Artykuł metodologiczny

Prosta alternatywa dla wstrzyknięcia stereotaktycznego w celu specyficznego dla mózgu knockdownu miRNA

DOI:

10.3791/53307

⸱

26 grudnia 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1CSIR-Institute of Genomics and Integrative Biology, New Delhi, India, 2Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR), New Delhi, India

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MikroRNA odgrywają kluczową rolę w mózgu i są potencjalnymi celami do modelowania neurodegeneracji. Jednak zaburzanie poziomów miRNA jest trudne ze względu na krótką długość miRNA i niedostępność tkanki mózgowej. Ten film przedstawia metodę projektowania antagomiru i dostarczania specyficznego dla mózgu przy użyciu neuropeptydu u myszy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MikroRNA (miRNA) są kluczowymi regulatorami ekspresji genów. W mózgu procesy życiowe, takie jak rozwój neurologiczny i funkcje neuronalne, zależą od prawidłowej ekspresji mikroRNA. Perturbacja mikroRNA w mózgu może być wykorzystana do modelowania chorób neurodegeneracyjnych poprzez modulację śmierci komórek neuronalnych. Obecnie wstrzyknięcie stereotaktyczne jest stosowane do dostarczania środków knockdown miRNA do określonego miejsca w mózgu. W tym miejscu omawiamy strategie projektowania antagomirów przeciwko miRNA z modyfikacjami zablokowanych nukleotydów (LNA). Następnie opisz metodę specyficznego dla mózgu dostarczania antagomirów, równomiernie w różnych regionach mózgu. Metoda ta jest prosta i ma szerokie zastosowanie, ponieważ pozwala przezwyciężyć operację, związany z nią uraz i ograniczenie miejscowego dostarczania w iniekcjach stereotaktycznych. Przygotowaliśmy kompleks neurotropowego, penetrującego komórki peptydu glikoproteiny wirusa wścieklizny (RVG) z antagomirem przeciwko miRNA-29 i wstrzykiwanym przez żyłę ogonową, aby specyficznie dostarczyć do mózgu. Konstrukcja antagomiru zawierała cechy, które umożliwiają specyficzne celowanie w miRNA i tworzenie niekowalencyjnych kompleksów z peptydem. Knockdown miRNA w komórkach neuronalnych spowodował apoptozę śmierci komórki i związane z nią wady behawioralne. W związku z tym metoda może być stosowana w ostrych modelach neurodegeneracji poprzez zaburzenia miRNA.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MikroRNA stały się nowymi celami terapeutycznymi ze względu na ich uniwersalną rolę w regulacji ekspresji genów i bezpośrednie dowody na udział w chorobie. MiRNA są aktywnie badane pod kątem ich potencjału jako celów terapeutycznych1,2. Co więcej, zmiany w ekspresji miRNA są związane z kilkoma chorobami3, a symulacja tych zmian poprzez sztuczne zakłócenia ekspresji miRNA może być wykorzystana do badania szlaków komórkowych zaangażowanych w manifestację choroby. Specyficzne tkankowo dostarczanie leków ukierunkowanych na miRNA jest obecnie głównym wyzwaniem dla opracowywania leków opartych na miRNA. Antagomiry i mimiki miRNA są obiecującymi środkami do zaburzania poziomów miRNA4-6. Jednak specjalne cechy, które zwiększają ich specyficzność i skuteczność, muszą zostać włączone do projektu antagomirów, zanim będą mogły być wykorzystane do zaburzeń ekspresji miRNA in vivo.

MikroRNA są szczególnie istotne jako cele w obecnie nieuleczalnych chorobach neurodegeneracyjnych i neurorozwojowych. Bariera krew-mózg stanowi ograniczenie w dostarczaniu antagomirów do mózgu. Iniekcje stereotaktyczne są szeroko stosowane w modelach gryzoni w celu dostarczania cząsteczek do określonych miejsc w mózgu7. Wymaga to umiejętności, rozległych inwestycji w oprzyrządowanie i czasu. Iniekcje stereotaktyczne są inwazyjne, wiążą się z operacją, powodują co najmniej niewielkie obrażenia i są ograniczone do dostarczania miejscowego. Zastosowanie peptydów penetrujących komórki z preferencją do celowania w neurony może przeciwdziałać tym ograniczeniom, ponieważ mogą one być dostarczane drogą przeznaczyniową, ale naruszają barierę krew-mózg. Taki peptyd pochodzący z glikoproteiny wirusa wścieklizny (RVG) był wcześniej używany do dostarczania siRNA przeciwko wirusowi japońskiego zapalenia mózgu u myszy8. Odkryliśmy, że używając peptydu do dostarczania antagomiru, miRNA mogą być skutecznie powalone w mózgu myszy9.

