Identyfikacja nanocząstek tlenków metali w próbkach histologicznych za pomocą ulepszonej mikroskopii ciemnego pola i mapowania hiperspektralnego

Podsumowanie

Ulepszona mikroskopia ciemnego pola i obrazowanie hiperspektralne z mapowaniem spektralnym umożliwiają badania, lokalizację i identyfikację materiałów w skali nano w próbkach histologicznych z większą szybkością i dokładnością w porównaniu z tradycyjnymi metodami. Celem niniejszej pracy jest przedstawienie metod obrazowania w ciemnym polu i mapowania hiperspektralnego nanocząstek tlenków metali w próbkach histologicznych.

Streszczenie

Nanomateriały są coraz bardziej rozpowszechnione w przemyśle, produkcji i badaniach biomedycznych. Rośnie zapotrzebowanie na narzędzia i techniki, które pomagają w identyfikacji, lokalizacji i charakterystyce materiałów w nanoskali w próbkach biologicznych. Obecnie dostępne metody, takie jak mikroskopia elektronowa, zwykle wymagają dużych zasobów, co sprawia, że ich stosowanie jest zaporowe dla dużej części społeczności naukowej. Ulepszona mikroskopia ciemnego pola uzupełniona o system obrazowania hiperspektralnego może stanowić rozwiązanie tego wąskiego gardła, umożliwiając szybką i tańszą charakterystykę nanocząstek w próbkach histologicznych. Metoda ta pozwala na obrazowanie w nanoskali o wysokim kontraście, a także identyfikację nanomateriałów. W przypadku tej techniki histologiczne próbki tkanek przygotowuje się tak, jak w przypadku mikroskopii świetlnej. Najpierw analizuje się dodatnie próbki kontrolne w celu wygenerowania widm referencyjnych, które umożliwią wykrycie materiału będącego przedmiotem zainteresowania w próbce. Kontrole ujemne bez materiału będącego przedmiotem zainteresowania są również analizowane w celu poprawy swoistości (zmniejszenia liczby wyników fałszywie dodatnich). Próbki mogą być następnie obrazowane i analizowane przy użyciu metod i oprogramowania do mikroskopii hiperspektralnej lub dopasowywane do tych widm referencyjnych w celu dostarczenia map lokalizacji materiałów będących przedmiotem zainteresowania w próbce. Technika ta szczególnie dobrze nadaje się do materiałów o bardzo unikalnych widmach odbicia, takich jak metale szlachetne, ale ma również zastosowanie do innych materiałów, takich jak tlenki półmetaliczne. Technika ta dostarcza informacji, które są trudne do uzyskania z próbek histologicznych bez użycia technik mikroskopii elektronowej, które mogą zapewnić wyższą czułość i rozdzielczość, ale są znacznie bardziej zasobochłonne i czasochłonne niż mikroskopia lekka.

Wprowadzenie

Ponieważ nanomateriały są coraz częściej używane w różnych branżach i zastosowaniach, istnieje zapotrzebowanie na metody obrazowania i charakteryzacji w nanoskali, które są szybsze, tańsze i wygodniejsze niż tradycyjne metody, takie jak mikroskopia elektronowa. Aby zobrazować interakcje nanocząstek (NP) z komórkami, tkankami i żywymi systemami, zastosowano wiele technik optycznych, w tym mikroskopię kontrastu interferencyjnego (DIC)¹ oraz podejścia oparte na polu ulotnym, takie jak całkowite odbicie wewnętrzne (TIR) lub skaningowa mikroskopia optyczna bliskiego pola (NSOM)^2,3. Są to jednak wysokiej klasy podejścia analityczne, poza zasięgiem większości laboratoriów niespecjalistycznych⁴. Mikroskopia elektronowa, w tym transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM), została również wykorzystana do badania interakcji NP z komórkami^5,6,7,8. Skaningowa skaningowa mikroskopia elektronowa w ciemnym polu pierścieniowym o wysokim kącie (HAADF) została wykorzystana do zbadania interakcji nanocząsteczek z wirusami⁹. Mikroskopia konfokalna jest kolejną popularną techniką stosowaną do badania interakcji NP-komórek¹⁰.

W ostatnich latach, techniki obrazowania hiperspektralnego (HSI) oparte na ciemnym polu były używane jako obiecujące narzędzie analityczne do badania nanocząsteczek w matrycach biologicznych¹¹. Systemy HSI generują trójwymiarową reprezentację danych przestrzennych i spektralnych, znaną jako hipersześcian lub kostka danych¹². Mapa przestrzenna zmienności spektralnej służy do identyfikacji materiałów. Profile spektralne znanych materiałów mogą być generowane i wykorzystywane jako biblioteki referencyjne do porównania z nieznanymi próbkami. Jedną z głównych zalet systemów HSI jest ich zdolność do łączenia obrazowania ze spektroskopią, ustalając w ten sposób lokalizację i rozmieszczenie nieznanych nanocząsteczek in vivo lub ex vivo, a także łącząc je z inną cząstką referencyjną o znanym, podobnym składzie.

Istnieje kilka zalet korzystania z systemów HSI w porównaniu z konwencjonalnymi technikami obrazowania: wymagane jest minimalne przygotowanie próbki; przygotowanie próbki jest zazwyczaj nieniszczące; akwizycja i analiza obrazu jest szybsza; technika jest opłacalna¹³; a rozkład przestrzenny i analiza związków o mieszanym składzie i/lub w złożonych matrycach jest łatwiejsza^{do osiągnięcia 14}.

Dla badań nad nanomateriałami z udziałem cennych próbek, jednym z najważniejszych czynników jest dostępność metody obrazowania nieniszczącego, która pozwala na wielokrotne badanie próbek za pomocą jednej lub więcej metod. Wielokrotne lub wielokrotne analizy mogą być pożądane w celu opracowania kompleksowych zbiorów danych, które nie byłyby dostępne przy użyciu jednej metody. W związku z tym badanie jego właściwości optycznych jest najbezpieczniejszym sposobem analizy próbki. Dzięki zastosowaniu mikroskopu wzmocnionego ciemnego pola (EDFM) i systemu HSI do badania odpowiedzi optycznej próbki – a mianowicie współczynnika odbicia, ale także absorbancji i transmitancji – można przeprowadzić identyfikację i charakterystykę cech¹⁵. Potencjalne punkty końcowe charakterystyki obejmują ocenę względnej wielkości i kształtu nanocząstek lub aglomeratów oraz rozmieszczenie nanocząstek w próbce.

