Eksperymentalne strategie wypełniania dużych luk tkankowych w uszkodzonym rdzeniu kręgowym po ostrym i przewlekłym uszkodzeniu

Podsumowanie

Poważne urazy rdzenia kręgowego często skutkują wadami tkanek. Opisano dwie możliwości skutecznego wypełnienia takich luk w celu promowania adaptacji tkanek, reakcji regeneracyjnych i poprawy funkcjonalnej u szczurów poprzez wszczepienie mechanicznego systemu mikrołączników po ostrym urazie i pięć tygodni po całkowitym przecięciu rdzenia kręgowego.

Streszczenie

Po urazie rdzenia kręgowego (SCI) w rdzeniu uszkodzenia tworzy się blizna, która utrudnia regenerację aksonów. Wypełnienie miejsca urazu po uszkodzeniu rdzenia kręgowego, resekcjach guza lub ubytkach tkanek wynikających z urazów może pomóc w ułatwieniu ogólnej naprawy tkanek, a także regeneracyjnego wzrostu włókien nerwowych do i poza dotkniętym obszarem. Przedstawiono dwie eksperymentalne strategie leczenia: (1) wszczepienie nowatorskiego urządzenia z mikrołącznikiem do rdzenia kręgowego szczura z ostrym i całkowicie przeciętym odcinkiem klatki piersiowej w celu readaptacji przerwanych kikutów tkanki rdzenia kręgowego oraz (2) wypełnienie glikolem polietylenowym miejsca SCI u szczurów z przewlekłymi zmianami po resekcji blizny. Przewlekła zmiana rdzenia kręgowego w tym modelu to całkowite przecięcie rdzenia kręgowego, które zostało wykonane 5 tygodni przed leczeniem. Obie metody przyniosły ostatnio bardzo obiecujące wyniki i przyczyniły się do odrastania aksonów, korzystnej inwazji komórkowej i poprawy funkcjonalnej w modelach uszkodzenia rdzenia kręgowego u gryzoni.

Mechaniczny system mikrozłączy (mMS) to wielokanałowy system składający się z polimetakrylanu metylu (PMMA) z systemem rurek wylotowych do wywierania podciśnienia na światło mMS, wciągając w ten sposób kikuty rdzenia kręgowego do otworów o strukturze plastra miodu. Po zagnieżdżeniu się w szczelinie tkankowej o średnicy 1 mm tkanka jest zasysana do urządzenia. Ponadto wewnętrzne ścianki mMS są mikrostrukturalne dla lepszej przyczepności tkanek.

W przypadku przewlekłego uszkodzenia rdzenia kręgowego, tkanka rdzenia kręgowego - w tym obszar zmiany wypełnionej blizną - jest wycinana na obszarze o długości 4 mm. Po mikrochirurgicznej resekcji blizny powstały ubytek wypełnia się glikolem polietylenowym (PEG 600), który okazał się stanowić doskonałe podłoże do inwazji komórkowej, rewaskularyzacji, regeneracji aksonów, a nawet kompaktowej remielinizacji in vivo.

Wprowadzenie

Urazowe uszkodzenie rdzenia kręgowego nie tylko prowadzi do utraty aksonów, ale także do wad tkanek, które utrudniają jakiekolwiek reakcje regeneracyjne (zobacz ^1,2). Tkanka rdzenia kręgowego jest często tracona w wyniku wtórnego zwyrodnienia, co prowadzi do powstawania torbieli lub w obszarze zmiany i wokół niej. Większość eksperymentalnych interwencji terapeutycznych koncentruje się na niekompletnych uszkodzeniach rdzenia kręgowego, takich jak częściowe przecięcie, zmiażdżenie lub stłuczenie z pozostałą krawędzią zdrowej tkanki. W przypadku całkowitych urazów, takich jak całkowite przecięcia w wyniku urazów lub interwencji chirurgicznych, takich jak resekcja guza, dostępne są obecnie tylko bardzo ograniczone możliwości leczenia^3,4. Po całkowitym przecięciu mechaniczne napięcie tkanki powoduje retrakcję kikuta kręgowego, pozostawiając niewielką szczelinę w rdzeniu kręgowym. Większość strategii koncentruje się na wypełnieniu tej luki tkankami, komórkami lub matrycami^5,6.

