Klasyczne kondycjonowanie mrugnięcia oczami sygnalizowane wąsem u myszy z głową

Podsumowanie

Prezentowany tutaj preparat do kondycjonowania mrugania oczami sygnalizowanego przez wąsy u myszy z głową precyzyjnie stymuluje określone wąsy, jednocześnie pozwalając myszom poruszać się na cylindrycznym bieżni. Bodziec warunkowy stymulacją wąsów (CS) w połączeniu z bodźcem bezwarunkowym wstrząsu okołooczodołowego (US) skutkuje niezawodnym uczeniem się asocjacyjnym na tym aparacie.

Streszczenie

Warunkowanie mrugnięcia oczami jest powszechnym paradygmatem do badania mechanizmów neuronalnych leżących u podstaw uczenia się i pamięci. Aby lepiej wykorzystać szeroki repertuar technik naukowych dostępnych do badania uczenia się i pamięci na poziomie komórkowym, idealnie jest mieć stabilną platformę czaszkową. Ponieważ myszy niełatwo tolerują ograniczenia, zwykle są szkolone podczas swobodnego poruszania się w komorze. Informacje o bodźcu warunkowym (CS) i bodźcu bezwarunkowym (US) są dostarczane, a reakcje mrugania oczami rejestrowane są za pomocą linki podłączonej do głowy myszy. W prezentowanym tutaj aparacie unieruchomionym na głowie myszom pozwala się biegać tak, jak chcą, podczas gdy ich głowy są zabezpieczone, aby ułatwić eksperymenty. Za pomocą tego aparatu treningowego uzyskuje się wiarygodne warunkowanie reakcji na mruganie, które pozwala na przeprowadzenie stymulacji wąsów jako CS, okołooczodołowego wstrząsu elektrycznego jak US oraz analizę aktywności elektromiograficznej (EMG) z powieki w celu wykrycia reakcji mrugnięcia.

Wprowadzenie

Warunkowanie mrugnięcia oczami jest formą warunkowania Pawłowa i modelowym systemem do badania mechanizmów neuronalnych asocjacyjnego uczenia się i pamięci. Badano go u różnych gatunków, w tym ludzi, królików, kotów, szczurów i myszy. Paradygmat polega na prezentacji dwóch sparowanych bodźców: neutralnego bodźca warunkowego (CS; np. ton, błysk światła lub stymulacja wąsów) i istotny bodziec bezwarunkowy (US; np. zaciągnięcie się powietrzem do oka lub wstrząs okołooczodołowy). Stany Zjednoczone wywołują bezwarunkową, odruchową reakcję mrugnięcia oczami (tj. UR). W końcu, po kilku prezentacjach sparowanego CS-US, podmiot uczy się kojarzyć CS z USA. To uczenie się przejawia się w formie warunkowej odpowiedzi (CR), mrugnięcia oka wywołanego przez sam CS, które poprzedza prezentację USA.

Kondycjonowanie mrugnięcia oczami w postaci śladowej obejmuje kilkusetmilisekundowy interwał bez bodźców, który oddziela CS od USA (Rysunek 1). Warunkowanie śladowe jest formą uczenia się deklaratywnego, ponieważ wymaga świadomości nieprzewidzianych bodźców¹. Przerwa skroniowa wymaga, aby zwierzę utrzymywało neuronalny "ślad" CS w obszarach przodomózgowia, takich jak hipokamp, aby US i CS zostały powiązane^1-6. Wraz z obszarami przodomózgowia, kondycjonowanie śladowe jest również zależne od móżdżku⁷.

Warunkowanie mrugnięcia oczami jest zatem użytecznym paradygmatem do badania wielu aspektów pamięci, w tym nabywania, konsolidacji i odzyskiwania. Podczas warunkowania mrugania oczami grupie kontrolnej zwierząt przedstawia się niesparowane bodźce w losowej kolejności, aby przetestować pseudowarunkowanie lub uwrażliwione reakcje na CS, które mogą być spowodowane samą prezentacją USG, a nie wyuczonym skojarzeniem CS-US.

Powszechnie używanym urządzeniem do badania kondycji mrugania oczami u gryzoni jest komora, w której gryzonie mogą się swobodnie poruszać podczas procesu treningu^8-10. W przypadku tego typu aparatów uwięź jest zwykle przymocowana do nakrycia głowy, które jest przymocowane do czaszki gryzonia. Uwięź pozwala na dostarczenie USG (a czasem CS) i przekazanie reakcji zwierzęcia na te bodźce (tj. reakcji mrugnięcia okiem)¹⁰. Sama pęta może być modyfikowana w zależności od rodzaju dostarczanych bodźców i sposobu rejestrowania reakcji mrugnięcia.

