Obrazowanie fluorescencyjne i bioluminescencyjne subkomórkowego Ca2+ w starzejących się neuronach hipokampa

Podsumowanie

Wewnątrzkomórkowa przebudowa Ca²⁺ w procesie starzenia się może przyczyniać się do ekscytotoksyczności i uszkodzenia neuronów, procesów, w których pośredniczy przeciążenie Ca²⁺. Naszym celem było zbadanie przebudowy Ca^{2 +} w starzejącym się mózgu za pomocą obrazowania fluorescencyjnego i bioluminescencyjnego cytozolowego i mitochondrialnego Ca^{2 +} w długoterminowych hodowlach neuronów hipokampa szczura, modelu starzenia się neuronów.

Streszczenie

Podatność na śmierć komórek neuronów związaną z neurodegeneracją i niedokrwieniem jest znacznie zwiększona w starzejącym się mózgu, ale mechanizmy odpowiedzialne za to są słabo znane. Ekscytotoksyczność, proces, który uważa się za przyczyniający się do uszkodzenia neuronów wywołanego przez oba uszkodzenia, jest pośredniczony przez aktywację receptorów glutaminianu, które promują napływ Ca^{2 +} i przeciążenie mitochondriów Ca^{2 +}. Znaczna zmiana wewnątrzkomórkowej homeostazy Ca^{2 +} lub przebudowa wewnątrzkomórkowej homeostazy Ca^{2 +} może sprzyjać uszkodzeniu neuronów w starych neuronach. Do zbadania przebudowy Ca^{2 +} w procesie starzenia się wykorzystaliśmy obrazowanie żywych komórek w długoterminowych hodowlach neuronów hipokampa szczura, które pod pewnymi względami przypominają starzejące się neurony in vivo. W tym celu komórki hipokampa są przede wszystkim świeżo rozproszone z hipokampów nowonarodzonych szczurów i posiane na szkiełkach nakrywkowych pokrytych poli-D-lizyną. Następnie kultury są trzymane w kontrolowanych pożywkach przez kilka dni lub kilka tygodni w celu zbadania odpowiednio młodych i starych neuronów. Po drugie, hodowane neurony są ładowane furą2 i poddawane pomiarom stężenia cytozolowego Ca^{2 +} za pomocą cyfrowego obrazowania współczynnika fluorescencji. Po trzecie, hodowane neurony są transfekowane plazmidami wyrażającymi tandem aequoryny i GFP o niskim powinowactwie skierowanych do mitochondriów. Po 24 godzinach aequorin wewnątrz komórek jest odtwarzany przez koelennterazinę, a neurony są poddawane obrazowaniu bioluminescencyjnemu w celu monitorowania stężenia mitochondrialnego Ca²⁺. Ta trzyetapowa procedura umożliwia monitorowanie cytozolowych i mitochondrialnych odpowiedzi Ca²⁺ na odpowiednie bodźce, takie jak na przykład agonista receptora glutaminianu NMDA, i porównanie, czy na te i inne odpowiedzi ma wpływ starzenie się. Procedura ta może dostarczyć nowych informacji na temat wpływu starzenia się na cytozolowe i mitochondrialne odpowiedzi Ca²⁺ na wybrane bodźce, a także przetestować wybrane leki mające na celu zapobieganie śmierci komórek neuronalnych w chorobach związanych z wiekiem.

Wprowadzenie

Ekscytotoksyczność jest jednym z najważniejszych mechanizmów przyczyniających się do uszkodzenia neuronów i śmierci komórek w neurologicznych urazach, takich jak niedokrwienie, oraz w niektórych chorobach neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera ¹. W tym typie neurotoksyczności pośredniczy głównie glutaminian działający na przepuszczalne dla^Ca2+, jonotropowe receptory NMDA (NMDAR) ². Narażenie hodowanych neuronów na glutaminian może prowadzić do ekscytotoksyczności ³, która powoduje apoptozę neuronów ⁴. My i inni wcześniej informowaliśmy, że podatność neuronów na apoptozę wywołaną przez NMDA może się zmieniać wraz z rozwojem in vitro i starzeniem się ^5-8.

