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Danio pręgowany to ważny organizm modelowy z nieodłącznymi zaletami, które mogą sprawić, że danio pręgowany stanie się powszechnie stosowanym modelem do badania homeostazy energetycznej i otyłości. Niewielki rozmiar danio pręgowanego pozwala na przeprowadzanie testów na zarodkach w formacie płytki 96- lub 384-dołkowej, technologie oparte na Morpholino i CRISPR ułatwiają manipulację genetyczną, a leczenie farmakologiczne przez kąpiel jest opłacalne. Co więcej, danio pręgowany idealnie nadaje się do badań genetycznych, które pozwalają na odkrycie nowych genów. Biorąc pod uwagę względną nowość danio pręgowanego jako modelu otyłości, konieczne jest opracowanie narzędzi, które w pełni wykorzystają te korzyści. W tym artykule opisujemy metodę pomiaru wydatku energetycznego u tysięcy embrionalnych ryb pręgowanych jednocześnie. Opracowaliśmy całą platformę mikropłytek zwierzęcych, w której używamy 96-dołkowych płytek do izolowania pojedynczych ryb i oceniamy skumulowaną produkcję NADH2 za pomocą dostępnego na rynku odczynnika żywotności hodowli komórkowych alamarBlue. W poikilotermach zależność między produkcją NADH2 a wydatkiem energetycznym jest ściśle powiązana. Ten test wydatku energetycznego stwarza potencjał do szybkiego badania przesiewowego manipulacji farmakologicznych lub genetycznych, które bezpośrednio zmieniają wydatek energetyczny lub zmieniają odpowiedź na zastosowany lek (np. Leki uczulające na insulinę).
Wprowadzenie
Mysz jest obecnie dominującym modelem w badaniach nad otyłością. Krótki odstęp między generacjami i narzędzia genetyczne dostępne u myszy nie miały sobie równych do tej pory. Jednak danio pręgowany ma również krótki odstęp między pokoleniami (3 - 4 miesiące) i przewyższa nawet mysz pod względem łatwości manipulacji genetycznej 1,2. Danio pręgowany zachowuje prawie 90% genów ssaków, znacznie przewyższając mysz pod względem liczby potomstwa i potencjału do wykorzystania w badaniach genetycznych i przesiewowych leków3.
Aby wykorzystać potencjał modelu danio pręgowanego do badań nad otyłością, muszą zostać opracowane testy do badania czynników wpływających na regulację masy ciała, w tym wydatku energetycznego. Ponieważ metabolity są przetwarzane przez β-utlenianie i cykl kwasu trikarboksylowego, zużywany jest tlen i wytwarzany jest NADH2. Tak więc NADH2 jest bezpośrednim wskaźnikiem przepływu metabolitów przez szlaki metaboliczne (utlenianie metabolitów). W poikilotermach H+ przecieka przez wewnętrzną błonę mitochondrialną, która rozprzęga utlenianie NADH2 od syntezy ATP, jest 4 - 5 razy niższe niż w hometermach 4. W związku z tym u danio pręgowanego NADH2 jest bardzo ściśle związany z produkcją ATP poprzez fosforylację oksydacyjną. W niniejszym artykule opisujemy test, który mierzy produkcję NADH2 u larw danio pręgowanego jako wskaźnik zastępczy dla wydatku energetycznego5.
Zużycie tlenu to złoty standard pomiaru wydatku energetycznego. Jednak, aby jak najlepiej wykorzystać potencjał wysokiej przepustowości danio pręgowanego, testy wydatku energetycznego muszą być podatne na wysoką przepustowość. Systemy zużycia tlenu, które zależą od układu cyrkulacyjnego z zamkniętą komorą, są ograniczone pod względem przepustowości ze względu na liczbę dostępnych komór6. Testy zużyciaO2 na wolnym powietrzu/produkcji CO2 zastosowano również u danio pręgowanego5,7. Te 96-dołkowe systemy oparte na płytkach na wolnym powietrzu są przystosowane do wysokiej przepustowości. Niestety, wymiana gazowa z otoczeniem ogranicza czułość tych testów. Niedawno opublikowaliśmy zastosowanie testu, który monitoruje NADH2 za pomocą wskaźnika redoks alamarBlue5. Test ten pozwala przezwyciężyć ograniczenia w przepustowości i czułości typowe dla analiz zużycia tlenu przez danio pręgowanego.