W tym artykule opisujemy metody mapowania nanocząstek tlenku metalu w tkance pośmiertnej za pomocą systemu HSI opartego na algorytmie dopasowania pikselowo-spektralnego, zwanym mapowaniem kąta widmowego (SAM). Wybraliśmy to konkretne zastosowanie, ponieważ ma ono potencjał, aby uzupełnić obecne i przyszłe badania nanatoksykologiczne in vivo, w których modele zwierzęce są wykorzystywane do oceny skutków zdrowotnych narażenia na zmodyfikowane nanomateriały. Zastosowanie tej metody może również dostarczyć informacji na temat badań nad dostarczaniem leków w nanoskali, które wykorzystują modele tkankowe lub zwierzęce. Za pomocą tego systemu można w szczególności badać absorpcję, dystrybucję, metabolizm i wydalanie nanocząstek w narządach i tkankach. Badanych jest wiele różnych zastosowań pod kątem wykorzystania w badaniach biomedycznych¹¹ .

Ta metoda może być wykorzystana do oceny różnych próbek biologicznych (takich jak różne typy tkanek, próbki płukania oskrzelowo-pęcherzykowego i rozmazy krwi), które zostały wystawione na działanie nanocząsteczek o różnych składach pierwiastkowych^16-19. Ponadto metoda ta jest przydatna do badania biodystrybucji nanocząstek in vivo i in vitro, co jest istotne dla badań nad dostarczaniem leków w nanoskali¹¹. Poza próbkami biologicznymi, EDFM i HSI mogą być wykorzystywane do oceny nanocząstek w próbkach środowiskowych, takich jak ścieki²⁰. Zastosowanie tej techniki może również ułatwić ocenę narażenia zawodowego, ponieważ może ona być wykorzystywana do oceny skuteczności środków ochrony indywidualnej w zapobieganiu przenikaniu nanocząstek. Ponadto zespół badawczy opracowuje obecnie podobny protokół EDFM i HSI do oceny próbek nanocząstek w mediach filtracyjnych pobranych z oceny narażenia zawodowego. Chociaż przygotowanie tych różnych typów próbek dla EDFM i HSI może się różnić, ważne jest, aby były one przygotowane w taki sposób, aby mogły być łatwo zobrazowane przez układ optyczny. Zazwyczaj próbka powinna być przygotowana tak, jakby była wizualizowana za pomocą tradycyjnej mikroskopii jasnego pola. Na rynku dostępnych jest kilka systemów obrazowania hiperspektralnego¹¹.

Protokół

Protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w instytucji współpracującej z badaczami, Uniwersytecie Stony Brook. Listę konkretnych materiałów i sprzętu użytego w tym artykule można znaleźć w Tabeli 1.

1. Przygotowanie próbki tkanek

1. Przygotować tkanki zwierzęce wystawione na działanie nanocząstek tlenku metalu do barwienia histologicznego lub immunohistochemicznego zgodnie z wcześniej opisanymi metodami^21-23.

