Chusteczki do nosa do wykrywania i izolacji wirusa grypy A od świń

Podsumowanie

Autorzy prezentują protokół zbierania chusteczek do nosa od świń w celu wykrycia i wyizolowania wirusa grypy A.

Streszczenie

Nadzór nad wirusami grypy A u świń jest krytyczny dla zdrowia ludzi i zwierząt, ponieważ wirus grypy A szybko ewoluuje w populacjach świń i ciągle pojawiają się nowe szczepy. Świnie mogą być zarażone różnymi liniami wirusa grypy A, co czyni je ważnymi gospodarzami dla pojawienia się i utrzymania nowych szczepów wirusa grypy A. Pobieranie próbek świń w różnych środowiskach, takich jak komercyjne fermy trzody chlewnej, targi rolnicze i targi żywych zwierząt, jest ważne, aby zapewnić kompleksowy obraz obecnie krążących szczepów IAV. Obecna technika pobierania próbek przedubojowych (tj. pobieranie wymazów z nosa) jest pracochłonna, ponieważ wymaga fizycznego przymusu świń. Chusteczki do nosa polegają na pocieraniu kawałka materiału po pysku świni przy minimalnym lub żadnym ograniczeniu zwierzęcia. Procedura wycierania nosa jest prosta do wykonania i nie wymaga personelu z profesjonalnym przeszkoleniem weterynaryjnym lub w zakresie obchodzenia się ze zwierzętami. Chociaż wymazy z nosa są nieco mniej czułe niż wymazy z nosa, wskaźniki wykrywania i izolacji wirusa są odpowiednie, aby chusteczki do nosa były realną alternatywą dla pobierania próbek od pojedynczych świń, gdy wymagane są metody pobierania próbek o niskim poziomie stresu. Protokół postępowania określa kroki potrzebne do pobrania żywej chusteczki do nosa od pojedynczej świni.

Wprowadzenie

Wirusy grypy A (IAV) powodują choroby układu oddechowego u wielu gatunków, w tym u ptaków domowych, świń i ludzi. Ze względu na reasortację segmentowanego genomu IAV może dojść do szybkiej ewolucji wirusa i często pojawiają się nowe szczepy IAV. Trzoda chlewna to gatunek, który może służyć jako naczynie do mieszania IAV z wielu gatunków żywicieli. ¹ Obecnie istnieją trzy główne podtypy IAV powszechnie krążące wśród świń w Ameryce Północnej (H1N1, H1N2, H3N2), ale wielokrotne wprowadzenie IAV od ludzi doprowadziło do dużej różnorodności IAV w obrębie tych podtypów. ² Szybka ewolucja wirusów IAV zakażających świnie jest widoczna od 1998 r., kiedy to potrójny reasortant IAV zawierający segmenty genów wirusów ludzkich, ptasich i świńskich³ stał się powszechny wśród świń w Stanach Zjednoczonych. ⁴ Wewnętrzne segmenty genów z tego potrójnego reasortantu IAV pozostają bardzo rozpowszechnione wśród IAV obecnie infekujących świnie. ⁵

Na całym świecie, IAV jest istotną przyczyną chorób układu oddechowego u świń, u których typowe objawy kliniczne obejmują gorączkę, jadłowstręt, letarg, kaszel, trudności w oddychaniu, kichanie, wydzielinę z nosa i słaby przyrost masy ciała. IAV może być szczególnie kosztowne dla gospodarstw lochowych, w których udokumentowano niepowodzenia reprodukcyjne spowodowane gorączką wywołaną przez IAV i słabo urodzone prosięta. ^6,7 W Stanach Zjednoczonych wirus IAV jest powszechnie wykrywany w komercyjnych stadach trzody chlewnej, a duża różnorodność antygenowa i genomowa oraz ciągła ewolucja wśród świń zakażających IAV utrudnia kontrolę tego wirusa. ^8-11

Obawy dotyczące zdrowia publicznego związane z pojawieniem się pandemicznego szczepu IAV wynikającego z reasortacji u świń zostały zrealizowane w 2009 roku, kiedy IAV linii świń zawierającej segmenty genów z potrójnie reasortowanej północnoamerykańskiej linii świń i euroazjatyckiej linii świń podobnych do ptaków spowodowało światową pandemię u ludzi. ¹² Od tego czasu wirus pandemiczny (A (H1N1)pdm09) został ponownie zaasortowany z endemicznymi szczepami IAV świń^13,14, a niektóre z tych nowo dobranych szczepów zostały przeniesione z powrotem na ludzi. ¹⁵ Częstotliwość zdarzeń związanych z reasortacją i pojawianiem się nowych szczepów IAV o potencjale pandemicznym sprawia, że konieczny jest aktywny nadzór nad krążącymi wirusami IAV u świń, zwłaszcza na granicy świnia-człowiek.

