Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie i hodowla komórek śródbłonka przerostu krwi z ludzkiej krwi obwodowej

20K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53384

⸱

23 grudnia 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Cambridge, 2Papworth Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół pozwala na wiarygodne generowanie i charakteryzowanie komórek śródbłonka (BOEC) z małej objętości dorosłej krwi obwodowej. BOEC mogą być stosowane jako substytut komórek śródbłonka od pacjentów z zaburzeniami naczyniowymi oraz jako substrat do wytwarzania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Streszczenie

Historycznie rzecz biorąc, ograniczona dostępność pierwotnych komórek śródbłonka od pacjentów z zaburzeniami naczyniowymi utrudniała badanie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw dysfunkcji śródbłonka u tych osób. Jednak niedawna identyfikacja komórek śródbłonka wyrastających z krwi (BOEC), generowanych z krążących komórek progenitorowych śródbłonka w dorosłej krwi obwodowej, może obejść to ograniczenie, oferując podobny do śródbłonka, pierwotny substytut komórek dla komórek śródbłonka pochodzących od pacjenta. Poza ich wartością dla zrozumienia biologii śródbłonka i modelowania chorób, BOEC mają potencjalne zastosowania w terapiach przeszczepiania komórek śródbłonka. Są one również odpowiednim substratem komórkowym do wytwarzania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) poprzez przeprogramowanie jądrowe, oferując szereg zalet w porównaniu z innymi typami komórek. Opisujemy metodę wiarygodnego wytwarzania, hodowli i charakterystyki BOEC z dorosłej krwi obwodowej do wykorzystania w tych i innych zastosowaniach. Takie podejście (i) pozwala na generowanie specyficznych dla pacjenta komórek śródbłonka ze stosunkowo niewielkiej objętości dorosłej krwi obwodowej oraz (ii) wytwarza komórki, które są bardzo podobne do pierwotnych komórek śródbłonka pod względem morfologii, sygnalizacji komórkowej i ekspresji genów.

Wprowadzenie

Do niedawna uważano, że powstawanie nowych naczyń krwionośnych po urodzeniu następuje wyłącznie w procesie znanym jako angiogeneza, zdefiniowana jako kiełkowanie nowych naczyń z komórek śródbłonka wcześniej istniejących naczyń. 1 Proces ten różni się od waskulogenezy, czyli tworzenia się naczyń krwionośnych de novo ze śródbłonka komórek progenitorowych, o którym sądzono, że zachodzi wyłącznie podczas embriogenezy. 2 Jednak nowsze badania zidentyfikowały i wyizolowały krążące śródbłonkowe komórki progenitorowe (EPC) we krwi obwodowej dorosłych. Komórki te mają zdolność różnicowania się w dojrzałe komórki śródbłonka w hodowli i uważa się, że uczestniczą w poporodowym unaczynieniu. 3,4

Protokoły izolacji i ekspansji tych EPC zazwyczaj obejmują hodowlę komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMNC) w pożywkach zawierających czynniki wzrostu śródbłonka, w tym czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) i czynnik wzrostu fibroblastów-2. 5-8 kultur EPC wytwarza wiele dramatycznie różnych typów komórek. Początkowe hodowle (<7 dni) są zdominowane przez typ komórek monocytowych, znany w literaturze jako "wczesne" EPC. Pomimo swojej nazwy, komórki te wyrażają marker monocytów CD14, są ujemne dla markera progenitorowego CD34 i wyrażają tylko minimalne poziomy klasycznych markerów śródbłonka CD31 i receptora VEGF 2 (VEGFR2). 5 Ciągła hodowla prowadzi do powstania wtórnej populacji komórek, znanej jako EPC późnego wzrostu lub komórki śródbłonka przerostu krwi (BOEC), które wyglądają jak dyskretne kolonie komórek podobnych do śródbłonka. W przeciwieństwie do monocytowych wczesnych EPC, BOEC, które są również nazywane komórkami tworzącymi kolonie śródbłonka (ECFC), komórkami śródbłonka wzrostu lub komórkami śródbłonka o późnym wzroście, wykazują morfologię brukową, która jest typowa dla monowarstw komórek śródbłonka i są bardzo podobne pod względem markera powierzchniowego5 i ekspresji genu9 do dojrzałych komórek śródbłonka.

Generowanie komórek podobnych do śródbłonka z krwi obwodowej oferuje kilka korzyści, szczególnie do badania dysfunkcji komórek śródbłonka związanych z zaburzeniami naczyniowymi, takimi jak tętnicze nadciśnienie płucne (PAH)10 lub choroba von Willebranda. 11 Przed pojawieniem się BOEC komórki śródbłonka można było pozyskać tylko z eksplantowanych narządów w chwili śmierci lub przeszczepu narządu lub wyizolować z żyły pępowinowej po urodzeniu. Ta zmniejszona dostępność stanowiła poważne ograniczenie w zrozumieniu biologii komórek śródbłonka u pacjentów z zaburzeniami sercowo-naczyniowymi, a także interakcji między komórkami śródbłonka a komórkami krwi lub komórkami ściennymi. Co więcej, wyizolowanie i wyhodowanie czystej populacji komórek śródbłonka z tych źródeł jest technicznie trudne, a komórki uzyskane tymi metodami wykazują jedynie ograniczoną zdolność proliferacyjną. BOEC stanowią zatem cenny substytut izolacji i hodowli pierwotnych komórek śródbłonka pochodzących od pacjenta.

