Artykuł metodologiczny

Sortowanie spermatyd myszy według cytometrii przepływowej w zależności od kroku

DOI:

10.3791/53379

⸱

31 grudnia 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Université de Sherbrooke, 2Department of Medicine, Université de Sherbrooke

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy strategię sortowania plemników myszy za pomocą cytometrii przepływowej. Spermatydy są podzielone na cztery wysoce czyste populacje, w tym okrągłe (etapy spermiogenezy 1-9), wczesne wydłużające się (etapy spermiogenezy 10-12), późne wydłużające się (etapy spermiogenezy 13-14) i wydłużone spermioidy (etapy spermiogenezy 15-16). Barwienie DNA, wielkość i ziarnistość są wykorzystywane jako parametry selekcji.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Różnicowanie mysich plemników jest jednym z kluczowych procesów dla produkcji funkcjonalnej męskiej gamety z nienaruszonym genomem, która ma być przekazywana następnemu pokoleniu. Dotychczasowe badania molekularne tego przejścia morfologicznego były utrudnione ze względu na brak metody pozwalającej na odpowiednie rozdzielenie tych ważnych etapów różnicowania spermatyd do kolejnych analiz. Wcześniejsze próby prawidłowego bramkowania tych komórek za pomocą cytometrii przepływowej mogły być utrudnione ze względu na swoisty wzrost fluorescencji DNA u spermatyd poddawanych przebudowie chromatyny. Opierając się na tej obserwacji, przedstawiamy szczegóły prostego schematu cytometrii przepływowej, umożliwiającego powtarzalne oczyszczanie czterech populacji mysich spermatyd związanych etanolem, z których każda reprezentuje inny stan w procesie przebudowy jądrowej. Wzbogacenie populacji potwierdza się za pomocą markerów specyficznych dla danego kroku i kryteriów morfologicznych. Oczyszczone spermatydy mogą być wykorzystywane do analiz genomicznych i proteomicznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Haploidalne okrągłe spermatydy różnicują się w plemniki w procesie zwanym spermiogenezą. Obejmuje to wiele różnych etapów, w tym nabycie wici, przebudowę chromatyny i cytoszkieletu, kondensację jądra, a także utratę większości cytoplazmy. Te unikalne zdarzenia komórkowe muszą być precyzyjnie regulowane, aby wytworzyć dojrzałą funkcjonalną gametę z nienaruszonym genomem nadającym się do zapłodnienia. Spermiogenezę trudno jest badać in vitro, ponieważ do tej pory żaden niezawodny system hodowli komórkowej nie był w stanie wspierać postępu na różnych etapach procesu. Co więcej, rzeczywiste techniki in vitro prowadzą do niskiej wydajności1,2. In vivo prawidłowe przejścia przez różne etapy spermiogenezy mają kluczowe znaczenie dla naturalnej integralności funkcjonalnej męskiej gamety. Skuteczne oczyszczanie plemników zgodnie z ich etapami różnicowania nigdy nie zostało osiągnięte przy poziomie wzbogacenia wystarczającym do molekularnej charakterystyki spermiogenezy. Na przykład oczyszczanie kluczowych etapów różnicowania plemników byłoby szczególnie przydatne do badania rozwijającego się akrosomu, tworzenia części środkowej3, dynamiki połączeń komórkowych4, dynamiki RNA5, procesu przebudowy chromatyny6,7 lub stabilności genomu8. Oczyszczanie plemników jest utrudnione przez ich postępującą transformację morfologiczną, brak znanych biomarkerów zewnętrznych specyficznych dla danego stadium oraz ich specyficzny kształt i rozmiar.