Powszechnie przyjmuje się, że wzrost stężenia Ca²⁺ wolnego od cytozolu ([Ca²⁺]_cyt) prowadzi do aktywacji komórek. Jeśli jednak wzrost ten jest zbyt wysoki i/lub wystarczająco trwały, może wywołać śmierć komórki ⁹. Co więcej, zaproponowano, że ekscytotoksyczność wymaga mitochondrialnego wychwytu Ca^{2 + 10}, ponieważ traktowanie neuronów mitochondrialnym rozprzęgaczem chroniło neurony przed śmiercią komórki wywołaną glutaminianem ¹¹. Jeśli mitochondria pobierają zbyt dużo Ca²⁺, może dojść do otwarcia porów przejściowych przepuszczalności mitochondriów, co prowadzi do uwolnienia cytochromu c i innych czynników proapoptotycznych oraz indukowania apoptozy. Niedawno wykazaliśmy, że ten mitochondrialny wychwyt Ca^{2 +} jest bezpośrednio związany z zależną od wieku podatnością na ekscytotoksyczność, poprzez bezpośredni pomiar indukowanego przez NMDA mitochondrialnego wychwytu Ca^{2 +} w pojedynczych neuronach hipokampa ⁵, metoda, która została opisana w tym artykule. Hipokamp, zaangażowany w procesy fizjologiczne, takie jak uczenie się, pamięć i inne procesy ^poznawcze12, jest bardzo podatny na starzenie się i zaburzenia neurodegeneracyjne13. Zaproponowano, że po kilku tygodniach in vitro wyhodowane neurony hipokampa wykazują szereg typowych cech starzejących się neuronów ¹⁴. W związku z tym długoterminowe hodowle neuronów hipokampa mogą stanowić kompleksowy model do badania mechanizmów zwiększonej ekscytotoksyczności w procesie starzenia się, w których pośredniczy Ca^{2 +}.

Ogólnym celem przedstawionej metody jest zatem zbadanie istotnych zmian w wewnątrzkomórkowej homeostazie Ca²⁺ lub przebudowie Ca²⁺ w starzejącym się mózgu, w tym zróżnicowanych odpowiedzi Ca²⁺ wywołanych przez agonistów receptora NMDA w długotrwale hodowanych neuronach hipokampa. Metoda obejmuje szczegółowy opis hodowli neuronów hipokampa szczura oraz monitorowanie stężeń cytozolowego i mitochondrialnego Ca²⁺ za pomocą obrazowania fluorescencyjnego i bioluminescencyjnego odpowiednio w poszczególnych neuronach. Obrazowanie fluorescencyjne cytozolowego Ca^{2 +} w hodowanych neuronach jest standardową procedurą. Jednak ta metoda jest mniej wiarygodna w przypadku subkomórkowych pomiarów Ca^{2 +}, w tym mitochondrialnego Ca^{2 +}. Powodem tego jest brak odpowiedniego ukierunkowania sond syntetycznych i niewłaściwe powinowactwo do stężeń Ca²⁺, które mogą zmieniać się w mitochondriach od niskiego poziomu μM nawet do poziomu mM. Zastosowanie sond Ca^{2 +} opartych na białkach, takich jak na przykład aequoryna, umożliwiło ukierunkowanie na organelle subkomórkowe i zastosowanie pochodnych o różnym powinowactwie do Ca^{2 +} przy użyciu różnych koelentrazyn lub zmutowanych sond pozbawionych specyficznych miejsc wiązania Ca^{2 + 15}. W ten sposób obrazowanie bioluminescencyjne komórek eksprymujących aequorynę ukierunkowaną na mitochondria może pozwolić na monitorowanie mitochondrialnych stężeń Ca²⁺ w poszczególnych neuronach. Jednak procedura ta może wymagać użycia kamer zliczających fotony lub ultraczułych kamer CCD do obrazowania bioluminescencyjnego ^16-18. Metoda ta może przynieść nowe wyniki, które powinny zostać potwierdzone w bardziej ugruntowanych modelach starzenia się mózgu, takich jak na przykład wycinki mózgu starych zwierząt.