Powodem używania "swobodnie poruszających się" myszy na uwięzi do kondycjonowania mrugania oczami jest to, że myszy mają problemy z ograniczeniami. Chociaż inne gatunki mogą być bardziej podatne na ograniczenia, główną zaletą wykorzystania myszy w eksperymentach z kondycjonowaniem mrugnięć jest to, że większość dostępnych genetycznie zmodyfikowanych zmutowanych szczepów to szczepy myszy. Oprócz zmagania się, całkowite unieruchomienie myszy powoduje ostry niepokój. Preparat na mysz z głową, który minimalizuje stres, zwiększyłby ilość informacji fizjologicznych, które można uzyskać podczas kondycjonowania mrugnięcia. Na przykład system ten umożliwiłby obrazowanie neuronów korowych za pomocą mikroskopii 2-fotonowej¹¹.

Preparaty do utrwalenia głowy były używane w poprzednich eksperymentach do optycznego obrazowania kory za pomocą ruchomych implantów czaszkowych, elektrofizjologicznych zapisów in vivo mózgu gryzoni za pomocą matryc tetrodowych, dwufotonowego obrazowania wapnia, a także jako platforma do warunkowania mrugania oczami u myszy^11-16.

W systemie head-fixed zapewniona jest niezawodna stymulacja i zapisy bez całkowitego ograniczenia myszy (Rysunek 2). Nakrycie głowy, takie jak to, które jest używane w systemie swobodnie poruszającym się, jest przymocowane do czaszki myszy. Podczas treningu nakrycie głowy jest przymocowane do łącznika, który jest przymocowany do prętów nad cylindryczną bieżnią w celu ustabilizowania głowy gryzonia (rysunek 2A). Cylindryczna bieżnia pozwala myszce wygodnie odpocząć, ale jeśli mysz sobie tego życzy, pozwala jej również biegać lub chodzić. Za pomocą tego systemu myszy mogą być trenowane z wibracjami wąsów, takimi jak CS, i łagodnymi okołooczodołowymi wstrząsami elektrycznymi, takimi jak USA (ryc. 1). USG jest dostarczany przez druty chirurgicznie umieszczone pod skórą po stronie oka. CS jest dostarczany za pomocą grzebienia, który jest przymocowany do 2-warstwowego prostokątnego siłownika gnącego (rysunek 2B). Grzebień i siłownik zginający są następnie przymocowane do podstawy magnetycznej, która podczas treningu jest przesuwana do właściwej pozycji i jest dostosowywana w celu optymalnego podania dla każdego zwierzęcia. Grzebień jest umieszczony tak, aby przylegał do wybranych wąsów. Podczas dostarczania CS do siłownika gnącego wysyłany jest sygnał, który przemieszcza grzebień i prowadzi do wibracji wąsów¹⁷.

Inne bodźce, takie jak ton lub błysk światła, były używane jako skuteczne bodźce warunkowe u myszy w ciągu ostatnich^16,18,19. Powodem, dla którego stymulacja wąsów została wybrana dla CS w tym eksperymentalnym paradygmacie, jest zależność mysich zwierząt od ich wibrysów w zakresie wprowadzania informacji somatosensorycznych podczas eksploracji. Wykazano, że stymulacja wąsów jest niezawodnym i skutecznym CS²⁰. Ponadto, biorąc pod uwagę dobrze ugruntowane i zorganizowane podłoże korowe systemu wibrysów (tj. Korę beczkowatą), stymulacja wąsów jako CS stanowi eleganckie narzędzie do mapowania zmian korowych i plastyczności związanych z nauką warunkowania mrugania oczami^20,21. System head-fix pozwala na precyzyjną stymulację wybranych wąsów w celu porównania odpowiedzi między stymulowanymi neuronami a neuronami odbierającymi dane wejściowe od niestymulowanych wąsów. Wreszcie, wiele szczepów myszy wykazuje ubytek słuchu związany z wiekiem jako stosunkowo młodzi dorośli²², a zamknięcie powieki podczas warunkowego mrugania zmienia wizualny CS (chociaż wizualny CS łagodzi problemy z reakcjami zaskoczenia¹⁶). Żadne z tych powikłań nie ma wpływu na stymulację wąsów.