Tutaj prezentowana jest inna strategia, a mianowicie readaptacja oddzielonych pni za pomocą nowatorskiego urządzenia z mikrozłączem⁷. Aby ponownie przystosować dwa pniaki, należy przyłożyć siłę mechaniczną w postaci lekkiego podciśnienia, aby to osiągnąć (rysunek 1). Mechaniczny system mikrozłączy (mMS) to wielokanałowy system z polimetakrylanu metylu (PMMA) z otworami w kształcie plastra miodu (rysunek 1A) i wyposażony w system rurek wylotowych. Wszczepia się go w szczelinę tkankową powstałą w wyniku całkowitego przecięcia rdzenia kręgowego u szczura (ryc. 1C). Jedną rurkę można podłączyć do pompy próżniowej, aby wytworzyć podciśnienie w mMS (rysunek 1D). Ciśnienie wciąga odłączone kikuty rdzenia kręgowego do otworów w kształcie plastra miodu w mMS, które mają mikrostrukturalne ścianki, które utrzymują tkankę na miejscu po zwolnieniu ciśnienia (ryc. 1B). Rurkę można pozostawić nienaruszoną po operacji i podłączyć do minipompy osmotycznej w celu wprowadzenia substancji do rdzenia zmiany chorobowej (ryc. 1E-F).

Oprócz ostrego przecięcia rdzenia kręgowego, inny rodzaj całkowitej zmiany wynika z chirurgicznego usunięcia guza kręgosłupa lub solidnej blizny po przewlekłej zmianie, co prowadzi do dużych luk tkankowych o długości kilku milimetrów, które jak dotąd nie mogą być pokonane przez mMS. Większość pacjentów z urazami rdzenia kręgowego cierpi z powodu przewlekłych urazów. U tych pacjentów w pełni rozwinięta blizna zajmuje rdzeń zmiany. Chirurgiczne usunięcie blizny po zmianie chorobowej jest koncepcją leczenia, która jest obecnie badana po eksperymentalnym SCI^8,9. Podczas gdy sam zabieg resekcji może być wykonany bez powodowania znacznych dodatkowych uszkodzeń, powstała luka tkankowa musi zostać zmostkowana za pomocą odpowiedniej matrycy, która umożliwia i wspomaga regenerację tkanki oraz, w szczególnym przypadku urazów rdzenia kręgowego, regenerację włókien nerwowych w celu utrzymania i promowania funkcji lokomotorycznych. Stwierdzono, że niskocząsteczkowy glikol polietylenowy (PEG 600) jest bardzo odpowiednim materiałem do tego celu. Jego brak immunogenności i bardzo niska lepkość pozwalają na płynną integrację z otaczającą tkanką. Wprowadzenie samego biopolimeru sprzyja inwazji korzystnych komórek, w tym komórek śródbłonka, obwodowych komórek Schwanna i astrocytów oraz - co bardzo ważne - regeneracji i wydłużeniu aksonów zstępujących i wstępujących dróg włóknistych, a także ich pokryciu zwartą mieliną⁸. Stwierdzono, że tym reakcjom regeneracyjnym towarzyszy długotrwała poprawa funkcjonalna. Połączenie resekcji tkanki bliznowatej z późniejszą implantacją PEG 600 stanowi bezpieczny i prosty, a jednocześnie bardzo skuteczny sposób na zniwelowanie znacznych ubytków tkanki rdzenia kręgowego.

Protokół

Przestrzegano wytycznych instytucjonalnych dotyczących bezpieczeństwa i komfortu zwierząt, a wszystkie interwencje chirurgiczne oraz opieka nad zwierzętami przed i po operacji były prowadzone zgodnie z niemiecką ustawą o ochronie zwierząt (Krajowy Urząd ds. Ochrony Środowiska i Konsumentów Nadrenii Północnej-Westfalii, LANUV NRW).

