Method Article

Izolacja i analiza składu monomerów lipidowych poliestrowych naskórków roślin

DOI:

10.3791/53386

⸱

November 22nd, 2015

 , 
1Department of Biology, Algoma University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poliestry lipidowe stanowią składniki strukturalne dwóch modyfikacji ściany komórkowej, naskórka roślinnego i barier dyfuzyjnych zawierających suberynę. W tym filmie opisujemy metodę depolimeryzacji kutyny z całych zdelipidowanych liści. Metoda ta może być stosowana do badania mutantów upośledzonych w biosyntezie kutyny lub suberyny.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rośliny lądowe wytwarzają zewnątrzkomórkowe alifatyczne biopoliestry, które modyfikują ściany komórkowe określonych tkanek. Komórki naskórka syntetyzują kutynę, poliester glicerolu i zmodyfikowane kwasy tłuszczowe, który stanowi szkielet naskórka pokrywającego powierzchnie roślin nadziemnych. Suberyna jest pokrewnym poliestrem lipidowym, który osadza się na ścianach komórkowych niektórych tkanek, w tym na endodermie korzenia i perydermie bulw, kory i korzeni drzew. Te polimery lipidowe mają bardzo zmienny skład chemiczny wśród gatunków roślin i często różnią się między tkankami w obrębie jednego gatunku. Tutaj opisujemy szczegółowy protokół badania składu monomeru kutyny w liściach Arabidopsis thaliana za pomocą depolimeryzacji katalizowanej mettlenkiem sodu (NaOMe), derywatyzacji, a następnie analizy metodą chromatografii gazowej ze spektrometrią mas (GC / MS). Metoda ta może być stosowana do badania monomerów nierozpuszczalnych poliestrów wyizolowanych z całych odlipidowanych tkanek roślinnych zawierających kutynę lub suberynę. Metoda ta może być stosowana nie tylko do charakteryzowania składu polimerów lipidowych u gatunków, które nie były wcześniej analizowane, ale także jako narzędzie analityczne w zaawansowanych i odwrotnych podejściach genetycznych do oceny funkcji genów kandydujących.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rośliny naczyniowe polegają na warstwach zewnątrzkomórkowych, które funkcjonują jako wodoodporne bariery między tkankami roślinnymi a środowiskiem zewnętrznym. Te lipofilowe struktury związane ze ścianą komórkową ograniczają infekcje chorobotwórcze i regulują bierny transport gazów, wody i rozpuszczonych substancji do i z tkanek roślinnych1. Takimi barierami są naskórek roślinny, struktura synapomorficzna unikalna dla roślin2 oraz różne bariery dyfuzyjne zawierające suberynę. Naskórek jest warstwą oleofilową syntetyzowaną przez komórki naskórka i związaną z nimi warstwą pektynową po zewnątrzkomórkowej stronie ściany komórkowej3-5. Otacza podstawowe organy powietrzne roślin wyższych, funkcjonując jako istotny interfejs między tkankami roślinnymi a środowiskiem.

Kutyna, strukturalna matryca naskórka, i suberyna to dwa nierozpuszczalne poliestry glicerolipidowe związane z woskami ekstrahowanymi rozpuszczalnikiem2,4. Te polimerowe lipidy składają się z nasyconych i nienasyconych pochodnych kwasów tłuszczowych i są podobne zarówno strukturalnie, jak i funkcjonalnie. Różnią się one jednak charakterystycznymi różnicami w składzie chemicznym i miejscach osadzania.

Suberin to alifatyczny poliester znajdujący się wewnątrz ścian komórkowych pewnych zewnętrznych i wewnętrznych tkanek, tworzących ścianę wtórną. Tkanki suberyzowane obejmują perydermę korzeni, bulwy i korę drzew, endodermę korzeni, warstwy okrywy nasiennej i zagojone rany2. W przeciwieństwie do kutyny, poliester suberynowy zazwyczaj zawiera alkohole, nasycone i jednonienasycone kwasy dikarboksylowe oraz dużą ilość monomerów o bardzo długich łańcuchach (C≥20).

Kutyna jest najobficiej występującym poliestrem lipidowym w roślinach naczyniowych6 i składa się z glicerolu i C16-C18 odsetki kwasów tłuszczowych, takich jak hydroksy i hydroksy-epoksydowe kwasy tłuszczowepodstawione 4. Chociaż skład polimerów kutyny różni się w zależności od gatunku tracheofitów, najbardziej dominującymi monomerami pierwszorzędowymi są kwasy tłuszczowe 10, 16-dihydroksy 16:0, 18-hydroksy-9,10-epoksydowe 18:0 i 9,10,18-trihydroksy 18:0. Co ciekawe, kutyna liści i łodyg rzodkiewnika składa się głównie z kwasu dikarboksylowego 18:2 7,8.