Interfejs świnia-człowiek jest ważny dla dwukierunkowej międzygatunkowej transmisji IAV. Przenoszenie wirusa z człowieka na świnię występujące w komercyjnej produkcji trzody chlewnej jest odpowiedzialne za dużą różnorodność IAV obecną w populacji trzody chlewnej. Targi rolnicze są największym miejscem mieszania się ludzi i trzody chlewnej w Stanach Zjednoczonych i są znanymi miejscami odzwierzęcego przenoszenia wirusa IAV. ^15-21 W 2012 r., podczas wybuchu epidemii wariantu H3N2 IAV, 93% przypadków zgłosiło udział w targach rolniczych w dniach poprzedzających wystąpienie choroby. ¹⁵ Analiza genomiczna izolatów wirusa od świń wystawowych w porównaniu z izolatami ludzkimi potwierdziła transmisję odzwierzęcą. ²¹ Świnie wystawowe zakażone wirusem zakażenia często nie wykazują klinicznych objawów ^{choroby,21-23} co wskazuje na potrzebę bezpośrednich badań diagnostycznych.

Pobieranie próbek od wyraźnie chorych świń samo w sobie nie pozwoli skutecznie zidentyfikować występowania IAV u świń i nie można na nim polegać w celu identyfikacji nowych szczepów IAV pojawiających się wśród świń. Aktywny nadzór jest absolutnie konieczny do wykrywania pojawiających się szczepów wirusa IAV u świń i oceny ich zagrożenia zarówno dla trzody chlewnej, jak i dla zdrowia publicznego. Większość działań związanych z nadzorem nad wirusami przenoszonymi drogą płciową jest dobrowolna, a zatem potrzebne są metody w minimalnym stopniu zakłócające. Trzy główne procedury pobierania próbek przedubojowych w przypadku IAV zakażającego świnie to: wymazy z nosa, płyny ustne i chusteczki do nosa. Aktualne zalecenia dotyczące pobierania próbek od poszczególnych świń w celu wykrycia IAV wymieniają wprowadzanie wymazów z końcówkami włókien syntetycznych do nozdrzy jako preferowaną metodę pobierania wydzieliny z nosa i komórek nabłonka. ^24,25 Ponieważ świnie mogą próbować unikać tej procedury, zespół wyszkolonego personelu musi krępować świnie ręcznie lub za pomocą wnyków, w zależności od wielkości zwierzęcia. ²⁶ Proces krępowania jest pracochłonny dla personelu i stresujący dla świń. Dodatkowo, świnie wystawowe są często zaangażowane w wiele konkursów na targach, więc postrzeganie dodatkowego stresu u zwierzęcia biorącego udział w zawodach może sprawić, że właściciele będą odporni na działania nadzoru.

Z prawdopodobieństwem wykrycia IAV od 80 do 100% w stadach zakażonych IAV, płyny ustne stały się popularną alternatywą dla wymazów z nosa do molekularnego wykrywania IAV w populacjach świń. ^27,28 Ponadto płyny z jamy ustnej mogą zapewniać szersze okno wykrywania IAV niż wymazy z nosa po początkowym zakażeniu. Jednak izolacja IAV z płynów ustnych była problematyczna - tylko 50% prób izolacji wirusa kończyło się wyleczeniem IAV. ²⁹

Używanie chusteczek do nosa zamiast wymazów z nosa podczas nadzoru IAV u świń pozwala przezwyciężyć ograniczenia opisane powyżej. Chusteczki do nosa nie wymagają użycia werbla krępującego i mogą być wykonywane bez stresowania zwierząt lub świadków zabiegu. Do pobierania chusteczek do nosa potrzebne jest minimalne przeszkolenie techniczne, które pozwala osobom niebędącym weterynarzami, w tym właścicielom trzody chlewnej, na pobieranie próbek kontrolnych. Chusteczki do nosa zostały wcześniej porównane z wymazami z nosa w celu wykrywania i izolacji wirusa grypy A³⁰, a szczegółowy protokół tej nieinwazyjnej metody pobierania próbek opisano poniżej.