Chociaż większość męskich komórek rozrodczych wykazuje bezpośredni związek między barwieniem DNA a ploidalnością (zawartością DNA), zauważyliśmy, że taka pozytywna korelacja nie ma już zastosowania do spermatyd. Wynika to z naszej wczesnej obserwacji, że odcinki kanalików nasiennych wykazują różną intensywność barwienia DNA na różnych etapach spermiogenezy. Chociaż barwienie DNA jest zgodne z ich haploidalnym zestawem chromosomów z etapów spermiogenezy od 1 do 7 (okrągłe spermatydy), zaobserwowaliśmy gwałtowny wzrost intensywności fluorescencji z DAPI lub SYTO 16 na początku reorganizacji jądrowej i przebudowy chromatyny (etap spermiogenezy 8) osiągając szczyt na początku kondensacji jądrowej (kroki spermiogenezy 11-12). Po kondensacji jądra intensywność barwienia DNA zmniejsza się aż do spermiogenezy (etap spermiogenezy 16). Przypuszczaliśmy, że jest to prawdopodobnie związane z powstaniem ich osobliwego przejścia struktury chromatyny, w którym histony są zastępowane protaminami. W związku z tym opracowaliśmy niezawodną metodę cytometrii przepływowej, która umożliwia separację spermatyd przy użyciu zmienności intensywności DNA spermatyd jako głównego parametru selekcyjnego.

Opisano proste podejście cytometrii przepływowej do rozdzielania mysich spermatyd o wysokiej czystości (95-100%) na podstawie ich pozornej zawartości DNA (barwienie SYTO16), wielkości i ziarnistości. Spermatydy są podzielone na cztery populacje; Etapy spermiogenezy 1-9, 10-12, 13-14 i 15-16. Oczyszczone spermatydy nadają się do analizy genetycznej/genomicznej, a także do zastosowań proteomicznych, jak opisano w niedawnej publikacji naszej grupy9.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opieka nad zwierzętami była zgodna z komitetem ds. opieki i użytkowania zwierząt Université de Sherbrooke.

1. Przygotowanie probówki

  1. Dzień przed sortowaniem komórek dodać 1-2 ml inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do 5 ml polipropylenowych probówek z okrągłym dnem oraz do 15 ml i 50 ml polipropylenowych probówek stożkowych.
    Krok krytyczny: Upewnij się, że każda rurka używana w protokole jest powlekana.
    Uwaga: Powłoka FBS zapobiega przywieraniu komórek rozrodczych do ścianek rurki.
  2. Powoli mieszać O/N przez odwrócenie w temperaturze 4 °C, aby równomiernie pokryć probówki za pomocą rotatora.
  3. Następnego dnia usuń FBS z powlekanych tub przez dekantację.
    1. *Krok krytyczny: Upewnij się, że probówki z okrągłym dnem z polipropylenu o pojemności 5 ml oraz probówki o pojemności 15 i 50 ml używane do przygotowania komórek (kroki protokołu od 2.1 do 2.11) są całkowicie opróżnione z FBS, aby zapobiec wachlowaniu (tj. nieprecyzyjnemu odchyleniu strumieni bocznych). Użyj pipety P200, aby usunąć FBS.
      Uwaga: Resztki FBS w probówkach przed sortowaniem mogą prowadzić do utraty komórek lub zanieczyszczenia innych probówek używanych podczas sortowania komórek,
    2. Pozostawić niewielką pozostałą objętość FBS (około 100-200 μl) w probówkach o pojemności 5 ml z okrągłym dnem z polipropylenu używanych do zbierania oczyszczonych komórek.