Drugim dużym wyzwaniem związanym z knock-downem miRNA jest mały rozmiar miRNA i obecność blisko spokrewnionych izoform sekwencji. Weźmy przykład rodziny mmu-miR-29, która składa się z trzech blisko spokrewnionych izoform: miR-29a, b i c. Antagomiry są również na ogół modyfikowane wzdłuż kręgosłupa, aby zwiększyć ich stabilność i uczynić je odpornymi na atak nukleaz. Zablokowane kwasy nukleinowe (LNA) mają dodatkową zaletę, ponieważ zwiększają stabilność termiczną, a nawet prowadzą do degradacji celu poza przeszkodą steryczną10. Wprowadzanie modyfikacji wzdłuż całej sieci szkieletowej może być skuteczne, ale kosztowne. Wcześniej widzieliśmy, że modyfikacje przekraczające optymalną liczbę mogą nie zwiększać jeszcze bardziej skuteczności. Projekt antagomira zakłada zatem optymalną modyfikację antagomiru.

Aby niekowalencyjnie skompleksować antagomir z neurotropowym peptydem, stosuje się naładowane rozszerzenie hepta- do nona-argininy. Stosuje się reszty D-argininy, ponieważ zapewniają one większą stabilność, ponieważ nie są podatne na rozszczepienie przez proteazy. Rozciągnięcia hepta- do nona-argininy działają jako skuteczne środki penetrujące komórki, chociaż nie nadają specyficzności typu komórki. Poprzez kowalencyjne połączenie peptydu RVG z łącznikiem nona-argininy, wytworzono neurotropowy, penetrujący komórki peptyd. Dodatnio naładowane reszty peptydu oddziałują z ujemnie naładowanym szkieletem kwasu nukleinowego, tworząc kompleksy. Kompleksy te mogą być wykorzystywane do skutecznej transfekcji DNA lub RNA do hodowanych komórek oraz in vivo do tkanek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uwaga: Wszystkie procedury, w tym zwierzęta badane, zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Etyki Zwierząt (IAEC) w Instytucie Genomiki i Biologii Integracyjnej w New Delhi (IGIB/AEC/10/2013). Protokół ten jest specjalnie dostosowany do celowanego dostarczania Antagomiru-29 do mózgu i knockdown miR-29.

1. Strategia projektowania Antagomiru

  1. Pobierz dojrzałą sekwencję miRNA z miRBazy11 (http://www.mirbase.org/).
  2. Pobierz sekwencje powiązanych członków rodziny miRNA za pomocą linku "Rodzina genów" w rekordzie miRBazy
    (http://www.mirbase.org/cgi-bin/mirna_summary.pl?fam=MIPF0000009 ).
  3. Odwrotne uzupełnienie sekwencji: http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html zapewnia wygodne narzędzie do odwracania sekwencji dopełnienia.
  4. Oznacz pozycje, które mają zostać zmodyfikowane przez LNA, korzystając z następujących wskazówek:
    1. Wybierz reszty tyminy umieszczone w odległości 3-4 zasad od siebie do modyfikacji LNA, ponieważ pirymidyny LNA są bardziej stabilne niż puryny12.
    2. Wybierz reszty cytozyny oddzielone 3-4 resztami, jeśli poprzedni krok daje mniej niż pięć modyfikacji.
    3. Nadaj priorytet pięciu modyfikacjom do końca 5' antagomiru, ponieważ pozwala to uniknąć sekwencji zasiewu.