Danio pręgowany staje się coraz ważniejszym modelem do badań homeostazy energetycznej całego ciała. Po części dlatego, że danio pręgowany jest podatny na wykorzystanie w badaniach genetycznych i badaniach przesiewowych leków. Co więcej, można szybko zastosować ukierunkowane manipulacje genetyczne, w tym knockdown i knock-in. Wcześniej wykazaliśmy, że test ten można połączyć z aplikacją leku do kąpieli i genetycznym knockdownem lub nokautem w celu zidentyfikowania związków i genów, które zmieniają tempo przemiany materii5. Co więcej, test ten ma na celu wykorzystanie zalet wysokiej przepustowości nieodłącznie związanych z danio pręgowanym.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Uwaga: Niniejszy protokół jest zgodny z wytycznymi Biura ds. Odpowiedzialnego Prowadzenia Badań Uniwersytetu w Arizonie i został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt
1. Rozmnażanie danio pręgowanego i utrzymanie embrionów
- Przygotować pożywkę E3 dla embrionów8. Aby przygotować 60-krotny roztwór zapasowy, rozpuścić 34,8 g NaCl, 1,6 g KCl, 5,8 g CaCl2●2H2O oraz 9,78 g MgCl2●6H2O w 1,95 L ddiH2O. Dostosować pH do 7,2 za pomocą NaOH i HCl. Uzupełnić objętość do 2 L za pomocą ddiH2O.
- Aby przygotować 1-krotną pożywkę E3 dla embrionów, rozcieńczyć 16,5 ml 60-krotnego roztworu zapasowego w 1 L ddiH20. Dodać 100 µl 1% błękitu metylenowego.
- Rozmnażanie
- Utrzymywać samce i samice stada hodowlanego (w wieku od 7 do 18 miesięcy) osobno, aby zmaksymalizować płodność.
- Wyłączyć światło na 1–2 h przed planowanym dniem uzyskania ikry. Przeprowadzić kojarzenie (1 samiec i 1–2 samice) w klatkach do krzyżowania zgodnie z wcześniejszym opisem9. Klatki do krzyżowania zapobiegają drapieżnictwu, ponieważ jaja przechodzą przez perforowane dno wkładki zbiornika, w której znajdują się dorosłe ryby.
- Opcjonalnie: W przypadku rozmnażania synchronicznego (wymaganego np. do badań z użyciem wstrzykiwań morfolino), oddzielić samce i samice przezroczystą plastikową przegrodą. Usunąć ją rano, aby uzyskać zsynchronizowane złożenie jaj i zapłodnienie. W badaniach nad morfolino przeprowadzić obliczenia mocy statystycznej, aby ocenić liczbę embrionów ryb wymaganą dla każdej grupy badawczej. W przypadku braku szacunków dotyczących wielkości efektu lub zmienności, można przeprowadzić próbne badanie z n = 8.
- Przenieść jaja z klatki do krzyżowania do szalki Petriego (100–150 embrionów na szalkę Petriego 10 cm). Pozostawić jaja do czasu ich opadnięcia na dno szalki, a następnie odlać wodę. Usunąć pozostałą wodę za pomocą jednorazowej pipety transferowej z cienką końcówką. Dolać pożywkę E3 dla embrionów przygotowaną w kroku 1.1.