Skórki roślin również wykazują znaczną zmienność grubości, od kilku nanometrów do kilku mikrometrów9. Ponieważ izolacja naskórka jest pracochłonnym i czasochłonnym etapem, szczególnie w przypadku bardzo cienkich skórek liści, takich jak Arabidopsis thaliana8, opracowano i zwalidowano metody omijania naskórka7,8. Tutaj opisujemy szczegółowy protokół badania składu monomeru kutyny w liściach Arabidopsis thaliana poprzez depolimeryzację katalizowaną mettlenkiem sodu (NaOMe) i późniejszą analizę chromatografii gazowej / spektrometrii mas (GC / MS). Protokół ten oferuje solidną metodę oznaczania składu poliestrów lipidowych roślin w całych odlipidowanych tkankach i został zaadaptowany z wcześniej zgłoszonych protokołów7,10,11. Próbki całych tkanek są najpierw homogenizowane i wyczerpująco delipidowane, usuwając lipidy ekstrahowane rozpuszczalnikiem, w tym woski kutykularne i naskórkowe, lipidy błonowe i triacyloglicerole. Reszty wzbogacone w ścianę komórkową są następnie depolimeryzowane do składowych monomerów estrów metylowych w procesie metalizy katalizowanej metatlenkiem sodu. Estry metylowe kwasów tłuszczowych są ekstrahowane po zakwaszeniu i derywatyzowane w celu uzyskania odpowiadających im pochodnych trimetylosililu lub acetylu. Reszty derywatyzowane są wysoce lotne i mogą być eluowane z kolumny chromatografii gazowej w rozsądnej temperaturze bez zmiany ich konformacji strukturalnej podczas analizy GC/MS.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uwaga: Ten protokół został zaadaptowany z Bonaventure et al. (2004), Molina et al. (2006), Li et al. (2013)7,10,11. Kroki 1-5 podsumowano na rysunku 1.

1. Delipidacja tkanek

Uwaga: Zawsze płucz wszystkie szklane naczynia i nakrętki chloroformem, pozostawiając do wyschnięcia pod wyciągiem, przed użyciem.

UWAGA: Przeprowadzaj homogenizację tkanek i wszystkie etapy transferu rozpuszczalnika pod kapturem oparów; zawsze noś fartuch laboratoryjny, rękawice i okulary chroniące przed rozpryskiwaniem, aby uniknąć bezpośredniego kontaktu z chemikaliami i chronić próbki przed zanieczyszczeniem.

  1. Podgrzej łaźnię wodną i blok grzewczy do 85 °C.
  2. Zważyć około 0,5 g każdej próbki liścia do wstępnie zważonych szklanych probówek o wymiarach 20 mm x 125 mm z nakrętkami pokrytymi politetrafluoroetylenem (PTFE). Dołączyć cztery kontrpróby do próbki.
  3. Umieścić 2-propanol w kolbie Erlenmeyera (około 125 ml; 25 ml na g próbki). Dodać 2,6-di-tert-butylo-4-metylofenol (znany również jako butylowany hydroksytoluen, BHT) do końcowego stężenia 0,01% (w/v).
    Uwaga: Dodaj BHT z 5% (w/v) roztworu podstawowego w metanolu (BHT pomaga zminimalizować utlenianie nienasyconych kwasów tłuszczowych).
  4. Podgrzać roztwór 2-propanolu do temperatury 85 °C w łaźni wodnej.
  5. Dodać 12 ml gorącego rozpuszczalnika 2-propanolowego do każdej probówki z próbką i ogrzewać przez 15 minut w temperaturze 85 °C w bloku grzewczym. Ten etap dezaktywuje lipazy, które mogą być uwalniane z uszkodzonych komórek.
  6. Pozostaw probówki do ostygnięcia do temperatury pokojowej i dokładnie zmiel tkankę homogenizatorem, aż do uzyskania jednorodnej zawiesiny.
  7. Umieścić próbki w wytrząsarce orbitalnej i wstrząsać przez 1-2 godziny przy 100 obr./min i temperaturze pokojowej.
  8. Wirować przez 10 minut przy 800 x g i odrzucić supernatant.
  9. Dodaj równą objętość 2-propanolu i wstrząsaj przez 12 godzin w temperaturze pokojowej.
  10. Wirować przez 10 minut przy 800 x g i odrzucić supernatant.
  11. Dodać 12 ml CHCl3:CH3OH (2:1, v/v) do pozostałości (25 ml na g próbki) i wstrząsać przez noc przy 100 obr./min w temperaturze pokojowej.
  12. Wirować przez 10 minut przy 800 x g i odrzucić supernatant.
  13. Dodać 12 ml CHCl3:CH3OH (1:2, v/v) do pozostałości i wstrząsać przez noc w temperaturze 100 obr./min.
  14. Wirować przez 10 minut przy 800 x g i usunąć rozpuszczalnik.
  15. Pozostaw próbki do wyschnięcia pod wyciągiem przez noc w temperaturze pokojowej.
  16. Pozostałość wysuszyć na powietrzu, a następnie umieścić w eksykatorze próżniowym nad bezwodnym CaCl2 lub CaSO4 do osiągnięcia stałej masy (3-5 dni).

2. Depolimeryzacja: Metaniza z metlenkiem sodu (Rysunek 2)

UWAGA: Wykonaj kroki 2.3 – 2.4, 2.7 – 2.8, 2.10 – 2.11, 2.13 – 2.15 i 2.17 – 2.18 pod wyciągiem; zawsze noś fartuch laboratoryjny, rękawice i okulary chroniące przed rozpryskami.