Oprócz zastosowań in vitro, BOEC są również potencjalnie użyteczne w terapiach autologicznych przeszczepów komórek. Zastosowania te obejmują zarówno przeszczep komórek śródbłonka w celu promowania neowaskularyzacji (patrz 12 i odniesienia w nim), jak i wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). 13 iPSC pochodzących z BOEC może być wykorzystywanych do modelowania chorób i oferują ogromny potencjał jako materiał wyjściowy dla autologicznych terapii komórkowych. BOEC przeprogramowują się szybciej i z większą wydajnością niż fibroblasty skóry. Co więcej, BOEC pozwalają również na wytwarzanie iPSC, które są wolne od nieprawidłowości kariotypowych, co jest istotną cechą każdej technologii, która będzie odpowiednia do zastosowań translacyjnych. Możliwość generowania iPSC z próbki krwi pacjenta eliminuje również potrzebę biopsji skóry i wytwarzania fibroblastów skóry, ułatwiając w ten sposób wytwarzanie komórek od pacjentów z zaburzeniami gojenia się ran lub bardzo młodych.

Protokół opisany poniżej, zatwierdzony i przeprowadzony zgodnie z wytycznymi Komitetu Służby Etyki Badań Naukowych (Wschodnia Anglia), zapewnia prostą i niezawodną metodę generowania BOEC o skuteczności większej niż 90% ze stosunkowo małej objętości (60 ml) krwi obwodowej. Komórki te są wysoce proliferacyjne i mogą być wielokrotnie pasażowane, co pozwala na wytworzenie setek milionów komórek z jednej próbki krwi.

Protokół

Schemat protokołu generowania BOEC jest pokazany na rysunku 1.

1. Pobieranie krwi i wirowanie w gradiacji gęstości

  1. Dla każdego dawcy dodać 3 ml cytrynianu sodu do każdej z dwóch stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml. Zebrać 60 ml krwi przez nakłucie dożylne i dodać 30 ml do każdej probówki. Delikatnie odwróć 2-3 razy, aby wymieszać. W protokole należy użyć zaledwie 40 ml krwi, odpowiednio dostosowując objętość cytrynianu.
    UWAGA: Istotne jest, aby próbki krwi zostały przetworzone w ciągu 2 godzin od pobrania. Opóźnione przetwarzanie krwi powoduje znaczne zmniejszenie plonu kolonii przerostowych.
  2. Przygotuj nowe stożkowe probówki zawierające pożywkę wirową z gradientem gęstości, najpierw kilkakrotnie odwracając butelkę w celu wymieszania. W sterylnym kapturze dodać 15 ml pożywki wirowej z gradientem gęstości na 50 ml stożkową probówkę (1 probówka na każde 10 ml krwi, 6 probówek na dawcę).
  3. Rozcieńczyć krew w stosunku 1:1 solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco. Przechylić probówkę zawierającą pożywkę wirującą w gradiencie gęstości pod kątem 20° z powierzchnią roboczą. Używając pipety i pipety serologicznej o pojemności 25 ml, powoli nałóż 21 ml rozcieńczonej krwi na wierzch pożywki, stopniowo dodając krew w dół ścianki przechylonej probówki.
    UWAGA: Zminimalizuje to mieszanie się krwi z warstwą gradientu gęstości i zapewni ciaśniejszą kożuchową powłokę, a także zwiększoną wydajność.
  4. Odwirować próbki o masie 400 x g przez 35 minut w temperaturze pokojowej przy wyłączonym akceleratorze i hamulcu.
  5. Podczas tego okresu wirowania rozpocznij powlekanie kolagenu szczegółowo w krokach 2.1 - 2.4. Upewnij się, że te kroki zostały wykonane przed przejściem do kroku 3.1.

2. Powłoka kolagenowa kolby T-75 i przygotowanie pożywki hodowlanej

UWAGA: Wykonaj następujące kroki w kapturze do hodowli komórkowej.

  1. Przygotuj roztwór kolagenu o stężeniu 50 μg/ml, rozcieńczając podstawowy kolagen typu I w 10 ml 0,02M kwasu octowego. Przykład: dla wywaru kolagenowego w stężeniu 4,05 mg/ml dodaj 123,5 μl kolagenu do 10 ml 0,02 M kwasu octowego. Sterylny filtr zawiesinowy kolagenu przed użyciem.
  2. Za pomocą pipety serologicznej dodać 7,5 ml roztworu kolagenu do kolby do hodowli komórek T-75. Objętość ta daje 5 μg kolagenu/cm2 (lub 375 μg/kolbę). Kolba na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  3. Przygotować śródbłonkową pożywkę wzrostową używaną do wytwarzania BOEC, uzupełniając śródbłonkowe podłoże podstawowe suplementami czynnika wzrostu dostarczonymi przez producenta. Dodaj wszystkie suplementy, ale nie dodawaj serum. Aby przygotować 15 ml pożywki wytwarzającej BOEC, należy dodać 2,5 ml zdefiniowanej płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do 12,5 ml pożywki do wzrostu śródbłonka zawierającej suplementy czynnika wzrostu.
  4. Postępuj zgodnie z krokami opisanymi w sekcji 3. Po upływie 1 godziny powlekania należy odessać roztwór kolagenu i zmyć pozostałości kwasu octowego za pomocą pipetowania w 10 ml DPBS. Odessać DPBS i powtórzyć ten krok mycia jeszcze raz. Jeśli zawiesina komórek uzyskana w kroku 3.3 nie jest w tym momencie gotowa do posiewu, dodaj 5 ml pożywki do wytwarzania BOEC do kolby, aby zapobiec wysychaniu powłoki kolagenowej.