Protokół

Wszystkie świnie użyte do zbierania poniższych danych były chronione przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Stanowego Ohio (numer protokołu wykorzystania zwierząt 2009A0134-R1).

1. Przygotowanie pożywki do transportu wirusów i fiolek do pobierania próbek

1. Dodać 37 g Brain Heart Infusion do 900 ml oczyszczonej wody i dokładnie wymieszać z mieszadłem i mieszadłem magnetycznym, podgrzewając do temperatury 70 °C, aby całkowicie rozpuścić proszek.
2. Autoklaw bulionu w temperaturze 121 °C przez 15 minut. Schłodzić na blacie, aż bulion osiągnie temperaturę pokojową. W razie potrzeby wstaw do lodówki w temperaturze 4 °C przez noc.
3. Rozpuścić, mieszając mieszadłem magnetycznym, 6,02 g soli sodowej penicyliny G i 10 g siarczanu streptomycyny w 50 ml oczyszczonej wody o temperaturze pokojowej. Dodaj więcej oczyszczonej wody, aby uzyskać całkowitą objętość do 100 ml. Przefiltrować roztwór przez membranę polieterosulfonową 0,22 μm do sterylnej butelki.
4. W asepcie dodać przefiltrowany roztwór penicyliny i streptomycyny do schłodzonego bulionu Brain Heart Infusion i dokładnie wymieszać (ręcznie mieszać lub obracać kolbą), aby uzyskać pożywkę transportową wirusa.
5. Przeprowadzić aseptyczne badanie pH pożywki transportowej wirusa; w razie potrzeby dostosować pH do 7,4 ± 0,2 za pomocą HCl lub NaOH.
6. Przeprowadzić testy zapewnienia jakości na pożywce transportowej wirusa, testując białko matrycy wirusa grypy A za pomocą rRT-PCR, zgodnie z opisem Zhanga i Harmona. ^{22 Rozdział 22}
7. Dozować 5 ml pożywki transportowej wirusa do sterylnych butelek z polietylenu o dużej gęstości o pojemności 8 ml. Oznaczyć fiolki do użytku w terenie.
8. Gotowe do użycia fiolki należy przechowywać w standardowych pojemnikach kriogenicznych w temperaturze -20 °C do momentu pobrania próbki.

2. Zbieranie chusteczek do nosa od świń

1. Bezpośrednio przed pobraniem próbki należy rozmrozić odpowiednią liczbę fiolek; na świnię, od której pobrano próbki, potrzebna będzie jedna fiolka. Rozmrażanie w temperaturze pokojowej trwa około 30-45 minut. Rozmrożone fiolki należy przechowywać w chłodnym miejscu na okładach z lodu do czasu użycia.
2. Należy założyć odpowiednie środki ochrony osobistej w zależności od sytuacji (np. kombinezony, pokrowce na buty, respirator, zatyczki do uszu itp.).
3. Wejdź do strefy dla zwierząt. W razie potrzeby ogranicz świnię do małego obszaru, ale nie krępuj się. Nie budź odpoczywających zwierząt.
4. Załóż parę jednorazowych rękawiczek egzaminacyjnych. Uważaj, aby nie zanieczyścić rękawic dotykając świń, ludzi lub przedmiotów nieożywionych.
5. Użyj dłoni w rękawiczce, aby wyjąć sterylny bawełniany gazik o wymiarach 5.08 cm × 5.08 cm (2 cale × 2 cale) z opakowania. W miarę możliwości należy używać sterylnych gazików. Pojedynczo pakowane gaziki są wygodniejsze w użyciu niż te owinięte dwoma gazikami w opakowaniu.
6. Przytrzymaj wacik z gazy opuszkami palców jednej ręki, odsłaniając jak największą część płatka w celu pobrania próbki.
7. Przetrzyj gazik w poprzek pyska świni, zwracając szczególną uwagę, aby wejść do zewnętrznych nozdrzy, jeśli to możliwe. Zebrać widoczną wydzielinę z nosa (około 1 ml) za pomocą tego samego gazika.
8. Tą samą ręką złożyć gazik na sobie, aby ułatwić umieszczenie go w fiolce zawierającej pożywkę transportową wirusa.
9. Drugą ręką zdjąć nakrętkę z fiolki i umieścić w niej złożony gazik. Ponownie zamknąć fiolkę i wstrząsnąć fiolką, aby upewnić się, że gazik i pożywka transportująca wirusa uległy zmieszaniu.
10. Zdejmij rękawice i umieść je w odpowiednim pojemniku. Zmieniaj rękawiczki między każdą świnią.
11. Sprawdzić identyfikator fiolki. Zapisz numer identyfikacyjny świni, wiek, płeć, objawy kliniczne i inne notatki uznane za niezbędne przez badacza.
12. Próbki należy schłodzić natychmiast po pobraniu. Rozważ wykonanie podwielokrotności próbki przed zamrożeniem, aby zapobiec wielokrotnym cyklom zamrażania i rozmrażania. Jak najszybciej po pobraniu należy umieścić próbki na suchym lodzie w celu transportu do laboratorium. Przechowywać fiolki w temperaturze -80 °C do czasu rozpoczęcia badania.