2. Przygotowanie komórek

  1. Uśmiercić jednego samca myszy pod narkozą za pomocąO2/izofluranu (indukcja na poziomie 5%, a następnie utrzymywana na poziomie 2%), a następnie uduszenieCO2.
  2. Wyciąć i usunąć kapsułkę z obu jąder i zmielić małymi nożyczkami w 500 μl buforu sortującego do probówki o pojemności 1,5 ml.
  3. Wypłukać komórki rozrodcze z kanalików nasiennych za pomocą delikatnego pipetowania w górę i w dół w probówce o pojemności 1,5 ml, najpierw za pomocą ściętej końcówki o pojemności 100-1000 μl, a następnie za pomocą nienaruszonej końcówki o pojemności 100-1000 μl.
  4. Usunąć zanieczyszczenia i grudki w jednym etapie filtracji za pomocą sitka komórkowego 40 μm i zebrać filtrat do stożkowej probówki o pojemności 50 ml, uprzednio pokrytej FBS w kroku 1.
  5. Przemyć filtr raz buforem sortującym do całkowitej objętości 3 ml i przenieść filtrat do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, uprzednio pokrytej w kroku 1.
  6. Dodać 16 μl 50 mM EDTA pH 8 na mililitr zawiesiny komórek (48 μl na 3 ml), aby uzyskać końcowe stężenie 0,8 mM EDTA.
  7. Aby utrwalić komórki rozrodcze, powoli dodaj 3 objętości lodowatego 100% etanolu za pomocą pipety o pojemności 10 ml z delikatnym mieszaniem (wir na niskiej prędkości), co spowoduje powstanie mlecznej zawiesiny.
    Krok krytyczny: Powolne dodawanie etanolu ma kluczowe i ważne znaczenie dla zachowania integralności preparatu komórkowego. Zauważyliśmy, że szybkie dodanie etanolu powoduje lizę komórek, co skutkuje znacznym spadkiem wydajności sortowania. W przypadku 3 ml zawiesiny komórkowej należy dodać 9 ml etanolu w ciągu około 1 minuty.
  8. Inkubować komórki na lodzie przez 15 minut, od czasu do czasu mieszając przez odwrócenie.
  9. Odwirować zawiesinę komórek o sile 800 x g przez 5 minut i usunąć klarowny supernatant.
  10. Delikatnie zawiesić utrwalone komórki rozrodcze w 2 ml buforu sortującego.
  11. Dodać 4 μl barwnika DNA SYTO16 (1 mM roztwór w DMSO) i inkubować przez co najmniej 30 minut (chronić przed światłem).
    Uwaga: Najlepsze wyniki sortowania uzyskuje się przy użyciu SYTO16, ponieważ jest to przepuszczalny barwnik DNA, który łatwo wbudowuje się w wysoce zbite jądra spermatydów.

3. Konfiguracja sortera komórek

Uwaga: Tutaj używany jest 4-laserowy (405 nm - fioletowy, 488 nm - niebieski, 561 nm - żółto-zielony, 633 nm - czerwony) 20-parametrowy sorter komórek BDFACSAria III. Oprogramowanie BD FACSDiva 6.1.3 służy do wizualizacji i analizy danych. Ustawienia mogą się różnić w zależności od typu używanego sortera.