2. Preparat kompleksu Antagomir-neuropeptyd

Uwaga: Jest to najbardziej krytyczny krok w protokole i wymaga standaryzacji. Aby ustandaryzować protokół, zamiast antagonukleotydu9 można użyć dowolnego fluorescencyjnie znakowanego oligonukleotydu (FLO). Peptydy powinny mieć wysoką czystość (stopień HPLC, czystość 98%). Sekwencje i ładunek peptydu i antagomiru podano w tabeli 1.

  1. Zdecyduj o liczbie pieprzyków antagomiru do wstrzyknięcia na podstawie ładunku molowego na antagomirze, jego toksyczności i wagi myszy. Obliczyć liczbę moli peptydu do wstrzyknięcia na podstawie stosunku ładunku molowego antagomiru : peptide.
    UWAGA: Standaryzuj stosunek ładunku molowego antagomiru : peptydu pod kątem toksyczności i skutecznego dostarczania do mózgu myszy. Do standaryzacji należy stosować różne współczynniki ładunków molowych znakowanego fluorescencyjnie oligonukleotydu: peptydu. Odkryliśmy, że zarówno Antagomir-29, jak i grupa kontrolna były toksyczne przy 4 mikrogramach/gram masy ciała myszy. Antagomir-29 i grupa kontrolna były używane przy 2 mikrogramach/gramach masy ciała, ale to skuteczne stężenie prawdopodobnie będzie się różnić dla każdego mikroRNA.
  2. Rozcieńczyć peptyd i antagomir w oddzielnych probówkach do mikrofuge z roztworów podstawowych sterylną 10% D-glukozą do pożądanego stężenia końcowego, jak obliczono w kroku 1.
  3. Trzymaj probówkę do mikrofuge z roztworem peptydów na wirze z umiarkowaną prędkością wirowania.
  4. Dodaj 1/3 roztworu antagomiru do probówki z roztworem peptydu, powoli, kroplami, podczas gdy dokładnie miesza się go w mieszalniku wirowym.
  5. Kontynuuj mieszanie roztworów na wirze przez następne 1 minutę, a następnie pozostaw mieszaninę na 1 minutę.
  6. Powtórz kroki 4 i 5 jeszcze dwa razy, aby wymieszać pozostały roztwór antagomiru z roztworem peptydu w tej samej probówce do mikrofuge. Powolne dodawanie ma kluczowe znaczenie dla tworzenia kompleksów monodyspersyjnych, które są skuteczne w transfekcji. Szybkie dodawanie może prowadzić do agregacji kompleksów i ich wytrącania.
  7. Inkubować kompleks przez 30 minut w temperaturze pokojowej bez wirowania. W tym czasie inkubacji zaaklimatyzuj myszy do laboratorium, w którym zostaną wykonane zastrzyki.

3. Iniekcja do żyły ogonowej kompleksu Antagomir-neuropeptyd

  1. Aby unieruchomić zwierzę, umieść mysz w uwięzi lub decapicone o odpowiedniej wielkości.
  2. Oczyść powierzchnię ogona za pomocą bawełnianego wacika nasączonego ciepłą wodą (około 40°C). Będzie to sprzyjać rozszerzeniu naczyń krwionośnych i zwiększy widoczność żyły.
  3. Zbliżyć się do ogona ze strzykawką insulinową o małej objętości (0,5 – 1,0 cm3) pod kątem 15-20°. Należy uważać, aby nie wprowadzić powietrza do strzykawki. Zacznij od dystalnej części ogona. Wstrzyknąć kompleks. Wyjąć igłę i przyłożyć wacik antyseptyczny bezpośrednio do miejsca wstrzyknięcia (około 5-10 sekund), aby zatrzymać krwawienie.
  4. Umieść mysz w indywidualnie wentylowanej klatce w grupie 3-5 sztuk, z kolbą kukurydzy i bibułą jako wzbogaceniem. Nie należy trzymać myszy bez wstrzyknięć i myszy z wstrzyknięciami w tej samej klatce.

4. Testy behawioralne

Uwaga: Zachowaj odstęp 3-4 godzin między wstrzyknięciem a testami behawioralnymi, aby umożliwić powrót do zdrowia po wstrzyknięciu. Przenieś mysz do cichego pokoju. Nie przeszkadzaj zwierzętom w tym okresie aklimatyzacji.