Protokół

Oświadczenie w sprawie etyki: Procedury z udziałem zwierząt są przeprowadzane zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez ośrodek utrzymania zwierząt Uniwersytetu w Valladolid zgodnie z Konwencją Europejską 123/Rady Europy i Dyrektywą 86/609/EWG.

1. Krótko- i długoterminowa hodowla neuronów hipokampa u szczurów

1. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych z poli-D-lizyny o grubości 12 mm.
   1. Sterylizuj szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm w etanolu przez co najmniej 24 godziny. Pozostaw do wyschnięcia w sterylnych warunkach.
   2. Rozprowadzić szkiełka nakrywkowe na pasku parafilmu na szalce Petriego. Pokryć powierzchnię każdego szkiełka nakrywkowego 200 μl poli-D-lizyny o stężeniu 1 mg/ml. Zezwól na leczenie O/N.
   3. Następnego dnia myj szkiełka nakrywkowe podwójnie destylowaną sterylną wodą co 15 minut przez 90 minut w sterylnych warunkach.
   4. Napełnij czterodołkową płytkę wielotalerzową 500 μl pożywki do hodowli neuropodstawowej na studzienkę. Pożywkę Neurobasal Culture Breeding należy uzupełnić o 10% płodową surowicę bydlęcą, 2% witaminy B27, 1 μg/ml gentamycyny i 2 mM L-glutaminy.
   5. Umieść szkiełka nakrywkowe w talerzu wielotalerzowym. Trzymaj je w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 ºC i 5% CO_{2 do} czasu użycia.
2. Izolacja neuronów hipokampa od nowonarodzonych szczurów.
   1. Przygotować 1,8 ml roztworu papainy (zakupionego bezpośrednio) w fiolce (20 μl/ml) w sterylnych warunkach: Aby uzyskać końcowe stężenie 20 μl/ml dodać około 40 μl papainy do 1,8 ml Hank's plus 0,6% BSA (μl należy obliczyć w zależności od warunków dostawcy). Hank's 0,6% BSA przygotowuje się przez zmieszanie 85 ml pożywki HBSS z 15 ml 4% albuminy surowicy bydlęcej (BSA, przygotowane roztwory 4 g BSA w 100 ml HBSS). Przygotuj go w sterylnym kapturze.
   2. Przed użyciem inkubować papainę w Hank's plus 0,6% BSA przez 30 minut w temperaturze 37 ºC. Przed użyciem przefiltrować roztwór za pomocą filtra 0,22 μm.
   3. Przygotuj pożywkę F-12 firmy Ham, dodając Dulbecco's Modified Eagle's Medium w proszku (13,5 g na litr) w 900 ml podwójnie destylowanej sterylnej wody. Następnie dodać 6 g HEPES i 336 mg_NaHCO3 i dostosować pH do 7,42 za pomocą NaOH 4 N. Dodać sterylną wodę w celu uzyskania 1 l roztworu i przefiltrować ją za pomocą filtra górnego do butelki z polieterosulfonu (PES) o stężeniu 0,20 μm. Przeprowadź ten proces w sterylnym kapturze. Na koniec nasycić roztwór CO₂ w sterylnych warunkach przed użyciem. Roztwory należy przechowywać w temperaturze 4 °C i używać w stanie schłodzonym.
   4. Eutanazja nowonarodzonych (P0) szczeniąt szczurów przez dekapitację i umycie głowy w sterylnym pożywce HBS. Otwórz czaszkę za pomocą sterylnych nożyczek. Wyjmij mózg szpatułką i szybko umyj go w pożywce F-12 Hama.