  1. Wysterylizuj sortownik FACS, uruchamiając 70% etanolu jako płyn osłonowy podczas procedury wyłączania fluidics (menu "Cytometr" w oprogramowaniu) przed sortowaniem. Wybierz "Cytometr" na pasku narzędzi oprogramowania i wybierz "Wyłączenie płynowe". Postępuj zgodnie z krokami wymienionymi przez procesy.
  2. Przygotuj i przefiltruj 1x PBS z filtrem 0,22 μm, aby wyeliminować wszelkie kryształy i zanieczyszczenia. Napełnij zbiornik osłony do górnej linii spawania po wewnętrznej stronie zbiornika.
  3. Uruchom oprogramowanie i zaloguj się. Uruchom sortownik FACS, aby rozgrzać lasery przez co najmniej 30 minut przed sortowaniem. Uruchom dwa procesy uruchamiania fluidycznego, aby wypłukać etanol z fluidyki. Wybierz "Cytometr" na pasku narzędzi oprogramowania i wybierz "Uruchamianie Fluidic". Postępuj zgodnie z krokami wymienionymi przez procesy.
    Uwaga: To przywraca płyny z normalnym płynem osłonkowym (1x PBS).
  4. Wyczyść blok sortujący i płytki odchylające wodą destylowaną i dokładnie je wysusz. Sonikować dyszę 100 μm umieszczoną w probówce z wodą destylowaną na 2 minuty w kąpieli sonikacyjnej. Dokładnie wytrzyj dyszę.
  5. Włóż dyszę 100 μm do komory przepływowej i przekręć dźwignię blokującą dyszę zgodnie z ruchem wskazówek zegara do pozycji 12 godzin. Ustaw ciśnienie w osłonie na 20 psi.
  6. Włącz strumień i dostosuj amplitudę, aby uzyskać docelowe wartości częstotliwości (około 30), Drop 1 (około 150) i Gap (około 12) oraz aby ustalić stabilny wzór zrywania kropli (kilka zrzutów satelitów). Wyłącz tłumienie.
  7. Upewnij się, że strumień jest prosty i uderza w środek aspiratora odpadów, zmieniając kąt bloku sortowania. Uwaga: Przetestowano również dyszę 130 μm przy ciśnieniu 10 psi i nie znaleziono żadnej oczywistej różnicy.
  8. Ustaw opóźnienie lasera na 0 dla lasera niebieskiego, -77,39 dla czerwonego, 37,33 dla fioletowego i -39,85 dla żółto-zielonego.
  9. Ustaw skalowanie obszarów na 1,14 dla niebieskiego, 1,0 dla czerwonego, 0,75 dla fioletowego i 0,96 dla żółto-zielonego lasera.
  10. Korzystając z sortowania testowego (w oknie "Strumień boczny" oprogramowania), upewnij się, że strumienie boczne nie są wachlowane. W oknie "Strumień boczny" wyreguluj suwaki napięcia każdego strumienia bocznego tak, aby uderzały w środek probówki do pobierania testów. Jeśli strumień środkowy nie jest ciasny, dostosuj ustawienia 2., 3. i 4. kropli, aby ograniczyć strumień środkowy.
  11. Uruchom aplikację Cytometer Setup and Tracking (CS&T) w oprogramowaniu (menu "Cytometr").
  12. Użyj konfiguracji cytometru i kulek śledzących w ilości 1 kropli na 350 μl, aby zautomatyzować charakterystykę i śledzenie działania cytometru zgodnie z instrukcjami producenta.
  13. Zamknij aplikację CS&T. Zastosuj ustawienie CS&T, upewnij się, że parametry strumienia nadal pozwalają na stabilny wzór odrywania kropli i włącz przycisk Sweet Spot zgodnie z instrukcją producenta (w "Oknie przerwania").
  14. Zoptymalizuj wartość opóźnienia upuszczania za pomocą koralików fluorescencyjnych (patrz Tabela materiałów).
    1. Zamontuj probówki zbiorcze w uchwycie. Otwórz drzwi bloku sortowania. W oknie "Strumień boczny" włącz napięcie, a następnie wybierz "Sortowanie testowe" i kliknij przycisk Szuflada aspiratora, aby otworzyć szufladę i uzyskać dostęp do probówek zbiorczych.
    2. Zoptymalizuj strumienie boczne tak, aby wchodziły do środka rury. Dostosuj wartości i suwaki zgodnie z potrzebami.
    3. Zamknij drzwiczki bloku sortowania i upewnij się, że wyregulowałeś pokrętło mikrometru, aby uzyskać najjaśniejsze miejsce koralika pośrodku. Odznacz szufladę na odpady, przetestuj sortowanie i napięcie. Wyjmij probówki zbiorcze.
