Metoda oceny wzmacniających właściwości etanolu u szczurów bez niedoboru wody, blaknięcia sacharyny lub szkolenia o przedłużonym dostępie

Summary

Ten protokół opisuje nowatorską i efektywną metodę szybkiego inicjowania reakcji instrumentalnej na etanol u szczurów, która, w przeciwieństwie do standardowych metod, nie wymaga pozbawienia wody ani zaniku sacharyny/sacharozy, aby zainicjować odpowiedź.

Abstract

Instrumentalne metody samodzielnego podawania doustnego są powszechnie stosowane do badania wzmacniających właściwości etanolu u zwierząt. Jednak standardowe metody wymagają blaknięcia sacharyny/sacharozy, niedoboru wody i / lub przedłużonego treningu w celu zainicjowania odpowiedzi instrumentalnej u szczurów. W artykule opisano nowatorską i skuteczną metodę szybkiego inicjowania odpowiedzi instrumentalnej na etanol, która jest wygodna dla eksperymentatorów i nie wymaga niedoboru wody ani blaknięcia sacharyny/sacharozy, eliminując w ten sposób potencjalne zakłócenia związane ze stosowaniem słodzików w badaniach samodzielnego podawania etanolu. Dzięki tej metodzie, szczury Wistar zazwyczaj nabywają i utrzymują samodzielne podawanie 20% roztworu etanolu w czasie krótszym niż dwa tygodnie treningu. Co więcej, stężenie etanolu we krwi i nagrody są dodatnio skorelowane dla 30-minutowej sesji samodzielnego podawania. Co więcej, naltrekson, zatwierdzony przez FDA lek na uzależnienie od alkoholu, który, jak wykazano, hamuje samodzielne podawanie etanolu u gryzoni, w zależności od dawki zmniejsza spożycie alkoholu i motywację do spożywania alkoholu u szczurów samodzielnie podając 20% etanolu, potwierdzając w ten sposób zastosowanie tej nowej metody do badania wzmacniających właściwości alkoholu u szczurów.

Introduction

Rozwój modeli zwierzęcych do badania wzmacniającego działania narkotyków okazał się ważnym narzędziem do badania uzależnienia od narkotyków u ludzi. Mówiąc dokładniej, samodzielne podawanie przez instrumentów jest szeroko stosowanym modelem behawioralnym, który jest jednym z najskuteczniejszych sposobów oceny pozytywnych wzmacniających efektów doustnego spożywanego roztworu etanolu. Wczesnym problemem związanym z opracowaniem takiego modelu był pierwotny awersyjny smak wysokich stężeń etanolu u większości gryzoni, zjawisko, które występuje również u ludzi z niewielkim lub żadnym doświadczeniem z alkoholem¹. Standardowy protokół mający na celu pokonanie tej bariery wymaga pozbawienia wody i/lub blaknięcia sacharyny lub sacharozy w celu uzyskania i utrzymania samodzielnego podawania. Jednak te dwa podejścia nie są korzystne. Wymagają długich okresów treningu, aby po prostu zainicjować reakcję na etanol i uzyskać względny wskaźnik sukcesu w pozyskiwaniu. Stosowanie substancji słodzących wprowadza również potencjalną stronniczość w interpretacji danych dotyczących samodzielnego podawania. Te ograniczenia nie mają zastosowania do następującego protokołu.

