Wytwarzanie i hodowla komórek śródbłonka przerostu krwi z ludzkiej krwi obwodowej

Do niedawna uważano, że powstawanie nowych naczyń krwionośnych po urodzeniu następuje wyłącznie w procesie znanym jako angiogeneza, zdefiniowana jako kiełkowanie nowych naczyń z komórek śródbłonka wcześniej istniejących naczyń. ¹ Proces ten różni się od waskulogenezy, czyli tworzenia się naczyń krwionośnych de novo ze śródbłonka komórek progenitorowych, o którym sądzono, że zachodzi wyłącznie podczas embriogenezy. ² Jednak nowsze badania zidentyfikowały i wyizolowały krążące śródbłonkowe komórki progenitorowe (EPC) we krwi obwodowej dorosłych. Komórki te mają zdolność różnicowania się w dojrzałe komórki śródbłonka w hodowli i uważa się, że uczestniczą w poporodowym unaczynieniu. ^3,4

Protokoły izolacji i ekspansji tych EPC zazwyczaj obejmują hodowlę komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMNC) w pożywkach zawierających czynniki wzrostu śródbłonka, w tym czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) i czynnik wzrostu fibroblastów-2. ^5-8 kultur EPC wytwarza wiele dramatycznie różnych typów komórek. Początkowe hodowle (<7 dni) są zdominowane przez typ komórek monocytowych, znany w literaturze jako "wczesne" epc. pomimo swojej nazwy, komórki te wyrażają marker monocytów cd14, ujemne dla markera progenitorowego cd34 i tylko minimalne poziomy klasycznych markerów śródbłonka cd31 receptora vegf 2 (vegfr2). ⁵ Ciągła hodowla prowadzi do powstania wtórnej populacji komórek, znanej jako EPC późnego wzrostu lub komórki śródbłonka przerostu krwi (BOEC), które wyglądają jak dyskretne kolonie komórek podobnych do śródbłonka. W przeciwieństwie do monocytowych wczesnych EPC, BOEC, które są również nazywane komórkami tworzącymi kolonie śródbłonka (ECFC), komórkami śródbłonka wzrostu lub komórkami śródbłonka o późnym wzroście, wykazują morfologię brukową, która jest typowa dla monowarstw komórek śródbłonka i są bardzo podobne pod względem markera powierzchniowego⁵ i ekspresji genu⁹ do dojrzałych komórek śródbłonka.

Generowanie komórek podobnych do śródbłonka z krwi obwodowej oferuje kilka korzyści, szczególnie do badania dysfunkcji komórek śródbłonka związanych z zaburzeniami naczyniowymi, takimi jak tętnicze nadciśnienie płucne (PAH)¹⁰ lub choroba von Willebranda. ¹¹ Przed pojawieniem się BOEC komórki śródbłonka można było pozyskać tylko z eksplantowanych narządów w chwili śmierci lub przeszczepu narządu lub wyizolować z żyły pępowinowej po urodzeniu. Ta zmniejszona dostępność stanowiła poważne ograniczenie w zrozumieniu biologii komórek śródbłonka u pacjentów z zaburzeniami sercowo-naczyniowymi, a także interakcji między komórkami śródbłonka a komórkami krwi lub komórkami ściennymi. Co więcej, wyizolowanie i wyhodowanie czystej populacji komórek śródbłonka z tych źródeł jest technicznie trudne, a komórki uzyskane tymi metodami wykazują jedynie ograniczoną zdolność proliferacyjną. BOEC stanowią zatem cenny substytut izolacji i hodowli pierwotnych komórek śródbłonka pochodzących od pacjenta.