2. Obrazowanie

1. Inicjalizacja mikroskopu
   UWAGA: W tym badaniu użyto mikroskopu klasy badawczej, wyposażonego w wysokowydajne źródło światła ciemnego pola, zmotoryzowany kontroler stopnia XY, 14-bitową kamerę hiperspektralną o głębokości i wiele soczewek obiektywowych (10X powietrze, 40X powietrze, 100X zanurzenie w olejku). Zastosowany tutaj system ma rozdzielczość przestrzenną 64 nm przy powiększeniu 100X (zanurzenie w oleju). Kondensor użyty w tym badaniu ma zarówno cechy oświetlenia Koehlera, jak i krytyczne i skupia wysoce skolimowane światło pod kątem na próbce.
   1. Podłącz i włącz źródło światła, kontroler stopnia XY, kamerę optyczną (do obrazowania ciemnego pola), kamerę hiperspektralną i system komputerowy. Ustaw źródło światła na 75% mocy; podnieś scenę do maksymalnej wysokości; Podłącz światłowód do kondensora w celu uzyskania lepszego obrazowania w ciemnym polu lub do kolimatora z tyłu mikroskopu w celu obrazowania odbitego jasnego pola.
      UWAGA: Ustawiając źródło światła na 75% mocy, uzyskuje się wystarczające, równomierne oświetlenie wszystkich pikseli w całym polu widzenia, które uwydatnia ciemniejsze piksele, jednocześnie umożliwiając kontrast między matowymi i jasnymi pikselami.
   2. Podnieś skraplacz do pozycji roboczej. Ostrożnie nałóż 3-5 kropli olejku immersyjnego typu A na soczewkę skraplacza, unikając tworzenia się pęcherzyków. Wytrzyj olej i nałóż go ponownie, jeśli utworzą się bąbelki.
   3. Umieść slajd na stole montażowym. Powoli podnoś skraplacz, aż olejek immersyjny zetknie się ze szkiełkiem. Będzie to zauważalne przez szybko rozjaśniający się pierścień oświetlenia w miejscu, w którym olej styka się ze szkiełkiem.
2. Umieść obiektyw 10X na miejscu. Ustaw ostrość i wyrównaj kondensator, badając przez okulary.
   1. Przesuwaj stage w górę iw dół za pomocą zgrubnego pokrętła ostrości obiektywu, aż jasność zostanie zmaksymalizowana.
   2. Przesuwaj ostrość kondensatora w górę iw dół za pomocą pokrętła regulacji kondensatora, aż zostanie znaleziona maksymalna jasność. Spróbuj stworzyć możliwie najjaśniejszy centralny punkt w polu widzenia.
   3. W razie potrzeby wyreguluj pokrętła wyrównania skraplacza, aby wyśrodkować jasny punkt, jeśli to konieczne.
   4. Użyj precyzyjnego pokrętła ostrości obiektywu, aby ustawić ostrość na jasnym punkcie. Zmieniając obiektywy w celu uzyskania innego powiększenia, ponownie dostosuj płaszczyznę ostrości. Podczas korzystania z obiektywu 100X nałóż kroplę olejku immersyjnego na szkiełko nakrywkowe, aby poprawić obraz i uniknąć uszkodzenia soczewki obiektywu.
3. Przechwytywanie obrazów
   1. Użyj kontrolera etapów, aby znaleźć interesujący Cię obszar. Region ten zostanie określony przez potrzeby eksperymentu. Typowym wskaźnikiem będzie wysoki kontrast z otaczającymi obszarami, ponieważ obszary nasycone nanocząstkami tlenku metalu często wydają się jaśniejsze niż obszary bez nich.
   2. Ustaw ostrość obszaru za pomocą precyzyjnego pokrętła ostrości obiektywu, regulując ostrość kondensatora w razie potrzeby, aby zrównoważyć oświetlenie. Uzyskaj dobrze zdefiniowany obszar o wysokim kontraście w polu widzenia.
   3. Określ, jakie obrazy (dla kamery optycznej) lub kostki danych (dla kamery hiperspektralnej) zostaną przechwycone i w jakiej kolejności. Zazwyczaj obrazy optyczne uzyskuje się za pomocą obiektywu powietrznego 10X, obiektywu powietrznego 40X i obiektywu zanurzeniowego 100X w oleju oraz odpowiadającego im modułu danych HSI z obiektywem 100X immersyjnym w olejku.
      1. Otwórz oprogramowanie do obrazowania optycznego. Kliknij "Ustawienia" na pasku menu. Wybierz "Przycisk przechwytywania obrazu dla zdarzenia przechwytywania". Wybierz zapisany format obrazu (w tym eksperymencie użyto formatu TIFF); przypisz nazwę pliku; przeglądanie i wybieranie folderu z zapisanymi obrazami; Zachowaj domyślny timelapse; kliknij "OK".
      2. W menu "Ekspozycja" wybierz ustawienia ekspozycji, które tworzą obraz o najwyższym kontraście (w tym badaniu zastosowano poziom 0,0%, wzmocnienie 3,0 dB i migawkę 35 ms).
      3. Uchwyć obraz, klikając przycisk "Obraz" na pasku menu. Uchwyć kilka obrazów ciemnego pola o małym powiększeniu, oprócz tych w dużym powiększeniu, zmieniając obiektywy mikroskopu, aby zapewnić kontekst.
         UWAGA: Przechwytuj obrazy optyczne w tym samym powiększeniu, co wszelkie kostki danych, które zostaną przechwycone za pomocą kamery hiperspektralnej, ponieważ te obrazy optyczne mają zwykle większe pole widzenia i lepszy estetyczny wygląd do późniejszej kontroli wizualnej. Istotne jest, aby wszelkie kostki danych, które będą później analizowane spektralnie, używały stałego powiększenia, ponieważ możliwe jest, że zmiana obiektywu zmieni widma transmisyjne optyki mikroskopu, zmieniając przechwycone widma, a tym samym zmniejszając dokładność mapowania kąta spektralnego (SAM). Jeśli jedna kostka danych jest porównywana z inną kostką danych uzyskaną w innym celu, funkcja SAM może nie działać.
   4. Wybierz detektor obrazowania kamery hiperspektralnej, przekierowując pokrętło źródła światła na mikroskopie do kamery hiperspektralnej. Jeśli światło jest skierowane w stronę kamery hiperspektralnej, żaden obraz nie zostanie pokazany w oprogramowaniu kamery optycznej. Zminimalizuj, ale nie zamykaj okna oprogramowania do obrazowania optycznego, ponieważ może być ono potrzebne zgodnie z opisem w kroku 2.4.4.
4. Przechwytywanie kostek danych
   1. Otwórz oprogramowanie do obrazowania hiperspektralnego, aby uzyskać kostki danych HSI. Upewnij się, że światłowód jest skierowany do kamery hiperspektralnej.
   2. Otwórz "Mikroskop hiperspektralny" na pasku menu i wybierz "Sterowanie mikroskopem HSI".
   3. Ustaw powiększenie obiektywu i ścieżkę zapisu. Upewnij się, że wszystkie obrazy i pliki są nazwane w charakterystyczny sposób, aby nie doszło do nadpisania. Zmień przechwytywanie obszaru w ustawieniach, dostosowując pole widzenia lub liczbę linii (w tym badaniu użyj 720 linii), ze znaczną ilością dodatkowego czasu potrzebnego na uchwycenie większych obszarów. Na koniec ustaw czas ekspozycji (0,25 sekundy dla tego badania). Pozostaw wszystko inne jako domyślne i kliknij "Podgląd HSI", aby wyświetlić obraz.
      Uwaga: Wyświetlony wykres intensywności pokazuje kostkę danych HSI, która zostanie zapisana na osi poziomej. Oś pionowa reprezentuje długości fal widm, które zostaną przechwycone w kostce danych HSI. Umieszczenie kursora w dowolnym miejscu na wykresie intensywności odpowiadającym długości fali spektralnej powoduje pokazanie intensywności wszystkich punktów na obrazie, na tej długości fali.
   4. Ustaw ostrość na podstawie tego podglądu, dostosowując precyzyjną ostrość obiektywu, aby wyostrzyć szczyty na tym obrazie. Jeśli jest to zbyt trudne, ogniskowa kamery optycznej jest dość podobna, więc załaduj oprogramowanie do obrazowania optycznego i przesuń suwak do kamery optycznej, ustaw ostrość, a następnie wróć do oprogramowania do obrazowania hiperspektralnego i zwróć suwak do kamery hiperspektralnej.
   5. Dostosuj intensywność z tego podglądu, dostosowując jasność źródła, ostrość kondensora lub anulując podgląd, aby dostosować czas ekspozycji. To ostatnie daje najlepsze wyniki, ale wydłużenie czasu naświetlania może zająć więcej czasu. Celem jest, aby bardziej znaczące piki były wystarczająco duże, ale nie przekraczały maksymalnej intensywności dla detektora; W tym przypadku idealny zakres wynosi od 1 000 do 16 000 jednostek.
   6. Kliknij "przechwyć". Mikroskop poprosi o wykonanie obrazu ciemnego prądu. Przekieruj górny suwak lub przysłonę (ostrożnie, aby nie zakłócać wyrównania i ostrości żadnej z pozostałych optyki) i kliknij "OK". Przywróć suwak lub przysłonę do właściwej pozycji i ponownie kliknij "OK", gdy pojawi się monit o obraz. Obrazowanie może trwać do 30 minut, choć czasami czasami jest około 5 minut. Dłuższe czasy naświetlania prowadzą do dłuższych czasów obrazowania. Obecny jest wskaźnik postępu. Uważaj, aby fizycznie nie zakłócić działania lunety przed zakończeniem wyświetlania wskaźnika postępu.
   7. Obserwuj cztery nowe okna z nazwami: "Lista dostępnych pasm", "#1zoom", "#1scroll" i "#1 pasmo RGB". Zmaksymalizuj okno "pasmo #1RGB", ponieważ jest to datacube dla wszystkich przyszłych odwołań.
   8. Kliknij prawym przyciskiem myszy kostkę danych i zapisz ją jako TIFF, a następnie kliknij "OK". Po zakończeniu obrazowania; odłożyć wszystkie próbki; oczyść wszystkie powierzchnie narażone na działanie oleju za pomocą 70% izopropanolu w wodzie; podnieś scenę do maksymalnej wysokości; obniżyć skraplacz do minimalnej wysokości i wcisnąć do pozycji spoczynku; Wyłącz lub odłącz źródło światła, stage kontroler i kamery.