  1. Zaaklimatyzuj mysz w nowym pomieszczeniu przez 30 minut, a następnie rozpocznij następujące testy behawioralne. Zachowaj 10-minutową przerwę między każdym testem behawioralnym.
  2. Zapięcie kończyn tylnych:
    UWAGA: Ten test wskazuje na dysfunkcję motoryczną i upośledzenie neurologiczne.
    1. Delikatnie podnieś mysz, przytrzymując ją w pobliżu podstawy ogona na czystym tle.
    2. Sprawdź pozycję tylnych kończyn przez 10-15 sekund. Mysz typu dzikiego odchyla tylne kończyny od brzucha, podczas gdy mysz ataksyjna ma tendencję do cofania jednej lub obu tylnych kończyn w kierunku brzucha przez ponad 50% czasu zawieszonego13.
    3. Umieść mysz z powrotem w klatce
  3. Test półki:
    1. Delikatnie podnieś mysz, trzymając ogon i trzymaj ją na półce klatki.
    2. Obserwuj mysz szczególnie w rogu klatki. Mysz typu wild może z łatwością pokonywać rogi bez strachu i utraty równowagi. Ataksyjna mysz traci równowagę, zastyga lub trzęsie się podczas chodzenia po półce klatki i na rogach.
  4. Test odcisku stopy myszy:
    UWAGA: Do tego testu należy przygotować arkusz chłonny na podłodze wąskiego pasa startowego (~70 cm długości, ~5 cm szerokości ze ściankami o wysokości ~5 cm).
    1. Chwyć delikatnie mysz jedną ręką i nałóż tusz na tylne kończyny za pomocą pędzla.
    2. Umieść arkusz chłonny na podłodze wąskiego pasa startowego.
    3. Pozwól myszy chodzić lub przebiegać po chłonnym arkuszu w linii prostej na pasie startowym od jednego końca do drugiego.
    4. Powtórz ten proces jeszcze dwa razy z każdą myszką, używając świeżego arkusza chłonnego.
    5. Zmierz odległość między dwoma kolejnymi krokami w ruchu do przodu. Nie uwzględniaj odpowiednio pierwszych i ostatnich kilku śladów stóp, w których zwierzę dopiero rozpoczyna i kończy swój bieg.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z przedstawionej tutaj procedury, kompleksy 50mikrogramowego fluorescencyjnie znakowanego oligonukleotydu (FLO) i ~850mikrogramowego peptydu RVG o stosunku ładunku molowego 1:15 (FLO : peptyd) zostały przygotowane i wstrzyknięte tylko raz przez żyłę ogonową. Jako kontrolę dostarczania zastosowano kompleks nieneurotropowego peptydu Matrycy Wirusa Wścieklizny (RVM) i FLO. Następnego dnia wyizolowano mózg i wątrobę myszy i przygotowano zawiesiny pojedynczych komórek. Komórki obserwowano pod mikroskopem pod kątem...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj pokazujemy szeroko dostępną metodologię badania skutków modulacji miRNA. Obecnie większość prób scharakteryzowania in vivo funkcji miRNA polega na stworzeniu myszy z nokautem lub transgenu, który ulega ekspresji gąbki miRNA. Większość miRNA, nawet tych specyficznych dla typu komórki, ulega ekspresji w więcej niż jednym narządzie. Na przykład miRNA, początkowo uważane za specyficzne dla układu krwiotwórczego, ulegają również ekspresji w mózgu ze względu na obecność mikrogleju. Tak więc nawet specyficzna...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Souvik Maiti za pomoc w projektowaniu antagomirów. Dziękujemy również Rangeetha J. Naik, Rakesh Dey i Bijay Pattnaik za ich pomoc w metodach eksperymentalnych. Prace te zostały sfinansowane przez Radę Badań Naukowych i Przemysłowych (BSC0123). HS, MV i RR potwierdzają stypendium Rady Badań Naukowych i Przemysłowych w Indiach. MAS potwierdza stypendium Komisji ds. Grantów Uniwersyteckich w Indiach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Vortex
Restrainer lub Decapicone
Wąski pas startowy~ 70 cm długości, ~ 5 cm szerokości ze ścianami o wysokości ~ 5 cm.
Odczynniki
Oligonukleotydy znakowane fluorescencyjnie (siGLO)GE Healthcare Dharmacon INCD0016300120
10% sterylna D-glukoza
Antagomir-29Niestandardowa syntezaExiqon
Antagomir-controlNiestandardowa syntezaExiqon
Neuropeptyd RVGG.L.Biochem ( Szanghaj) Ltd.niestandardowa synteza>98% czystości
Neuropeptyd RVMG.L.Biochem (Shanghai) Ltd.Niestandardowa synteza>98% czystości
Inne
Bawełna
Ciepła woda
Strzykawki insulinowe Arkusze
chłonne
Tusz
Pędzel
Antyseptyczny