Przedstawione tutaj są unikalne i ważne modyfikacje innych preparatów do kondycjonowania mrugnięcia oczami, w tym metody dostarczania CS i US oraz nabywanie odpowiedzi na mrugnięcie oczami. Niezawodność tego aparatu i paradygmatu treningowego w warunkowaniu mrugania oczami wykazano za pomocą krzywych uczenia się od uwarunkowanych myszy i stosunkowo płaskiej krzywej uczenia się od pseudowarunkowanych zwierząt kontrolnych (Figura 7A).

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem myszy zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Northwestern na podstawie wytycznych wydanych przez National Institute of Health.

1. Cylinder (Rysunek 2A)

1. Zbuduj cylinder zgodnie z opisem Chettiha i wsp. oraz Heineya i wsp. z długiego cylindra piankowego^14-15. Wytnij cylinder o długości 10 cm i wywierć otwór w środku, aby pasował do osi, metalowego pręta o średnicy 12.7 mm (0.5 cala). Zamontuj cylinder osią na metalowej płytce stykowej optycznej, jak opisano przez Heineya i wsp., lub innym wsporniku (np. Plexi)¹⁵.
2. Postaw dwa pionowe metalowe pręty o średnicy 12,7 mm po obu stronach cylindra.
3. Przymocuj dwa mocowania pod kątem prostym do metalowych prętów.
4. Zamocuj dwa dodatkowe pręty (5 cm długości, 12,7 mm średnicy) przez mocowania pod kątem prostym. Ukosuj końce tych prętów i wypoziomuj ich końce powyżej środka cylindra (rysunek 2G).
5. Wywierć i nagwintuj otwór w wypoziomowanych końcach prętów, aby dopasować dwie maszynowe 4-40, które utrzymają skrzydełka łącznika na miejscu (Rysunek 2G).

2. Montaż systemu stymulacji wąsów (Rysunek 2B)

1. Wytnij 10-zębowy segment grzebienia ze zwykłego grzebienia do włosów.
2. Wytnij szczelinę o szerokości około 2-3 mm i głębokości około 5 mm w górnej części grzebienia, aby przyjąć 2-warstwowy prostokątny siłownik gięcia.
3. po jednym przewodzie do każdej powierzchni siłownika gnącego. Użyj lutu i topnika dostarczonego przez producenta. Zakryj siłownik i taśmą izolacyjną, aby chronić mysz i użytkownika przed prądem elektrycznym.
4. Wsuń listwę uruchamiającą w szczelinę wyciętą w grzebieniu tak, aby listwa siłownika gięcia była prostopadła do płaszczyzny grzebienia. Ustaw grzebień pod takim kątem, aby był przechylony pod kątem 45° i bardziej naturalnie podążał za krzywizną twarzy myszy.
5. Przymocuj koniec listwy aktywatora do górnej części grzebienia za pomocą szybkowiążącej żywicy epoksydowej.
   Uwaga: Przewody przylutowane do listwy siłownika gnącego powinny być podłączone do reostatu, który dostarcza 40 woltów do siłownika. Poprzednie eksperymenty wykazały, że 40 woltów jest skuteczne w kondycjonowaniu, ale nie wywołuje żadnych reakcji zaskoczenia.
6. Umieść siłownik gnący i grzebień na ruchomym uchwycie. Dobrze sprawdza się uchwyt na pipety przymocowany do podstawy magnetycznej, jak zwykle używany w urządzeniach do elektrofizjologii in vitro.

3. Montaż łącznika, który montuje się do prętów nad cylindrem (Rysunek 2C, 2E)

Uwaga: Łącznik jest wydrukowanym w 3D 7-otworowym paskiem wzorowanym na nylonowym pasku serii Amphenol 221 używanym do wiązania przez Weissa i Disterhofta oraz Galveza i innych.^10,17

