Walidacja modelu mysiego w celu rozbicia kompleksów LINC w sposób specyficzny dla komórki

Summary

Białka otoczki jądrowej odgrywają kluczową rolę w wielu podstawowych procesach biologicznych i są związane z różnymi chorobami ludzkimi. Protokół ten opisuje nowy model myszy oparty na Cre/Lox, który pozwala na czasoprzestrzenną kontrolę zakłóceń kompleksów LINC.

Abstract

Migracja jądrowa i zakotwiczenie w rozwijających się i dorosłych tkankach opiera się głównie na dużych makromolekularnych zespołach białkowych zwanych LInkers kompleksów nukleoszkieletu i cytoszkieletu (LINC). Te rusztowania białkowe obejmują otoczkę jądrową i łączą wnętrze jądra ze składnikami otaczającego cytoszkieletu cytoplazmatycznego. Kompleksy LINC składają się z dwóch ewolucyjnie konserwatywnych rodzin białek, białek Sun i Nesprins, które zawierają C-końcowe motywy sygnatury molekularnej zwane odpowiednio domenami SUN i KASH. Białka słoneczne są białkami transbłonowymi wewnętrznej błony jądrowej, których N-końcowa domena nukleoplazmatyczna oddziałuje z blaszką jądrową, podczas gdy ich C-końcowe domeny SUN wystają w przestrzeń okołojądrową i oddziałują z domeną KASH Nesprins. Kanoniczne izoformy Nesprin mają N-koniec o zmiennej wielkości, który wystaje do cytoplazmy i oddziałuje ze składnikami cytoszkieletu. Protokół ten opisuje walidację strategii myszy transgenicznej dominująco-ujemnej, która zakłóca endogenne interakcje SUN / KASH w sposób specyficzny dla typu komórki. Nasze podejście opiera się na systemie Cre/Lox, który omija wiele wad, takich jak letalność okołoporodowa i nieautonomiczne fenotypy komórek, które są związane z modelami linii zarodkowej inaktywacji kompleksu LINC. Z tego powodu model ten stanowi użyteczne narzędzie do zrozumienia roli kompleksów LINC podczas rozwoju i homeostazy w szerokim zakresie tkanek.

Introduction

Otoczka jądrowa (NE) oddziela nukleoplazmę od cytoplazmy. Składa się z wewnętrznej i zewnętrznej błony jądrowej (odpowiednio INM i ONM), które łączą się w porach jądrowych. Światło wyznaczone przez obie błony nazywane jest przestrzenią okołojądrową (PNS). ONM jest przedłużeniem szorstkiej retikulum endoplazmatycznego (ER), a INM przylega do blaszki jądrowej, siatki jądrowych włókien pośrednich typu V reprezentowanych przez blaszki typu A i B ^1,2. Ogniwa kompleksów nukleoszkieletu i cytoszkieletu (LINC) to zespoły makromolekularne, które obejmują całą otoczkę jądrową, aby fizycznie połączyć wnętrze jądra z włóknami cytoszkieletu i silnikami molekularnymi (ryc. 1A). Składają się one z interakcji między ewolucyjnie zachowanymi motywami, które charakteryzują dwie rodziny integralnych białek transbłonowych NE: białka Słońca (Sad1/Unc84) i Nesprins (Nuclear Envelope SPectRINS). U ssaków Sun1 i Sun2 są transbłonowymi białkami INM, których N-końcowy region nukleoplazmatyczny oddziałuje bezpośrednio z laminami typu A i B ^3-5. Po drugiej stronie INM, w obrębie PNS, białka słoneczne zawierają ewolucyjnie konserwatywny odcinek ~150 C-końcowych aminokwasów zwanych domeną SUN. Domeny SUN oddziałują bezpośrednio z ewolucyjnie zachowaną domeną KASH (Klarsicht/Anc-1, Syne Homology), molekularną sygnaturą Nesprins. Domeny KASH składają się z odcinka ~ 30 C-końcowych aminokwasów, które wystają do PNS, a następnie domeny transbłonowej ⁶. Co najmniej cztery odrębne geny Nesprin (Nesprin1-4) kodują białka zawierające KASH, które lokalizują się w NE ⁷. Regiony cytoplazmatyczne Nesprins, których rozmiary wahają się od ~50 kDa (Nesprin4) do zdumiewających 1000 kDa (gigant Nesprin1), zawierają wiele powtórzeń spektryny, a także specyficzne motywy umożliwiające ich interakcję ze składnikami cytoszkieletu, takimi jak aktyna, pektyna i silniki molekularne^8-13.