Krótko mówiąc, Samson i koledzy² wykazali, że rozpuszczenie etanolu w słodkim roztworze 20% sacharozy, a następnie zaniknięcie słodyczy w ciągu 4 tygodni treningu jest wymagane do rozpoczęcia reakcji na 10% etanolu w wodzie. Co więcej, niezawodne spożycie etanolu jest zwykle osiągane w ciągu 6 do 8 tygodni^1-3. Takie podejście jest wysoce problematyczne. Po pierwsze, wymaga to dłuższych okresów szkolenia, zanim badacze będą mogli zacząć mierzyć samodzielne podawanie etanolu. W przeciwieństwie do tego, dożylne samodzielne podawanie kokainy lub heroiny wymaga 0-1 dnia treningu przedlekowego na dźwigni do dostarczania pokarmu u zwierząt z ograniczeniami pokarmowymi, a stabilna reakcja na lek jest często osiągana w ciągu 10 - 12 dni^4,5. Innym ograniczeniem tej metody jest fakt, że sacharyna i sacharoza są wysoce satysfakcjonujące dla szczurów i wywołują wzorce aktywacji mózgu podobne do nadużywanych narkotyków, co wprowadza potencjał do zakłóceń w badaniach nad samodzielnym podawaniem etanolu^6-9. Wreszcie, szczury, które samodzielnie podawały roztwór etanolu przy użyciu tej metody, wykazywały zmienność w wskaźniku nabywania i odpowiedzi^1,10, przy czym znaczna część szczurów była konsekwentnie wykluczana z eksperymentów z powodu nieudanego nabycia i/lub niewystarczającego wskaźnika odpowiedzi.

Dla kontrastu, w tym protokole, prezentujemy prostą, ale skuteczną metodę pozyskiwania i utrzymywania doustnego samodzielnego podawania 20% etanolu w roztworze wodnym, która nie wymaga pozbawienia wody, blaknięcia sacharozy/sacharyny lub szkolenia w zakresie przedłużonego dostępu. Niedawne badanie wykazało, że samodzielne podawanie doustnego etanolu wykazuje odwróconą krzywą odpowiedzi na dawkę w kształcie litery U z najwyższym spożyciem etanolu podczas samodzielnego podawania przy 20% stężeniu etanolu, co stanowi uzasadnienie dla wyboru 20% roztworu etanolu w naszym eksperymentalnym projekcie¹¹.

Protocol

Wszystkie procedury są przeprowadzane zgodnie z Przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.

1. Opieka nad zwierzętami i ich trzymanie

1. Po przybyciu do kolonii trzyma w domu samce szczurów rasy Wistar o wadze 200 - 225 g w momencie przybycia w parach w środowisku o kontrolowanej temperaturze (21 °C) i wilgotności z odwróconym 12-godzinnym cyklem jasno-ciemnym.
   Uwaga: W zależności od przesłanek eksperymentów, szczury mogą być trzymane w jednym pomieszczeniu.
2. Pozwól szczurom zaaklimatyzować się w wiwarium i cyklu świetlnym przez co najmniej tydzień przed rozpoczęciem eksperymentu i dotykaj ich codziennie. Waż zwierzęta raz w tygodniu.
3. Daj szczurom swobodny dostęp do jedzenia i wody z kranu na czas trwania eksperymentu (brak wody nie jest konieczny do rozpoczęcia odpowiedzi¹²). Przeprowadź wszystkie testy behawioralne podczas ciemnej fazy cyklu światło-ciemność w ciemnym pomieszczeniu testowym.
   Uwaga: Chociaż rutynowo używamy młodych dorosłych samców szczurów rasy Wistar (dni po urodzeniu 62 - 65), protokół ten może teoretycznie być odpowiedni do badania innych szczepów szczurów, a także różnic płci i/lub wieku.

