Kora mózgowa, hipokamp, wzgórze, podwzgórze, jądro przegrody bocznej i jądro prążkowia specyficzne dla macicy elektroporacja u myszy C57BL/6

Podsumowanie

Ten protokół opisuje szczegółowo, jak specyficznie transfekować różne regiony w ośrodkowym układzie nerwowym C57BL/6 za pomocą elektroporacji in utero. W tym protokole zawarte są szczegółowe instrukcje dotyczące transfekcji regionów, które rozwijają się w korę, hipokamp, wzgórze, podwzgórze, jądro przegrody bocznej i prążkowie.

Streszczenie

Elektroporacja in utero jest szeroko stosowaną techniką szybkiej i efektywnej czasoprzestrzennej manipulacji różnymi genami w ośrodkowym układzie nerwowym gryzoni. Nadekspresja pożądanych genów jest tak samo możliwa, jak badania nad utratą funkcji za pośrednictwem shRNA. Dzięki temu oferuje szeroki zakres zastosowań. Możliwość celowania w poszczególne komórki na określonym obszarze dodatkowo zwiększa zakres potencjalnych zastosowań tej bardzo przydatnej metody. Do skutecznego celowania w określone regiony niezbędna jest wiedza na temat subtelności, takich jak stadium embrionalne, napięcie, które należy przyłożyć, a co najważniejsze, położenie elektrod.

Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół, który pozwala na specyficzną i efektywną elektroporację in utero kilku regionów ośrodkowego układu nerwowego myszy C57BL/6. W szczególności pokazano, jak transfekować regiony, które rozwijają się w korę zaśledzionową, korę ruchową, korę somatosensoryczną, korę gruszkowatą, rogówkę amonialną 1-3, zakręt zębaty, prążkowie, jądro przegrody bocznej, wzgórze i podwzgórze. W celu uzyskania informacji o odpowiednim stadium zarodkowym podaje się odpowiednie napięcie dla odpowiedniego stadium zarodkowego. Co najważniejsze, przedstawiona jest mapa kątów, która wskazuje odpowiednie położenie bieguna dodatniego. Ten ustandaryzowany protokół ułatwia skuteczną elektroporację w macicy, co może również prowadzić do zmniejszenia liczby zwierząt.

Wprowadzenie

Od pierwszego opisu w 2001 roku przez trzy niezależne grupy ^1-3, elektroporacja stała się powszechnie używanym standardowym narzędziem do analizy ekspresji genów w ośrodkowym układzie nerwowym gryzoni. W porównaniu z generacją myszy z nokautem, która, pomimo ciągłego ulepszania technik, nadal jest czasochłonna i kosztowna, elektroporacja in utero przemawia swoją prostotą. Tak więc elektroporacja in utero umożliwia szybkie i skuteczne badania przyrostu i utraty funkcji ⁴.

Aby transfekować obszary mózgu, roztwór zawierający ujemnie naładowany plazmid jest wstrzykiwany do komory. Podcza....

Protokół

Oświadczenie etyczne: Postępowanie z myszami i procedury eksperymentalne były prowadzone zgodnie z europejskimi, krajowymi i instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami.

1. Elektroporacja w macicy

Uwaga: Elektroporacja in utero została przeprowadzona, jak poprzednio opublikowano^12,14. W związku z tym metoda ta została opisana jedynie pokrótce w dalszej części (rysunek 1).

1. Preparaty
   1. Przygotować szybko zielony roztwór plazmidu o wysokiej klasie transfekcji (zawierający 1,5 pCAGGS), jak opisano wcześniej¹².

Wyniki

Rycina 2 przedstawia przykłady specyficznej elektroporacji in utero obszarów rozwijających się w korę retrosplenialną, korę ruchową, korę somatosensoryczną, korę piriformową, pole CA1-3, zakręt zębaty, prążkowie, jądro przegrody bocznej, wzgórze i podwzgórze. Wyniki transfekcji przedstawiono obok zalecanego kąta (Rycina 2). Dla lepszej wizualizacji kątów in vivo na embrionie pokazano również pozycję elektrody (0,5 mm) (Rycina 5, embrion in utero

Dyskusja

Protokół ten opisuje szczegółowo, jak transfekować korę zaśledzionową, korę ruchową, korę somatosensoryczną, korę gruszkowatą, róg amonialny 1-3, zakręt zębaty, prążkowie, jądro przegrody bocznej, wzgórze i podwzgórze myszy C75BL / 6. Ze wszystkimi dostarczonymi informacjami jest to pierwszy protokół, który dostarcza wszystkich niezbędnych informacji do łatwego odtworzenia transfekcji tych obszarów mózgu w myszy C57BL/6. Poprzednie publikacje koncentrowały się głównie na kilku konkretnych regionach, dlatego szczegółowe i.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
EndoFree Plasmid Maxi Kit	QIAGEN	12362
Fast Green	Roth	0301.1
pCAGGS	Kapilary
(średnica 0,8-0,9 mm)	Precision Instrument Inc.	1B100F-4
Isoflurane (Forene)	Abbott	PZN 4831850
Carprofen (Rimadyl)	Pfizer GmbH	numer zgody: 400684.00.00
maść do oczu (Bepanthen Augen und Nasensalbe)	Bayer	PZN 01578681
0,9% alkohol benzylowy 0,9% roztwór soli	Apteka Uniwersyteckiego Centrum Medycznego w Moguncji
gaza (ES-Kompressen)	Hartmann	407835
sterylny 5-0 Perma-Hand Jedwabny	Ethicon Johnson & Kleszcze	K890H
1/ 1,5 mm	Fine Science Tools	11101-09
kleszcze pierścieniowe 4,8/ 6 mm	Fine Science Tools	11106-09
kleszcze pierścieniowe 2,2/ 3 mm	Fine Science Tools	11103-09
Kleszcze Adson-ząbkowane, proste 12 cm	Fine Science Tools	1106-12
IrisNożyczki-Delikatne, Proste-Ostre/ Blunt 10 cm	Fine Science Tools	14028-10
Mayo-Stille Nożyczki-Proste 15 cm	Fine Science Tools	14012-15
Dumont #5 Kleszcze-Inox	Fine Science Tools	11251-20
Castroviejo NeedleHolder-z zamkiem-Węglik wolframu 14 cm	Fine Science Tools	12565-14
Elektroporator CUY21 SC	Nepa Gene Co.
FST 250 Sterylizator gorących koralików	Fine Science Tools	18000-45
Mikroszlifierka EG-44	Narishige
P-97 Ściągacz Micropette	Sutter Instrument Company	P-97
Elektrody platynowe 650P 0,5 mm	Nepagene	CUY650P0,5
Elektrody platynowe 650P 3 mm	Nepagene	CUY650P3
Elektrody platynowe 650P 5 mm	Nepagene	CUY650P5
Elektrody platynowe 650P 10 mm		Nepagene
	Rothacher-Medical GmbH	CV-30511-3 Vapor 19.3
Płyta grzewcza	Rothacher-Medical GmbH	HP-1M
Regulator temperatury 220V AC	Rothacher-Medical GmbH	TCAT-2LV

ze szkła borokrzemianowego Addgene szew pierścieniowe Johnson System anestezjologiczny CUY650P10