3. Zbieranie i powlekanie PBMNC

  1. Po odwirowaniu w gradiencie gęstości opisanym w kroku 1.4 ostrożnie zebrać warstwę kożucha za pomocą sterylnej plastikowej pipety transferowej. Pobranie kożucha powinno dać około 20 ml zawiesiny komórkowej i osocza z każdej probówki. Unikaj przenoszenia medium gradientu gęstości.
  2. Rozcieńczyć zawiesinę komórek jednojądrzastych w stosunku 1:1 w DPBS i odwrócić do mieszania. Wirować w temperaturze pokojowej przez 20 minut przy 300 x g z maksimum hamulcem i przyspieszeniem.
  3. Po odwirowaniu odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki, dodając 1 ml pożywki do wytwarzania BOEC do każdej osadki i wielokrotnie pipetując w górę iw dół. Zebrać zawiesiny komórek i uzupełnić całkowitą objętość do 10 ml pozostałą pożywką.
  4. Aby oszacować całkowitą liczbę komórek, należy pobrać próbkę 10 μl zawiesiny komórkowej i rozcieńczyć 50 razy 490 μl roztworu Turka, który spowoduje lizę czerwonych krwinek. Odliczyć 10 μl próbki rozcieńczonej zawiesiny komórek za pomocą hemocytometru.
    UWAGA: 60 ml krwi powinno dać około 100-150 x 106 białych krwinek do posiewu.
  5. Zawiesinę całych komórek umieścić w pojedynczej, pokrytej kolagenem kolbie T-75, uzupełnić pożywkę do objętości 15 ml / kolbę i wyhodować w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2 . Komórki posiane w tym czasie reprezentują przejście 0,
    UWAGA: Możliwe jest zamrożenie wyizolowanych PBMNC przed izolacją BOEC w celu uzyskania BOEC w późniejszym czasie lub w celu przetransportowania PBMNC do innego laboratorium, w którym można wytworzyć BOEC. Należy jednak zauważyć, że zamrożenie PBMNC może zmniejszyć skuteczność izolacji BOEC. Patrz sekcja 8 poniżej, aby zapoznać się z metodą.

4. Długoterminowa hodowla komórkowa

  1. Zmieniaj pożywkę co 2 dni, dodając 15 ml świeżej pożywki generacji BOEC (mieszanina 5:1 pożywki do wzrostu komórek śródbłonka i zdefiniowanego FBS). W weekendy średnie zmiany mogą być opóźnione do co 3 dni.
    UWAGA: Kolonie wyrostka powinny pojawić się między 7 a 14 dniem hodowli.
  2. Monitorować kolbę hodowlaną BOEC w dniach 7-14 pod kątem pojawienia się kolonii odrostowych. Zidentyfikuj kolonie jako okrągłe grupy komórek wykazujące klasyczną morfologię śródbłonka bruku.
  3. Po zidentyfikowaniu kolonii lub wielu kolonii w kolbie, należy kontynuować zmiany pożywki i pozwolić koloniom urosnąć do około 1000 do 2000 komórek na kolonię przed pasażowaniem. Określ liczbę komórek w kolonii za pomocą przybliżonego oszacowania wizualnego.
    UWAGA: Jako wskazówkę, zwyczajowo przechodzi się przez początkowe kolonie wyrostki tydzień po zidentyfikowaniu pierwszej kolonii odrostowej.
  4. Komórki przepuszczać przez dwukrotne przepłukanie kolb 10 ml DPBS. Dodać 5 ml 1X trypsyna-EDTA i inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 5 minut. Po 5 minutach zneutralizować trypsynę 10 ml pożywki (zawierającej FBS) i wprowadzić komórki do zawiesiny, powtarzając pipetowanie.
  5. Odwirować zawiesinę o sile 300 x g przez 5 minut, ponownie zawiesić w 15 ml świeżej pożywki BOEC i umieścić zawiesinę całych komórek w nowej kolbie T-75 (reprezentującej pasaż 1, P1). Nie jest wymagana powłoka kolagenowa.
  6. Kontynuuj zmiany pożywki zgodnie z powyższym opisem, aż komórki zaczną się zlewać (około 3-5 x 10,6 komórek na kolbę). Po zlewaniu się komórki pasażowe zgodnie z opisem w kroku 4.3.
    UWAGA: Począwszy od pasażu 2, komórki nie wymagają już pożywki do wytwarzania BOEC i mogą być hodowane w pożywce do wzrostu komórek śródbłonka i 10% standardowym FBS inaktywowanym termicznie. Powlekanie kolagenem może być stosowane jako opcjonalny krok w przyszłości, ponieważ istnieją dowody sugerujące, że obecność kolagenu może zwiększyć tempo proliferacji BOEC.
  7. W celu dalszego pasażowania należy płytkować nie mniej niż 750 000 komórek na kolbę T-75, ponieważ niska gęstość komórek może spowodować zatrzymanie proliferacji BOEC.