  1. Rozgrzej blok grzejny do 60 °C.
  2. Zważyć probówki zawierające suchą pozostałość (ważne dla dalszych obliczeń).
  3. Do każdej probówki dodać wzorce wewnętrzne: 25 ωl heptadekanianu metylu (1 mg/ml podstawy) i 25 μl ω-pentadekalaktonu (1 mg/ml bulwentu).
  4. Dodaj 0,9 ml octanu metylu, 1,5 ml mettlenku sodu i 3,6 ml metanolu do każdej probówki i zakorkuj je. Alternatywnie, należy przygotować mieszaninę reakcyjną z tymi trzema odczynnikami i dodać 6 ml podwielokrotności do każdej próbki.
  5. Podgrzewać próbki przez 2 godziny w temperaturze 60 °C i okresowo wirować w odstępach 15-minutowych.
  6. Pozwól próbkom ostygnąć do temperatury pokojowej.
  7. Dodać 10 ml dichlorku metylenu (CH2Cl2) i 1,5 ml lodowatego kwasu octowego w celu ekstrakcji estrów metylowych kwasów tłuszczowych.
  8. Dodaj roztwór soli fizjologicznej (0,5 M NaCl), aby napełnić każdą probówkę i nakrętkę.
  9. Wirować próbki przez 1 minutę i wirować przez 10 minut przy 800 x g.
  10. Przenieś fazę organiczną (dolną) do czystych probówek średniej wielkości (szklane probówki 16 x 125 mm z nakrętką z politetrafluoroetylenu (PTFE)).
  11. Dodaj roztwór soli fizjologicznej (0,5 M NaCl), aby napełnić każdą probówkę i nakrętkę.
  12. Wirować próbki przez 1 minutę i wirować przez 10 minut przy 800 x g.
  13. Usunąć fazę wodną (górną) i powtórzyć kroki 2.11-2.12.
  14. Usuń całą fazę wodną (górną).
  15. Dodać bezwodny siarczan sodu (Na2SO4) do rozpuszczalnika, zakryć probówki i wirować przez 1 minutę; próbki można teraz pozostawić do następnego dnia. W tym momencie próbki można pozostawić na noc pod wyciągiem.
  16. Wirować przez 2 minuty przy 800 x g, aby zagęścić sól Na2SO4 na dnie.
  17. Przenieś fazę organiczną do małej szklanej jednorazowej probówki (szklane probówki 13 x 100 mm z nakrętką z politetrafluoroetylenu (PTFE)).
  18. Odparować rozpuszczalnik do sucha pod azotem i przejść do etapu derywatyzacji. Jeżeli próbki nie zostaną natychmiast poddane obróbce, należy je przechowywać w temperaturze -20 °C (próbki można również przechowywać przed etapem odparowywania).

3. Przygotowanie pochodnych do chromatografii gazowej

UWAGA: Wykonaj kroki 3.1.2 i 3.1.5 – 3.1.8 pod wyciągiem; zawsze noś fartuch laboratoryjny, rękawice i okulary chroniące przed zachlapaniem.

  1. Pochodne trimetylosililu
    1. Rozgrzej blok grzewczy do 100 °C.
    2. Dodać 100 μl pirydyny i 100 μl BSTFA (N,O Bis-trimetylosililo-trifluoroacetamid) do każdej probówki i zakryć je.
    3. Podgrzewać próbki w temperaturze 100 °C przez 10 minut.
    4. Pozwól próbkom ostygnąć do temperatury pokojowej.
    5. Odparować próbki w atmosferze azotu w temperaturze pokojowej. Unikaj podgrzewania próbek, na tym etapie monomery są bardzo lotne.
    6. Dodać 500 μl heptanu:toluenu w stosunku 1:1 (v/v).
    7. Wirować próbki przez 1 minutę i wirować przez 2 minuty przy 800 x g.
    8. Dodać próbki do fiolek GC i przystąpić do analizy GC/MS.
  2. Pochodne acetylu
    Uwaga: W przypadku acetylacji zmodyfikuj kroki 3.1.1-3.1.3 powyżej w następujący sposób (nie pokazano na filmie); Kroki 3.1.4-3.1.8 są takie same:
    1. Rozgrzej blok grzejny do 60 °C.
    2. Dodać 100 μl pirydyny i 100 μl bezwodnika octowego (Ac2O) do probówek.
    3. Podgrzewać próbki przez 1 godzinę w temperaturze 60 °C.

4. Analiza GC/MS

  1. Użyj kolumny kapilarnej HP-5 (30 m x 0,25 mm x 0,25 μm grubości folii) lub równoważnej (tj. 5% difenylu, 95% polisiloksanu dimetylu). Zaprogramuj GC z przepływem helu w gazie nośnym ustawionym na 1,5 ml/min i temperaturą pieca zaprogramowaną od 150 do 300 °C na 3 °C/min.
  2. Użyj wtrysku dzielonego (stosunek podziału 1:10) i ustaw spektrometr masowy na tryb skanowania powyżej 40-600 amu (jonizacja uderzeniowa elektronów).
  3. Należy utworzyć tabelę sekwencji zawierającą kontrpróby rozpuszczalnika (ślepej próby), WT i mutantów, z których każda jest używana przy użyciu wskazanej metody analizy kutyny.
  4. Załadować fiolki z rozpuszczalnikiem i próbkami na karuzelę, w razie potrzeby dodać heksan do fiolek do płukania strzykawek w autosamplerze i rozpocząć sekwencję. Po zakończeniu sekwencji dostępne są ślady chromatogramu jonów całkowitych dla wszystkich próbek.