1. Całkowite przecięcie rdzenia kręgowego klatki piersiowej samic szczura rasy Wistar (220 - 250 g)

1. Przygotowanie rdzenia kręgowego
   1. Stosować znieczulenie wziewne izofluranem (2 - 3% izofluranu w_O2/NO₂ w stosunku 1:2) i wstrzyknięcie karprofenu w bolusie (podskórnie [podskórnie] 5 mg/kg). Zaleca się skojarzenie karprofenu z opioidem buprenorfiną (0,02 mg/kg s.c.). Operację należy wprowadzić, gdy nie obserwuje się już odruchu powiek na lekki dotyk patyczkiem kosmetycznym i odruch wycofania łapy na szczypanie bodźca kleszczami.
   2. Umieść zwierzę na kocu grzewczym w temperaturze 37 °C, aby utrzymać temperaturę ciała podczas zabiegu i nałóż maść na oczy, aby uniknąć wysuszenia w znieczuleniu.
   3. Ogol grzbiet zwierzęcia i przygotuj skórę za pomocą środka dezynfekującego skórę.
   4. Przeciąć skórę na linii środkowej wzdłuż kręgów piersiowych na 4 cm za pomocą ostrza chirurgicznego i otwórz ją. Od tego kroku do wszystkich zabiegów należy używać wysterylizowanych narzędzi chirurgicznych (sterylizowanych w autoklawie lub sterylizowanych zanurzeniowo).
   5. Wycofaj mięśnie powyżej kręgów piersiowych za pomocą małego zacisku mięśniowego.
   6. Usuń wyrostki kolczyste na poziomie klatki piersiowej 8 (Th8) i Th9 za pomocą rongeura kostnego, ostrożnie przycinając małe kawałki kości, aż kości kręgowe będą płaskie.
   7. Użyj kleszczy anatomicznych, aby podnieść kręgosłup w wyrostku kolczystym Th7 i użyj rongeur, aby przyciąć małe kawałki kości kręgowej od ogona do rostralu, aż do wykonania laminektomii w Th8 i Th9. Odsłoń oponę twardą, nie uszkadzając jej, ostrożnie usuwając jednorazowo tylko kilka i bardzo małych kawałków kości kręgowej.
   8. Zaciśnij kręgosłup za pomocą 2 zacisków stabilizacyjnych w wyrostkach kolczystych Th7 i Th10, podnieś zwierzę, aby odłączyć ruchy oddechowe od kręgów.
2. Całkowite przecięcie rdzenia kręgowego na poziomie klatki piersiowej 8/9
   1. Podnieś oponę twardą za pomocą cienkich kleszczy, przetnij oponę twardą cienkimi nożyczkami do oczu w kierunku poprzecznym.
   2. Przytrzymaj boczny odcięty koniec opony twardej za pomocą cienkich kleszczy i włóż hak rdzeniowy do przestrzeni podpajęczynówkowej między oponą twardą a pajęczynówką. Unikaj uszkodzenia opon mózgowych, nie nakłuwając opony mózgowej ani pia lub opony twardej ani kleszczami, ani haczykiem rdzenia kręgowego.
   3. Powoli obracaj haczyk, aby umieścić go wzdłuż tkanki rdzenia kręgowego, uważając, aby nie wbić się w oponę twardą (pia jest nadal nienaruszona).
   4. Podnieś rdzeń kręgowy na około 1 - 2 mm w górę, aż po stronie brzusznej pojawi się szczelina między tkanką rdzenia kręgowego a oponą twardą.
   5. Włóż cienkie nożyczki do oczu w przestrzeń między oponą twardą a pia i przetnij rdzeń kręgowy, pozostawiając hak rdzeniowy na miejscu.
   6. Podnieś dwa kikuty rdzenia kręgowego za pomocą dwóch kleszczy i wizualnie zapewnij całkowite przecięcie.
   7. W przypadku zwierząt z uszkodzeniami kontrolnymi i zwierząt z przewlekłym urazem należy zamknąć oponę twardą za pomocą przerywanych szwów za pomocą nieadsorbowalnych nici 9,0 z monofilamentu.
   8. W przypadku zmian przewlekłych należy zapoznać się z częścią 1.6.
3. Implantacja mMS
   1. Umieść mMS powyżej miejsca urazu z dwiema rurkami leżącymi po każdej bocznej stronie kręgu i opuść go do jamy uszkodzenia.
   2. Rurki do szwów do mięśni z boku kręgu za pomocą niewchłanialnej nici 4-0, aby zapewnić stabilizację mSM. Na tym etapie upewnij się, że mMS jest unieruchomiony za pomocą kleszczy.
   3. Usuń pin złącza mMS, przecinając go cienkimi nożyczkami.
   4. Zamknij oponę twardą nad mMS i zszyj ją niciami 9,0.
   5. Podłącz jedną rurkę do pompy próżniowej, a drugą uszczelnij, zaciskając.
   6. Zastosuj delikatne podciśnienie do mMS za pomocą pompy próżniowej przez otwartą rurkę, zasysając kikuty rdzenia kręgowego do światła mMS. Stosować podciśnienie przez kilka minut (maksymalnie przez 10 minut) i monitorować za pomocą czujników (250 - 350 mbar).
   7. Przeciąć rurki blisko mMS i usunąć rurki. Przejdź do kroku 1.6.