2. Trening operacyjny

1. Przeprowadź wszystkie szkolenia i testy behawioralne w identycznych komorach operacyjnych o wymiarach 30,5 × 29,2 × 24,1 cm i zawierających siatkowe podłogi i pojemniki na śmieci wyłożone ściółką (zmienianą między zwierzętami w celu zmniejszenia sygnałów zapachowych), umieszczonymi w kabinach dźwiękochłonnych wyposażonych w wentylatory wyciągowe do wentylacji.
   Uwaga: Szczury są trenowane przez warunkowanie instrumentalne od pierwszego dnia treningu (reakcja na dźwignię jest niezbędna do uzyskania wzmacniacza) między + 1 godziną a + 8 godziną cyklu ciemnego. Nie ma wstępnej ekspozycji na alkohol, ani jedzenia lub kształtowania płynów przed treningiem alkoholowym.
2. Wyposaż każdą komorę operacyjną w lampki stymulacyjne, pompy strzykawkowe i dwie wysuwane dźwignie umieszczone z boku pojemnika na płyn. Interfejs komór i sterowanie przez komputer za pomocą odpowiedniego oprogramowania.
   Uwaga: Większość dostawców dostarcza pakiety do samodzielnego administrowania zawierające wszystkie niezbędne komponenty, a także oprogramowanie i interfejsy niezbędne do sterowania komorami.
3. Napisz program kondycjonowania instrumentalnego, który inicjuje harmonogram stałego stosunku (FR) 20% wzmocnienia etanolem (harmonogram operacyjny, w którym odpowiedź jest wzmacniana dopiero po określonej liczbie odpowiedzi) zgodnie z instrukcjami producenta. Na przykład, w przypadku 1 o stałym stosunku, szczury muszą wytworzyć jedną odpowiedź, aby uzyskać wzmacniacz (zobacz sekcję Pliki kodu uzupełniającego, aby zapoznać się z przykładem programu FR1). Wykonaj następujące polecenia.
   1. Wysuń dwie dźwignie, aby zaznaczyć początek sesji i zasygnalizować dostępność alkoholu.
      Uwaga: Jedno naciśnięcie dźwigni związanej z etanolem (aktywnym) jest nagradzane dostarczeniem objętości 100 μl 20% etanolu do wody w sąsiedniej studni do picia i inicjuje jednoczesny 5-sekundowy okres przerwy sygnalizowany zapaleniem się lampki sygnalizowanej przez zapalenie się lampki sygnalizującej nad dźwignią. Lampka sygnalizująca jest wprowadzana w pierwszym dniu treningu.
   2. W okresie limitu czasu zarejestruj odpowiedź, mimo że nie ma ona zaplanowanych konsekwencji. Zapisuj odpowiedzi na drugiej dźwigni (nieaktywnej), chociaż nigdy nie mają one konsekwencji behawioralnych. Uwaga: Nieaktywna dźwignia służy jako element sterujący do oceny nieokreślonego zachowania.
   3. Zapisz liczbę odpowiedzi na aktywną dźwignię (wskaźniki odpowiedzi) oraz liczbę zdobytych nagród w wysokości 20% etanolu.
   4. Po upływie 30 minut należy cofnąć obie dźwignie, aby zasygnalizować koniec sesji i zasygnalizować koniec dostępności alkoholu.
   5. Zapisz i zarchiwizuj wszystkie dane.
4. Przed rozpoczęciem sesji treningowej należy sprawdzić poprawność działania wszystkich urządzeń w każdej komorze operacyjnej (wysuwane dźwignie, dozownik płynu).
5. Przygotuj 20% v/v roztwór etanolu z 190 Proof (95%) etanolu rozcieńczonego w wodzie z kranu.