   5. Wykonaj ukośne cięcie za pomocą skalpela w każdej półkuli (ryc. 1B) i przenieś je na szalkę Petriego zawierającą pożywkę F-12 szynki.
   6. Opony mózgowe należy ostrożnie wyrzucić za pomocą kleszczy preparacyjnych i pod szkłem powiększającym.
   7. Zidentyfikuj hipokamp w charakterystycznym wklęsłym miejscu nad korą za pomocą szkła powiększającego. Następnie oddziel hipokamp od kory, ostrożnie pociągając za jedną granicę i usuwając ją z pozycji za pomocą nożyczek do oczu.
   8. Przenieś tkankę hipokampa na 4-dołkową płytkę wypełnioną sterylnym podłożem Hanka, w którym brakuje Ca²⁺ i Mg²⁺ plus 0,6% BSA i umyj tkankę hipokampa. Nie usuwając podłoża, pokrój tkankę na małe kawałki (około 2 x 2 mm) za pomocą tych samych nożyczek do oczu.
   9. Przenieść kawałki hipokampa do fiolki zawierającej 1,8 ml wstępnie przefiltrowanego roztworu papainy. Następnie inkubować je w temperaturze 37 °C, od czasu do czasu delikatnie wstrząsając. 15 minut później dodać 90 μl roztworu DNazy I (50 μg/ml final) i inkubować przez dodatkowe 15 minut.
   10. Przenieść tkankę do probówki wirówkowej o pojemności 10 ml i przepłukać fragmenty świeżą pożywką do hodowli neuropodstawowych. Zawiesinę komórek uzyskuje się, przepuszczając fragmenty tkanek przez plastikową pipetę o pojemności 5 ml.
   11. Odwirować zawiesinę komórek w dawce 160 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant za pomocą sterylnej pipety Pasteura z tworzywa sztucznego i ostrożnie zawiesić osad za pomocą automatycznej pipety o pojemności 1 ml w 1 ml pożywki do hodowli neuropodstawowej.
   12. Zmierz gęstość komórek za pomocą komory liczącej Neubauera. Umieść szklane szkiełko nakrywkowe na komorze Neubauera. Dodać 10 μl zawiesiny komórkowej. Upewnij się, że zawiesina komórek dostaje się do komory równomiernie i nie tworzy pęcherzyków. Policz liczbę komórek pod mikroskopem i wykonaj odpowiednie obliczenia, aby uzyskać odpowiednią kroplę 40-80 μl zawierającą 30 x 10³ komórek. Całkowita liczba komórek będzie zależeć od liczby wykorzystanych zwierząt.
3. Krótko- i długoterminowa hodowla neuronów hipokampa szczura.
   1. Na czterodołkowej płytce wielotalerzowej zawierającej 500 μl przygotowanej wcześniej pożywki do hodowli neurobazalnej i przechowywanej w inkubatorze, rozłożyć około 3 komórki o wymiarach około 30 x 10³ komórki w kropli około 50 μl do każdego dołka płytki wielodyszowej zawierającej jedno szkiełko nakrywkowe o średnicy 12 mm pokryte poli-D-lizyną.
   2. Utrzymuj pierwotne komórki hipokampa w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 ºC i 5% CO₂ przez 2-5 dni in vitro (DIV, krótkoterminowe, młode kultury) lub >15 DIV (długoterminowe, dojrzałe kultury) przed eksperymentami bez zmiany pożywki hodowlanej.