Oprócz zastosowań in vitro, BOEC są również potencjalnie użyteczne w terapiach autologicznych przeszczepów komórek. Zastosowania te obejmują zarówno przeszczep komórek śródbłonka w celu promowania neowaskularyzacji (patrz ¹² i odniesienia w nim), jak i wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). ¹³ iPSC pochodzących z BOEC może być wykorzystywanych do modelowania chorób i oferują ogromny potencjał jako materiał wyjściowy dla autologicznych terapii komórkowych. BOEC przeprogramowują się szybciej i z większą wydajnością niż fibroblasty skóry. Co więcej, BOEC pozwalają również na wytwarzanie iPSC, które są wolne od nieprawidłowości kariotypowych, co jest istotną cechą każdej technologii, która będzie odpowiednia do zastosowań translacyjnych. Możliwość generowania iPSC z próbki krwi pacjenta eliminuje również potrzebę biopsji skóry i wytwarzania fibroblastów skóry, ułatwiając w ten sposób wytwarzanie komórek od pacjentów z zaburzeniami gojenia się ran lub bardzo młodych.

Protokół opisany poniżej, zatwierdzony i przeprowadzony zgodnie z wytycznymi Komitetu Służby Etyki Badań Naukowych (Wschodnia Anglia), zapewnia prostą i niezawodną metodę generowania BOEC o skuteczności większej niż 90% ze stosunkowo małej objętości (60 ml) krwi obwodowej. Komórki te są wysoce proliferacyjne i mogą być wielokrotnie pasażowane, co pozwala na wytworzenie setek milionów komórek z jednej próbki krwi.

Schemat protokołu generowania BOEC jest pokazany na rysunku 1.

1. Pobieranie krwi i wirowanie w gradiacji gęstości

1. Dla każdego dawcy dodać 3 ml cytrynianu sodu do każdej z dwóch stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml. Zebrać 60 ml krwi przez nakłucie dożylne i dodać 30 ml do każdej probówki. Delikatnie odwróć 2-3 razy, aby wymieszać. W protokole należy użyć zaledwie 40 ml krwi, odpowiednio dostosowując objętość cytrynianu.
   UWAGA: Istotne jest, aby próbki krwi zostały przetworzone w ciągu 2 godzin od pobrania. Opóźnione przetwarzanie krwi powoduje znaczne zmniejszenie plonu kolonii przerostowych.
2. Przygotuj nowe stożkowe probówki zawierające pożywkę wirową z gradientem gęstości, najpierw kilkakrotnie odwracając butelkę w celu wymieszania. W sterylnym kapturze dodać 15 ml pożywki wirowej z gradientem gęstości na 50 ml stożkową probówkę (1 probówka na każde 10 ml krwi, 6 probówek na dawcę).
3. Rozcieńczyć krew w stosunku 1:1 solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco. Przechylić probówkę zawierającą pożywkę wirującą w gradiencie gęstości pod kątem 20° z powierzchnią roboczą. Używając pipety i pipety serologicznej o pojemności 25 ml, powoli nałóż 21 ml rozcieńczonej krwi na wierzch pożywki, stopniowo dodając krew w dół ścianki przechylonej probówki.
   UWAGA: Zminimalizuje to mieszanie się krwi z warstwą gradientu gęstości i zapewni ciaśniejszą kożuchową powłokę, a także zwiększoną wydajność.
4. Odwirować próbki o masie 400 x g przez 35 minut w temperaturze pokojowej przy wyłączonym akceleratorze i hamulcu.
5. Podczas tego okresu wirowania rozpocznij powlekanie kolagenu szczegółowo w krokach 2.1 - 2.4. Upewnij się, że te kroki zostały wykonane przed przejściem do kroku 3.1.

2. Powłoka kolagenowa kolby T-75 i przygotowanie pożywki hodowlanej

UWAGA: Wykonaj następujące kroki w kapturze do hodowli komórkowej.