5. Analiza danych

  1. Zidentyfikuj monomery lipidowo-poliestrowe, porównując widmo masowe każdego piku z opublikowanymi widmami masowymi lub przeszukując komercyjną bibliotekę, jeśli jest dostępna.
  2. Dla każdego zidentyfikowanego piku w chromatogramie całkowitego prądu jonowego, należy użyć odpowiednich czasów retencji, aby znaleźć obszary w tabeli wyników integracji w oprogramowaniu GC/MS (rysunek uzupełniający 1).
  3. Dla każdego monomeru (kolumny A-B) dodać wartości powierzchni znalezione w tabeli całkowania (Rysunek uzupełniający 1, kolumna D) do odpowiedniej kolumny dla każdej powtórzonej próbki w tabeli monomerów Excel (plik uzupełniający 2, kolumny C-F), która jest arkuszem kalkulacyjnym do ilościowego określania pochodnych Arabidopsis cutin TMSi. Użyj pliku uzupełniającego 3, jeśli zamiast niego przygotowywane są pochodne acetylowane.
  4. Dodaj obszary wzorców wewnętrznych (IS) do kolumn IS (H-K). W przypadku monomerów, które nie są derywatyzowane, a mianowicie estrów metylowych kwasów tłuszczowych (FAME) i estrów dimetylowych kwasu dikarboksylowego (DME DCA), należy użyć FAME 17:0 (IS1) jako IS do oznaczania ilościowego (fioletowe zacienione komórki w tabeli monomerów; Akta uzupełniające 2/3). W przypadku hydroksylowanych monomerów, w tym pierwszorzędowych alkoholi, kwasu ferulowego i ω-hydroksykwasów, należy użyć 15:0 15-hydroksy FAME (IS2) jako IS z wyboru do oznaczania ilościowego związku (zielone komórki w tabeli monomerów; Akta uzupełniające 2/3).
  5. Dodać masę suchych liści dla każdej kontrpróby do kolumn AX-BA (plik uzupełniający 2) lub AQ-AT (plik uzupełniający 3); alternatywnie, zeskanuj liście, aby obliczyć pola powierzchni i dodaj wartości powierzchni do tabeli monomerów, aby wyrazić ładunki monomerów na jednostkę powierzchni.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół opisany w tym manuskrypcie jest ustawiony w celu określenia monomerów lipidowych poliestrowych (tj. kutyny lub suberyny), minimalizując udział lipidów nie-kutynowych10. Rysunek 1 przedstawia przegląd testu, który łącznie trwa od 8 do 10 dni (od wstępnego pobrania tkanek do uzyskania danych GC), w zależności od tego, jak długo próbki mogą wyschnąć.

Wybrana metoda metalizy katalizowanej zasadą (Rysunek 2) do depolimeryzacji poliestrów została wcześniej zatwierdzona dla nasion Arabidopsis, które zawierają zarówno kutynę, jak i suberynę. Tkanki są najpierw homogenizowane i wyczerpująco odlipidowane w celu usunięcia lipidów ekstrahowanych rozpuszczalnikiem. Wydajność pozostałości po ekstrakcji, wyrażona jako procent początkowej świeżej masy, wynosi zwykle 6% w przypadku liści A. thaliana Col-0. Pozostałości wzbogacone w ścianę komórkową są suszone w eksykatorze próżniowym, a następnie depolimeryzowane do postaci monomerów estrów metylowych w procesie transmetylacji katalizowanej zasadą. Dwugodzinna inkubacja została wybrana jako krytyczny czas wymagany do prawidłowej depolimeryzacji i odzysku składników lipidowych poliestrowych. Dłuższy czas inkubacji powodował wzrost 2-hydroksykwasów; Potencjalnie pochodzą one od sfingolipidów błonowych10.

Typowy chromatogram dla skórki z liści Arabidopsis typu dzikiego jest pokazany na rysunku 3, dla pochodnych eteru O-TMSi (rysunek 3A) i pochodnych O-acetylu (rysunek 3B). Każdy pik został zidentyfikowany przez porównanie z widmami masowymi z literatury7,8 i publicznej bazy danych12. Nasz protokół wideo pokazuje, jak przygotować pochodne TMSi, ale próbki można alternatywnie acetylować w celu uzyskania grup hydroksylowych. Pochodne sililowane są dobre do celów identyfikacyjnych, ponieważ dają diagnostyczne widma masowe. Jednak pochodne acetylowane są bardziej stabilne i stanowią dobrą alternatywę dla sililowania po zidentyfikowaniu monomerów 10. Aby pomóc we wdrożeniu tego protokołu w laboratoriach, które mają tylko GC sprzężony z detektorem płomieniowo-jonizacyjnym (FID), pokazano również ślady GC / FID odpowiadające acetylowanym pochodnym monomerów kutyny liści WT oraz serii homologicznej wzorców estrów metylowych kwasów tłuszczowych (rysunek uzupełniający 4).