4. Resekcja tkanki rdzenia kręgowego, w tym blizny po przewlekłej zmianie chorobowej, w 5. tygodniu po początkowym urazie
   1. Wykonaj kroki 1.1.1 - 1.1.5.
   2. Zidentyfikuj tkankę bliznowatą po brązowo-żółtym wyglądzie i sztywnej tkance na szczycie rdzenia kręgowego. Delikatnie usuń powierzchowne warstwy tkanki bliznowatej, przytrzymując cienkimi kleszczami i tnąc cienkimi nożyczkami. Dzięki tej metodzie należy ponownie otworzyć miejsce laminektomii, aby odsłonić tkankę zawierającą obszar urazu rdzenia kręgowego. Należy przerwać przygotowanie, gdy szew opony twardej zostanie wizualnie zidentyfikowany.
   3. Zaciśnij kręgosłup za pomocą 2 zacisków stabilizacyjnych na wyrostkach kolczystych Th7 i Th10, a następnie podnieś zwierzę, aby odłączyć ruchy oddechowe od kręgów.
   4. Za pomocą małej tekturowej linijki zmierz obszar rdzenia kręgowego, który ma zostać wycięty (długość: 4 mm) i zaznacz krawędzie tego odpowiedniego obszaru tkanki poprzecznymi nacięciami, aby umożliwić późniejsze usunięcie tkanki.
   5. Usuń tkankę bliznowatą poprzez kombinację cięcia i aspiracji. Usuń tkankę, która została oddzielona od rdzenia kręgowego za pomocą nacięć poprzecznych. Stosować delikatne aspiracje, gdy jest to wystarczające, aby umożliwić usunięcie tkanki. Ponadto, gdy sztywna tekstura tkanki bliznowatej sprawia, że aspiracja tkanki jest zbyt trudna, użyj cienkich nożyczek, aby przeciąć i usunąć tę tkankę.
   6. Włóż kawałek (około 5 mm x 5 mm x 5 mm sześcian) hemostatycznej gąbki żelatynowej do szczeliny tkanki, aż krwawienie ustąpi. Gąbka żelatynowa zmniejszy się, gdy tylko zostanie nasączona płynem.
5. Implantacja PEG 600
   1. Przygotować 1 ml czystego, nierozcieńczonego PEG 600 do wstrzykiwań, ogrzewając go do temperatury 37 °C.
   2. Usuń gąbkę żelatynową.
   3. Wprowadzić odpowiednią ilość (około 5 - 7 μl) PEG do szczeliny za pomocą strzykawki o pojemności 10 μl lub pipety o pojemności 10 μl.
   4. Ostrożnie przykryj obszar kawałkiem (około 5 mm x 4 mm) zamiennika szczeliwa/opony twardej.
   5. Przymocuj uszczelniacz do otaczającej tkanki mięśniowej za pomocą kilku kropli kleju do tkanek. Umieść szczeliwo na wierzchu wypełnionej PEG szczeliny resekcyjnej. Aby zapobiec ślizganiu się szczeliwa, użyj małych kropli kleju tkankowego, aby przymocować rogi szczeliwa do otaczającej tkanki mięśniowej. Uwaga: Unikaj wycieku kleju tkankowego na tkankę rdzenia kręgowego!
6. Zamykanie tkanek i opieka pooperacyjna
   1. Zszyj mięśnie i skórę warstwa po warstwie z przerywanymi szwami z plecionymi adsorbowalnymi nićmi 4-0
   2. Wstrzyknąć 2 × 2,5 ml chlorku sodu (NaCl [0,9%]) w temperaturze 36 °C s.c. w celu nawodnienia po zabiegu. Pojedyncze wstrzyknięcie 5 ml NaCl rozciągnęłoby skórę zwierzęcia i mogłoby spowodować niepotrzebne szkody dla zwierzęcia. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyskasz pełnej świadomości.
   3. Karprofen należy wstrzykiwać codziennie (s.c. 5 mg/kg) przez co najmniej 2 dni po zabiegu. Zwierzę domowe w pojedynczej klatce przez pierwsze 2 dni, następnie w grupach po 2 - 3 osoby.
   4. Zastosuj antybiotykoterapię (codzienne doustne podawanie enrofloksacyny) przez pierwszy tydzień po operacji.
   5. Wykonuj ręczne opróżnianie pęcherza dwa do trzech razy dziennie, delikatnie głaszcząc brzuch zwierzęcia od rostralnego do ogonowego. Należy uważać, aby nie poruszać kręgosłupem zwierzęcia i nie podnosić zwierzęcia za ogon. Ręcznie opróżniaj pęcherz zwierzęcia z całkowicie uszkodzonym kręgosłupem codziennie przez cały czas przeżycia. Należy zwrócić uwagę, aby granulki pokarmu i butelki z wodą umieścić na wysokości, do której zwierzęta mogą sięgnąć bez stania na tylnych łapach. Chociaż funkcja tylnej ćwiartki jest upośledzona, zwierzęta poruszają się i aktywnie eksplorują klatki natychmiast po operacji. Zaleca się trzymanie szczurów w grupach towarzyskich.
   6. W przypadku zmian przewlekłych należy pozostawić czas przeżycia zwierząt wynoszący pięć tygodni przed resekcją blizny. Wykonaj kroki 1.4.