1. Przygotuj roztwór kolagenu o stężeniu 50 μg/ml, rozcieńczając podstawowy kolagen typu I w 10 ml 0,02M kwasu octowego. Przykład: dla wywaru kolagenowego w stężeniu 4,05 mg/ml dodaj 123,5 μl kolagenu do 10 ml 0,02 M kwasu octowego. Sterylny filtr zawiesinowy kolagenu przed użyciem.
2. Za pomocą pipety serologicznej dodać 7,5 ml roztworu kolagenu do kolby do hodowli komórek T-75. Objętość ta daje 5 μg kolagenu/^cm2 (lub 375 μg/kolbę). Kolba na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
3. Przygotować śródbłonkową pożywkę wzrostową używaną do wytwarzania BOEC, uzupełniając śródbłonkowe podłoże podstawowe suplementami czynnika wzrostu dostarczonymi przez producenta. Dodaj wszystkie suplementy, ale nie dodawaj serum. Aby przygotować 15 ml pożywki wytwarzającej BOEC, należy dodać 2,5 ml zdefiniowanej płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do 12,5 ml pożywki do wzrostu śródbłonka zawierającej suplementy czynnika wzrostu.
4. Postępuj zgodnie z krokami opisanymi w sekcji 3. Po upływie 1 godziny powlekania należy odessać roztwór kolagenu i zmyć pozostałości kwasu octowego za pomocą pipetowania w 10 ml DPBS. Odessać DPBS i powtórzyć ten krok mycia jeszcze raz. Jeśli zawiesina komórek uzyskana w kroku 3.3 nie jest w tym momencie gotowa do posiewu, dodaj 5 ml pożywki do wytwarzania BOEC do kolby, aby zapobiec wysychaniu powłoki kolagenowej.

3. Zbieranie i powlekanie PBMNC

1. Po odwirowaniu w gradiencie gęstości opisanym w kroku 1.4 ostrożnie zebrać warstwę kożucha za pomocą sterylnej plastikowej pipety transferowej. Pobranie kożucha powinno dać około 20 ml zawiesiny komórkowej i osocza z każdej probówki. Unikaj przenoszenia medium gradientu gęstości.
2. Rozcieńczyć zawiesinę komórek jednojądrzastych w stosunku 1:1 w DPBS i odwrócić do mieszania. Wirować w temperaturze pokojowej przez 20 minut przy 300 x g z maksimum hamulcem i przyspieszeniem.
3. Po odwirowaniu odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki, dodając 1 ml pożywki do wytwarzania BOEC do każdej osadki i wielokrotnie pipetując w górę iw dół. Zebrać zawiesiny komórek i uzupełnić całkowitą objętość do 10 ml pozostałą pożywką.
4. Aby oszacować całkowitą liczbę komórek, należy pobrać próbkę 10 μl zawiesiny komórkowej i rozcieńczyć 50 razy 490 μl roztworu Turka, który spowoduje lizę czerwonych krwinek. Odliczyć 10 μl próbki rozcieńczonej zawiesiny komórek za pomocą hemocytometru.
   UWAGA: 60 ml krwi powinno dać około 100-150 x 10⁶ białych krwinek do posiewu.
5. Zawiesinę całych komórek umieścić w pojedynczej, pokrytej kolagenem kolbie T-75, uzupełnić pożywkę do objętości 15 ml / kolbę i wyhodować w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO₂ . Komórki posiane w tym czasie reprezentują przejście 0,
   UWAGA: Możliwe jest zamrożenie wyizolowanych PBMNC przed izolacją BOEC w celu uzyskania BOEC w późniejszym czasie lub w celu przetransportowania PBMNC do innego laboratorium, w którym można wytworzyć BOEC. Należy jednak zauważyć, że zamrożenie PBMNC może zmniejszyć skuteczność izolacji BOEC. Patrz sekcja 8 poniżej, aby zapoznać się z metodą.