1. Stuknij w pierwszy otwór w pasku na maszynową 0-80 x-1". Będzie to służyć jako śruba blokująca do zakotwiczenia głowicy do złącza. Przymocuj nakrętkę 0-80 do łba blokującej za pomocą kleju cyjanoakrylowego, aby ułatwić ręczne obracanie.
2. Pozostaw jeden otwór pusty za gwintowanym otworem (aby zrobić miejsce na nakrętkę maszynową 0-80) i wepchnij pięć pozłacanych nasadek relia-tac przez pozostałe pięć otworów.
3. Zdejmij powłokę z pięciu długich drutów (przewodów uzyskanych z Ethernet) i do końców gniazd.
   Uwaga: Pierwsze dwa przewody będą używane do rejestrowania sygnałów elektromiograficznych (EMG), które wykryją reakcję mrugnięcia okiem po filtrowaniu sygnału i wzmocnieniu ze wzmacniacza. Kolejne dwa dostarczą sygnał uderzeniowy z izolatora bodźców. Ostatni przewód będzie służył jako uziemienie. Przewody te zostaną podłączone do systemów używanych do czasowej dostawy CS-US.
4. Zapewnij łączność elektryczną między przewodami a gniazdami za pomocą multimetru. Ustaw multimetr na ustawieniu ciągłości i przytrzymaj jedną z sond do kołka, a drugą sondę do odizolowanych końców drutu. Styki i przewody są połączone elektrycznie, gdy rezystancja jest niska, a multimetr emituje dźwięk.
   1. Alternatywnie, jeśli multimetr nie ma ustawienia ciągłości, zmierz rezystancję między stykami a przewodami. Ciągłość elektryczna występuje, jeśli mierzona jest bardzo mała rezystancja.
5. Przygotuj skrzydełka złącza z dwóch tranzystorów typu TO-220. Odetnij przewody emitera, podstawy i kolektora tranzystora i wypoziomuj powierzchnię, aby można było ją przymocować do złącza.
6. Przytnij krawędź zaczepu montażowego, aby przebić się przez otwór, aby wypustka mogła wsunąć się pod.
7. Epoksydowe tranzystory do złącza. Otwór w zaczepie montażowym posłuży do przymocowania łącznika do prętów nad cylindrem.
8. Nałóż żywicę epoksydową na podstawę drutów wystających z gniazd i pozostaw żywicę epoksydową do wyschnięcia. Żywica epoksydowa zaizoluje i ochroni połączenia.

4. Przygotowanie nakrycia głowy (Rysunek 2D, 2E)

Uwaga: Pasek na głowę to wydrukowany w 3D 7-otworowy pasek wzorowany na nylonowym pasku serii Amphenol 221, używanym do nakrycia głowy przez Weissa i Disterhofta oraz Galveza i innych.^10,17. Ten element nie jest już produkowany komercyjnie. Plik drukarki można pobrać ze strony internetowej tego czasopisma.

1. Stuknij w pierwszy otwór w pasku na maszynową 0-80 x 1" i pozostaw jeden otwór pusty po pierwszym otworze.
2. Wciśnij pięć pozłacanych szpilek przez spód pozostałych pięciu otworów (przez węższe końce). Użyj imadła, aby ułatwić równomierne wciskanie kołków w pasek.
3. Za pomocą ściągacza izolacji termicznej usuń około 0,5 cm powłoki poliimidowej z końca drutu ze stali nierdzewnej (średnica 0,005 cala), odizolowany koniec drutu do otworu jednego z kołków i przytnij drut na 0,6-0,7 cm.
4. Odizoluj się około 0,2 cm od końca przewodu, aby umożliwić przepływ prądu do zwierzęcia.
5. Powtórz kroki 4.3-4.4 dla pozostałych trzech przewodów.
   Uwaga: Pierwsze dwa przewody będą rejestrować odpowiedzi EMG, podczas gdy drugie dwa będą służyć do dostarczenia wstrząsu zwierzęciu.
6. Ponieważ ostatni (piąty) przewód będzie służył jako przewód uziemiający, przytnij około 5 cm niepowlekanego drutu ze stali nierdzewnej (średnica 0.005 cala) i do pozostałego kołka.
7. Zapewnij ciągłość między przewodami a stykami za pomocą multimetru. (W przypadku przewodu uziemiającego, który nie jest powlekany, sondę multimetru można umieścić w dowolnym miejscu wzdłuż przewodu.)