2. Obrazowanie fluorescencyjne stężenia cytozolowego Ca ²⁺

1. Przygotowanie roztworów testowych do obrazowania fluorescencyjnego.
   1. Przygotować zewnętrzny roztwór soli fizjologicznej buforowany przez HEPS (HBS) zawierający w mM: NaCl 145, KCl 5, MgCl₂ 1, CaCl₂ 1, glukozę 10, sód-HEPES 10 (pH 7,42).
   2. Przygotować zewnętrzny, wolny od Mg²⁺, buforowany przez HEPS roztwór soli fizjologicznej (HBS) zawierający w mM: NaCl 146, KCl 5, CaCl₂ 1, glukozę 10 i HEPES 10 (pH 7,42).
   3. Rozpuścić NMDA w roztworze soli fizjologicznej (HBS) wolnym od Mg²⁺, buforowanym przez HEPS o końcowym stężeniu 100 μM i uzupełnić go 10 μM glicyną.
   4. Przygotować roztwór HBS zawierający KCl zamiast NaCl przez rozpuszczenie (w mM): KCl 145, MgCl₂ 1, CaCl₂ 1, glukozy 10 i HEPES 10 (pH 7,42).
2. Ładowanie komórek hipokampa fluorescencyjną sondą wapniową fura2/AM.
   1. Z inkubatora należy zdjąć hodowlę komórkową zawierającą szkiełka nakrywkowe i przemyć je pożywką HBS w temperaturze pokojowej, przenosząc je na nową czterodołkową płytkę wielotalerzową zawierającą 500 μl HBS na dołek.
   2. Inkubować komórki z fura2/AM 4 μM (przygotowanym w tej samej pożywce HBS) przez 60 minut w temperaturze pokojowej (25 °C) w ciemnym miejscu.
   3. Po 60 minutach zmyć szkiełka nakrywkowe świeżym podłożem HBS.
3. Rejestrowanie obrazów fluorescencyjnych cytozolu [Ca ²⁺ ] w hodowanych komórkach.
   1. Włącz lampę, mikroskop, system perfuzyjny, kamerę fluorescencyjną i komputer.
   2. Umieść szkiełka nakrywkowe w termostatyzowanej platformie dla otwartych szkiełek nakrywkowych o średnicy 12 mm na stoliku mikroskopu odwróconego i wybierz pole mikroskopowe za pomocą obiektywu 40X (olej, NA:1.3). Perfuzjować komórki w sposób ciągły za pomocą wstępnie ogrzanej (37 °C) pożywki HBS przy braku lub w obecności substancji badanych. Utrzymuj przepływ z szybkością około 5-10 ml/min.
      Uwaga: System perfuzji komórek dla żywych komórek jest zamontowany na platformie termostatycznej dla otwartych szkiełek nakrywkowych o grubości 12 mm. Do perfuzji roztworów służy 8-liniowy grawitacyjny system perfuzyjny wyposażony w sterownik zaworu. Pompa próżniowa jest odpowiedzialna za usuwanie nadmiaru medium. Roztwory są podgrzewane za pomocą systemu grzewczego w rurze.
   3. Przechwyć obraz tła z zamkniętą migawką na obu długościach fal wzbudzenia.
   4. Epi-illuminate komórki na przemian przy 340 i 380 nm. Rejestruj światło emitowane o długości fali 520 nm co 5-10 sekund za pomocą kamery fluorescencyjnej, która jest filtrowana przez zwierciadło dichroiczne fura-2.
   5. Po zakończeniu okresu nagrywania zapisz w komputerze całą sekwencję obrazów emitowanych przy długości fali 520 nm w celu dalszej analizy.
4. Analiza zarejestrowanych obrazów fluorescencyjnych.
   1. Otwórz plik eksperymentu. Korzystając z oprogramowania aquacosmos, kliknij "Stosunek" i wybierz żądany zakres proporcji. Oblicz stosunek piksel po pikselu na wynikowych obrazach, aby uzyskać sekwencję obrazów o proporcjach.
   2. Odejmij tło, dostosowując "eliminację tła". Naciśnij "rozpocznij obliczenia".
   3. Naciśnij przycisk "cała sekwencja czasu" i usuń starożytne obszary zainteresowania (ROI). W celu analizy ilościowej poszczególnych komórek ustal nowe obszary zainteresowania lub ROI odpowiadające poszczególnym neuronom. Uśrednij wszystkie wartości współczynnika w każdym pikselu odpowiadające każdemu ROI i każdemu obrazowi, aby uzyskać zapis wartości fluorescencji proporcji dla poszczególnych ROI (komórek).
   4. Aby wyświetlić wykres poszczególnych nagrań, wyeksportuj wartości fluorescencji współczynnika odpowiadające każdemu ROI do programu do tworzenia wykresów.
   5. Wykonaj odpowiednie obliczenia w celu oszacowania wielkości wzrostu współczynnika fluorescencji w odpowiedzi na każdą stymulację, korzystając z odpowiedniego oprogramowania do analizy danych i tworzenia wykresów.