3. Tworzenie referencyjnych bibliotek spektralnych

1. Wybór widm referencyjnych
   1. Należy wybrać kontrolę pozytywną, o której wiadomo, że zawiera materiał będący przedmiotem zainteresowania zawarty w tej samej matrycy co próbki eksperymentalne, ponieważ profile widmowe HSI są zależne od matrycy.
      1. W tym badaniu należy użyć skóry świni, której wstrzyknięto wysokie dawki nanocząstek tlenku metalu jako kontrole pozytywne w celu porównania z eksperymentalną tkanką skóry świni z badania narażenia miejscowego. Wygenerowano i zbadano profile spektralne nanocząstek tlenku metalu w zawiesinie, które okazały się niewłaściwą kontrolą pozytywną dla histologicznych próbek eksperymentalnych ze względu na różne matryce.
   2. Uzyskać kostkę danych z kontroli dodatniej, jak opisano w kroku 2.4, za pomocą kamery hiperspektralnej.
      1. Zachowaj szczególną ostrożność podczas ustawiania intensywności, ponieważ jest to podstawowa miara, za pomocą której wewnętrzny filtr cząstek stałych zidentyfikuje materiały. Wszelkie intensywności powyżej punktu nasycenia detektora (w tym przypadku 16 000 jednostek) spowodują nieprawidłowe dane (patrz krok 2.4.5.).
   3. Kliknij prawym przyciskiem myszy w oknie obrazu, a następnie kliknij lewym przyciskiem myszy "Spektrum profilu Z". Pojawi się wyskakujące okno Spectral Profile. Kliknij lewym przyciskiem myszy interesujące Cię piksele w kostce danych, szczególnie te najjaśniejsze lub te, które można z pewnością zidentyfikować jako reprezentujące interesujący Cię materiał. Obserwuj okno Spectral Profile (Profil spektralny) pokazujące skojarzone widmo. Zwróć szczególną uwagę na ich najniższą i najwyższą wartość oraz na to, jaka długość fali jej odpowiada.
      1. Podczas badania pozytywnej próbki kontrolnej należy przeprowadzić badanie, klikając obszary zainteresowania, które są bardzo jasne w stosunku do otaczającej tkanki, zwłaszcza te, w których znajdują się łatwo identyfikowalne cząstki. Cząstki te najprawdopodobniej są materiałami będącymi przedmiotem zainteresowania, zwłaszcza w przypadku metali.
   4. Użyj narzędzia "Filtr cząstek" w menu "Analiza cząstek", aby zidentyfikować cząstki obecne w kostce danych. W nowym wyskakującym oknie zwróć uwagę na "Widmo maksymalne musi przekroczyć". Zostanie to określone na podstawie obserwacji podanych w kroku 3.1.3. Ustaw tę wartość tak, aby była wyższa niż piksele tła, ale niższa niż interesujące Cię materiały. "Maksymalna liczba ważnych danych" to maksymalna intensywność (w tym przypadku 16 000 jednostek).
      1. Pozostaw inne parametry domyślne, ale wyklucz obiekty na podstawie rozmiaru, dostosowując pole "Próg rozmiaru". Zapisz te dane w tym momencie lub po uruchomieniu analizy. W tym eksperymencie użyj następujących parametrów: Maksimum widmowe musi przekraczać: 5 000; Maksimum prawidłowych danych: 16 000; Próg rozmiaru (piksele): 400. Po ustawieniu wszystkich parametrów kliknij "OK".
   5. Obserwuj otrzymany wykres ze szczegółowymi informacjami na temat cząstek wykrytych we wskazanym progu natężenia; dane te można wyeksportować. Jeśli znana jest charakterystyczna maksymalna długość fali odbicia interesującego nas materiału, wybierz te cząstki, które mają podobną wartość "Max WL"; W przeciwnym razie kliknij "Zaznacz wszystko". Następnie kliknij "Eksportuj"; "Do biblioteki spektralnej". Wybierz nazwę pliku, a następnie kliknij "OK".
2. Usuń widma fałszywie dodatnie
   1. Należy wybrać próbkę, która posłuży jako kontrola ujemna. Taka próbka powinna być przygotowana i potraktowana w taki sam sposób, jak wszystkie próbki doświadczalne, z wyjątkiem tego, że gwarantowany jest brak nanocząstek podobnych lub identycznych z materiałem będącym przedmiotem zainteresowania.
      UWAGA: Ważne jest, aby matryca kontroli ujemnej była taka sama jak matryca próbek doświadczalnych, ponieważ profile widmowe HSI są zależne od matrycy. W tym badaniu wykorzystaliśmy skórę świń, która nie była narażona na nanomateriały tlenków metali jako kontrolę negatywną.
   2. Uzyskać kilka kostek danych z kontroli ujemnej, jak opisano w kroku 2.4.7, za pomocą kamery hiperspektralnej. Wymagany jest co najmniej jeden, ale można wychwycić więcej w celu zwiększenia selektywności (jest to szczególnie ważne w przypadku, gdy pewne zanieczyszczenie może znajdować się w widmach odniesienia).
   3. Użyj oprogramowania do obrazowania hiperspektralnego, aby przefiltrować bibliotekę spektralną zebraną w kroku 3.1 (kontrola pozytywna) względem każdej kostki danych przechwyconej w kroku 3.2.2 (kontrole ujemne) szeregowo, zgodnie z instrukcjami w następujących krokach:
      UWAGA: Zapisz wynikową, przefiltrowaną bibliotekę spektralną w osobnym pliku i użyj jako referencyjnej biblioteki spektralnej dla interesującego nas materiału.
      1. Kliknij "Filter Spectral Library" w menu Analysis, znajdującym się na głównym pasku narzędzi programu. Kliknij "Otwórz"; "Nowy plik" i wybierz bibliotekę spektralną utworzoną w kroku 3.1. dla kontroli pozytywnej jako plik wejściowy. Kliknij "OK".
      2. W przypadku źródła zewnętrznego wybierz opcję "Obraz" w polu Dane spektralne. Zachowaj ustawienia domyślne w polu Parametry przetwarzania. Wybierz nazwę wyjściową dla filtrowanej biblioteki (powinna być inna niż oryginalna, w przeciwnym razie zebrana surowa biblioteka spektralna zostanie utracona). Kliknij "OK".
      3. Kliknij "Otwórz"; "Nowy plik" i wybierz pierwszą kostkę danych przechwyconą w kroku 3.2.2 dla kontroli ujemnej, po wyświetleniu monitu o wybranie obrazu źródłowego.
         UWAGA: Oprogramowanie przeanalizuje bibliotekę spektralną i usunie każde widmo, które pasuje do dowolnego widma kostki danych kontroli negatywnej. Usunięcie tła z kryteriów wyboru zmniejsza w ten sposób ryzyko wyników fałszywie dodatnich. Po wykonaniu tej czynności podsumowanie będzie dostępne (należy pamiętać, że to podsumowanie nie jest zapisywane automatycznie).
      4. Jeśli wymagane jest dodatkowe filtrowanie, powtórz czynności od kroku 3.2.3.1, z wyjątkiem: kroku 3.2.3.2 wybierz ostatnią utworzoną filtrowaną bibliotekę widmową (powstałą po zakończeniu kroku 3.2.3.3); w kroku 3.2.3.3 wybierz następny DataCube z kroku 3.2.2.
         UWAGA: Korekta i normalizacja widma lampy może być konieczna, jeśli próbki rozpraszają znaczną ilość światła (np. nanorurki węglowe) i/lub jeśli podczas filtrowania biblioteki widmowej kontroli pozytywnej w stosunku do kontroli ujemnej pozostają zerowe widma. Okoliczności te nie wystąpiły w naszym badaniu, więc ta korekta nie została przeprowadzona.