5. Zamrażanie i rozmrażanie kultur BOEC

  1. Trypsynizować komórki zgodnie z opisem w sekcji 4.3 i odwirowywać przy 300 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić w 10 ml pożywki. Nie wymaga to pożywki do wzrostu komórek śródbłonka; DMEM z 10% standardowym FBS będzie wystarczający. Pobrać 10 μl próbki zawiesiny komórek, aby przeprowadzić ręczne zliczanie komórek za pomocą hemocytometru.
  2. Ponownie odwirować i ponownie zawiesić przy 2x106 komórek/ml w lodowato zimnym podłożu do kriokonserwacji (40% DMEM z 50% FBS i 10% DMSO). Dodać 0,5 ml (106 komórek) do każdej fiolki, umieścić fiolki w lodowatym naczyniu do kriokonserwacji izopropanolu i umieścić w zamrażarce o temperaturze -80 °C na co najmniej 2 godziny przed przeniesieniem do ciekłego azotu. Nie pozostawiaj komórek w temperaturze -80 °C na dłużej niż 24 godziny.
  3. Aby rozmrozić komórki, dodaj 10 ml wstępnie podgrzanej pożywki do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
    UWAGA: Podczas rozmrażania komórek pasażowych 1 rozmrażaj się w pożywce do wzrostu komórek śródbłonka uzupełnionej 20% zdefiniowanym FBS przez pierwsze 2 dni po rozmrożeniu. Prowadzi to do bardziej stabilnej izolacji komórek w przyszłości.
  4. Usunąć komórki z ciekłego azotu i rozmrozić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, delikatnie mieszając, aż w fiolce pozostanie tylko mały kryształek lodu. Dodawać kroplami zawartość fiolki do stożkowej probówki wirówkowej i wirować do 300 x g przez 5 minut.
  5. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 ml EGM-2MV+10%FBS. Dodać do kolby T-75 i uzupełnić pożywką do 15 ml.

6. Charakterystyka BOEC za pomocą cytometrii przepływowej

  1. Po umożliwieniu ekspansji kolonii BOEC opisanej w sekcji 4, trypsynizować komórki zgodnie z opisem w sekcji 4.4 i ponownie zawiesić w stężeniu 10-6 komórek na ml w buforze barwiącym (DPBS z 2% FBS i 2 mM EDTA).
  2. Połącz 105 komórek z przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromem skierowanymi przeciwko CD45, CD14, CD34, CD31 (użyć wszystkich w rozcieńczeniu 1:20) lub VEGFR2 (rozcieńczyć 1:10) (szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli 1). Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.
  3. Przemyć komórki 1 ml buforu barwiącego i odwirować przy 300 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić w 400 μl buforu barwiącego do analizy. Przechowywać komórki w temperaturze 4 °C i chronić przed światłem przed analizą.
  4. Przeprowadzić analizę cytometryczną na cytometrze wyposażonym w wykrywanie fluorescencyjnie sprzężonych przeciwciał użytych w teście.
  5. Użyj niebarwionej próbki BOEC, aby zidentyfikować populację komórek na cytometrze, dostosowując napięcia rozpraszania do przodu i boku, a także napięcia dla kanałów FITC i APC.
  6. Określ progi bramkowania za pomocą komórek barwionych izotypem dla każdego fluorochromu. Oceń dodatniość dla każdego markera powierzchni komórki na podstawie obecności szczytowego przesunięcia intensywności fluorescencji w porównaniu z kontrolą izotypu dla analizowanego fluorochromu.

7. Charakterystyka BOEC za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej

  1. Umieścić BOEC w 24-dołkowej, płaskodennej płytce do hodowli tkankowej bez szkiełek nakrywkowych o gęstości 5 x 104 komórki w 500 μl pożywki do wzrostu komórek śródbłonka + 10% inaktywowanego termicznie FBS na studzienkę i pozostawić do przylegania i wzrostu w temperaturze 37 °C, 5% CO2 do momentu, gdy komórki pokryją co najmniej 70-80% powierzchni każdej studzienki (oszacować zbieg przez oględziny pod lekkim mikrozopem).
  2. Myć komórki w każdym dołku przez 5 minut 1 ml DPBS.
  3. Utrwalić komórki O/N w temperaturze 4 °C za pomocą 500 μl 4% roztworu paraformaldehydu w DPBS.
  4. Myć komórki przez 3 x 5 minut 1 ml DPBS na studzienkę. Dodaj i wyjmij DPBS za pomocą odpowiednio pipety i aspiratora.
  5. Przepuszczalność komórek przez 3 x 10 min z 0,2% polisorbatem 20 w DPBS.
  6. Inkubować komórki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w buforze blokującym zawierającym 10% FBS w DPBS.
  7. Komórki barwione w temperaturze 4 °C O/N w 300 μl buforu do rozcieńczania przeciwciał (0,1% albuminy surowicy bydlęcej w DPBS) zawierającego pierwszorzędowe przeciwciała skierowane przeciwko CD34 (10 μg/ml), CD144 (1:300) lub vWF (1:250). Szczegółowe informacje można znaleźć w tabeli 1.
  8. Niezwiązane przeciwciała pierwszorzędowe zmywać przez 5 x 10 minut za pomocą DPBS.
  9. Inkubować komórki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym znakowanym fluorescencyjnie, jak opisano w Tabeli 1 (wszystkie w stosunku 1:200).
  10. Niezwiązane przeciwciała drugorzędowe zmywać przez 5 x 10 minut za pomocą DPBS.
  11. Inkubować komórki z 1 μg/ml 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) w DPBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  12. Myć komórki DPBS przez kolejne 3 x 5 minut.
  13. Obrazuj komórki w 100-krotnym powiększeniu za pomocą odwróconego mikroskopu wyposażonego w zewnętrzne źródło światła do wzbudzenia fluorescencji i rejestruj obrazy za pomocą dołączonej kamery cyfrowej w celu późniejszej analizy w trybie offline.