5. Przygotowanie chirurgiczne (Rysunek 2F)

1. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne, w tym nakrycie głowy. Wysterylizuj nakrycie głowy, mocząc je w alkoholu, a następnie spłukując sterylnym roztworem soli fizjologicznej.
2. Znieczulij mysz w komorze indukcyjnej z 3-4% odparowanym izofluranem zmieszanym z natężeniem przepływu 1-2 l tlenu na minutę.
3. Upewnij się, że zwierzę jest w pełni znieczulone za pomocą uszczypnięcia palca u nogi. Mysz jest w pełni znieczulona, gdy nie reaguje odruchowo na uszczypnięcie palca.
4. Gdy zwierzę zostanie w pełni znieczulone, wstrzyknąć dawkę chlorowodorku buprenorfiny jako środek przeciwbólowy (0,05–2 mg/kg mc., sc), ogolić czubek głowy zwierzęcia, umieścić go na przykrytej poduszce grzewczej na podstawie ramy stereotaktycznej, upewnić się, że zwierzę jest w pełni znieczulone i przymocować głowę do ramy. Utrzymać przepływ odparowanego izofluranu do zwierzęcia, przejście na 2% przy natężeniu przepływu 1-2 l tlenu na minutę. Nałóż niewielką ilość maści okulistycznej na rogówkę.
5. Zdezynfekuj skórę głowy jodonem i alkoholem po trzy razy, naprzemiennie.
6. Za pomocą ostrza skalpela numer 10 lub 15 wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej skóry głowy, odsłaniając czaszkę od przodu oczu do poza kość międzyciemieniową (~1,5-2 cm).
7. Przytrzymaj płaty skóry za pomocą mikroklipsów. Umieść jeden klips nad okiem, jeden wzdłuż środka osi rostralno-ogonowej i jeden z tyłu czaszki obustronnie (tj. użyj w sumie sześciu klipsów). Aby zapobiec zwichnięciu nakrycia głowy, odsłoń jak największą część czaszki, w tym boki i tył. Zwiększy to powierzchnię do nakładania kleju cementowego.
8. Za pomocą skalpela zeskrob górną część czaszki, aby usunąć okostną i zapewnić czystą i suchą powierzchnię roboczą. Oczyść górną część czaszki trzykrotnie 3% nadtlenkiem wodoru.
9. Wywierć dwa otwory w czaszce za pomocą zadziorów w kształcie odwróconego stożka w rozmiarze 34 lub wiertła do grawerowania 1.6 mm, aby pomieścić 00-90 (0.0625 cala długości). zapewnią połączenie uziemienia elektrycznego. Umieść jeden otwór przed Bregmą, a drugi przed Lambdą, na lewo od linii środkowej podczas kondycjonowania prawego oka. Umieść po jednej w każdym otworze. Opuść o 0,28 mm do czaszki na każdy pełny obrót; Wystarczą dwa pełne obroty.
10. Na czaszce należy wykonać kilka małych wgłębień o średnicy około 0,75 mm, aby zwiększyć powierzchnię i siłę chwytu cementu.
11. Weź gotową głowicę i nawiń przewód uziemiający w konfiguracji ósemki wokół dwóch. Pozostaw trochę luzu (~1.5 cm między głowicą a śrubą) w przewodzie uziemiającym, aby można było później prawidłowo ustawić głowicę.
    Uwaga: Ósemka zwykle zapewnia dobre połączenie elektryczne między przewodem a uziemiającymi. Drut można również do, aby zapewnić połączenie elektryczne.
12. Nałożyć klej cementowy cementowy. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi mieszania kleju cementowego lub wymieszaj 4 miarki mieszanki L-Powder, 8 kropli bazy i 2 krople katalizatora w zimnym ceramicznym naczyniu do mieszania (upewnij się, że pasek temperatury na naczyniu do mieszania jest całkowicie). Niska temperatura wydłuża czas pracy cementu.