4. Długoterminowa hodowla komórkowa

1. Zmieniaj pożywkę co 2 dni, dodając 15 ml świeżej pożywki generacji BOEC (mieszanina 5:1 pożywki do wzrostu komórek śródbłonka i zdefiniowanego FBS). W weekendy średnie zmiany mogą być opóźnione do co 3 dni.
   UWAGA: Kolonie wyrostka powinny pojawić się między 7 a 14 dniem hodowli.
2. Monitorować kolbę hodowlaną BOEC w dniach 7-14 pod kątem pojawienia się kolonii odrostowych. Zidentyfikuj kolonie jako okrągłe grupy komórek wykazujące klasyczną morfologię śródbłonka bruku.
3. Po zidentyfikowaniu kolonii lub wielu kolonii w kolbie, należy kontynuować zmiany pożywki i pozwolić koloniom urosnąć do około 1000 do 2000 komórek na kolonię przed pasażowaniem. Określ liczbę komórek w kolonii za pomocą przybliżonego oszacowania wizualnego.
   UWAGA: Jako wskazówkę, zwyczajowo przechodzi się przez początkowe kolonie wyrostki tydzień po zidentyfikowaniu pierwszej kolonii odrostowej.
4. Komórki przepuszczać przez dwukrotne przepłukanie kolb 10 ml DPBS. Dodać 5 ml 1X trypsyna-EDTA i inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 5 minut. Po 5 minutach zneutralizować trypsynę 10 ml pożywki (zawierającej FBS) i wprowadzić komórki do zawiesiny, powtarzając pipetowanie.
5. Odwirować zawiesinę o sile 300 x g przez 5 minut, ponownie zawiesić w 15 ml świeżej pożywki BOEC i umieścić zawiesinę całych komórek w nowej kolbie T-75 (reprezentującej pasaż 1, P1). Nie jest wymagana powłoka kolagenowa.
6. Kontynuuj zmiany pożywki zgodnie z powyższym opisem, aż komórki zaczną się zlewać (około 3-5 x 10,⁶ komórek na kolbę). Po zlewaniu się komórki pasażowe zgodnie z opisem w kroku 4.3.
   UWAGA: Począwszy od pasażu 2, komórki nie wymagają już pożywki do wytwarzania BOEC i mogą być hodowane w pożywce do wzrostu komórek śródbłonka i 10% standardowym FBS inaktywowanym termicznie. Powlekanie kolagenem może być stosowane jako opcjonalny krok w przyszłości, ponieważ istnieją dowody sugerujące, że obecność kolagenu może zwiększyć tempo proliferacji BOEC.
7. W celu dalszego pasażowania należy płytkować nie mniej niż 750 000 komórek na kolbę T-75, ponieważ niska gęstość komórek może spowodować zatrzymanie proliferacji BOEC.

5. Zamrażanie i rozmrażanie kultur BOEC

1. Trypsynizować komórki zgodnie z opisem w sekcji 4.3 i odwirowywać przy 300 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić w 10 ml pożywki. Nie wymaga to pożywki do wzrostu komórek śródbłonka; DMEM z 10% standardowym FBS będzie wystarczający. Pobrać 10 μl próbki zawiesiny komórek, aby przeprowadzić ręczne zliczanie komórek za pomocą hemocytometru.
2. Ponownie odwirować i ponownie zawiesić przy 2x10⁶ komórek/ml w lodowato zimnym podłożu do kriokonserwacji (40% DMEM z 50% FBS i 10% DMSO). Dodać 0,5 ml (10⁶ komórek) do każdej fiolki, umieścić fiolki w lodowatym naczyniu do kriokonserwacji izopropanolu i umieścić w zamrażarce o temperaturze -80 °C na co najmniej 2 godziny przed przeniesieniem do ciekłego azotu. Nie pozostawiaj komórek w temperaturze -80 °C na dłużej niż 24 godziny.
3. Aby rozmrozić komórki, dodaj 10 ml wstępnie podgrzanej pożywki do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
   UWAGA: Podczas rozmrażania komórek pasażowych 1 rozmrażaj się w pożywce do wzrostu komórek śródbłonka uzupełnionej 20% zdefiniowanym FBS przez pierwsze 2 dni po rozmrożeniu. Prowadzi to do bardziej stabilnej izolacji komórek w przyszłości.
4. Usunąć komórki z ciekłego azotu i rozmrozić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, delikatnie mieszając, aż w fiolce pozostanie tylko mały kryształek lodu. Dodawać kroplami zawartość fiolki do stożkowej probówki wirówkowej i wirować do 300 x g przez 5 minut.
5. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 ml EGM-2MV+10%FBS. Dodać do kolby T-75 i uzupełnić pożywką do 15 ml.