    4. Zoptymalizuj opóźnienie upuszczenia zgodnie z instrukcjami producenta.
      1. Krótko wstrząsnąć energicznie fiolką z kulkami i rozcieńczyć 1 kroplę kulek w 0,5 ml PBS.
      2. Korzystając z instrukcji producenta, ustaw opóźnienie upuszczenia, korzystając z szablonu eksperymentu Drop Delay dostępnego w oprogramowaniu. Alternatywnie użyj funkcji Auto Drop Delay, aby ustawić opóźnienie upuszczania.
      3. Załaduj rurkę z koralikami fluorescencyjnymi i dostosuj natężenie przepływu, aż szybkość progowa wyniesie ~ 3,000 do 4,000 zdarzeń / sekundę. Ustaw dokładność sortowania na "Początkową", a na końcu na "Dostosuj dostosowanie" w oknie "Sortuj układ". Wybierz filtr optyczny i posortuj koraliki. Dostosuj opóźnienie upuszczania, aż ~100% zostanie posortowane po lewej stronie.
        Uwaga: Ten krok ma kluczowe znaczenie, aby upewnić się, że interesujące komórki są sortowane w strumieniu bocznym. Kulki i filtr optyczny służą do uzyskania blisko 100% odchylenia kropli.
  15. Umieść filtr FSC 1.5 ND (o neutralnej gęstości) na lewym końcu bloku detektora FSC. Ustaw rozszerzenie okna na 2,00 μs i skalowanie obszaru FSC na 1,00 (w zakładce "Laser" w oknie "Cytometr").
  16. Przed załadowaniem probówki z próbką należy umieścić przewód filtra do próbki o długości 50 μm na końcu linii próbkowania, aby uniknąć zbrylania. Aby to zrobić, wybierz "Zmień filtr próbki" w menu "Cytometr".
  17. Zbadać skład płynu w próbce, aby uzyskać dobrą separację bez wachlowania między strumieniami bocznymi i zapobiec przywieraniu komórek do rurek polipropylenowych.
    1. Załaduj probówkę z próbką, włącz płytki odchylające i wybierz "Sortowanie testowe" przy zamkniętej szufladzie. Spójrz na strumienie boczne, jeśli separacja następuje bez zbyt dużego wentylatora.
      Uwaga: Wachlowanie jest prawdopodobnie spowodowane wysokim stężeniem białka w buforze próbki.
  18. Załaduj probówkę z próbką do przyrządu FACS. Wybrać mieszanie próbki 300 obr./min i temperaturę próbki 4 °C. Wybierz opcję "Acquire Data" (Pobieranie danych) w menu "Acquisition Dashboard" (Pulpit nawigacyjny akwizycji).
  19. W razie potrzeby rozcieńczyć próbkę, aby osiągnąć odpowiednią szybkość zdarzeń do maksymalnej liczby 5 000 zdarzeń/s (przy maksymalnym natężeniu przepływu 3,0). Należy ściśle przestrzegać tych limitów, aby zachować czystość sortowanych komórek.
  20. Aby przeanalizować i posortować komórki, zoptymalizuj wartość progową FSC, aby wyeliminować zanieczyszczenia bez ingerencji w badaną populację. W skali logarytmicznej wyreguluj napięcie detektora fotopowielacza (PMT) z filtrem 530/30, aby upewnić się, że sygnał fluorescencji całej populacji mieści się w skali i bramce na populacji dodatniej (Rysunek 1, Bramka 1).
  21. Utwórz wykres obszaru rozproszenia do przodu (FSC-A)/obszaru rozproszenia bocznego (SSC-A) populacji dodatniej SYTO16 i dostosuj FSC-A do około 110 V w skali liniowej, a SSC-A do około 150 V w skali logarytmicznej, aby zobrazować wszystkie zdarzenia, wykluczając bardzo duże komórki i agregaty komórek.
  22. W oknie "Układ sortowania" ustaw "Tryb precyzji sortowania" na "Czystość 4-kierunkowa" (Maska wydajności: 0, Maska czystości: 32, Maska fazy: 0). Wybierz "Ciągłe" z menu "Zdarzenia docelowe", aby sortować ciągło.
  23. Dodaj populacje do sortowania w polu odpowiadającym rurom (w oknie "Sortuj układ"). Populacje o wyższych częstotliwościach należy umieszczać pośrodku, a populacje o niższych częstotliwościach na końcach. Ustaw tabliczki napięcia na 2 500 V. Podczas sortowania probówki do pobierania próbek należy przechowywać na lodzie.