    1. Pokryj obficie czaszkę i cementem cementowym i pozostaw cement do wyschnięcia. Powinno to zająć tylko kilka minut.
13. Po wyschnięciu cementu ustaw nakrycie głowy pionowo, ze szpilkami stojącymi do góry, nad czaszką. Przytrzymaj głowicę na miejscu za pomocą uchwytu podobnego do złącza
    Uwaga: Zobacz "3. Montaż złącza"-Uchwyt musi być tylko pięciootworowym paskiem z pozłacanymi gniazdami, aby otrzymać kołki głowicy. Uchwyt jest przymocowany do ramienia na ramie stereotaktycznej. Zastosowanie uchwytu i ramienia ułatwia pozycjonowanie głowicy i przewodów.
14. Po umieszczeniu nakrycia głowy zdejmij skórę wokół obszaru okołooczodołowego i ustaw dwa druty uderzeniowe tak, aby 0,2 cm odizolowany koniec spoczywał pod skórą i około 2-4 mm bezpośrednio doogonowo do oka. Nie pozwól, aby końce dwóch przewodów stykały się ze sobą. Umieść dwa przewody EMG na mięśniu okrężnym oka nad oczodołem.
    1. W razie potrzeby odetnij końce przewodów, jeśli są zbyt długie i sprawiają wrażenie, jakby mogły bezpośrednio porysować orbitę i spowodować infekcję. Jeśli odcinasz końce drutu, upewnij się, że odsłonięty jest wystarczający poziom gołego drutu. Alternatywnie, jeśli druty wydają się zbyt długie, zegnij drut z powrotem u podstawy, gdzie wystają z głowicy.
    2. Zacementuj podstawę drutów (tj. koniec w pobliżu głowicy) na miejscu na czaszce za pomocą niewielkiej ilości kleju cementowego i pozostaw do wyschnięcia (użyj połowy opisanej wcześniej porcji).
15. Usuń mikroklipsy i delikatnie złóż płaty skóry z powrotem na cemencie. Pozwól, aby skóra naturalnie się uspokoiła, aby zapobiec napięciu jakiejkolwiek części skóry, aby uniknąć zniekształcenia powieki, zapobiegania reakcji mrugania oczami i niepokoju zwierzęcia.
16. Uszczelnij odsłonięty obszar cementem dentystycznym, pokrywając cementem wszystko, od naciętej skóry po krawędź górnej części nakrycia głowy. Zachowaj szczególną ostrożność, aby uniknąć kapania cementu na oczy lub szpilki nakrycia głowy. Częściowo utwardzony cement można wygładzić i manipulować nim za pomocą bawełnianego wacika, który jest zwilżony rozpuszczalnikiem do cementu dentystycznego. Poczekaj, aż cement całkowicie wyschnie przed wyjęciem uchwytu głowicy.
17. Pozwól zwierzęciu dojść do siebie po znieczuleniu na rozgrzanej powierzchni przed ponownym umieszczeniem zwierzęcia w klatce. Podać mu Metacam (1 mg/kg mc., SQ), a następnie umieścić zwierzę z powrotem w klatce.
18. Pozwól zwierzęciu na 5-7 dni na regenerację przed testami lub treningiem. Utrzymuj standardową opiekę pooperacyjną nad zwierzęciem zgodnie z wytycznymi Twojej instytucji. Zwierzę powinno być badane co najmniej raz dziennie po powrocie do zdrowia po operacji. Zwróć uwagę na oznaki złego jedzenia i/lub picia oraz apatycznego zachowania. W przypadku podejrzenia bólu należy podawać Metacam co 24 godziny (taka sama dawka, jak pod koniec leczenia pooperacyjnego) aż do ustąpienia. Lidokainę można miejscowo nakładać na ranę, jeśli zwierzę drapie się lub wykazuje oznaki dyskomfortu.