6. Charakterystyka BOEC za pomocą cytometrii przepływowej

1. Po umożliwieniu ekspansji kolonii BOEC opisanej w sekcji 4, trypsynizować komórki zgodnie z opisem w sekcji 4.4 i ponownie zawiesić w stężeniu 10-6 komórek na ml w buforze barwiącym (DPBS z 2% FBS i 2 mM EDTA).
2. Połącz 10⁵ komórek z przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromem skierowanymi przeciwko CD45, CD14, CD34, CD31 (użyć wszystkich w rozcieńczeniu 1:20) lub VEGFR2 (rozcieńczyć 1:10) (szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli 1). Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.
3. Przemyć komórki 1 ml buforu barwiącego i odwirować przy 300 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić w 400 μl buforu barwiącego do analizy. Przechowywać komórki w temperaturze 4 °C i chronić przed światłem przed analizą.
4. Przeprowadzić analizę cytometryczną na cytometrze wyposażonym w wykrywanie fluorescencyjnie sprzężonych przeciwciał użytych w teście.
5. Użyj niebarwionej próbki BOEC, aby zidentyfikować populację komórek na cytometrze, dostosowując napięcia rozpraszania do przodu i boku, a także napięcia dla kanałów FITC i APC.
6. Określ progi bramkowania za pomocą komórek barwionych izotypem dla każdego fluorochromu. Oceń dodatniość dla każdego markera powierzchni komórki na podstawie obecności szczytowego przesunięcia intensywności fluorescencji w porównaniu z kontrolą izotypu dla analizowanego fluorochromu.

7. Charakterystyka BOEC za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej

1. Umieścić BOEC w 24-dołkowej, płaskodennej płytce do hodowli tkankowej bez szkiełek nakrywkowych o gęstości 5 x 10⁴ komórki w 500 μl pożywki do wzrostu komórek śródbłonka + 10% inaktywowanego termicznie FBS na studzienkę i pozostawić do przylegania i wzrostu w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ do momentu, gdy komórki pokryją co najmniej 70-80% powierzchni każdej studzienki (oszacować zbieg przez oględziny pod lekkim mikrozopem).
2. Myć komórki w każdym dołku przez 5 minut 1 ml DPBS.
3. Utrwalić komórki O/N w temperaturze 4 °C za pomocą 500 μl 4% roztworu paraformaldehydu w DPBS.
4. Myć komórki przez 3 x 5 minut 1 ml DPBS na studzienkę. Dodaj i wyjmij DPBS za pomocą odpowiednio pipety i aspiratora.
5. Przepuszczalność komórek przez 3 x 10 min z 0,2% polisorbatem 20 w DPBS.
6. Inkubować komórki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w buforze blokującym zawierającym 10% FBS w DPBS.
7. Komórki barwione w temperaturze 4 °C O/N w 300 μl buforu do rozcieńczania przeciwciał (0,1% albuminy surowicy bydlęcej w DPBS) zawierającego pierwszorzędowe przeciwciała skierowane przeciwko CD34 (10 μg/ml), CD144 (1:300) lub vWF (1:250). Szczegółowe informacje można znaleźć w tabeli 1.
8. Niezwiązane przeciwciała pierwszorzędowe zmywać przez 5 x 10 minut za pomocą DPBS.
9. Inkubować komórki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym znakowanym fluorescencyjnie, jak opisano w Tabeli 1 (wszystkie w stosunku 1:200).
10. Niezwiązane przeciwciała drugorzędowe zmywać przez 5 x 10 minut za pomocą DPBS.
11. Inkubować komórki z 1 μg/ml 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) w DPBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
12. Myć komórki DPBS przez kolejne 3 x 5 minut.
13. Obrazuj komórki w 100-krotnym powiększeniu za pomocą odwróconego mikroskopu wyposażonego w zewnętrzne źródło światła do wzbudzenia fluorescencji i rejestruj obrazy za pomocą dołączonej kamery cyfrowej w celu późniejszej analizy w trybie offline.