Ta metoda jest jakościowa i wykrywa różnice ilościowe między próbkami, stąd jej wartość dla analizy mutantów. Ilości poszczególnych monomerów określa się przy użyciu metody oznaczania ilościowego wzorca wewnętrznego, umożliwiającej porównanie obfitości monomerów między próbkami. Należy jednak wyjaśnić, że wielkość piku (całkowita liczba jonów) może nie odzwierciedlać stosunku molowego monomerów w poliestrze. Dołączamy edytowalne tabele monomerów do obliczania ilości monomerów w kutynie liści Arabidopsis jako estry metylowe kwasów tłuszczowych i pochodne TMSi (plik uzupełniający 1) lub pochodne acetylu (plik uzupełniający 2) alkoholi. Tabele te mogą wymagać dostosowania, jeżeli próbki są pobierane z różnych organów lub gatunków roślin.

Jako przykład, przeanalizowaliśmy liście Arabidopsis thaliana Columbia (Col-0) typu dzikiego oraz dwa wcześniej scharakteryzowane allele zerowo-mutantowe genu CYP86A2/ATT1, att1-1 (m-1) i att1-2 (m-2)13,14. Monooksygenazy cytochromu P450 z podrodziny CYP86A kodują przypuszczalne ω-oksydazy i uczestniczą w biosyntezie monomerów suberyny i kutyny. Nasze wyniki (ryc. 4) wykazują znaczne zmniejszenie ładunku trzech głównych monomerów lipidowych w zmutowanych liściach w porównaniu z liśćmi WT. Zgodnie z przewidywaną funkcją enzymu, dikarboksylany 16:0, 18:2 i 18:1 były specyficznie dotknięte mutantami att1.

figure-results-1
Rysunek 1. Przegląd analizy lipidów poliestrowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2. Mechanizm reakcji transmetylacji katalizowanej NaOMe. Nukleofilowe aniony mettlenku atakują węgiel kabonylowy poliestrów lipidowych, tworząc niestabilny czworościenny produkt pośredni (A), który łatwo dysocjuje na estry metylowe kwasów tłuszczowych i aniony alkoholanowe (B). Te alkoholany są sprzężonymi zasadami i reagują z metanolem, regenerując katalitycznie aktywne aniony metlenku, podtrzymując w ten sposób dodatkowe reakcje depolimeryzacji (C). Jeśli w układzie znajduje się woda, będzie reagować z metlenkiem sodu, tworząc wodorotlenek sodu, silną zasadę, która nieodwracalnie hydrolizuje estry w celu wytworzenia niepożądanych wolnych kwasów tłuszczowych. Octan metylu dodaje się jako współrozpuszczalnik15 w celu usunięcia niewielkich ilości wodorotlenku sodu w układzie (D). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3. Reprezentatywny chromatogram jonów całkowitych monomerów kutyny z liści Arabidopsis thaliana typu dzikiego. (A) Eter O-trimetylosililowy (TMSi) i pochodne hydroksylowe octanu (B). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4. Skład monomeru kutyny Arabidopsis thaliana WT i dwóch zerowych zmutowanych alleli genu CYP86A2 (mutant-1=att1-1; mutant-2=ATT1-2). Słupki błędu reprezentują odchylenie standardowe średniej (n = 4). Na podstawie 13, za zgodą © Blackwell Publishing (2007). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek uzupełniający 1. Tabela wyników integracji szczytów z oprogramowania GC/MS. Piki odpowiadające zidentyfikowanym monomerom i wzorcom wewnętrznym są identyfikowane na podstawie czasu ich retencji (kolumna C), a wartości powierzchni są zestawione w tabeli w kolumnie D. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

figure-results-6
Plik uzupełniający 2. Tabela monomerów kutyny Arabidopsis (pochodne eteru trimetylosililu estrów metylowych hydroksykwasów tłuszczowych). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

figure-results-7
Plik uzupełniający 3. Tabela monomerów kutyny Arabidopsis (O-acetylowe pochodne estrów metylowych hydroksykwasów tłuszczowych). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

figure-results-8
Rysunek uzupełniający 4. GC/FID śladowe wzorce wskaźnika retencji estru metylowego kwasów tłuszczowych (FAME) (piki są oznaczane każdą nasyconą długością łańcucha FAME); oraz (C) acetylowane monomery kutyny liści A. thaliana WT. Liczby na szczycie odpowiadają: 16:0 FAME (1), ferulate (2), 18:3 FAME (3), 18:1/18:2 FAMEs (4), 18:0 FAME (5), sinapate (6), 16:0 DCA (7), 16-OH 16:0 FAME (8), 18:2 DCA (9), 18:1 DCA (10) 18:0 DCA (11), 18-OH 18:2 FAME (12), 18-OH 18:1 FAME (13), 20:0 FAME (14), 10,16-diOH 16:0 FAME (15), 24:0 FAME (16). DCA: ester dimetylowy kwasu dikarboksylowego; FAME: ester metylowy kwasów tłuszczowych; IS1: wzorzec wewnętrzny 1, 17:0 FAME; IS2: wzorzec wewnętrzny 2, 15-OH 15:0 FAME. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W przeciwieństwie do innych biopolimerów, takich jak DNA i białka, poliestry lipidowe roślin nie są wytwarzane z szablonu. Zamiast tego ich skład zależy od specyfiki enzymów obecnych w tkankach, które wytwarzają te zewnątrzkomórkowe polimery. W związku z tym analizy chemiczne składników składowych mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia składu lipidowego poliestru.