Badania na kręgowcach i bezkręgowcach wykazały, że silniki Lamin/Sun/Nesprin/molekularne stanowią ewolucyjnie zachowaną "oś" kontrolującą migrację jądrową i zakotwiczenie. Opisano kilka mysich modeli knock-out (KO) składników kompleksu LINC, które odegrały zasadniczą rolę w zrozumieniu ról białek Sun i Nesprin w NE podczas rozwoju ssaków ^9,14,15. Modele te mają jednak kilka istotnych wad, przede wszystkim: 1) trudności w interpretacji fenotypów z powodu nieautonomicznych efektów komórkowych, 2) trudności w rozróżnieniu fenotypowych wkładów izoform Nesprin zawierających KAS i bezKASH¹⁶, 3) funkcjonalna redundancja białek Sun i Nesprin w NE w wielu typach komórek wymaga złożonych schematów hodowlanych w celu dezaktywacji wszystkich interakcji SUN-KASH u myszy ¹⁷ oraz 4) letalność okołoporodowa myszy z niedoborem domeny KAS zarówno Nesprins1, jak i 2 wyklucza analizę dorosłych fenotypów ¹⁸.

Ten protokół opisuje nowatorski model myszy, zaprojektowany do zakłócania wszystkich interakcji SUN-KASH in vivo, w sposób autonomiczny i regulowany rozwojowo, omijając w ten sposób wiele wad opisanych powyżej. Ten mysi model oparty na Cre/lox opiera się na dwóch ważnych koncepcjach: 1) domena KASH dowolnego znanego białka Nesprin jest wystarczająca do kierowania EGFP na NE w systemach hodowli komórkowych oraz 2) domeny SUN oddziałują promiskuitywnie z domenami KASH, więc nadekspresja dowolnej domeny KASH nasyci wszystkie endogenne domeny SUN i dezaktywuje kompleksy LINC w sposób dominująco-ujemny ¹⁷ (Figura 1B). Protokół ten opisuje etapy pobierania i przetwarzania tkanek stosowane w celu potwierdzenia zakłócenia wszystkich interakcji SUN-KASH w komórkach Purkinjego móżdżku.

Protocol

Oświadczenie etyczne: Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Waszyngtońskim w St. Louis.

1. Hodowla i genotypowanie myszy

1. Hoduj myszy Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) z myszami Tg (PCP2-Cre) w celu wytworzenia Tg (^PCP2CreCAG-EGFP / KASH2) ^19,20. Uwaga: Podczas gdy pozostała część tego protokołu koncentruje się na wykorzystaniu linii myszy Tg (PCP2-Cre) w celu ograniczenia ekspresji EGFP-KASH2 do komórek Purkinjego w móżdżku, podobną procedurę można zastosować w przypadku każdej innej myszy Tg (Cre) (Figura 2A).
2. Wykonaj genotypowanie w celu zidentyfikowania młodych posiadających zarówno transgeny EGFP, jak i Cre, jak opisano wcześniej ¹⁹.

2. Przygotowanie materiałów do sekcji i pobrania tkanek

1. Przygotować 100 ml 30% sacharozy w PBS (30 g sacharozy/100 ml 1x PBS) i przechowywać w temperaturze -20°C. W dniu pobrania tkanek rozmrozić i załadować ~30-35 ml roztworu sacharozy do strzykawki o pojemności 35 ml do perfuzji przezsercowych.
2. Przygotować 40 ml 4% PFA w PBS (10 ml 16% paraformaldehydu i 30 ml PBS). Załaduj ~30-35 ml 4% PFA do strzykawki o pojemności 35 ml do perfuzji przezsercowych.
3. Wypełnić 10-centymetrową płytkę do hodowli tkankowej 10 ml PBS w celu wypreparowania tkanki.
4. Przygotuj koktajl ketamina/ksylazyna składający się z 16 mg/ml ketaminy i 3 mg/ml ksylazyny.
5. Do rozbioru przygotuj roztwór 70% etanolu.