3. Obrazowanie bioluminescencyjne stężenia mitochondrialnego Ca ²⁺

1. Transfekcja hodowanych neuronów hipokampa plazmidem mitGAmut.
   UWAGA: Komórki są najpierw transfekowane plazmidem mitGAmut zawierającym sekwencję ukierunkowaną na mitochondria i zmutowaną aequorynę pozbawioną miejsca wiązania Ca^{2 +} połączonego z białkiem zielonej fluorescencji (GFP). Taka konstrukcja wykrywa duże wzrosty mitochondrialnego wychwytu^Ca2+ i umożliwia identyfikację transfekowanych komórek za pomocą fluorescencji GFP. Plazmid został opracowany i udostępniony dzięki uprzejmości P. Brûleta i współpracowników ¹⁸ (CNRS, Paryż).
   1. Przygotuj Neurobasal TF, zawierający pożywkę Neurobasal Culture Software, bez płodowej surowicy bydlęcej, witaminy B27, gentamycyny i 2 mM L-glutaminy.
   2. Przygotować 50 μl Neurobasel TF plus 2,5 μl odczynnika do transfekcji w fiolce (roztwór A). Przygotować 50 μl Neurobaseal TF plus 4 μg plazmidu mitGAmut w fiolce (roztwór B). Dodać delikatnie roztwór B na roztwór A. Pozostawić na mieszanie przez 20 minut, bez wstrząsania.
   3. Przenieś szkiełka nakrywkowe zawierające neurony hipokampa na nowe płytki wielotalerzowe zawierające 200 μl świeżego TF neurobazalnego.
   4. Dodawać kropla po kropli 100 μl roztworu A + B na każde szkiełko nakrywkowe. Inkubować przez 30 minut. Usuń nośnik. Umyj raz komórki świeżym Neurobasem TF. Umieść szkiełka nakrywkowe z powrotem w oryginalnym pożywce do hodowli neuropodstawowych.
   5. Hodowla neuronów przez dodatkowe 24 godziny w temperaturze 37 ºC i 5% CO₂ po transfekcji, aby umożliwić efektywną ekspresję i celowanie sondy.
2. Przygotowanie roztworów testowych do obrazowania bioluminescencyjnego.
   1. Przygotować roztwory HBS zawierające NMDA 100 μM lub 145 mM KCl, jak powyżej (krok 2.1). Przygotować roztwór HBS zawierający 10 mM^Ca2+ plus digitoninę 100 μM.
3. Rekonstytucja aequoriny ukierunkowanej na mitochondria za pomocą koelenterazyny n.
   1. Przenieść szkiełka nakrywkowe zawierające transfekowane neurony hipokampa na czterodołkową płytkę zawierającą 200 μl HBS.
   2. Dodać 4 μl celetoksyny n (200 μM) do 200 μl HBS w celu uzyskania końcowego stężenia 4 μM i delikatnie wymieszać. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej (25 °C) i w ciemności.
4. Rejestrowanie obrazów bioluminescencyjnych mitochondriów [Ca ²⁺ ].
   1. Włącz mikroskop, lampę, system perfuzyjny, kamerę bioluminescencyjną i komputer.
   2. Odtworzone szkiełka nakrywkowe przenieść do termostatyzowanej (37 °C) komory perfuzyjnej i wysysać w sposób ciągły z wstępnie podgrzanym roztworem HBS z szybkością 5-10 ml/min.