   Uwaga: Roztwór etanolu można przechowywać w temperaturze pokojowej. W zależności od producenta standardowe roztwory etanolu mogą wynosić do 99,98%. Należy również zauważyć, że podczas gdy w większości opublikowanych manuskryptów stężenia etanolu są zwykle przedstawiane jako objętość/objętość, niektóre mogą przedstawiać je jako masę/objętość.
6. Napełnij strzykawkę 20% roztworem etanolu i upewnij się, że w przewodach infuzyjnych nie ma wycieków ani pęcherzyków powietrza. Ręcznie przepchnij niewielką objętość etanolu przez przewody infuzyjne, aby upewnić się, że etanol zostanie prawidłowo dostarczony do pojemnika od pierwszej wzmocnionej reakcji. Osusz pojemnik ręcznikiem papierowym i upewnij się, że jest pusty przed rozpoczęciem sesji.
7. Załaduj oprogramowanie, które steruje harmonogramem FR zbrojenia etanolem o 20%
8. Trenuj szczury, które nie były wcześniej leczone narkotykami i działały zgodnie z harmonogramem FR1, aby samodzielnie podawały 20% etanolu bez niedoboru wody podczas 30-minutowych sesji.
   1. Przetransportuj szczury z wiwarium do pomieszczenia testowego za pomocą klatki transportowej.
   2. Przypisz każdego szczura do jednej komory. Wyjmij każdego szczura z klatki transportowej i umieść go w przydzielonej komorze do samodzielnego podawania.
   3. Staraj się, aby warunki eksperymentu były spójne każdego dnia. Dlatego zawsze testuj szczury w tej samej komorze do samodzielnego podawania o mniej więcej tej samej porze każdego dnia.
   4. Uruchom oprogramowanie, które inicjuje harmonogram FR1 20% wzmocnienia etanolem.
   5. Pod koniec sesji wyjmij szczury z komór do samodzielnego podawania i włóż je z powrotem do wiwarium.
   6. W celu ręcznego potwierdzenia, że roztwór alkoholu został spożyty przez zwierzęta, należy użyć ręcznika papierowego i sprawdzić, czy pojemnik jest wysuszony. Alternatywnie, użyj strzykawki o pojemności 1 lub 2 ml i zbierz płyn pozostały w pojemniku, aby oszacować objętość, która nie została zużyta.
      Uwaga: W celu uzyskania bardziej precyzyjnego pomiaru (ale również droższego) możliwe jest wyposażenie każdej komory w system lizometru podłączony do pojemnika na kubek z płynem, który umożliwia precyzyjne zliczenie lizawek wytwarzanych przez szczury podczas sesji samodzielnego podawania.
   7. Oczyść ściany i podłogę kratową każdej komory środkiem do dezynfekcji powierzchni.
   8. Po użyciu należy konserwować linie infuzyjne, czyszcząc je 70% roztworem etanolu. Gdy nie jest używany, włóż nasadkę, aby uniknąć pleśni i kurzu.
9. Po każdej sesji zbierz i przeanalizuj wygenerowane dane. Dokładniej rzecz ujmując, oblicz średnią liczbę aktywnych naciśnięć dźwigni, średnią liczbę uzyskanych nagród alkoholowych, a także średnią liczbę nieaktywnych naciśnięć dźwigni.
   Uwaga: W większości prac spożycie alkoholu jest również przedstawiane jako spożycie etanolu w g/kg (masa ciała). Spożycie etanolu można obliczyć za pomocą następującego wzoru:
   