8. Zamrażanie i rozmrażanie PBMNC

  1. Pod koniec etapu 3.2, po odwirowaniu, należy odessać pożywkę i ręcznie rozbić osad komórkowy poprzez wielokrotne pipetowanie w górę i w dół za pomocą końcówki do pipety P1000. Dodaj 1 ml pożywki do zamrażania, 90% serum i 10% DMSO, upewniając się, że delikatnie mieszasz, aby uzyskać zawiesinę komórkową. Przenieść zawiesinę komórek do kriowialnego i zamrozić i rozmrozić zgodnie z opisem w sekcji 5.

Wyniki

Izolacja monocytycznych komórek warstwy leukocytarnej (buffy coat) z 60 ml krwi zazwyczaj daje 100-150x106 całkowitej liczby białych krwinek. Po wysianiu do jednej kolby T-75, duża liczba komórek w niezlizowanej zawiesinie utrudnia rozróżnienie pojedynczych komórek adherentnych przy użyciu mikroskopii w polu jasnym. Wielokrotne wymiany medium prowadzą do usunięcia komórek nieadherentnych i umożliwiają wizualizację adherentnej populacji monocytarnych „wczesnych” EPC. W 7. dniu kolba T-75 będzie zawierać około 7x106 tych wydłużonych komórek adherentnych. Od 7. do 14. dnia w kolbie powinny pojawić się kolonie BOEC (Ryc. 2A). Kolonie pojawiają się początkowo jako 3 do 5 sąsiadujących komórek. Liczba kolonii outgrowth może wynosić od 1 do 10 kolonii na 60 ml krwi. Zazwyczaj młodsi dawcy (i.e., w wieku 20-25 lat) wykazują tendencję do produkowania większej liczby kolonii outgrowth, które pojawiają się również wcześniej w hodowli. Komórki BOEC proliferują z tej centralnej grupy komórek, tworząc kolonie okrągłe składające się z kilkuset komórek. Komórki w tych koloniach wykazują klasyczną endotelialną morfologię brukowaną.

Zaleca się pasażowanie początkowych kolonii, gdy zawierają one około 1000 komórek na kolonię. Kolonie wzrostowe zazwyczaj osiągają taki rozmiar 7 dni po ich pierwotnym pojawieniu się w hodowli. Po przeniesieniu oryginalnych kolonii do nowej kolby T-75 powinny one proliferować, tworząc konfluentną monowarstwę (3-5x106 komórek na kolbę) w ciągu 5 dni lub krócej (Ryc. 2B). W niewielkim odsetku izolacji (<10%) kolonie wzrostowe nie pojawiają się lub nie proliferują w wystarczającym stopniu po tym początkowym etapie pasażowania. BOEC wykazujące niską proliferację po pierwszym pasażowaniu rzadko przekształcają się w stabilne izolacje BOEC i często przestają proliferować w ciągu dwóch do trzech pasaży. Monocytarne wczesne EPC zawarte w hodowlach BOEC nie proliferują i są zazwyczaj usuwane z hodowli w ciągu 1-2 pasaży. Usuwanie tych wczesnych komórek wynika z ich śmierci, braku ponownej adhezji wczesnych komórek po pasażowaniu oraz rozcieńczenia nieproliferujących wczesnych EPC podczas powtarzanego pasażowania.

Komórki z pasażu 1 można dalej pasażować w hodowli lub zamrozić do późniejszego użycia. Po uzyskaniu stabilnej izolacji komórki można pasażować w stosunku 1 konfluentnej kolby do 3-5 nowych kolb T-75, aż do pasażu 8 lub 9, przed wejściem w stan spoczynku. Ponownie, gęstość komórek jest krytyczna w całej hodowli. W naszym doświadczeniu w kolbie T-75 powinno zostać wysiane nie mniej niż 750,000 komórek, ponieważ niższe gęstości komórek mogą prowadzić do zahamowania wzrostu. Pomimo wysokiego potencjału proliferacyjnego BOECs, nie należy dopuścić do nadmiernej konfluencji komórek (t.j. >5x106 komórek na kolbę), gdyż może to spowodować przejście BOECs w fenotyp nieproliferujący.