3. Sekcja i pobieranie tkanek

1. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml wstrzyknąć 500 μl koktajlu ketamina/ksylazyna na 25 gramów masy ciała i odczekać ~15 min. Alternatywnie można zastosować inną, zatwierdzoną przez instytucję metodę sedacji, która jest odpowiednia dla danego systemu biologicznego.
2. Po uspokojeniu delikatnie uszczypnij tylną łapę, aby potwierdzić brak reakcji na ból, przypnij wszystkie łapy do styropianowej tacki grzbietową stroną myszy skierowaną w dół.
3. Spryskaj brzuch 70% etanolem i wykonaj nacięcie od dolnej części brzucha do górnej części klatki piersiowej, aby uzyskać dostęp do serca.
4. Wykonaj małe nacięcie w prawym przedsionku serca i włóż strzykawkę zawierającą 30% roztwór sacharozy do lewej komory serca.
5. Roztworu należy ukrwić z szybkością ~2-5 ml na minutę. Po opróżnieniu wyjmij strzykawkę i powtórz czynność z 4% roztworem PFA.
6. Odepnij mysz od styropianowej tacki i odetnij głowę, aby uzyskać dostęp do mózgu.
7. Usuń skórę wokół głowy zwierzęcia za pomocą kleszczy i nożyczek. Zrób igłą otwór w tylnej części czaszki i ostrożnie usuń czaszkę nożyczkami i kleszczami preparacyjnymi.
8. Gdy mózg będzie wyraźnie dostępny, użyj kleszczy, aby usunąć móżdżek i umieścić go w PBS. Przeciąć móżdżek w płaszczyźnie strzałkowej na pół za pomocą skalpela i przenieść do 30% roztworu sacharozy przez noc w temperaturze 4°C. Uwaga: Aby przygotować skrawki parafiny, należy utrwalić móżdżek przez noc w temperaturze 4°C w 4% PFA przed zatopieniem tkanki i sekcją.

4. Przetwarzanie i cięcie tkanek

1. Przygotuj zawiesinę z suchego lodu i 2-metylobutanu. Pozwól, aby temperatura kąpieli wyrównała się przez 5 minut.
2. Napełnij kriomold związkiem OCT i umieść połowę przeciętego móżdżku w formie.
3. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego i kleszczy ustaw móżdżek tak, aby przecięta na pół powierzchnia (w pobliżu linii środkowej móżdżku) była skierowana do góry.
4. Przenieś kriomold do zawiesiny suchego lodu na 5 minut, aż związek OCT utworzy stałą białą matrycę wokół próbki tkanki. Uwaga: W razie potrzeby zamrożoną próbkę można teraz przechowywać w temperaturze -20°C.
5. Oznacz wstępnie obrobione szkiełka polilizynowe do pobierania skrawków tkanek i przygotuj kriostat zgodnie z instrukcjami producenta w celu pobrania 15 μm skrawków móżdżku. Aby zebrać sekcje, ostrożnie zetknij sekcję OCT ze stroną szkiełka pokrytą polilizyną. Aby zachować orientację sekcji, nie obracaj suwaka na tym etapie.
6. Skrawki tkanek należy przechowywać w temperaturze -20°C do czasu przystąpienia do barwienia i obrazowania.