   Ze zużytą objętością (ml) - liczba zdobytych nagród ± jednostkową objętością/nagrodą i gęstością etanolu w temperaturze pokojowej - 0,789 g/ml.
   Na przykład, jeśli szczur ważący 400 g zdobył 20 nagród w postaci 20% roztworu etanolu v/v:
   
10. Prowadź sesje 5/6 dni w tygodniu, aż do ustabilizowania się wyników (zdefiniowanych jako minimum 15 sesji i brak zmiany większej niż 15% w całkowitej liczbie nagród zdobytych w ciągu ostatnich 3 sesji).
    Uwaga: Gdy szczury osiągną stabilną linię bazową na FR1, program kondycjonowania instrumentalnego może zostać zmodyfikowany zgodnie z instrukcjami producenta w celu zwiększenia liczby odpowiedzi niezbędnych do uzyskania nagrody w postaci alkoholu. Stały współczynnik można na przykład zwiększyć do FR2 lub FR3, aby zminimalizować przypadkowe zbrojenie.
11. Zmierz stężenie etanolu we krwi:
    1. Aby potwierdzić, że nagrody uzyskane podczas sesji samodzielnego podawania są spożywane przez szczury, zmierz stężenie etanolu we krwi po samodzielnym podaniu. Gdy szczury osiągną stabilną linię bazową, natychmiast po sesji pobierz krew z bocznej żyły ogonowej. Wprowadzić igłę o sile 23 G do naczynia krwionośnego i pobrać 50 μl próbek krwi za pomocą rurki kapilarnej.
    2. Przenieść 50 μl próbek krwi do fiolek o pojemności 10 ml i dodać 50 μl alkoholu izopropylowego w proporcji 1:1 000 jako wzorzec wewnętrzny. Przygotować krzywą wzorcową od 10 do 300 mg/dl z wzorców etanolu. Próbki należy przetwarzać za pomocą próbnika z kolumną chromatograficzną¹³ zgodnie z ustawieniami producenta.
12. Współczynnik progresywny
    1. Użyj harmonogramów progresywnych proporcji (PR), aby ocenić motywację zwierząt do spożycia nagrody¹⁴. PR to harmonogram instrumentalny, w którym liczba odpowiedzi w celu uzyskania wzmacniacza jest stopniowo zwiększana (innymi słowy, szczury muszą pracować ciężej na każdą kolejną nagrodę).
       Uwaga: W przeciwieństwie do sesji FR, sesja PR nie jest ograniczona czasowo i zostanie zakończona dopiero po upływie 30 minut bez pełnego współczynnika.
       1. Umieść szczury w przydzielonych im skrzynkach operacyjnych i pozwól im zareagować na 20% etanolu zgodnie z harmonogramem PR wzmocnienia: Utrzymuj wszystkie warunki eksperymentalne identyczne z tymi stosowanymi w harmonogramie FR (patrz krok 2.3), z wyjątkiem zwiększenia wymogu odpowiedzi lub kosztu w trakcie sesji (tj. liczby naciśnięć dźwigni wymaganych na aktywnej dźwigni, aby otrzymać pojedynczą nagrodę w postaci etanolu) zgodnie z następującym wzorem: 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20, 24, 28, 32... Uwaga: Przykład programu PR znajduje się w sekcji Pliki kodu uzupełniającego.
       2. Zakończ sesję PR po upływie 30 minut bez nagrody.
          Uwaga: Punkt przerwania jest zdefiniowany jako ostatnie ukończone wymaganie odpowiedzi podczas sesji żądania ściągnięcia.

3. Testowanie trafności predykcyjnej instrumentalnego modelu samodzielnego podawania alkoholu

Uwaga: Gdy szczury osiągną stabilną linię bazową samodzielnego podawania (patrz krok 2), możliwa jest ocena trafności predykcyjnej modelu poprzez testowanie skuteczności naltreksonu, obecnie zatwierdzonego przez FDA leku na uzależnienie od alkoholu, w zmniejszaniu 20% samodzielnego podawania etanolu. Zalecamy wykonanie tego testu na najwyższym FR osiągniętym podczas treningu (FR2), gdy odpowiedzi są niezawodnie wysokie. Po ustaleniu trafności predykcyjnej model może być wykorzystany do oceny nowych kandydatów na leki.

1. Przed dniem testu należy podać szczurom podskórne zastrzyki z soli fizjologicznej na 30 minut przed sesjami samodzielnego podawania, aby przyzwyczaić je do wstrzyknięcia podczas co najmniej dwóch kolejnych sesji samodzielnego podawania lub do momentu, gdy wstrzyknięcia soli fizjologicznej nie wpłyną na odpowiedź na etanol (zdefiniowane jako brak zmiany większej niż 15% w całkowitej liczbie nagród zdobytych w ciągu ostatnich 2 sesji).
2. Rozpuść naltrekson w soli fizjologicznej i dostosuj pH do neutralności, aby ułatwić wstrzykiwanie zwierzętom. Lek należy wstrzykiwać w objętości 1,0 ml/kg na 30 minut przed sesją, podając podskórnie. Uwaga: Literatura dostarcza dobrych danych naukowych na temat wyboru dawki w zakresie 0,1 - 1 mg/kg, dlatego w tym protokole stosuje się 0,1, 0,3 i 1 mg/kg.
   Uwaga: Badania wskazują na stosowanie naltreksonu zarówno podskórnej, jak i dootrzewnowej drogi podawania, chociaż ich siła działania może się różnić, przy czym wstrzyknięcie podskórne jest 30-krotnie silniejsze niż wstrzyknięcie dootrzewnowe¹⁵. Z tego powodu zalecamy stosowanie drogi podskórnej, ponieważ stosowanie tej drogi do wstrzykiwania naltreksonu zostało zatwierdzone i powtórzone przez różne laboratoria w zakresie stężeń od 0,1 do 1 mg / kg^12,15,16.
3. W dniu testu należy wstrzykiwać szczurom w zrównoważonej/losowej kolejności w schemacie międzyosobowym w jednym z czterech cykli dawkowania naltreksonu (0, 0,1, 0,3 i 1 mg / kg) 30 minut przed sesją samodzielnego podawania.
4. Pomiędzy każdym cyklem dawkowania należy pozwolić szczurom na wypłukanie leku za pomocą co najmniej dwóch kolejnych sesji samodzielnego podawania lub do momentu, gdy odpowiedź na etanol powróci do wartości wyjściowej. Uwaga: W rezultacie, pod koniec testu, wszystkim szczurom wstrzyknięto każdą z czterech dawek.
5. Po tej fazie należy wybrać najbardziej efektywną dawkę (1 mg/kg) i przetestować wpływ naltreksonu na motywację zwierząt do spożywania alkoholu przy użyciu progresywnego schematu proporcji (patrz krok 2.12).