8. Zamrażanie i rozmrażanie PBMNC

1. Pod koniec etapu 3.2, po odwirowaniu, należy odessać pożywkę i ręcznie rozbić osad komórkowy poprzez wielokrotne pipetowanie w górę i w dół za pomocą końcówki do pipety P1000. Dodaj 1 ml pożywki do zamrażania, 90% serum i 10% DMSO, upewniając się, że delikatnie mieszasz, aby uzyskać zawiesinę komórkową. Przenieść zawiesinę komórek do kriowialnego i zamrozić i rozmrozić zgodnie z opisem w sekcji 5.

Izolacja komórek jednojądrzastych kożucha kożucha z 60 ml krwi zazwyczaj daje 100-150x106 białych krwinek. Po umieszczeniu w pojedynczej kolbie T-75 duża liczba komórek w niezlizowanej zawiesinie komórek utrudnia rozdzielenie pojedynczych przylegających komórek przy użyciu mikroskopii jasnego pola. Powtarzające się zmiany pożywki powodują usunięcie nieprzylegających komórek i pozwalają na wizualizację przylegającej populacji monocytowych "wczesnych" EPC. W dniu 7 T-75 będzie zawierał około 7x106 tych wydłużonych przylegających komórek. Od 7 do 14 dnia w kolbie powinny pojawić się kolonie BOEC (ryc. 2A). Kolonie pojawiają się najpierw jako 3 do 5 sąsiadujących ze sobą komórek. Liczba kolonii rozrostu może wahać się od 1 do 10 kolonii na 60 ml krwi. Ogólnie rzecz biorąc, młodsi dawcy (tj. w wieku 20-25 lat) mają tendencję do wytwarzania większej liczby kolonii wyrostowych, które również pojawiają się wcześniej w kulturze. BOEC namnażają się z tej centralnej grupy komórek, tworząc okrągłe kolonie składające się z kilkuset komórek. Komórki w tych koloniach wykazują klasyczną morfologię śródbłonka bruku.

Lepiej jest przechodzić przez początkowe kolonie, gdy zawierają one około 1000 komórek na kolonię. Kolonie rozrostowe zazwyczaj osiągają ten rozmiar 7 dni po ich pierwotnym pojawieniu się w kulturze. Gdy pierwotne kolonie zostaną przeniesione do nowej kolby T-75, powinny się namnażać, tworząc zlewającą się monowarstwę (3-5x106 komórek na kolbę) w ciągu 5 dni lub krócej (Figura 2B). W niewielkim odsetku izolacji (<10%) kolonie przerostu nie pojawiają się lub nie rozmnażają się wystarczająco po tym początkowym etapie pasażowania. BOEC, które wykazują niską proliferację po pierwszym pasażu, rzadko przechodzą w stabilne izolacje BOEC i często przestają się namnażać w ciągu dwóch do trzech pasaży. Monocytowe wczesne EPC zawarte w kulturach BOEC są nieproliferacyjne i są zwykle usuwane z kultur w ciągu 1-2 pasaży. Klirens tych wczesnych komórek jest spowodowany śmiercią komórki, niezdolnością wczesnych komórek do ponownego przylegania po pasażowaniu i rozcieńczeniem nieproliferacyjnych wczesnych EPC z powtarzającym się pasażowaniem.