Proponujemy, aby każda komórka określana jako BOEC wykazywała odpowiednie barwienie powierzchniowe i wewnątrzkomórkowe dla markerów śródbłonkowych. Charakterystyka BOEC może zostać przeprowadzona za pomocą cytometrii przepływowej (Rysunek 3) lub mikroskopii fluorescencyjnej (Rysunek 4) po przeprowadzeniu barwienia na typowe markery komórek śródbłonka. BOEC są dodatnie dla powierzchniowych markerów śródbłonkowych CD31 i VEGFR2 oraz ujemne dla markera monocytów CD14 i pan-leukocytowego markera CD45. BOEC posiadają również ciałka Weibela-Palade, w związku z czym wykazują ekspresję czynnika von Willebranda (vWF) w postaci dyskretnego, punktowego barwienia cytoplazmatycznego. W przeciwieństwie do innych dojrzałych typów komórek śródbłonka, takich jak komórki śródbłonka tętnicy płucnej lub aorty, BOEC wykazują na swojej powierzchni również marker progenitorowy i aktywacyjny CD34.

Proces frakcjonowania krwi; schemat etapów izolacji PBMNC za pomocą wirowania w gradiencie Ficoll.
Rysunek 1. Schemat protokołu generowania BOEC. Mononuklearne komórki krwi obwodowej są izolowane z krwi żylnej poprzez wirowanie w gradiencie gęstości i hodowane na płytkach pokrytych kolagenem w medium wzrostu śródbłonka zawierającym określone FBS. Kolonie BOEC pojawiają się w ciągu 7–14 dni hodowli. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Porównanie wzrostu kultur komórkowych; obrazy mikroskopowe pokazujące zmienność gęstości populacji próbek komórek.
Rycina 2. Obrazy w jasnym polu reprezentatywnych kultur BOEC. (A) Kolonie przerostu pojawiają się w kulturach między 7. a 14. dniem. Kolonie występują jako skupiska komórek przypominających komórki śródbłonka, które są ułożone w monowarstwę o strukturze bruku i proliferują promieniście z punktu centralnego. Wokół kolonii przerostu znajdują się przylegające komórki monocytyczne, które stanowią zdecydowaną większość komórek we wczesnych kulturach. Komórki te, wcześniej opisywane jako „wczesne” komórki progenitorowe śródbłonka, mają morfologię wrzecionowatą i wykazują ekspresję markera monocytycznego CD14. (B) Po pasażowaniu, silnie proliferujące BOEC przejmują kultury, ponieważ nieproliferujące komórki monocytyczne obumierają lub nie przyłączają się ponownie po pasażowaniu. Pasek skali 250μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza cytometrii przepływowej; histogramy; markery CD; intensywność fluorescencji; białka powierzchniowe komórek.
Rycina 3. Charakterystyka BOECs za pomocą cytometrii przepływowej. Komórki BOECs poddano trypsynizacji i zabarwiono przeciwciałami kontrolnymi izotypowymi sprzężonymi z fluorochromem (szary wypełniony szczyt) lub przeciwciałami skierowanymi przeciwko specyficznym markerom powierzchniowym (czerwona linia). Markery powierzchniowe wykorzystane do charakterystyki cytometrycznej obejmują markery hematopoetyczne CD45 i CD14, markery endotelialne CD31 i VEGFR2 oraz marker progenitorowy i marker aktywacji endotelialnej CD34. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia fluorescencyjna komórek śródbłonka wykazująca barwienie DAPI, CD144 i vWF.
Rycina 4. Barwienie immunofluorescencyjne BOEC na markery komórek śródbłonka. Reprezentatywne obrazy immunofluorescencji BOEC przebarwionych przeciwciałami skierowanymi przeciwko markerowi powierzchniowemu komórek śródbłonka CD144 (VE-kadheryna, prawy górny panel) oraz glikoproteinie krwi czynnikowi von Willebranda (vWF, prawy dolny panel). Po lewej stronie przedstawiono odpowiadające im panele z barwieniem jąder DAPI. Pasek skali 50μm dla CD144. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Przedstawiamy szczegółowy protokół, który pozwala na solidne i skuteczne wyprowadzanie BOEC z dorosłych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMNC). Nasz protokół zawiera dwa ważne udoskonalenia, które stanowią postęp w stosunku do poprzednich metod izolacji BOEC. 14-16 Należą do nich brak heparyny w początkowej pożywce hodowlanej PBMNC oraz stosowanie określonej, embrionalnej surowicy kwalifikowanej do komórek macierzystych. To ostatnie uściślenie ma szczególne znaczenie. Surowica kwalifikowana do produkcji embrionalnych komórek macierzystych (ESC) jest bardziej spójną klasą surowicy i chociaż nie wiadomo jeszcze, jakie składniki są wzbogacone w surowicę, które korzystnie wpływają na izolację BOEC, wpływ tej zdefiniowanej surowicy na wydajność wytwarzania BOEC jest oczywisty w naszych rękach. Ponadto odnieśliśmy również sukces w izolowaniu BOEC za pomocą ludzkiej surowicy, co pozwoliło na generowanie BOEC do translacji klinicznej. W naszych rękach ten udoskonalony protokół skutkuje udaną izolacją stabilnych kultur BOEC od ponad 90% dawców, co czyni go jedną z najbardziej niezawodnych metod generowania BOEC zgłoszonych do tej pory. Chociaż stosowanie określonych surowic ma kluczowe znaczenie dla generowania BOEC, stanowi ono również podstawowe ograniczenie obecnego protokołu. Przyszłe udoskonalenia tej techniki mogą obejmować wytwarzanie tych komórek w określonych warunkach hodowli bez surowicy.