4. Analiza obrazu

1. Mapowanie kąta spektralnego
   1. Otwórz "Spectral Angle Mapper" (SAM) z menu Spectral, podmenu Mapping Methods, używając oprogramowania do obrazowania hiperspektralnego, gdy wszystkie eksperymentalne kostki danych zostaną pobrane zgodnie z krokiem 2.4. Mapowanie kąta spektralnego porównuje widma poprzez geometryczną analizę zmian intensywności w funkcji długości fali (tj. porównuje dwa widma, normalizując ich intensywność i porównując kąty wymagane do prześledzenia wykresu każdego widma)²⁴.
   2. Po otwarciu kostki danych wybierz nazwę eksperymentalnej kostki danych w wyskakującym okienku i kliknij "OK". Jeśli na liście nie ma żadnych nazw plików, kliknij "otwórz"; "nowy plik", wybierz eksperymentalną kostkę danych, a następnie kliknij "OK".
      1. Obserwuj nowe wyskakujące okienko o nazwie Endmember Collection:SAM. Kliknij "Importuj" na pasku menu, a następnie wybierz "z pliku Spectral Library". Pojawi się wyskakujące okienko o nazwie Spectral Library Input File. Otwórz bibliotekę spektralną odniesienia utworzoną w kroku 3.2.3. i kliknij "OK". Obserwuj nowe wyskakujące okienko o nazwie "Input Spectral Library".
      2. Kliknij "Zaznacz wszystkie elementy"; kliknij "OK", kliknij prawym przyciskiem myszy "Kolor" i wybierz "Zastosuj domyślne kolory do wszystkich". Kliknij "Zaznacz wszystko", a następnie "Zastosuj", a następnie wybierz nazwę pliku wyjściowego i kliknij "OK". Mapowanie kąta spektralnego zajmie kilka sekund na analizę i zapisanie danych.
   3. Otwórz kostkę danych w oprogramowaniu do obrazowania hiperspektralnego. Wybierz "Klasyfikacja" w menu Nakładka w oknie obrazu, a następnie przejdź do nazwy pliku i kliknij "OK". Użytkownik może teraz nałożyć dowolne widmo z biblioteki, aby zobaczyć, gdzie na obrazie jest mapowany.
   4. Wybierz opcję "Scal klasy" z menu Opcje w narzędziu "Klasa interaktywna" otwartym za pomocą menu Nakładka w oknie obrazu, jeśli wymagany jest ujednolicony schemat kolorów, na przykład w celu łatwiejszej analizy przez inne oprogramowanie (zgodnie z opisem w kroku 4.2.).
   5. Zaznacz wszystkie klasyfikacje do połączenia (zazwyczaj wszystko oprócz "niesklasyfikowane" na liście "klasy do scalenia z bazą") i wybierz pojedyncze spektrum z listy "klasa bazowa", a następnie kliknij "OK". Ten kolor będzie teraz reprezentował wszystkie wybrane widma.
   6. Kliknij wybrany kolor, a wszystkie pasujące widma zostaną pokazane w tym kolorze.
   7. Aby uzyskać obraz dichromatyczny, który pokaże pasujące widma na czarnym tle, włącz pole "niesklasyfikowane" kolory, które domyślnie jest czarne. Obserwuj obraz dwuchromatyczny. Ten krok można odwrócić, klikając ponownie pole "niesklasyfikowane" kolory.
   8. Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby zapisać obraz jako TIFF, łącznie ze wszystkimi aktualnie aktywnymi nakładkami.
      UWAGA: Do przyszłego przetwarzania obrazu zostanie użyty obraz dichromatyczny.
   9. Wybierz "Rozkład klas" z menu opcji w oknie "Interaktywne narzędzie klas", aby uzyskać statystyki mapowania. Dane te pokazują, ile pikseli nie zostało zmapowanych (niesklasyfikowanych) i ile z nich zostało zidentyfikowanych jako materiał będący przedmiotem zainteresowania. Należy pamiętać, że liczba pikseli nie odpowiada liczbie zmapowanych cząstek. Informacje te nie są rejestrowane automatycznie.
2. Analiza cząstek w obrazach mapowanych hiperspektralnie
   1. Otwórz obrazy w oprogramowaniu NIH ImageJ.
   2. Użyj menu Obraz, podmenu Dostosuj, funkcji "Próg". Wybierz parametry, które odróżniają interesujące cząstki od wszystkich innych materiałów. W tym badaniu należy użyć następujących parametrów progowych: domyślna metoda progowa, kolor czerwony, przestrzeń kolorów HSB, zaznaczone pole wyboru ciemnego tła, zaznaczone pola wyboru przejścia dla odcienia, nasycenia i jasności.
      UWAGA: Może się to znacznie różnić w zależności od przypadku. Podczas analizowania zmapowanego narzędzia Datacube można to uprościć, ujednolicając wszystkie odpowiednie klasy do jednego koloru i nakładając ten kolor na wszystkie niesklasyfikowane kolory przed wygenerowaniem obrazu (kroki od 4.1.4 do 4.1.8).
   3. Użyj menu Analizuj, funkcji "Analizuj cząstki", która pobierze informacje o powierzchni, średniej, minimalnych i maksymalnych wartościach. W tym badaniu użyj podanych tutaj parametrów: rozmiar 0-nieskończoność, okrągłość 0-1, nic nie pokazuj, zaznacz pole wyboru wyświetl wyniki.
   4. W celu analizy statystycznej należy wyeksportować te dane do innego programu umożliwiającego statystyczne porównanie z liczbą i wielkością cząstek znajdujących się w podobnych próbkach kontrolnych. Sugerujemy użycie arkusza kalkulacyjnego do analizy danych ImageJ. Dane wyświetlane w tabeli wyników po kroku 4.2.4 należy skopiować do arkusza kalkulacyjnego. Funkcja MAX może być użyta w pierwszej kolumnie (bez tytułu) w celu określenia liczby cząstek, natomiast funkcja ŚREDNIA może być użyta w kolumnie Area w celu określenia średniej wielkości cząstki. W przyszłości prowadzona będzie walidacja eksperymentalna w celu zbadania tej funkcji w określaniu średniej wielkości w stosunku do ustalonego standardu wymiarowania (np. TEM).