Chemiczne metody rozszczepiania wiązań estrowych obejmują zmydlanie, hydrogenolizę, transmetylację katalizowaną kwasem i transmetylację katalizowaną zasadą2. Każdy z nich ma zalety i wady. Zmydlanie wytwarza wolne hydroksykwasy tłuszczowe, które mogą ulegać reakcjom wtórnym. Doanalizy kutyny zastosowano hydrogenolizę z wodorkiem litowo-glinowym (LiAlH4)16. Hydrogenoliza redukuje funkcjonalizowane węgle do alkoholi, a pierwotne struktury należy wywnioskować przez deuteriolizę z deuteriolizą deuterogenku litu i glinu (LiAlD4). Wadą tego podejścia jest wymóg wysokiej rozdzielczości GC/MS w celu porównania stopnia deuteriacji otrzymanych polioli tłuszczowych w celu przypisania ich struktur. Transestryfikacja katalizowana kwasem metanolowym trifluorkiem boru (BF3) była często stosowana w depolimeryzacjach kutyny i suberyny8,17,18, ale odczynnik ten ma ograniczony okres trwałości i może wprowadzać artefakty w wyniku reakcji ubocznych15. Metanolowy kwas siarkowy również daje estry metylowe monomerów, ale z większą zawartością 2-hydroksykwasów tłuszczowych, które przypuszczalnie nie są prawdziwymi składnikami lipidowymi poliestru, w porównaniu z innymi metodami10.

Metoda transestryfikacji katalizowana NaOMe opisana w tym protokole wytwarza estry metylowe kwasów tłuszczowych, które są derywatyzowane przez sililowanie grup hydroksylowych, zapewniając charakterystyczne widma masowe do identyfikacji, lub przez acetylację w celu uzyskania bardziej stabilnych pochodnych grup hydroksylowych do kwantyfikacji. Jedną z wad tej techniki jest to, że hydroliza konkuruje z transestryfikacją, gdy w reakcji obecna jest woda. Woda reaguje z NaOMe (katalizatorem) i wytwarza NaOH, który z kolei hydrolizuje estry metylowe kwasów tłuszczowych, dając wolne kwasy (ryc. 2D). Jest to niepożądana reakcja uboczna, ponieważ dla każdego kwasu tłuszczowego będą obecne dwa piki: ester metylowy i pochodna estru TMSi, co komplikuje analizę. Stosowanie bezwodnych odczynników i dodawanie octanu metylu jako współrozpuszczalnika w celu konkurowania ze zmydlaniem jest zatem kluczowym krokiem w celu zapobieżenia hydrolizie (ryc. 2D).

Kutyna i suberyna zawierają od 1 do 26% glicerolu4. Jednak monomer ten nie zostanie wykryty w warunkach eksperymentalnych opisanych w niniejszym protokole. Glicerol jest wysoce hydrofilowy i, w przeciwieństwie do monomerów estrów metylowych kwasów tłuszczowych, zostanie wyeliminowany podczas etapów przemywania wodnym rozpuszczalnikiem. Ograniczenie to dotyczy również innych metod depolimeryzacji kutyny, ale glicerol można oznaczyć w warstwie wodnej otrzymanej po transestryfikacji metodą enzymatyczną. Alternatywnie można go określić ilościowo w łagodniejszych warunkach (np. 0,05 M NaOMe) bez dalszej ekstrakcji wodą w celu wykrycia wszystkich monomerów, w tym glicerolu19,20. Chociaż jest to przydatne do celów ilościowego oznaczania glicerolu, łagodne warunki zwykle powodują niepełną depolimeryzację kutyny i suberyny.

Jeśli dostępny jest GC sprzężony z detektorem płomieniowo-jonizacyjnym (FID), wszystkie kontrpróby mogą być analizowane w tym przyrządzie do celów ilościowych, po zidentyfikowaniu pików reprezentatywnej próbki za pomocą GC/MS. Alternatywnie, monomery w śladach GC/FID mogą być zidentyfikowane, jeśli znane są ich wskaźniki retencji. Detektor płomieniowo-jonizacyjny charakteryzuje się szczególnie wysoką czułością i szerokim zakresem proporcjonalności, co ma kluczowe znaczenie dla kwantyfikacji głównych i drugorzędnych składników próbki w pojedynczych seriach. Ponadto jest wytrzymały i łatwy w utrzymaniu i obsłudze15.