Krytyczne kroki w protokole obejmują przetwarzanie próbek krwi tak szybko, jak to możliwe po pobraniu, całkowite zebranie komórek kożucha po odwirowaniu w gradiacji gradientu gęstości oraz terminowe przejście początkowych kolonii od P0 do P1. Ten etap pasażowania ma kluczowe znaczenie dla ustanowienia stabilnej izolacji. Podobnie jak inne komórki śródbłonka, BOEC wydają się być bardzo wrażliwe na gęstość posiewu. Jeśli gęstość poszycia po pasażowaniu jest zbyt niska, BOEC nie będą się rozmnażać. I odwrotnie, jeśli kolonie staną się nadmiernie zlewające się przed pasażem, komórki również przestaną się namnażać i będą miały tendencję do przekształcania się w wydłużony, mezenchymalny fenotyp komórek. Jeśli od 7 do 14 dnia pojawi się kilka kolonii lub jeśli kolonie są małe, rozwiązywanie problemów może obejmować zwiększenie gęstości komórek poprzez przechodzenie kolonii P0 do kolby T-25 zamiast T-75.

Po opanowaniu tej techniki, powstałe BOEC mogą być wykorzystywane w wielu zastosowaniach, w tym w badaniach in vitro biologii komórek śródbłonka, modelowaniu chorób i badaniach przesiewowych leków, a także w terapiach przeszczepów komórkowych in vivo . Ważnym czynnikiem przy opracowywaniu każdego procesu terapii komórkowej jest wykorzystanie komórek, które są wolne od mutacji patogennych. Wcześniej wykazaliśmy, że BOEC wyizolowane przy użyciu naszego protokołu posiadają genomy, które są wolne od zmian liczby kopii, a zatem są reprezentatywne dla osoby, od której zostały pobrane. Ponadto wykazaliśmy również, że większość linii iPSC pochodzących od BOEC jest wolna od zmian liczby kopii. 13 Kontrastuje to z wcześniejszymi doniesieniami o zmienności liczby kopii w iPSC pochodzących z fibroblastów. Do tej pory komórki te pozostają jedynymi iPSC, dla których odnotowano ten stopień wierności genomowej. Ta cecha jest ważna dla dziedziny biologii iPSC i wykorzystania iPSC w modelowaniu chorób, badaniach przesiewowych leków i przyszłych terapiach przeszczepiania komórek.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty fundowane przez British Heart Foundation (BHF), Dinosaur Trust, McAlpine Foundation, Fondation Leducq, Fight for Sight, Cambridge Biomedical Research Centre, National Institute of Health Research, w tym (i) BHF Oxbridge Centre of Regenerative Medicine [RM/13/3/30159], (ii) BHF Cambridge Centre of Research Excellence, (iii) Addenbrooke's Hospital, Cambridge University Hospitals NHS Foundation Trust oraz (iv) Papworth Hospital NHS Foundation Trust i wspierał Cambridge NIHR BRC Cell Phenotyping Hub. MLO jest finansowany przez BHF Intermediate Fellowship. FNK jest finansowany ze stypendium doktoranckiego BHF.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Do pobierania krwi
strzykawka 60 ml z końcówką luer-lokBD309653
19G Zestaw do infuzji Surflo WingedTerumoSV-19BL
Stożkowa probówka wirówkowa 50 mlStarLabE14502 na dawcę
Cytrynian soduMartindalePharmaceuticals 270541
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
Do izolacji kożuchowca
Ficoll-Paque PlusGE Healthcare17-1440-03
Dulbecco' s PBS (bez Ca2+ i Mg2+)Sigma-AldrichD8537
Sterylnie owinięte plastikowe pipety transferoweAppleton WoodsKC231
Turk' s RoztwórMillipore1.093E+09
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Do hodowli komórkowych, pasażowania i zamrażania komórek
Kolagen typu 1 (pochodzący z ogona szczura)BD Biosciences35-4236
Dulbecco' s PBS (bez Ca2+ i Mg2+)Sigma-AldrichD8537
0,02M Kwas octowy Sigma-AldrichA6283przygotowany w wodzie z odczynnikiem
Endothelial Growth Medium-2MV
(zawierający zestaw pocisków, ale nie serum)		LonzaCC-3202Uwaga: Istotne jest, aby podłoże nie zawierało heparyny.   
Nie używać EGM-2.
Płodowa surowica bydlęca (USA), zdefiniowanyhyklonSH30070
10x Trypsyna EDTAGibcoT4174Rozcieńczyć do 1x w PBS przed użyciem
Inaktywowany termicznie FBSGibco10500-064
DMEMGibco41965-039
DMSOSigma-Aldrich276855
Nalgene Mr. Mr. Frosty Pojemnikdo zamrażaniaSigma-AldrichC1562
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Do charakterystyki cytometrii przepływowej
FITC-sprzężony mysz anty-ludzka CD14BD 555397Mysie IgG1k, Klon: WM59
Rozcieńczenie: 1:20
Skoniugowany z FITC mysz anty-ludzka CD31BD Biosciences555445Mysza IgG1k, Klon: WM59
Rozcieńczenie: 1:20
Skoniugowany z APC mysz anty-ludzka CD34BD Biosciences555824Mysia IgG1k, Klon: 581/CD34
Rozcieńczenie: 1:20
Skoniugowany z FITC mysi anty-ludzki CD45BD Biosciences560976mysi IgG1k, Klon: HI30
Rozcieńczenie: 1:20
  Mysz skoniugowana APC anty-ludzka VEGFR2R& Systemy DFAB357Amysia IgG1, Klon: 89106
Rozcieńczenie: 1:10
Kontrola izotypu myszy sprzężonej z FITC1kKlon 555748 BD Biosciences: MOPC-21
Rozcieńczenie: 1:20
Kontrola izotypu myszy skoniugowanej z APC1k KlonBD Biosciences555751: MOPC-21
Rozcieńczenie: 1:20
Kontrola izotypu IgG1k myszy sprzężona z APCR& D SystemsIC002A
Rozcieńczenie: 1:10		Klon: 11711
EDTA, roztwór 0,5 MSigma-AldrichE7889
NazwaCompanyNumer katalogowyUwagi
Do mikroskopii immunofluorescencyjnej 
Corning Costar 24-dołkowa płytka do hodowli tkankowejSigma-AldrichCLS3527
ParaformaldehydSigma-Aldrich158127
BSASigma-AldrichA7906
Polisorbat 20Sigma-AldrichP2287
Monoklonalne mysie przeciwciało anty-ludzkie CD34R& Systemy DMAB72271klon 756510, IgG1, stosować przy 10 μ g/ml
Poliklonalna koza anty-ludzka VE-kadheryna (CD144)R& D SystemsAF938Powinowactwo do antygenu - oczyszczona IgG, zastosowanie w 1:300
Monoklonalny królik anty-ludzki czynnik von Willebranda (vWF)Abcamab154193Klon EPSISR15, stosować w 1:250
Przeciwciało drugorzędowe anty-mysie IgG (H + L) osła, koniugat Alexa Fluor 488Life TechnologiesA-21202Poliklonalny, 2 mg / ml, stosować w 1:200
Przeciwciało drugorzędowe przeciw kozom IgG (H+L) osła, koniugatAlexa Fluor 488Life TechnologiesA-11055Poliklonalny, 2 mg / ml, 1:200
Przeciwciało drugorzędowe IgG (H + L) przeciwko królikowi osła, koniugat Alexa Fluor 568Life TechnologiesA-10042Poliklonalny,  2 mg / ml, 1:200
DAPI (4&,,6-dichlorowodorek di-dimidino-2-fenyloindolu)Sigma-AldrichD9542stosować w 1 μ g/ml