Wyniki

Zachowanie tkanki, odrost aksonalny i korzyść funkcjonalna po implantacji mMS po ostrym całkowitym przerwaniu rdzenia kręgowego
Wykazano, że ostra implantacja mMS ustabilizowała kikut całkowicie przerwanego rdzenia kręgowego i zmniejszyła kurczenie się tkanki (Rysunek 2A versus B). Jak pokazano w barwieniu trichromowym w przekrojach strzałkowych, zielone barwienie tkanki łącznej włóknistej blizny w centrum zmiany jest znaczni...

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiono dwa różne podejścia chirurgiczne w celu wypełnienia luk tkankowych w rdzeniu kręgowym po (1) ostrym całkowitym przecięciu i implantacji mMS oraz (2) przewlekłym uszkodzeniu rdzenia kręgowego i usunięciu blizn włóknistych oraz implantacji macierzy PEG. Obie strategie prowadzą do zachowania tkanek i regeneracji aksonów, a także do znacznej poprawy funkcjonowania lokomotoryki leczonych zwierząt. W przypadku implantacji mSM odpowiednim unieruchomieniem mSM w rdzeniu kręgowym za pomocą mocnego szwu...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
PEG 600 Ph Eur	Merck/VWR	8 170 041 000
Gąbka żelatynowa Gelastypt	sanofi Aventis	PZN-8789582
Uszczelniacz Nescofilm	Roth	2569.1
Baytril	Bayer
Rimadyl (Carpofen)	Pfizer
Forene (Isoflurane)	Abbvie
Kodan (środek do dezynfekcji skóry)
Histoacryl (klej do tkanek)
Friedman-Pearson Rongeur, kubek 1 mm, prosty	Fine Science Tools	16020-14
Mikroszpatułka dwa w jednym - 12 cm	Fine Science Tools	10091-12
Kleszcze Dumont #7 - Inox Medical	Narzędzia Fine Science	11273-20
Dumont #5/45 Kleszcze - Inox Medical	Fine Science Tools	11253-25
Hak do rdzenia kręgowego	Narzędzia do nauki pięknej	10162-12
Nożyczki	Narzędzia do nauki precyzyjnej	14078-10
Zacisk	Aesculap	EA016R
Ethicon Vicryl 4-0
Bepanthen Augen- und Nasensalbe	Bayer
Kleszcze anatomiczne	Fine Science Tools	11000-13
Zwijacz samozatrzymujący się	Fine Science Tools	17008-07
Zacisk do skóry	Narzędzia Fine Science	13008-12
Aluspray	Selectavet