- Przygotować jednorazową pipetę polerowaną płomieniem do późniejszego przenoszenia jaj i ryb. Za pomocą nożyczek odciąć skalowaną jednorazową pipetę transferową na poziomie graduacji 0,25 ml. Aby usunąć ostre krawędzie, wypolerować odciętą końcówkę płomieniem palnika Bunsena.
- Utrzymywać embriony ryb do 4 dnia po zapłodnieniu (dpf) w szalkach Petriego 10 cm w pożywce E3 dla zebrafish w temperaturze 28,5 ○C. Dwa razy dziennie, używając polerowanej płomieniem skalowanej jednorazowej pipety transferowej, usuwać niezapłodnione jaja lub martwe embriony (o nieprzezroczystym białym wyglądzie). Raz dziennie wymieniać pożywkę E3. Odlać pożywkę E3, usunąć pozostały płyn za pomocą jednorazowej pipety transferowej z cienką końcówką i dolać uprzednio ogrzaną (28,5 ○C) pożywkę E3.
2. Przygotowanie roztworu do analizy
- Przygotować roztwór analityczny zgodnie z Tabelą 1. Roztwór analityczny przefiltrować sterylnie przez filtr 0,22 µM. Przed rozpoczęciem analizy ogrzać sterylny roztwór analityczny w łaźni wodnej o temperaturze 28,5 ○C.
| Składnik | % całkowitej objętości | Objętość (µl/10 ml) |
| 60x E3 Embryo Medium | 1.667 | 166.7 |
| Podwójnie dejonizowana (ddi) H20 | 96.233 | 9623.3 |
| Alamar Blue | 1 | 100 |
| 400 mM NaOH | 1 | 100 |
| DMSO | 0.1 | 10 |
Tabela 1. Pożywka do analizy
3. Wykonanie analizy
- Przepłukać zarodki danio pręgowanego 3 razy sterylnym, filtrowanym medium E3 dla zarodków. Przenieść wszystkie żywotne zarodki z jednej partii do zlewki. Przefiltrować sterylnie 75 ml medium E3 dla zarodków. Za pomocą jednorazowej pipety transferowej z cienką końcówką usunąć z zarodków danio pręgowanego jak najwięcej medium E3. Dodać z powrotem 20 ml sterylnie filtrowanego medium E3 dla zarodków. Powtórzyć usuwanie i uzupełnianie medium E3 3 razy.
- Umieścić po jednej rybie w każdym z 93 dołków czarnej płytki 96-dołkowej z przezroczystym dnem. Przenieść zarodki do płytki, chwytając pojedynczo każdy zarodek za pomocą polerowanej płomieniem, plastikowej, graduowanej jednorazowej pipety transferowej (krok 1.5) i delikatnie wypuszczając go do dołka. Przenieść medium E3 ze zlewki zawierającej wypłukane ryby do 3 pustych dołków. Zapewnia to, że dołki kontrolne (blanki) były narażone na dokładnie tę samą wodę co dołki zawierające ryby. Po zakończeniu tego kroku zarówno dołki z rybami, jak i dołki kontrolne powinny być wypełnione co najmniej do ½ objętości (200 µl).
- Zastąpić medium E3 roztworem analitycznym we wszystkich 96 dołkach, w tym w dołkach kontrolnych. Krok ten należy wykonywać kolumna po kolumnie dla każdej z 12 kolumn płytki 96-dołkowej. Używając jednorazowej pipety transferowej z cienką końcówką, usunąć medium E3 z każdego dołka w jednej kolumnie płytki (8 dołków). Należy uważać, aby nie dotknąć zarodka danio pręgowanego. Do każdego dołka, z którego usunięto wodę, dodać 300 µl roztworu analitycznego. Powtórzyć usuwanie medium E3 i zastępowanie go roztworem analitycznym dla wszystkich 12 kolumn płytki.