4. Sortowanie komórek

  1. Bezpośrednio przed sortowaniem przefiltrować komórki za pomocą filtra 50 μm w uprzednio powlekanej probówce z okrągłym dnem o pojemności 5 ml z polipropylenu.
  2. Dokładnie umyć filtr 1-2 ml buforu sortującego.
  3. Sortuj utrwalone komórki rozrodcze za pomocą sortera komórek wyposażonego w laser 488 nm zgodnie ze schematem bramkowania opisanym na rysunku 1. Oczyszczone frakcje zebrać w 5 ml polipropylenowych probówkach z okrągłym dnem, uprzednio pokrytych lodem w sekcji 1.
    1. Upewnij się, że 100-200 μl FBS jest przechowywane w probówkach zbiorczych, aby uniknąć przywierania posortowanych komórek do ścianki probówki.
    2. Upewnij się, że stężenie SYTO16 jest nasycone, aby uniknąć wahań fluorescencji w okresie sortowania. SYTO16 nasyca się, gdy nie ma dalszych zmian intensywności barwienia komórek przy parametrze Alexa Fluor 488 (barwienie DNA) na grafice sortowania. W razie potrzeby dodać 1 μl SYTO16 do probówki sortującej, aby osiągnąć nasycenie.
    3. Wyświetl łączną liczbę zdarzeń na grafice wyświetlającej następujące parametry: liczba zdarzeń w porównaniu z Alexa Fluor 488-A.
    4. Wybierz dodatnie komórki barwiące DNA za pomocą bramki 1, jak pokazano na rysunku 1.
      1. Wyświetlanie komórek od bramki 1 na grafice przy użyciu parametrów SSC-A vs FSC-A
        1. Wybierz komórki z bramką 2, jak pokazano na rysunku 1.
        2. Wyświetlaj komórki od bramki 2 na grafice, używając FSC-A vs Alexa Fluor 488-A jako parametrów.
        3. Wybierz komórki z bramką 5 i bramką 6 na grafice bramki 2, jak pokazano na rysunku 1.
        4. Wyświetlaj oddzielnie bramkę 5 i bramkę 6 na grafice, używając parametrów Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor 488-A.
        5. Wybierz kroki spermiogenezy 1-9 spermatydy na grafice bramki 5 i kroki spermiogenezy 10-12 spermiogenezy na grafice bramki 6, jak pokazano na rysunku 1.
      2. Wyświetlanie komórek od bramki 1 na grafice przy użyciu parametrów FSC-A vs Alexa Fluor 488-A
        1. Wybierz komórki z bramką 3 i bramką 4, jak pokazano na rysunku 1.
        2. Wyświetlaj oddzielnie bramkę 3 i bramkę 4 na grafice, używając parametrów Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor 488-A.
        3. Wybierz kroki spermiogenezy 13-14 spermatydy na grafice bramki 3 i kroki spermiogenezy 15-16 spermiogenezy na grafice bramki 4, jak pokazano na rysunku 1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Strategia bramkowania stosowana w cytometrii przepływowej

Rysunek 1 przedstawia strategię bramkowania stosowaną w cytometrii przepływowej do sortowania czterech wysoce czystych populacji spermatydów. Krótko mówiąc, komórki z dodatnim barwieniem DNA (Alexa Fluor 488-A) są najpierw selekcjonowane za pomocą bramki 1. Spermatydy z etapów spermiogenezy 1-12 są wybierane (bramka 2) na wykresie kropkowym pokazującym zi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie komórek plemnikotwórczych zawsze stanowiło wyzwanie ze względu na złożoność nabłonka nasiennego, a także ograniczony sukces hodowli in vitro . Z biegiem lat opracowano wiele podejść do oczyszczania komórek rozrodczych różnych gatunków. Techniki sedymentacji wykorzystujące oczyszczanie grawitacyjne za pomocą gradientów albuminy Percoll lub surowicy bydlęcej zwykle zapewniają dobrą wydajność nienaruszonych komórek rozrodczych, ale brakuje odpowiedniej definicji między niektórymi typami komórek, takimi jak ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy pragną podziękować dr Leonidowi Volkovowi i Éricowi Bouchardowi za ich techniczne porady dotyczące mikroskopii epifluorescencyjnej.