5. Barwienie i obrazowanie skrawków móżdżku

1. Przed barwieniem tkanek należy przygotować następujące roztwory:
   ~50 ml PBS
   ~5-10 ml 4% PFA w PBS
   ~10-20 ml 0,5% Triton X-100, 10% surowicy osła w PBS
2. Rozmrozić odcinki móżdżku. Co ważne, zminimalizuj ich ekspozycję na jakiekolwiek źródło ciągłego i intensywnego światła, aby zapobiec blaknięciu EGFP.
3. Za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego narysuj prostokąt wokół odcinków tkanki.
4. Po utrwaleniu skrawków 4% PFA przez 5 minut. Użyj wystarczającej ilości płynu, aby pokryć cały obszar wyznaczony przez barierę hydrofobową (zwykle ~500 μl). Za pomocą odkurzacza lub pipety usuń utrwalacz, zwracając szczególną uwagę, aby nie naruszyć skrawków tkanki.
5. Za pomocą pipety delikatnie nałóż PBS na szkiełko, nie naruszając skrawków tkanki. Po 5 minutach użyj odkurzacza lub pipety, aby ostrożnie usunąć płyn. Powtórz płukanie PBS w sumie trzy razy.
6. Za pomocą pipety ostrożnie nanieść odpowiednie rozcieńczenie przeciwciał pierwszorzędowych (3 μl przeciwciała Calbindin i/lub Nesprin2 na 900 μl roztworu) w 0,5% Triton X-100, 10% surowicy osła w PBS. Inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.
   Uwaga: EGFP-KASH2 będzie widoczny pod bezpośrednią mikroskopią fluorescencyjną na zamrożonych skrawkach i nie jest konieczne stosowanie przeciwciała anty-EGFP. Jeśli jednak wycinki parafiny zostały przygotowane, obrazowanie EGFP-KASH2 wymaga immunodetekcji przeciwciałem anty-EGFP.
7. Usunąć roztwór przeciwciał i trzykrotnie spłukać PBS.
8. Przygotuj 1:1,000 rozcieńczeń przeciwciał drugorzędowych Alexa-Fluor w 0,5% Triton X-100, 10% surowicy osła w PBS i przechowuj w ciemności.
9. Delikatnie usuń ostatnie płukanie PBS i nałóż wtórne rozcieńczenie przeciwciał na godzinę w ciemności.
10. Usunąć wtórny roztwór przeciwciała, spłukać i umyć sekcję trzy razy. W razie potrzeby nałóż barwnik jądrowy, taki jak DAPI (~300nM), podczas pierwszej aplikacji PBS.
11. Całkowicie usuń roztwór PBS z okolic tkanki i umieść ~5-7 μl podłoża montażowego na wycinku tkanki. Umieść szklane szkiełko nakrywkowe na chusteczce i odstaw na ~15-30 min w temperaturze pokojowej w ciemności.
12. Użyć mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w odpowiednie filtry, aby uwidocznić EGFP i wszelkie inne długości fal odpowiednie dla przeciwciał drugorzędowych użytych w krokach 5.8/5.9. W wycinkach móżdżku użyj obiektywu 20X, aby zobaczyć obrzeża jądrowe EGFP-KASH2.

Results

Ten protokół ilustruje przydatność mysiego modelu Tg(CAG-LacZ/EGFP-KASH2) do ograniczenia ekspresji EGFP-KASH2 do komórek Purkinjego móżdżku przy użyciu myszy Tg(PCP2-Cre). U potomstwa Tg (^PCP2CreCAG-EGFP / KASH2) otwarta ramka odczytu LacZ / V5 jest wycinana w P6 przez rekombinazę Cre, co prowadzi do ekspresji EGFP-KASH2 specyficznie ukierunkowanej na komórki Purkinjego (Figura 2A). Zgodnie z oczekiwaniami, EGFP-KASH2 jest ukierunkowany na otoczkę jądrową, na co wskazuje EGFP-dodatni wzór pod...

Discussion

Najważniejszym krokiem do pomyślnego zbadania roli kompleksów LINC in vivo przy użyciu modelu Tg(CAG-LacZ/EGFP-KASH2) jest zidentyfikowanie odpowiedniej linii (linii) myszy Cre. Rzeczywiście, jeśli Cre jest aktywny w innych typach komórek zaangażowanych w podobne szlaki, może to skomplikować interpretację wyników. Dlatego ważne jest, aby zbadać pobliskie komórki, jak pokazano tutaj w warstwach komórek molekularnych i ziarnistych móżdżku (ryc. 2B). Podobnie, aby zmaksymalizować wszelkie fizjologi...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sacharoza	Sigma Aldrich	S0389
10x PBS	Gibco	14200-075
16% roztwór paraformaldehydu	Mikroskopia elektronowa Sciences	15710
OCT Compound	Tissue-Tek	4583
Szkiełka adhezyjne	StatLab	M1000W
Serum dla osła	Sigma Aldrich	D9663
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284
ImmuEdge Pen	Vector Laboratories	H-4000
Przeciwciało anty-kalbindynowe	Przeciwciało anty-EGFP Sigma Aldrich	C9848
Przeciwciało anty-EGFP	Abcam	ab13970
Przeciwciało			Wcześniej opisane w ref. 21
Montaż fluorescencyjny Media	Dako	S3023
2-metylobutan	Sigma Aldrich	O3551