Wyniki

Mikroskopia hiperspektralna jest przydatna ze względu na możliwość identyfikacji materiałów w sposób podobny do spektrofotometrii. Jak pokazano na rysunku 1, każdy materiał ma kilka charakterystycznych widm i ogólny kształt jego współczynnika odbicia, który jest unikalny. Ponadto rysunek 1 ilustruje zależny od matrycy charakter profili spektralnych: profile widmowe dla każdego z trzech tlenków metali w histologicznych próbkach tkanek (górny panel) różnią się od profili widmowych dla każdego z trzech tlenków metali w zawiesinie wodnej (dolny panel). Dzięki mapowaniu charakterystycznych profili widmowych do nieznanych próbek w tej samej matrycy, technika ta jest przydatna do określania obecności lub braku materiału, a także może częściowo ilościowo porównywać względne ilości materiału w próbkach.

Referencyjne biblioteki spektralne utworzone z próbek skóry z kontroli pozytywnej są odpowiednie do mapowania na eksperymentalne próbki skóry. Jak widać na rysunku 2, referencyjne biblioteki spektralne dobrze odwzorowują odpowiednie kontrole dodatnie i nie odwzorowują ich na odpowiadające im kontrole ujemne.

Najbardziej znaczącą zaletą tej techniki jest jej zdolność do wykrywania niskich poziomów interesujących materiałów w próbkach, a także do odróżniania ich od zanieczyszczeń. Na przykład pojedyncze nanorurki można zaobserwować w płucach podczas wdychania dawek tak niskich, jak 40 μg u szczura o wadze 20-30 g²⁵. Rysunek 3 pokazuje to w histologicznych próbkach skóry: podczas gdy niektóre cząstki są łatwo widoczne na obrazie optycznym ciemnego pola (kolumna 2), inne są wykrywane za pomocą obrazowania hiperspektralnego (kolumna 3), które mogły zostać pominięte przy użyciu mikroskopii jasnego pola (kolumna 1) lub innych metod. Zastosowanie HSI w ciemnym polu służy również poprawie swoistości w porównaniu z prostą mikroskopią jasnego pola. Obrazy te mogą być następnie poddawane bardziej ilościowym formom analizy, w szczególności analizie cząstek za pomocą ImageJ.

Rozszerzona mikroskopia ciemnego pola ma kilka różnych zastosowań, nawet przy braku obrazowania hiperspektralnego. Pierwszą z nich jest zdolność do generowania wysokiej jakości obrazów o wysokim kontraście. Najlepiej pokazuje to rysunek 3, na którym interesujące cząstki są łatwe do zidentyfikowania w porównaniu z ich odpowiednikami w jasnym polu. Obrazy te mogą być również poddawane ilościowej analizie cząstek, chociaż w przypadku braku mapowania hiperspektralnego należy zachować ostrożność, aby uniknąć pomylenia cząstki zanieczyszczenia z cząstką będącą przedmiotem zainteresowania.

Rysunek 1. Referencyjne biblioteki spektralne (matryca tkankowa) w porównaniu z bibliotekami spektralnymi (nanocząstki w zawiesinie). Rysunek ten pokazuje, jak ważne jest generowanie referencyjnej biblioteki spektralnej z nanomateriałów będących przedmiotem zainteresowania w tej samej matrycy, co próbki eksperymentalne. Pierwszy wiersz przedstawia referencyjną bibliotekę spektralną (RSL) dla każdego materiału w tym badaniu (tlenek glinu, krzemionka i tlenek ceru). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ten RSL został utworzony metodą opisaną w tym protokole, gdzie próbki tkanek kontroli pozytywnej były filtrowane przez próbki tkanek kontroli negatywnej. Drugi rząd przedstawia biblioteki spektralne (SL) utworzone z interesujących nas nanocząstek w ciekłej zawiesinie na szkiełku podstawowym na szkiełku podstawowym. W przypadku tlenku glinu pik bimodalny o długościach fal 500 i 650 stwierdzono w RSL, podczas gdy bardziej zakrzywiony i mniej charakterystyczny pik zaobserwowano w zawiesinie NP z tlenku glinu SL przy około 600. W przypadku krzemionki pik o długości fali około 650 był obecny w RSL, podczas gdy bardziej zakrzywiony i mniej charakterystyczny pik zaobserwowano w zawiesinie krzemionki NP SL na poziomie około 600. W przypadku ceru pik bimodalny stwierdzono na długościach fal 520 i 620 w RSL, podczas gdy mniej charakterystyczny pik zaobserwowano w zawiesinie NP cerii SL na poziomie około 560. Sugeruje to, że matryca, w której osadzone są NP, powoduje przesunięcie widm, które może być znaczne przy wyborze kontroli do stworzenia SL dla konkretnego eksperymentu.