3. Wykrywanie kwasu nukleinowego wirusa grypy A

1. Rozmrażać próbki w suchej kąpieli perełkowej w temperaturze 37 °C przez 5 minut, a następnie dokończyć rozmrażanie próbek na stole w temperaturze pokojowej przez 20-30 minut. Jednoczesne dodanie kilku fiolek do kulek spowoduje nagrzanie kąpieli; Należy zachować ostrożność, aby nie przegrzać fiolek.
2. Usunąć 100 μl pożywki transportowej wirusa do ekstrakcji RNA.
   1. Użyj wysokoprzepustowej (format płytki 96-dołkowej) platformy z kulkami magnetycznymi do ekstrakcji RNA z dużej liczby próbek. ^{Rozdział 31}
3. Używaj testów PCR z odwrotną transkryptazą w czasie rzeczywistym do szybkiego wykrywania wirusa grypy A. ^{Rozdział 31}

4. Izolacja wirusa grypy A z chusteczek do nosa

1. Rozmrozić próbki zgodnie z opisem w sekcji 3.1 powyżej
2. Rozmrożone próbki należy potraktować siarczanem gentamycyny (1 000 μg / ml), amfoterycyną B (22,5 μg / ml) i siarczanem kanamycyny (325 μg / ml).
3. Zaszczepić w komórkach nabłonka nerki psów Madin-Darby (MDCK), jak opisano wcześniej. ^{Rozdział 32}

Wyniki

Prawidłowe zastosowanie tej metody pozwala uzyskać wyniki rRT-PCR, które – wraz z wykorzystaniem kontroli wewnętrznej podczas ekstrakcji RNA i rRT-PCR – wykazują, że próbki nie zawierały inhibitorów PCR pochodzących z zanieczyszczeń środowiskowych pobranych podczas próbkowania. Po inokulacji próbki dołki do izolacji wirusa powinny być wolne od widocznych zanieczyszczeń środowiskowych obecnych w próbce. Istnieje rozsądna zgodność między wynikami rRT-PCR a wynikami izolacji wirusa, przy czym należy pamiętać, że PCR często ...

Dyskusja

Pobieranie próbek od świń za pomocą wymazów z nosa z końcówką poliestrową okazało się przydatne w prowadzeniu nadzoru nad IAV; Jednak stosowanie procedury wymazu z nosa utrudnia wysiłki związane z nadzorem ze względu na wymagane użycie sidła do krępowania. Chusteczki do nosa stanowią udoskonalenie obecnych technik pobierania próbek świń w celu zminimalizowania stresu u ludzi i świń podczas pobierania próbek. Chociaż metoda ta została opracowana i zatwierdzona na wystawach trzody chlewnej, można ją łatwo zastosować w inny...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
BBL Napar z mózgu serca	Becton, Dickinson and Company	211059
Sól sodowa penicyliny G	MP Biomedicals, LLC	021194537	1500 u/mg
siarczanu streptomycyny	AMRESCO LLC	0382
Roztwór gentamycyny	Mediatech, Inc.	30-005-CR	50 mg/ml
Amfoterycyna B Roztwór	Fisher	S 24 25	250 ug/ml
Siarczan Kanamycyny	Teknova	K2105	5000 ug/ml
TPP Rapid Filtermax System	TPP Techno Plastic Products AG	99150
Butelki diagnostyczne Nalgen	Thermo Scientific	342002-9025	HDPE z białym zamknięciem PP
Gąbka z gazy Dermacea, 8-warstwowa 441211	Covidien		5,08 cm i razy; 5,08 cm (2 cale i razy; 2 cale)
Rękawice nitrylowe	Saftey Choice	19-170-010 (A-D)