Bibliografia

  1. Yancopoulos, G. D., Klagsbrun, M., Folkman, J. Vasculogenesis, angiogenesis, and growth factors: ephrins enter the fray at the border. Cell. 93, 661-664 (1998).
  2. Flamme, I., Frölich, T., Risau, W. Molecular mechanisms of vasculogenesis and embryonic angiogenesis. J Cell Physiol. 173, 206-210 (1997).
  3. Asahara, T., et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275, 964-967 (1997).
  4. Shi, Q., et al. Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells. Blood. 92, 362-367 (1998).
  5. Ormiston, M. L., Deng, Y., Stewart, D. J., Courtman, D. W. Innate immunity in the therapeutic actions of endothelial progenitor cells in pulmonary hypertension. Am J Respir Cell Mol Biol. 43, 546-554 (2010).
  6. Hur, J., et al. Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24, 288-293 (2004).
  7. Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. J Clin Invest. 105, 71-77 (2000).
  8. Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, 1801-1809 (2007).
  9. Toshner, M., et al. Transcript analysis reveals a specific HOX signature associated with positional identity of human endothelial cells. PLOS ONE. 9, e91334(2014).
  10. Toshner, M., et al. Evidence of dysfunction of endothelial progenitors in pulmonary arterial hypertension. Am J Respir Crit Care Med. 180, 780-787 (2009).
  11. Wang, J. W., et al. Analysis of the storage and secretion of von Willebrand factor in blood outgrowth endothelial cells derived from patients with von Willebrand disease. Blood. 121, 2762-2772 (2013).
  12. O'Neill, C. L., et al. Therapeutic revascularisation of ischaemic tissue: the opportunities and challenges for therapy using vascular stem/progenitor cells. Stem Cell Res & Ther. 3, 31(2012).
  13. Geti, I., et al. A Practical and Efficient Cellular Substrate for the Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Adults: Blood-Derived Endothelial Progenitor Cells. Stem Cells TM. 1, 855-865 (2012).
  14. Prasain, N., Meador, J. L., Yoder, M. C. Phenotypic and functional characterization of endothelial colony forming cells derived from human umbilical cord blood. Journal of Vis Exp: JoVE. , (2012).
  15. Martin-Ramirez, J., Hofman, M., van den Biggelaar, M., Hebbel, R. P., Voorberg, J. Establishment of outgrowth endothelial cells from peripheral blood. Nat Prot. 7, 1709-1715 (2012).
  16. Hofmann, N. A., Reinisch, A., Strunk, D. Isolation and large scale expansion of adult human endothelial colony forming progenitor cells. Journal of Vis Exp: JoVE. , (2009).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja z krwi obwodowejwirowanie w gradiencie gęstościpowlekanie kolagenemmedium do generowania BOECprotokół hodowli komórkowejmarkery komórek śródbłonkaimmunofluorescencja CD144barwienie na czynnik von Willebrandametoda kriokonserwacji
Wytwarzanie i hodowla komórek śródbłonka przerostu krwi z ludzkiej krwi obwodowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.