- Opcjonalnie: Aby przetestować zmianę tempa metabolizmu w odpowiedzi na związek, przygotować roztwór o stężeniu 100 razy większym (100X) niż pożądane stężenie traktowania. Należy pamiętać, aby roztwór 100X nie przekraczał 10% DMSO, aby ograniczyć końcowe stężenie DMSO do poziomu nie wyższego niż 0,1%. Do każdego z dołków traktowanych dodać 3 µl roztworu 100X.
UWAGA: Przeprowadzić obliczenia mocy testu w celu określenia liczby dołków traktowanych. Jednak bez szacunki wielkości odpowiedzi lub zmienności, można przeprowadzić wstępną próbę w 8 dołkach traktowanych związkiem i 8 dołkach kontrolnych traktowanych nośnikiem, zawierających ryby.- Do dołków kontrolnych (bez traktowania lekiem) zawierających ryby dodać 3 µl kontroli nośnika. Aby upewnić się, że odpowiedź fluorescencyjna na związek jest wynikiem procesów zachodzących w rybie, zastosować traktowanie lekiem i nośnikiem w 3 pustych dołkach na płytce 96-dołkowej.
- Odczytać płytkę z rybami na fluorescencyjnym czytniku płytek z długością fali wzbudzenia 530 nM i długością fali emisji 590 nM.
- Umieścić płytkę w inkubatorze z nawilżaczem ustawionym na 28,5 ○C (płytkę należy przechowywać w ciemności przez cały czas trwania analizy, aby uniknąć fotobleachingu roztworu analitycznego). Analizę można prowadzić w czasie od 1 h do 24 h. Czas trwania analizy zależy od celu badania. W przypadku testowania odpowiedzi na krótko działający, niestabilny związek, najbardziej odpowiedni może być krótki czas trwania. Jednak w przypadku testów stabilnych związków lub testów efektów genetycznych, zaleca się maksymalizację czasu trwania analizy, aby wykorzystać korzyści związane z sygnałem kumulatywnym.
- W określonym punkcie czasowym (patrz krok 3.6 w celu ustalenia czasu) ponownie odczytać fluorescencję płytki z rybami przy użyciu tych samych ustawień co w kroku 3.5.
4. Ocena względnej zmiany fluorescencji związanej z traktowaniem
- Oblicz zmianę fluorescencji w każdym dołku, odejmując wartość fluorescencji w czasie 0 od fluorescencji na koniec badania. Dołki bez ryb (próby ślepe) powinny wykazywać wartości bliskie 0, znacznie niższe niż wartości w dołkach zawierających ryby.
Zmiana fluorescencji = Fluorescencja na koniec - Fluorescencja w czasie 0 - Aby określić względną zmianę fluorescencji, oblicz średnią zmianę fluorescencji dla dołków kontrolnych, a następnie podziel zmianę fluorescencji w każdym dołku przez średnią zmianę fluorescencji w dołkach kontrolnych. Należy zauważyć, że kontrole mogą być kontrolami nośnikiem lub kontrolami genetycznymi.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Roztwór testowy nie zwiększa fluorescencji w przypadku braku embrionów ryb (Rycina 1). Test jest jednak wysoce czuły na niewielkie zmiany tempa metabolizmu wewnątrz studzienki. Pojedyncza ryba w studzience generuje sygnał istotnie różniący się od studzienek pustych w ciągu 1 h (P<0,0001). Rycina 2 przedstawia wizualną reprezentację sygnałów generowanych przez embriony ryb po 24 h inkubacji. Na potrzeby tego zdjęcia zastosowano studzienki z przeźroczystymi ściankami. Niemniej jednak, w...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Zanieczyszczenie bakteriami lub grzybami znacznie ograniczy zastosowanie tego testu. Błękit metylenowy w pożywce zarodkowej E3 ogranicza możliwość zanieczyszczenia grzybiczym. Przez cały okres hodowli zarodków bardzo ważne jest, aby zachować ostrożność w usuwaniu martwych zarodków dwa razy dziennie. Dodatkowo konieczne jest dokładne przepłukanie zarodków sterylną pożywką zarodkową E3 w dniu rozpoczęcia testu. Te 2 kroki ograniczają możliwość skażenia bakteryjnego zarodków. Włączenie ślepych studzienek opisanych w kroku 3...