6. Umieszczanie myszy na cylindrze i trening (Rysunek 2G)

1. Aby umieścić mysz na cylindrze, przytrzymaj ją na chwilę ręką, trzymając ją jedną ręką za ogon, a następnie chwytając mysz za ramiona palcem wskazującym, a drugą kciukiem. Owiń pozostałe palce wokół brzucha i tułowia myszy.
2. Gdy ręka nie przytrzymuje myszy, przymocuj łącznik do głowicy na główce myszy i przekręć blokującą.
3. Delikatnie umieść mysz na cylindrze i przytrzymaj ją na miejscu, jednocześnie mocując łącznik do ramy. Użyj dwóch, aby przymocować łącznik do prętów nad cylindrem.
4. Po zamocowaniu łącznika do ramy cylindra zwolnij uchwyt myszy. Daj myszy jeden dzień z dwóch sesji przyzwyczajenia się do cylindra. Pozwól, aby każda sesja habituacji trwała tak samo, jak każda sesja kondycjonująca.
   1. Rejestruj częstotliwość spontanicznego mrugania podczas habituacji i wstępnie wystaw myszy na wibracje wąsów CS, aby zminimalizować występowanie reakcji zaskoczenia. Zastosuj CS tak, jak podczas rzeczywistej sesji kondycyjnej, ale bez porażenia prądem US.
   2. Zastosuj stymulację wąsów CS, umieszczając system piezoelektryczny blisko (około 0,5 cm) kondycjonowanej strony (prawej strony) myszy, jednocześnie wsuwając zęby grzebienia na poszczególne wąsy. Upewnij się, że te same wąsy są stymulowane z dnia na dzień, umieszczając system piezoelektryczny w tej samej pozycji z dnia na dzień.
5. Rozpocznij trening myszy na klasycznym warunkowaniu. Prowadź dwie sesje treningowe dziennie przez pięć dni. Pozostaw około dwóch godzin między każdą sesją treningową.
   1. Do grupy kondycjonowanej należy dostarczyć trzydzieści prób na sesję wibracji CS (60 Hz) o długości 250 ms w połączeniu z impulsem elektrycznym US o długości 100 ms (0,3 mA - 3 mA, dostarczanym z izolatora bodźca WPI A385R). Oddziel CS i US za pomocą 250 ms długiego interwału śledzenia wolnego od bodźców, aby zadanie było zależne od hipokampa (Rysunek 1)²³.
   2. Dostosuj intensywność porażenia prądem dla każdego zwierzęcia tak, aby wywołało to mrugnięcie. Oddzielne badania z losowym interwałem międzypróbnym wynoszącym 30-60 sekund (średnio 45 sekund, łączny czas trwania 30 minut na sesję).
   3. Dostarczyć trzydzieści niesparowanych prób CS w monoterapii i samych USG (w sumie sześćdziesiąt prób) do grupy pseudowarunkowanej, używając tych samych parametrów bodźca, jakie podano dla grupy uwarunkowanej. Należy upewnić się, że badania kliniczne prowadzone wyłącznie w badaniu CS i w samych badaniach klinicznych w USA są pseudorandomizowane, tak aby żaden bodziec nie był prezentowany częściej niż dwa razy z rzędu. Oddziel każdą próbę ze średnim interwałem międzypróbnym wynoszącym 22,5 sekundy.
6. Dostarczaj hałas tła o natężeniu 65 dB przez cały czas habituacji i treningu, aby zamaskować wszelkie dźwięki wibracji generowanych przez stymulator wąsów.

Wyniki

Samce myszy C57Bl6/J w wieku 8-10 tygodni były trenowane w warunkowaniu mrugania o charakterze śladowym na aparacie z cylindryczną bieżnią z mocowaniem głowy. 8 myszy trenowano przy sparowanych prezentacjach CS-US (grupa warunkowana), a 9 myszy trenowano przy niesparowanych prezentacjach CS i US (grupa pseudowarunkowana).

Przykładowe zapisy EMG odpowiedzi warunkowej u myszy uwarunkowanej przedstawiono na Rysunku 3