   3. Używając obiektywu 40X (olej, NA: 1.3), wybierz mikroskopijne pole zawierające komórki wyrażające apoaequoryny, jak pokazano przez emisję fluorescencji związaną z ekspresją białka zielonej fluorescencji (GFP) przy użyciu filtrów FITC. Typowe pole może zawierać 1-2 transfekowane komórki. Przechwyć obraz fluorescencyjny GFP za pomocą kamery CCD.
   4. Wyłącz światło mikroskopu. Usunąć pudełko zawierające dichroik znajdujące się na ścieżce światła. Wyłącz światło wzbudzenia i zamknij ciemne pudełko, aby uzyskać całkowitą ciemność.
   5. Perfuzja komórek przy 5-10 ml/min z pożywką HBS z roztworami testowymi lub bez, wstępnie podgrzanymi w temperaturze 37 °C.
   6. Rejestruj obrazy emisji fotonicznej co 10 sekund za pomocą kamery zliczającej fotony obsługiwanej przez procesor obrazu.
   7. Pod koniec każdego eksperymentu przeniknij komórki za pomocą 0,1 mM digitoniny w 10 mM CaCl₂ w HBS, aby uwolnić wszystkie pozostałe emisje fotoniczne.
      Uwaga: Te emisje fotoniczne muszą być zsumowane w celu oszacowania całkowitej emisji fotonicznej, wartości wymaganej do kalibracji w stężeniach^Ca2+.
   8. Przechowuj obrazy bioluminescencji w komputerze z obrazem fluorescencji związanym z GFP zarejestrowanym przed obrazowaniem zliczającym fotony.
5. Analiza obrazów bioluminescencyjnych odzwierciedlających mitochondria [Ca ²⁺ ].
   1. Ilościowe określanie emisji fotonicznych za pomocą specjalnego oprogramowania. Emisje fotoniczne mogą być przekształcane w mitochondrialne stężenie wolnego Ca²⁺ ([Ca²⁺]_mit) przy użyciu algorytmu opisanego przez Brini i wsp. ¹⁵.
   2. Otwórz eksperyment i obraz fluorescencji GFP. Wybierz obszary zainteresowania (ROI) za pomocą specjalnego oprogramowania, rysując kształt transfekowanych komórek zgodnie z obrazami fluorescencyjnymi uchwyconymi na początku eksperymentu.
   3. Wklej te same ROI na każdym obrazie. Całkowite emisje fotoniczne w każdym ROI są obliczane za pomocą specjalnego oprogramowania w celu uzyskania wartości emisji luminescencji (L) dla każdego ogniwa w każdym momencie.
   4. Zsumuj wszystkie emisje fotoniczne na obrazach bioluminescencyjnych, w tym te uzyskane po przepuszczalności digitoniny, za pomocą specjalnego oprogramowania, aby uzyskać obraz bioluminescencyjny zawierający wszystkie emisje fotoniczne.
   5. Eksport wartości emisji fotonicznych dla każdego regionu zainteresowania do określonego oprogramowania w celu obliczeń. Aby to zrobić, kliknij "Wykres", aby obliczyć wartości bioluminescencji dla każdego zwrotu z inwestycji za każdym razem. Wybierz "wartość całkowita" i "użyj bieżącego zwrotu z inwestycji do wszystkich obrazów". Naciśnij "oblicz". Zapisz plik "txt.file" i wyeksportuj dane do arkusza. Dla każdego zwrotu z inwestycji [Ca²⁺]_mit oblicza się przy użyciu następującego algorytmu:
      