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować doktorom Rogerowi Cone'owi i Chao Zhangowi za ich wkład w walidację zastosowania tego testu w wersji wcześniej opublikowanej. Prace te były wspierane przez NIH 1F32DK082167-01 (BJR).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| AlamarBlue | Fisher Scientific | 10-230-103 | Wyprodukowany przez Thermo Scientific |
| Jednorazowa pipeta transferowa z cienką końcówką | Fisher Scientific | 13-711-26 | Wyprodukowana przez Thermo Scientific |
| Fisherbrand Jednorazowa pipeta transferowa z podziałką | Fisher Scientific | 13-771-9AM | Wyprodukowana przez Thermo Scientific |
| 96-dołkowe płytki z przezroczystym dnem po czarnych | Fisher Scientific | 50-320-785 | Wyprodukowane przez E& K Scientific Products Inc. |
Bibliografia
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. PNAS. 110, 13904-13909 (2013).
- Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Sci. Rep. 4, 6545(2014).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
- Brand, M. D., Couture, P., Else, P. L., Withers, K. W., Hulbert, A. J. Evolution of energy metabolism. Proton permeability of the inner membrane of liver mitochondria is greater in a mammal than in a reptile. Biochem. J. 275 (Pt 1), 81-86 (1991).
- Renquist, B. J., Zhang, C., Williams, S. Y., Cone, R. D. Development of an assay for high-throughput energy expenditure monitoring in the zebrafish. Zebrafish. 10, 343-352 (2013).
- Livingston, R. J. A volumetric respirometer for long-term studies of small aquatic animals. J.Mar. Biol. Assoc. U.K. 48, 485-497 (1968).
- Makky, K., Duvnjak, P., Pramanik, K., Ramchandran, R., Mayer, A. N. A whole-animal microplate assay for metabolic rate using zebrafish. J. Biomol. Screen. 13, 960-967 (2008).
- E3 medium (for zebrafish embryos) Cold Spring Harb. Protoc. , http://cshprotocols.cshlp.org/citmgr?gca=protocols%3B2011%2F10%2Fpdb.rec66449 (2011).
- Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish breeding in the laboratory environment. ILAR J. 53, 161-168 (2012).
- Brand, M., Granato, M., Nusslein-Volhard, C. Zebrafish, A practical approach. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. (2002).
- Fry, F. E. J., Hart, J. S. Cruising speed of goldfish in relation to water temperature. J. Fish. Res. Board Can. 7, 169-175 (1948).
- Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC physiol. 10 (21), (2010).
- Song, Y., Cone, R. D. Creation of a genetic model of obesity in a teleost. FASEB J. 21, 2042-2049 (2007).
- Maddison, L. A., Joest, K. E., Kammeyer, R. M., Chen, W. Skeletal muscle insulin resistance in zebrafish induces alterations in beta-cell number and glucose tolerance in an age and diet dependent manner. Am. J. physiol. Endocrinol. , (2015).
- Flynn, E. J. 3rd, Trent , C. M., Rawls, J. F. Ontogeny and nutritional control of adipogenesis in zebrafish (Danio rerio). J. lipid res. 50, 1641-1652 (2009).
- Shimada, Y., Hirano, M., Nishimura, Y., Tanaka, T. A high-throughput fluorescence-based assay system for appetite-regulating gene and drug screening. PloS one. 7, e52549(2012).
- Tingaud-Sequeira, A., Ouadah, N., Babin, P. J. Zebrafish obesogenic test: a tool for screening molecules that target adiposity. J. lipid res. 52, 1765-1772 (2011).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Tagi