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Roshan, R., Ghosh, T., Scaria, V., Pillai, B. MicroRNAs: novel therapeutic targets in neurodegenerative diseases. Drug discovery today. 14, 1123-1129 (2009).
  2. Maes, O. C., Chertkow, H. M., Wang, E., Schipper, H. M. MicroRNA: Implications for Alzheimer Disease and other Human CNS Disorders. Current Genomics. 10, 154-168 (2009).
  3. Soifer, H. S., Rossi, J. J., Saetrom, P. MicroRNAs in Disease and Potential Therapeutic Applications. Mol Ther. 15, 2070-2079 (2007).
  4. Bader, A. G., Brown, D., Winkler, M. The Promise of MicroRNA Replacement Therapy. Cancer research. 70, 7027-7030 (2010).
  5. Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides. Silence. 3, 1-17 (2012).
  6. Trang, P., et al. Systemic Delivery of Tumor Suppressor microRNA Mimics Using a Neutral Lipid Emulsion Inhibits Lung Tumors in Mice. Molecular Therapy. 19, 1116-1122 (2011).
  7. Barbash, S., Hanin, G., Soreq, H. Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome. J Vis Exp. (76), e50170(2013).
  8. Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448, 39-43 (2007).
  9. Roshan, R., et al. Brain-specific knockdown of miR-29 results in neuronal cell death and ataxia in mice. RNA. 20, 1287-1297 (2014).
  10. Kaur, H., Wengel, J., Maiti, S. Thermodynamics of DNA−RNA Heteroduplex Formation: Effects of Locked Nucleic Acid Nucleotides Incorporated into the DNA Strand. Biochemistry. 47, 1218-1227 (2008).
  11. Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., Van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34, D140-D144 (2006).
  12. Kaur, H., Babu, B. R., Maiti, S. Perspectives on Chemistry and Therapeutic Applications of Locked Nucleic Acid (LNA). Chemical Reviews. 107, 4672-4697 (2007).
  13. Guyenet, S. J., et al. A Simple Composite Phenotype Scoring System for Evaluating Mouse Models of Cerebellar Ataxia. J. Vis. Exp. (39), (2010).
  14. Bergen, J. M., Park, I. -K., Horner, P. J., Pun, S. H. Nonviral Approaches for Neuronal Delivery of Nucleic Acids. Pharmaceutical Research. 25, 983-998 (2008).
  15. Zou, L. -L., Ma, J. -L., Wang, T., Yang, T. -B., Liu, C. -B. Cell-Penetrating Peptide-Mediated Therapeutic Molecule Delivery into the Central Nervous System. Current Neuropharmacology. 11, 197-208 (2013).
  16. Hwang, D. W., et al. A brain-targeted rabies virus glycoprotein-disulfide linked PEI nanocarrier for delivery of neurogenic microRNA. Biomaterials. 32, 4968-4975 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wyciszanie mikroRNAProjektowanie antagomir wZablokowany kwas nukleinowyPeptyd przenikaj cy przez b ony kom rkoweGlikoproteina wirusa w ciekliznyIniekcja do y y ogonowejDostarczanie specyficzne dla m zguTesty behawioralneIlo ciwa PCRModel neurodegeneracji

Powiązane artykuły