Opisany protokół pozwala na wiarygodną i powtarzalną izolację, identyfikację i kwantyfikację monomerów lipidowych poliestrów roślinnych, umożliwiając charakterystykę chemiczną mutantów różniących się składem jednego lub więcej monomerów lipidowych poliestrowych. Procedura jest skalowalna, można ją łatwo dostosować do przetwarzania zarówno małych, jak i dużych ilości różnych materiałów roślinnych, w tym korzeni, nasion, liści, łodyg i kwiatów. Dane spektralne mas lipidowych monomerów poliestrowych wielu gatunków zostały opublikowanenp. 21-26 i stanowią cenne źródło do identyfikacji nieznanych monomerów podczas adaptacji tego protokołu do innych tkanek i/lub gatunków. Metoda ta ma zastosowanie do badań biosyntezy, regulacji i dystrybucji poliestrów lipidowych w roślinach wyższych.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez grant Natural Sciences and Engineering Research (NSERC)-USRA dla S.J. oraz przez NSERC-Discovery Grant dla I.M. Dziękujemy Richardowi Bourgaultowi, Meghan Rains i Amandzie Fluke za pomoc techniczną. Nasiona mutantów att1-1 i att1-2 zostały dostarczone przez dr Jian-Min Zhou z Instytutu Genetyki i Biologii Rozwoju w Pekinie.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Chemikalia
2-propanolFisher ScientificBPA451-4Rozpuszczalnik do delipidacji
Bezwodny siarczan soduFisher ScientificS421500
Bezwodnik octowySigma Aldrich320102Środek do derywatyzacji
BSTFA (N,O-bis(trimetylosililo)-trifluoroacetamid)Sigma-Aldrich15222Środek derywatyzacyjny
Butylowany hydroksytoluen (BHT)Sigma-Aldrich101162Przeciwutleniacz
Chlorek wapnia, bezwodnyFisher ScientificC614-3Środek do suszenia
Suflan wapnia, bezwodny (DRIERITE-8 MESH ze wskaźnikiem)Acros Organics219090020Środek do suszenia
Chloroform (trichlorometan)Fisher ScientificC6074Rozpuszczalnik organiczny
Lodowaty kwas octowyFisher ScientificBP2401212Środek zakwaszający
Hel nośny gaz, sprężonepowietrze LiquideALPHAGAZ1-UN1046Gaz nośny, GC/MS
HeptanFisher ScientificH3501Rozpuszczalnik organiczny
HeksanyFisher ScientificH3024Rozpuszczalnik organiczny
MetanolFisher ScientificA4124Rozpuszczalnik organiczny, reaktywny transmetylacja
Octan metyluSigma-Aldrich296996Rozpuszczalnik organiczny
Heptadekanian metyluSigma-AldrichH4515Wzorzec wewnętrzny (zapas 1 mg / ml)
Dichlorek metylenu (dichlorometan)Fisher ScientificD374Rozpuszczalnik organiczny
Azot, sprężonyAir LiquideALPHAGAZ1-UN1044Gaz nośny, GC-FID
PentadekanolaktonFluka76530Wzorzec wewnętrzny (zapas 1 mg/ml)
PirydynaSigma-Aldrich270970Współrozpuszczalnik do derywatyzacji
Chlorek soduFisher ScientificBP358212Roztwór soli
Mettlenek sodu (25% wag.%)Sigma-Aldrich156256Nukleofil
ToluenFIsher ScientificT2904Rozpuszczalnik organiczny
Materiały
Pro-Mix PGXPremier Tech Horticulture LtdPro-Mix PGX jest zalecany do uprawy Arabidopsis (Eddy, R. i Hahn, D.T., 2012,http://docs.lib.purdue.edu/pmag/2)
Metody Purdue dla wzrostu Arabidopsis. 
Kopuła wilgotnościowa PermaNest Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN GD2211-24
Tace na rośliny z trwałym gniazdem (22x11in)Rozwiązanie hodowcy, LLC, Cookeville, TN Nie dotyczy
Kwadratowe doniczki szklarniowe, 3,5 cala Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN P86
Nawóz do roślin ogólnego przeznaczenia, Plant-Prod 20-20-20Premier Tech Home and Garden In., Brantford, ONN/A
Szkło
Probówka szklana 13 x 100 mm z nakrętką z teflonemKimble Chase Life Science and Research Products LLC45066A-13100
Szklana probówka 16 x 125 mm z nakrętkąz teflonemKimble Chase Life Science and Research Products LLC45066A-16125
Szklane probówki 20 x 125 mm z nakrętką z teflonową nasadkąKimble Chase Life Science and Research Products LLC45066A-20125
Nakrętki na fiolkiGC National ScientificC400051A
GC Mikrowkładki do fiolekNational ScientificC4011631
Fiolki GCScientificC40001
Jednorazowe pipety PasteuraFisher Scientific1367820B
KolbyFisher Scientific
Equipment Wirówka
Allegra X15R BeckmanCoulter
Równowaga analitycznaFisher Scientific
TancerkabrzuchaDo tego celu można użyć shakera, jeśli Tancerka brzucha nie jest dostępna
DB-5 Kapilarna kolumna GCJ& W Scientific, Kalifornia, Stany Zjednoczone;  30 m x 0,25 mm x 0,25 μ m grubość warstwy
Eksykator
Isotemp 202 łaźnia wodnaFisher Scientific
ISQ LT pojedynczy kwadrupolowy spektrometr masowyThermo Scientific
Blok ciepłaFisher Scientific
Parownik
Homogenizator PolytronBirkmann
Chromatograf gazowy Trace 1300Thermo Scientific
Dwustopniowy regulatorAir LiquideQ1-318B-580
Eksykator próżniowyFisher Scientific
Mieszalnik wirowyFisher Scientific
do wzrostu roślin National azotu