Rysunek 2. Referencyjne biblioteki spektralne (matryca tkankowa) zmapowane na tkance skóry świń w ramach kontroli dodatniej i kontroli ujemnej. Rysunek ten służy jako potwierdzenie RSL odpowiednich do przyporządkowania do próbek doświadczalnych, w tym sensie, że każdy RSL (lewa kolumna) dobrze odwzorowuje odpowiadającą mu kontrolę dodatnią (środkowa kolumna) i nie odwzorowuje odpowiadającej mu kontroli ujemnej (prawa kolumna). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Mapowanie hiperspektralne eksperymentalnej tkanki skóry świń narażonej na działanie nanocząstek tlenków metali. Rzędy od góry do dołu odpowiadają różnym warstwom skóry, od warstwy powierzchownej do najgłębszej: odpowiednio naskórka, skóry właściwej i tkanki podskórnej. Pierwszy rząd przedstawia warstwę rogową naskórka z próbki skóry, która była wystawiona na działanie nanocząsteczek tlenku glinu w zawiesinie; drugi rząd poddano działaniu nanocząsteczek krzemionki w zawiesinie; i trzeci rząd do cząstek tlenowych ceru w zawiesinie. Każda kolumna przedstawia ten sam obszar skóry zobrazowany przy użyciu różnych technik. Pierwsza kolumna odpowiada mikroskopii jasnego pola (40X mag.; skala = 50 μm), gdzie obszar zamknięty w czerwonym kwadracie został powiększony (100X mag; podziałka = 10 μm) ze wzmocnioną mikroskopią ciemnego pola (EDFM) w drugiej kolumnie, gdzie białe strzałki wskazują na NP o wysokim kontraście. Trzecia kolumna została uzyskana za pomocą kamery hiperspektralnej (HSI), pokazującej te same NP o wysokim kontraście (białe strzałki). Zdjęcia EDFM i HSI zostały wykonane w powiększeniu 100x; podziałka = 10 μm. Czwarta kolumna przedstawia obraz HSI odwzorowany w odniesieniu do odpowiedniego RSL dla każdej grupy ekspozycji, gdzie NP tlenku glinu są pokazane odpowiednio na zielono, NP krzemionki na czerwono, a NP tlenku ceru na żółto. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

W przypadku próbek tkanek, które zostały poddane konwencjonalnemu barwieniu histologicznemu, identyfikację i analizę nanocząstek tlenku metalu można osiągnąć poprzez połączenie technik EDFM, mapowania HSI i analizy obrazu. Chociaż istnieje elastyczność w przygotowywaniu próbek do badań histologicznych lub immunohistochemicznych (np. przy użyciu utrwalonych lub zamrożonych tkanek; rodzaj barwienia), ważne jest, aby próbki były cięte na sekcje do grubości 5-10 μm w celu optymalnej wizualizacji. Użyte tu próbki utrwalono w formalinie i zatopiono w parafinie przed cięciem za pomocą mikrotomu obrotowego o grubości 6 μm, zamontowano na szklanych szkiełkach mikroskopowych, wybarwiono hematoksyliną i eozyną oraz nakryto. W tym badaniu wykorzystano tkanki skóry świń pochodzące z współpracy w zakresie toksykologii penetracji skóry ex vivo . Tkanki poddano działaniu nanocząstek tlenków metali (tlenek glinu, krzemionka, tlenek tlenku) w zawiesinach wodnych. Wykrywanie obszarów zainteresowania (elementów o wysokim kontraście) za pomocą EDFM jest krytycznym pierwszym krokiem, który ułatwia późniejsze mapowanie i analizę HSI. Dodatnie i ujemne próbki kontrolne muszą być najpierw zobrazowane i przeanalizowane w celu stworzenia biblioteki spektralnej w celach informacyjnych. Zebrane widma z kontroli dodatniej są eksportowane do biblioteki spektralnej kontroli dodatniej. Następnie wszystkie widma z obrazów kontroli ujemnej są odejmowane od biblioteki spektralnej kontroli pozytywnej w celu poprawy swoistości (zmniejszenia liczby wyników fałszywie dodatnich). Wynikowa filtrowana biblioteka spektralna jest uważana za RSL, który służy do analizy materiałów będących przedmiotem zainteresowania. Wszystkie próbki tkanek poddawane są temu samemu procesowi obrazowania i są mapowane względem RSL. Wynikowy obraz będzie zawierał tylko obszary z elementami zainteresowania na czarnym tle. Obraz ten można następnie przeanalizować za pomocą ImageJ przy użyciu funkcji analizy progowej i cząstek, aby uzyskać obszar zmapowanych cząstek w polu widzenia. Dane liczbowe uzyskane z ImageJ można wyeksportować do arkusza kalkulacyjnego w celu dalszej analizy.

Ważne jest, aby wziąć pod uwagę, że ponieważ próbki biologiczne z natury różnią się od siebie, a metody barwienia mogą wpływać na wizualizację za pomocą EDFM i HSI, ustawienia ekspozycji powinny być określone zgodnie z tym, co daje najlepszy obraz o wysokim kontraście dla określonego rodzaju próbki. Chociaż redukcję wyników fałszywie dodatnich można osiągnąć poprzez filtrację bibliotek spektralnych, kluczowe znaczenie ma uzyskanie wiarygodnych kontroli ujemnych, które pozwoliły uniknąć zanieczyszczenia pierwiastkiem będącym przedmiotem zainteresowania, ponieważ widma odpowiadające temu zanieczyszczeniu mogą być potencjalnie filtrowane z biblioteki spektralnej kontroli pozytywnej, zwiększając odsetek wyników fałszywie ujemnych. Ponadto zakres intensywności widma, który jest wykrywalny za pomocą oprogramowania do obrazowania hiperspektralnego, nie może przekroczyć limitu konkretnego oprogramowania (w tym badaniu jest to 16 000 jednostek): obszary z dużą liczbą nagromadzonych cząstek, które wytwarzają intensywność widmową powyżej limitu intensywności, są pomijane w bibliotece spektralnej ze względu na ryzyko zwiększenia liczby wyników fałszywie ujemnych.

Chociaż system HSI ma wiele zalet w porównaniu z tradycyjnymi metodami, istnieją pewne wady i ograniczenia, które należy wziąć pod uwagę. Jednym z nich jest to, że duża ilość gromadzonych danych optycznych może wymagać znacznej mocy obliczeniowej. Innym jest to, że HSI może być czasochłonne, szczególnie na początkowych etapach, kiedy tworzone są referencyjne biblioteki spektralne. Ponadto czas obrazowania może wymagać kilku minut na przechwycenie obrazu, co czyni go wolniejszym niż proste obrazowanie w ciemnym polu; Jest to jednak nadal szybsze niż przygotowanie i wizualizacja próbek za pomocą mikroskopii elektronowej. Dodatkowo, złożone systemy mogą skutkować wieloma widmami charakterystycznymi, co wymaga opracowania wysoce wyspecjalizowanych kontroli i utrudnia tworzenie znormalizowanych, uniwersalnych bibliotek referencyjnych²⁶. Wreszcie, technika ta skutkuje niższą rozdzielczością niż techniki mikroskopii sondowej lub elektronowej, takie jak mikroskopia sił atomowych lub transmisyjna mikroskopia elektronowa, które mogą rozdzielić pojedyncze atomy. Rozdzielczość tej techniki jest ograniczona ze względu na jej fotoniczny charakter, co sprawia, że nie jest ona precyzyjnym narzędziem do pomiaru rozmiarów cząstek na poziomie nanometrów lub do precyzyjnego lokalizowania materiałów na poziomie submikronowym. Chociaż technika ta może być w stanie wskazać cząstki w określonych przedziałach tkankowych lub organellach komórkowych większych niż 1 μm (takich jak jądra komórkowe), mniejsze organelle lub cechy są trudne do dokładnej wizualizacji za pomocą tej metody. Warto również zauważyć, że ze względu na rozdzielczość przestrzenną metoda ta nie jest w stanie rozróżnić pojedynczych nanocząstek i aglomeratów¹¹.