Results

Rysunek 1 pokazuje reprezentatywne zachowanie szczurów Wistar, które wcześniej nie stosowały leków i nie stosowały leków, (osiem różnych kohort w sumie 239 szczurów) wyszkolonych według schematu FR1 do samodzielnego podawania 20% etanolu bez niedoboru wody lub blaknięcia sacharyny/sacharozy podczas 30-minutowych sesji. Dzięki temu protokołowi szczury inicjują naciskanie dźwigni, aby bardzo szybko uzyskać nagrodę w postaci etanolu, uzyskując już ponad 10 nagród podczas pie...

Discussion

Dzięki temu protokołowi przedstawiamy nową metodę pozyskiwania i utrzymywania stabilnego samodzielnego podawania doustnego 20% etanolu u szczurów, która, w przeciwieństwie do klasycznych modeli samodzielnego podawania etanolu, nie wymaga stosowania pozbawienia wody, szkolenia w zakresie przedłużonego dostępu lub blaknięcia sacharyny/sacharozy¹². Co więcej, naltrekson, obecnie zatwierdzony przez FDA lek na uzależnienie od alkoholu, skutecznie zmniejsza samodzielne podawanie alkoholu i motywację do spożywania al...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ekstra wysoka kabina dźwiękochłonna z MDF, wnętrze: 22 "szer. x 22" wys. x 16 "D	Med Associates Inc.	ENV-018MD
Ekstra wysoka modułowa komora testowa ze zmodyfikowaną górą, wanną na odpady i Photobeam	Med Associates Inc.	ENV-007CT-PH
Podłoga ze stali nierdzewnej dla szczurów lub małych naczelnych	Med Associates Inc.	ENV-005
Wysuwana dźwignia	Med Associates Inc.	ENV-112CM	2 firmy SA
chambers Stimulus Light, 1" Biała soczewka, montowana na panelu modułowym	Med Associates Inc.	ENV-221M	2 firmy SA komory
Dwukubkowy pojemnik na płyn z rurami ze stali nierdzewnej 18 ga	Med Associates Inc.	ENV-200R3AM
Jednobiegowa pompa strzykawkowa, 3,33 obr./min	Med Associates Inc.	PHM-100
	Med Associates Inc.	PHM-122-18
Pakiet wejść SmartCtrl 8 / 16 wyjść	Med Associates Inc.	DIG-716P2
Oprogramowanie MED-PC	firmy Med Associates Inc.	SOF-735
http://www.mednr.com/	Med Associates Inc.		Strona internetowa, która jest open-source i została stworzona, aby zaoferować naukowcom miejsce do wymiany kodu notacji MEDState
Strzykawki Kendall Monoject 20 cc, regularna końcówka Luer VWR	International	MJ8881-520657
Etanol, czysty, 190 Proof (95%), USP, KOPTEC	Decon Labs	2801
0,9% Chlorek sodu do wstrzykiwań, USP	Hospira	0409-4888-50
Naltrekson chlorowodorek	Sigma Aldrich	N3136-1G
23 G BD Igły PrecisionGlide	BD	305145
Minivette POCT 50 µ L, K3EDTA	Sarstedt	17.2113.150	Do pobierania krwi włośniczkowej