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kolattukudy, P. Biopolyester membranes of plants: cutin and suberin. Science. 208 (4447), 990-1000 (1980).
  2. Kolattukudy, P. E. Polyesters in higher plants. Adv. Biochem. Eng. Biot. 71, 1-49 (2001).
  3. Yeats, T. H., Rose, J. K. C. The formation and function of plant cuticles. Plant Physiol. 163 (1), 5-20 (2013).
  4. Pollard, M., Beisson, F., Li, Y., Ohlrogge, J. B. Building lipid barriers: biosynthesis of cutin and suberin. Trends Plant Sci. 13 (5), 236-246 (2008).
  5. Beisson, F., Li-Beisson, Y., Pollard, M. Solving the puzzles of cutin and suberin polymer biosynthesis. Curr. Opin. Plant Biol. 15 (3), 329-337 (2012).
  6. Heredia, A. Biophysical and biochemical characteristics of cutin, a plant barrier biopolymer. Biochim. Biophys. Acta. 1620 (1-3), 1-7 (2003).
  7. Bonaventure, G., Beisson, F., Ohlrogge, J., Pollard, M. Analysis of the aliphatic monomer composition of polyesters associated with Arabidopsis epidermis: occurrence of octadeca-cis-6, cis-9-diene-1, 18-dioate as the major component. Plant J. 40 (6), 920-930 (2004).
  8. Franke, R., et al. Apoplastic polyesters in Arabidopsis surface tissues - A typical suberin and a particular cutin. Phytochemistry. 66 (22), 2643-2658 (2005).
  9. Vogg, G., et al. Tomato fruit cuticular waxes and their effects on transpiration barrier properties: functional characterization of a mutant deficient in a very-long-chain fatty acid -ketoacyl-CoA synthase. J. Exp. Bot. 55 (401), 1401-1410 (2004).
  10. Molina, I., Bonaventure, G., Ohlrogge, J., Pollard, M. The lipid polyester composition of Arabidopsis thaliana and Brassica napus seeds. Phytochemistry. 67 (23), 2597-2610 (2006).
  11. Li-Beisson, Y., et al. Acyl-lipid metabolism. The Arabidopsis Book. 11, e0161(2013).
  12. Christie, W. W. Mass Spectrometry of Fatty Acid Derivatives. , LipidHome. Available from: http://www.lipidhome.co.uk/ms/masspec.html (2015).
  13. Molina, I., Ohlrogge, J. B., Pollard, M. Deposition and localization of lipid polyester in developing seeds of Brassica napus and Arabidopsis thaliana. Plant J. 53 (3), 437-449 (2008).
  14. Xiao, F., et al. Arabidopsis CYP86A2 represses Pseudomonas syringae type III genes and is required for cuticle development. EMBO J. 23 (14), 2903-2913 (2004).
  15. Christie, W. W., Han, X. Lipid Analysis - Isolation, Separation, Identification and Lipidomic Analysis. , 4th edition, Oily Press. Bridgwater, U.K. 446(2010).
  16. Walton, T. J., Kolattukudy, P. E. Determination of the structures of cutin monomers by a novel depolymerization procedure and combined gas chromatography and mass spectrometry. Biochemistry. 11 (10), 1885-1896 (1972).
  17. Matzke, K., Riederer, M. A comparative study into the chemical constitution of cutins and suberins from Picea abies (L.) Karst., Quercus robur L., and Fagus sylvatica L. Planta. 185 (2), 233-245 (1991).
  18. Riederer, M., Schönherr, J. Quantitative gas chromatographic analysis of methyl esters of hydroxy fatty acids derived from plant cutin. J. Chromatogr. 360, 151-161 (1986).
  19. Moire, L., Schmutz, A., Buchala, A., Yan, B., Stark, R., Ryser, U. Glycerol Is a Suberin Monomer. New Experimental Evidence for an Old Hypothesis. Plant Physiol. 119 (3), 1137-1146 (1999).
  20. Graça, J., Schreiber, L., Rodrigues, J., Pereira, H. Glycerol and glyceryl esters of omega-hydroxyacids in cutins. Phytochemistry. 61 (2), 205-215 (2002).
  21. Eglinton, G., Hunneman, D. H. Gas chromatographic-mass spectrometric studies of long chain hydroxy acids-I: The constituent cutin acids of apple cuticle. Phytochemistry. 7 (2), 313-322 (1968).
  22. Espelie, K. E., Köller, W., Kolattukudy, P. E. 9,16-dihydroxy-10-oxo-hexadecanoic acid, a novel component in citrus cutin. Chem. Phys. Lipids. 32 (1), 13-26 (1983).
  23. Holloway, P. J. Intracuticular lipids of spinach leaves. Phytochemistry. 13 (10), 2201-2207 (1974).
  24. Holloway, P. J., Deas, A. H. B. Epoxyoctadecanoic acids in plant cutins and suberins. Phytochemistry. 12 (7), 1721-1735 (1973).
  25. Holloway, P. J. The chemical constitution of plant cutins. Cutler, D. F., Alvin, K. L., Price, C. E. , Academic Press. London. 45-85 (1982).
  26. Croteau, R., Fagerson, I. S. The constituent cutin acids of cranberry cuticle. Phytochemistry. 11 (1), 353-363 (1972).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cutin AnalysisSuberin AnalysisPlant CuticleLipid PolyesterGC MS AnalysisSodium MethoxideTissue ExtractionMonomer QuantificationArabidopsis ThalianaLipid Polymer

Related Articles