      [Ca²⁺](M) = [R + (R · K_TR) - 1] / [K_R - (R · K_R)];
      
      gdzie,
      R = [L/(L_całkowityλ)]^1/n
      L to luminescencja emitowana w czasie pomiaru w każdym obszarze zainteresowania.
      L_całkowita jest całkowitą luminescencją pozostałą po dodaniu zliczeń obecnych w tkance w tym czasie w czasie pomiaru dla każdego obszaru będącego przedmiotem zainteresowania. λ, K,_TR, K,_R i n są stałymi, których wartości zależą od kombinacji użytej ekworyny (typu dzikiego lub zmutowanego) i koelentrazyny (typu dzikiego lub typu n), a także temperatury zapisu ¹⁶. Dla zastosowanej tutaj kombinacji (zmutowany AEQ i koelenterzyna n), w temperaturze 37 ºC, przyjęliśmy następujące wartości: K_R = 8,47 x 10⁷, K_TR = 165,6 x 10³, n = 1,204 i λ = 0,138.
6. Wykonaj odpowiednie obliczenia, aby oszacować wielkość wzrostu bioluminescencji w odpowiedzi na każdy bodziec, korzystając z odpowiedniego oprogramowania do analizy danych i tworzenia wykresów.

Wyniki

Tutaj opisujemy prostą metodę oceny przebudowy Ca²⁺ i wpływu NMDA na cytozolowe i mitochondrialne [Ca²⁺] w starzejących się neuronach. Rycina 1 przedstawia schemat procedury izolowania i hodowli neuronów hipokampa od nowonarodzonych szczurów. Przed rozpoczęciem musimy przygotować sterylne, pokryte poli-D-lizyną, szklane szkiełka nakrywkowe i umieścić je w naczyniu 4-dołkowym. Następnie nowonarodzone szczury są zabijane, a mózg usuwany. Po wyizolowaniu hipokampa tkanka jest ostrożnie...

Dyskusja

Przebudowa wewnątrzkomórkowej homeostazy Ca^{2 +} w starzejącym się mózgu wiąże się z utratą funkcji poznawczych, zwiększoną podatnością na uszkodzenia niedokrwienne, ekscytotoksycznością i neurodegeneracją. Aby zbadać tę hipotezę in vitro, dostępne są procedury obrazowania^Ca2+ . Niestety, żywotne kultury starych neuronów hipokampa nie są wiarygodne. Ostatnio zaobserwowano, że długoterminowe hodowle neuronów hipokampa szczurów wykazują wiele typowych cech starzenia się in vivo , w tym...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pożywka do hodowli neuropodstawowej	Gibco	21103-049
Pożywka HBSS	Gibco	14170-088
Pożywka F-12 szynki	Gibco	31330-038
DNaza I (z trzustki bydlęcej)	Sigma	D5025-15KU
Surowica bobinowa płodu	Lonza	DE14-801E
B27	Gibco	17504-044
Gentamycyna	Gibco	15750
L-glutamina	Gibco	25030-032
Szkiełka nakrywkowe 12 mm	Labolan	0111520/20012
Papaina	Worthington	LS003127
4-dołkowe blaszki wielodaniowe	Nunc	176740
Szalki Petry'ego	JD Catalan s.l.	2120044T
Sterylne pipety	Fisher Scientific	431030
Fura2-AM	Life Technologies	F1201
Lipofectamine2000	Invitrogen	11668-027
Coelenterazine n	Biotium	BT-10115-2250 uG
Digitonina	Sigma	D5628
NMDA	Sigma	M3262
Glycine	Sigma	50046
Mikroskop telewizyjny Zeiss Axiovert S100 Carl	Zeiss Inc.
System oświetlenia Xcite	Kamera
ORCA ER	Hamamatsu
VIM zliczanie fotonów Kamera CCD	Hamamatsu
VC-8	System grzewczy Warner Instruments
SH-27B	Warner Instruments
Oprogramowanie Aquacosmos	Hamamatsu Photonics