Dyskusja

Klasyczne warunkowanie mrugania oczami jest formą uczenia się asocjacyjnego, które jest użytecznym narzędziem do zrozumienia substratów neuronalnych leżących u podstaw uczenia się i pamięci. Poprzednie metody stosowane do kondycjonowania mrugania oczami u gryzoni, takich jak myszy, obejmowały komorę, która pozwalała zwierzęciu na swobodne poruszanie się. Utrwalony na głowie preparat do kondycjonowania mrugania oczami u myszy, przy użyciu aparatury opisanej przez Chettiha i wsp. oraz Heineya i wsp., a os...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wałek piankowy Exervo TeraNova 36" x 6"	Amazonka	B002ONUM0E	Do cylindra
		z pleksi	Wykonane na zamówienie; Pręty metalowe o grubości 1 cm
(12,7  mm średnicy)			Wykonana na zamówienie
śruba maszynowa 4-40 (.25  w. długie)	Amazon Supply	B00F33Q8QO	Do cylindra
Klasyczny grzebień do włosów	Conair	93505WG-320	Do stymulacji wąsów
2-warstwowy prostokątny siłownik do gięcia	Systemy piezoelektryczne	T220-A4-303X	Do stymulacji wąsów
Zestaw lutowniczy i topnika	Systemy piezoelektryczne	MSF-003-NI	Do stymulacji wąsów
Podstawa magnetyczna	Thor Labs	MB175	Do stymulacji wąsów
Pręt gwintowany do podstawy			Wykonane na zamówienie
Paski oparte na nylonowych łącznikach paskowych serii 221 firmy Electronic Connector Corp.			Wykonany na zamówienie, na podstawie Weiss i Disterhoft, 2008
Tranzystor w stylu TO-220	Amazon Supply	B0002ZPZYO	Do łącznika, do skrzydeł
Złącze elektroniczne Relia-Tac Sockets	Corp.	220-S02	Do złącza
Relia-Tac Pins	Electronic Connector Corp.	220-P02	Do głowicy
śruba maszynowa ze stali nierdzewnej 0-80 (długość 1 cala)	Śruba blokująca	Amazon Supply	B000FN68EE
Nakrętka sześciokątna maszynowej ze stali nierdzewnej 0-80 (grubość 5/32 cala)	Amazon Supply	B000N2TK7Y	Śruba blokująca z
Loctite Super Glue-Liquid	Loctite	1365896	Klej cyjanoakrylowy; do blokującej
Szybkowiążąca żywica epoksydowa Ace	Sprzęt	18613	Do złącza i systemu stymulacji wąsów
Przewody			Ethernet Ethernet można rozebrać, aby użyć poszczególnych przewodów do złącza
Druty ze stali nierdzewnej pokryte poliimidem (2  w. długi, .005 cala średnica)	PlasticsOne	005sw/2.0 37365 S-S	Do nakryć głowy, przewodów EMG i wstrząsowych
Drut niepowlekany ze stali nierdzewnej (.005  w. średnica)	AM Systems	792800	Do głowicy, przewodów uziemiających
Zmienny autotransformator Tenma Tenma		72-110	Do stymulacji wąsów; reostat do regulacji prądu do siłownika zginającego
Wzmacniacz A-M	Systems	1700	Wzmacniacz do filtrowania i wzmacniania sygnałów EMG
Izolator bodźca WPI A385R	World Precision Instruments	31405	Dla porażenie prądem
elektrycznym Isothesia (Isoflurane)	Henry Schein: Zdrowie zwierząt	50031	Do operacji; znieczulenie
Buprenex Iniekcyjne CIII	Reckett Benckiser Pharmaceuticals Inc	NDC 12496-0757-1	Do operacji; przeciwbólowe
Akwa Tears: Lubrykant Maść okulmiczna	Akorn	NDC 17478-062-35	Maść na sztuczne łzy zapobiegająca suchości oczu podczas znieczulenia
Płatki przygotowawcze Povidine-Jodine	PDI	NDC 10819-3883-1	Do operacji; antyseptyczne
Podkładki			Można kupić w każdej standardowej aptece
Rękojeści do skalpela chirurgicznego ze stali nierdzewnej (nr 3)	Integra Miltex	4-7.	Do operacji
Ostrza skalpela chirurgicznego ze stali nierdzewnej	Integra Miltex	4-310 lub 4-315	Do operacji; ostrze skalpela numer 10 lub 15
3% Nadtlenek			Można kupić w każdej standardowej aptece
Micro Clip	Roboz	RS-5459	Do operacji, do powstrzymywania skóry
00-90 śruba maszynowa ze stali nierdzewnej (0,0625  w. długie)	Dostawa Amazon	B002SG89X4	Do zabiegów chirurgicznych, aby owinąć przewód uziemiający
Profesjonalne narzędzie obrotowe Walnut	Hollow	29637	Wiertarka ręczna do chirurgii, do wiercenia otworów w czaszce
Zadziory w kształcie odwróconego stożka	Roboz	RS-6282C-34	Frez z odwróconym stożkiem rozmiar 34; do chirurgii, do wiercenia otworów w czaszce
Frez do grawerowania	Dremel	106	Frez do grawerowania; Wiertło 1,6 mm; do chirurgii, do wiercenia otworów w czaszce
C& B Metabond - szybko! System cementowy "B" Quick Base	Parkell	S398	Do zabiegów chirurgicznych; adhezyjny system cementowy cementowy; ważne, aby zapobiec zwichnięciu głowicy
C& B Metabond - szybko! System cementowy Clear L-Powder	Parkell	S399	Do zabiegów chirurgicznych; adhezyjny system cementowy cementowy; ważne, aby zapobiec zwichnięciu głowicy
C& B Metabond - szybko! Cement System "C" Uniwersalny katalizator TBB 0,7 ml	Parkell	S371	Do zabiegów chirurgicznych; adhezyjny system cementu cementowego; ważne, aby zapobiec zwichnięciu
główki C& B Metabond - szybko! Ceramiczne naczynie do mieszania Cement System z paskiem temperaturowym	Parkell	S387	Do operacji; adhezyjny system cementowy; ważne, aby zapobiec zwichnięciu głowicy
Pęseta szwajcarska, styl #5	Światowe instrumenty precyzyjne	504506	Do operacji
Purytańskie aplikatory z bawełnianą końcówką	VWR International	10806-005	Do zabiegu chirurgicznego
Zestaw cementu do uszczelniania zębów	Dentsply	675570	Do zabiegów chirurgicznych; cement dentystyczny