Inne kwestie obejmują: niektóre materiały (takie jak metale szlachetne) mają znacznie wyższy współczynnik odbicia i wyraźne profile spektralne, co może ułatwić ich analizę i mapowanie spektralne za pomocą tego narzędzia. Inne, takie jak tlenki półmetaliczne badane w tym badaniu i nanomateriały na bazie węgla^{24, 27}, mogą być trudniejsze ze względu na ich skład pierwiastkowy, kształt i zależność od matrycy. W dwóch badaniach nad inhalacją mysią przeprowadzonym przez Mercera i wsp., system podobny do tego zastosowanego w tym badaniu został wykorzystany w celu zlokalizowania nanorurek węglowych w płucach i narządach wtórnych w oparciu o ich niezwykle wysoki kontrast z otaczającymi tkankami. Jednak mapowanie hiperspektralne nie zostało wykazane w żadnym z badań, prawdopodobnie dlatego, że unikalny kształt włókien węglowych był wystarczającą cechą do identyfikacji. Inna kwestia odnosi się w szczególności do tkanek: ponieważ osadzanie się nanocząstek będących przedmiotem zainteresowania w określonych narządach w wyniku normalnych procesów biofizycznych jest nieprzewidywalne (i często samo w sobie jest przedmiotem badań), określenie mającego zastosowanie kontroli dodatniej może być trudne i wymaga rozważenia, w jaki sposób wytwarzanie kontroli może wpłynąć na stan materiału będącego przedmiotem zainteresowania. Na przykład, jeśli biblioteka spektralna jest tworzona z nieskazitelnych nanocząstek będących przedmiotem zainteresowania, mapowanie biblioteki do tych samych nanocząstek w tkankach lub komórkach może być trudne ze względu na zmiany widm wynikające ze zmiany cząstki (np. z powodu zmiany pH, rozpuszczania, aglomeracji, wiązania białek) i całego mikrośrodowiska lub matrycy. Wreszcie, technika ta ma ograniczony charakter półilościowy: może być tylko tak ilościowa, jak inne techniki mikroskopii dwuwymiarowej o podobnej rozdzielczości, co oznacza, że nie można jej łatwo wykorzystać do wykonywania zadań, takich jak scharakteryzowanie całkowitego obciążenia narządów materiału.

Ogólnie rzecz biorąc, EDFM i HSI mają kilka zalet w porównaniu z konwencjonalnymi technikami obrazowania i charakteryzowania nanomateriałów, takimi jak TEM, HAADF i DIC. EDFM/HSI pozwala na szybszą akwizycję i analizę obrazu, co pozwala zaoszczędzić czas i koszty w porównaniu z bardziej intensywnymi technikami konwencjonalnymi. Dodatkowo, przygotowanie próbki do EDFM/HSI jest zazwyczaj zarówno minimalne, jak i nieniszczące, co oszczędza czas, a także pozwala na bardziej elastyczną analizę danej próbki, ponieważ może być następnie wykorzystana do innych technik. Co więcej, HSI jest wszechstronny, pozwalając na analizę materiałów w nanoskali o wielu składach i w różnych matrycach. Zespół badawczy pracuje nad udoskonaleniem opisanej tu metody dla innych materiałów i typów próbek, w tym nad dogłębną oceną specyfiki technologii. Kolejnym kluczowym krokiem badanym przez zespół badawczy jest walidacja tych technik w odniesieniu do tradycyjnych standardów złota (np. Raman, TEM, SEM) dla materiałów i typów tkanek będących przedmiotem zainteresowania.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Jednostka CytoViva 150 (kondensator)	CytoViva (Auburn, AL)		zamontowana na mikroskopie Olympus BX43
Mikroskop Olympus BX43 - Szczelina analizatora - HSI z 10-krotnymi i 40-krotnymi obiektywami powietrznymi oraz 100-krotnym obiektywem zanurzeniowym	uzyskanym przez CytoViva (Auburn, AL)		do użytku z kondensatorem CytoViva 150
Unit Dagexcel-M Cyfrowa kamera Firewire - chłodzona; zawiera oprogramowanie	Exponent 7uzyskany za pomocą CytoViva (Auburn, AL)		ulepszonej kamery i oprogramowania do ciemnego pola
System obrazowania hiperspektralnego CytoViva 1.4; zawiera kamerę hiperspektralną Pixelfly, kontroler stopnia XY, oprogramowanie do obrazowania hiperspektralnego ENVI	kamery hiperspektralnej	CytoViva (Auburn, AL)
pomieszczeniach czystych (szkiełka szklane B)	Schott NEXTERION	1025087	Zmniejszona ilość zanieczyszczeń i artefaktów w porównaniu z konwencjonalnymi szklanymi szkiełkami mikroskopowymi dla optymalnego obrazowania Szkiełka
nakrywkowe do mikroskopu z czyszczonego szkła w pomieszczeniach czystych (#1.0; 22 mm x 22 mm x  1,45 mm)	Schott NEXTERION	niestandardowo	zredukowane zanieczyszczenia i artefakty w porównaniu z konwencjonalnymi szklanymi szkiełkami nakrywkowymi dla optymalnego obrazowania
Olejek immersyjny do mikroskopii typu A	Fisher Scientific	12368B	wielu dostawców
70% izopropanolu w woda			wielu dostawców
Oprogramowanie ImageJ	National Institutes of Health (NIH)		bezpłatne oprogramowanie typu open source do pobrania online
nanocząstki tlenku metalu	dostarczone zespołowi badawczemu przez partnerów		nanocząstki tlenku glinu, krzemionki i tlenku ceru w zawiesinach wodnych. Ze względu na umowę o zachowaniu poufności między autorami a partnerami branżowymi, dalsze informacje o produkcie nie mogą być ujawniane.