Wsparcie finansowe

Ufundowane przez Kanadyjskie Instytuty Badań nad Zdrowiem (grant #MOP-93781) dla G.B.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
IsofluraneABBOT05260-05Do znieczulenia myszy przed eutanazją
Surowica bydlęcapłodu Żubr90150Do powlekania probówki
1x PBS
EDTABioShopEDTDo sortowania preparatu buforowego
HEPESSigmaHDo sortowania preparatu buforowego
100% EtanolLes alcools de commerce092-09-11NDo utrwalania komórek
SYTO 16Life TechnologiesS7578Barwienie DNA
5 ml polipropylenowe probówki z okrągłym dnemBD Falcon352063Kolekcja sortowanych komórek
15 ml polipropylenowe stożkowe probówki z dnemPROgene1500
50 ml polipropylenowe stożkowe probówki z dnemPROgene5000
Waporyzator anestezjologiczny TEC4Ohmeda1160526Do eutanazji myszy
Zbiornik gazu CO2PraxairC799117902Do eutanazji
myszy Zbiornik gazu O2PraxairO254130501Do eutanazji myszy
Domowa komoraDo eutanazji myszy
40 &mikro; m Sitko do komórek FalconCorning Incorporated352340
50 μ m Filtry linii próbkowaniaBD Biosciences649049
Mieszalnik VortexLabnet international, inc.S0200Do utrwalania komórek
Wirówka DynacClay Adams101
Celltrics 50 µ m filtryPartec 04-004-2327
488 nm laserowy sortownik komórekBD BiosciencesFACSAria III
Accudop Koraliki fluorescencyjneBD Biosciences345249
Bufor sortujący: 1x PBS, 1 mM EDTA pH 8,0, 25 mM HEPES pH 7,0, 1% FBSFBS jest inaktywowany termicznie. Przygotuj świeży roztwór, 0,22 μ m przefiltrowane i przechowywać w temperaturze 4& st. C.
gazowa myszy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).
  2. Sato, T., et al. In vitro production of fertile sperm from murine spermatogonial stem cell lines. Nat. Commun. 2, 472(2011).
  3. Sun, X., Kovacs, T., Hu, Y. -J., Yang, W. -X. The role of actin and myosin during spermatogenesis. Mol. Biol. Rep. 38 (6), 3993-4001 (2011).
  4. Cheng, C. Y., Mruk, D. D. Cell junction dynamics in the testis: Sertoli-germ cell interactions and male contraceptive development. Physiol. Rev. 82, 825-874 (2002).
  5. Laiho, A., Kotaja, N., Gyenesei, A., Sironen, A. Transcriptome profiling of the murine testis during the first wave of spermatogenesis. PLoS ONE. 8 (4), (2013).
  6. Leduc, F., Maquennehan, V., Nkoma, G. B., Boissonneault, G. DNA damage response during chromatin remodeling in elongating spermatids of mice. Biol. Reprod. 78 (2), 324-332 (2008).
  7. Meistrich, M. L., Mohapatra, B., Shirley, C. R., Zhao, M. Roles of transition nuclear proteins in spermiogenesis. Chromosoma. 111 (8), 483-488 (2003).
  8. Grégoire, M. -C., et al. Male-driven de novo mutations in haploid germ cells. Mol. Hum. Reprod. 19 (8), 495-499 (2013).
  9. Simard, O., et al. Instability of trinucleotidic repeats during chromatin remodeling in spermatids. Hum. Mutat. , (2014).
  10. Wykes, S. M., Krawetz, S. Separation of spermatogenic cells from adult transgenic mouse testes using unit-gravity sedimentation. Mol. Biotechnol. 25 (2), 131-138 (2003).
  11. Yoshida, S., et al. The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage. Development (Cambridge, England). 133 (8), 1495-1505 (2006).
  12. Moreno, R. D., Lizama, C., Urzúa, N., Vergara, S. P., Reyes, J. G. Caspase activation throughout the first wave of spermatogenesis in the rat. Cell Tissue Res. 325 (3), 533-540 (2006).
  13. Meistrich, M. L., Trostle-Weige, P. K., Van Beek, M. E. Separation of specific stages of spermatids from vitamin A-synchronized rat testes for assessment of nucleoprotein changes during spermiogenesis. Biol. Reprod. 51 (2), 334-344 (1994).
  14. van Pelt, A. M., de Rooij, D. G. Synchronization of the seminiferous epithelium after vitamin A replacement in vitamin A-deficient mice. Biol. Reprod. 43, 363-367 (1990).
  15. Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. J. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J. Vis. Exp. , (2011).
  16. Kovtun, I. V., McMurray, C. T. Trinucleotide expansion in haploid germ cells by gap repair. Nature Genet. 27 (4), 407-411 (2001).
  17. Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).
  18. Lassalle, B., Ziyyat, A., Testart, J., Finaz, C., Lefèvre, A. Flow cytometric method to isolate round spermatids from mouse testis. Hum. Reprod. 14 (2), 388-394 (1999).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Spermiogenezaprzebudowa chromatynysortowanie kom rekbarwienie DNAfiksacja etanolemrozproszenie bocznerozproszenie przednieAlexa Fluor 488

Powiązane artykuły