Komórki pasażu 1 mogą być albo dalej pasażowane w hodowli, albo zamrożone do późniejszego wykorzystania. Po wygenerowaniu stabilnej izolacji, komórki mogą być pasażowane z szybkością 1 kolby zlewającej się do 3-5 nowych kolb T-75 aż do przejścia 8 lub 9 przed stanem spoczynku. Ponownie, gęstość komórek ma kluczowe znaczenie w całej hodowli. Z naszego doświadczenia wynika, że nie mniej niż 750 000 komórek powinno być posianych w kolbie T-75, ponieważ niższa gęstość komórek może powodować zatrzymanie wzrostu. Pomimo wysokiego potencjału proliferacyjnego BOEC, nie należy również dopuścić do nadmiernej konfluencji komórek (tj. >5x106 komórek na kolbę), ponieważ może to spowodować konwersję BOEC do fenotypu nieproliferacyjnego.

Proponujemy, aby każda komórka oznaczona jako BOEC wykazywała odpowiednią powierzchnię komórki i wewnątrzkomórkowe zabarwienie dla markerów śródbłonka. Charakterystykę BOEC można uzyskać za pomocą cytometrii przepływowej (ryc. 3) lub mikroskopii fluorescencyjnej (ryc. 4), po barwieniu typowych markerów komórek śródbłonka. BOEC są dodatnie dla markerów powierzchni śródbłonka CD31 i VEGFR2 oraz ujemne dla markera monocytów CD14 i markera panleukocytów CD45. BOEC posiadają również ciała Weibela-Paladego, a tym samym wyrażają czynnik von Willebranda (vWF) jako dyskretne, punktowe barwienie cytoplazmatyczne. W przeciwieństwie do innych dojrzałych typów komórek śródbłonka, takich jak komórki śródbłonka tętnicy płucnej lub aorty, BOEC również wyrażają na swojej powierzchni marker progenitorowy i aktywacyjny CD34.

Rysunek 1. Schemat ideowy protokołu generowania BOEC. Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej izoluje się z krwi żylnej przez wirowanie w gradionym spadku gęstości i hoduje na płytkach pokrytych kolagenem w pożywce wzrostowej śródbłonka zawierającej zdefiniowany FBS. Kolonie BOEC pojawiają się w ciągu 7-14 dni od hodowli. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Obrazy w jasnym polu reprezentatywnych kultur BOEC. (A) Kolonie przerostowe pojawiają się w kulturach między 7 a 14 dniem. Kolonie występują jako zbiory komórek podobnych do śródbłonka, które są ułożone w monowarstwę brukową i proliferują promieniście od centralnego punktu. Wokół kolonii wyrostkowych znajdują się przylegające komórki monocytowe, które stanowią zdecydowaną większość komórek we wczesnych hodowlach. Komórki te, wcześniej opisane jako "wczesne" śródbłonkowe komórki progenitorowe, mają wrzecionowatą morfologię i wyrażają marker monocytowy CD14. (B) Po pasażowaniu wysoce proliferacyjne BOEC przejmują kultury, ponieważ nieproliferacyjne komórki monocytowe albo obumierają, albo nie łączą się ponownie po pasażowaniu. Podziałka 250μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Charakterystyka BOEC za pomocą cytometrii przepływowej. BOEC trypsynizowano i barwiono fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami kontrolnymi izotypu (szary pik) lub przeciwciałami skierowanymi przeciwko specyficznym markerom powierzchniowym (czerwona linia). Markery powierzchniowe do charakterystyki cytometrycznej obejmują markery krwiotwórcze CD45 i CD14, markery śródbłonka CD31 i VEGFR2 oraz marker aktywacji progentiora i śródbłonka CD34. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Barwienie immunofluorescencyjne BOEC pod kątem markerów komórek śródbłonka. Reprezentatywne obrazy immunofluorescencyjne BOEC wybarwionych immunologicznie przeciwciałami skierowanymi przeciwko markerowi powierzchni komórek śródbłonka CD144 (VE-kadheryna, prawy górny panel) i glikoproteinie krwi z czynnikiem Willebranda (vWF, prawy dolny panel). Odpowiednie panele pokazujące barwienie jądrowe DAPI są pokazane po lewej stronie. Podziałka 50μm. dla CD144. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.