Artykuł metodologiczny

Prosta metoda kontrolowanej wielkości syntezy stabilnych oligomerycznych klastrów nanocząstek złota w warunkach otoczenia

DOI:

10.3791/53388

⸱

5 lutego 2016

 ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Condensed Matter Physics Department, Laboratory of Biophysics, Jozef Stefan Institute

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy prostą metodę wytwarzania wysoce stabilnych oligomerycznych klastrów nanocząstek złota poprzez redukcję kwasu chloroaurowego (HAuCl4) tiocyjanianem sodu (NaSCN). Oligoklastry mają wąski rozkład wielkości i mogą być produkowane w szerokim zakresie rozmiarów i powłok powierzchniowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Redukcja rozcieńczonego wodnego HAuCl4 za pomocą tiocyjanianu sodu (NaSCN) w warunkach alkalicznych wytwarza nanocząstki o średnicy od 2 do 3 nm. Stabilne, podobne do winogron oligomeryczne klastry tych żółtych nanocząstek o wąskim rozkładzie wielkości są syntetyzowane w warunkach otoczenia za pomocą dwóch metod. Metoda opóźnienia w czasie kontroluje liczbę podjednostek w oligoklastrach poprzez zmianę czasu między dodaniem HAuCl4 do roztworu alkalicznego a późniejszym dodaniem środka redukującego, NaSCN. Powstałe żółte oligoklastry mają wielkość od ~3 do ~25 nm. Ten zakres wielkości można dodatkowo rozszerzyć za pomocą metody dodatkowej wykorzystującej hydroksylowany chlorek złota (Na+[Au(OH4-x)Clx]-) w celu automatycznego katalitycznego zwiększenia liczby podjednostek w zsyntetyzowanych nanocząstkach oligoklastra, zapewniając całkowity zakres od 3 nm do 70 nm. Surowe preparaty oligoklastrów mają wąski rozkład wielkości i w większości przypadków nie wymagają dalszego frakcjonowania. Powstałe oligoklastry mogą być zagęszczane >300 razy bez agregacji, a surowe mieszaniny reakcyjne pozostają stabilne przez tygodnie bez dalszego przetwarzania. Ponieważ te klastry oligomeryczne mogą być skoncentrowane przed derywatyzacją, pozwalają one na ekonomiczne stosowanie drogich środków do derywatyzacji. Ponadto przedstawiamy dwa modele, za pomocą których można z dużą dokładnością przewidywać wielkość cząstek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystanie nanocząsteczek złota jako narzędzi zarówno w zastosowaniach biomedycznych, jak i w badaniach podstawowych ogromnie wzrosło w ciągu ostatnich kilku dekad. Niewiele nowoczesnych nanomateriałów znalazło zastosowanie w tak wielu różnych dziedzinach, znajdując swoje zastosowanie we wszystkim, od paneli słonecznych po fototermiczne leczenie raka; od czujników elektrycznych po biologiczne; Od katalizy chemicznej do systemów dostarczania leków 1-7. Zainteresowanie nanocząstkami złota jako narzędziami w tych dziedzinach jest napędzane przez unikalne właściwości nanocząstek złota, które obejmują specjalne właściwości strukturalne, optyczne i elektroniczne 8.

Coraz częściej wykorzystuje się nanocząstki złota 9,10 w testach biologicznych i chemicznych. Pomimo dostępności wielu źródeł zakupu nanocząstek złota, mają one znaczną cenę w porównaniu z kosztem syntezy we własnym zakresie. Wysoki koszt dostępnych na rynku nanocząstek sprawia, że pożądana jest synteza we własnym zakresie. Nasza procedura polega na syntezie nanoklastrów oligomerycznych wytworzonych przez małe sferyczne podjednostki złota o długości fali 2-3 nm. Posiadając wszystkie zalety klasycznych nanocząstek złota, nanoklastry oligomeryczne są preferowanym wyborem, jeśli chodzi o pomiary przepuszczalności lub szybkości filtracji, ponieważ ich modułowa struktura naśladuje strukturę białek.

Obecnie, najczęstsze podejścia do wewnętrznej syntezy nanocząstek złota polegają na redukcji chlorku złota (HAuCl4) w warunkach wodnych 11,12. Redukcja HAuCl4 za pomocą popularnych odczynników redukujących, takich jak borowodorek sodu (NaBH4) lub cytrynian sodu, pozwala na wytwarzanie sferycznych nanocząstek 13. Nanocząstki złota syntetyzowane tymi metodami mają ograniczony użyteczny zakres wielkości, ponieważ stają się wrażliwe na obecność soli w biologicznych wraz ze wzrostem ich średnic rdzeni. Wcześniej opisano metodę syntezy żółtych nanocząstek o średnicy 2-3 nm z redukcji HAuCl4 tiocyjanianem sodu w warunkach zasadowych 14,15.

Tutaj opisujemy modyfikację tej metody, która wytwarza podobny do winogrona oligoklaster żółtych nanocząstek bez potrzeby stosowania dodatkowych środków ograniczających. Po prostu zmieniając czas między dodaniem HAuCl4 do roztworu alkalicznego a późniejszym dodaniem środka redukującego, tiocyjanianu sodu, jesteśmy w stanie zmienić wynikową wielkość cząstek złota od ~3 nm do ~25 nm. Aby wytworzyć większe cząstki, można zastosować prostą procedurę dodatkową do hodowli tych oligoklastrów poprzez dodanie hydroksylowanego złota (HG) do zsyntetyzowanych oligoklastrów w obecności tiocyjanianu sodu. Dzięki tym dwóm metodom jesteśmy w stanie niezawodnie wyprodukować oligoklastry obejmujące zakres od ~3 nm do ~70 nm. Fakt, że metoda ta pozwala na dobrze kontrolowaną syntezę wysokiej jakości oligoklastrów złota w warunkach laboratoryjnych przy użyciu standardowego sprzętu i ograniczonej liczby odczynników, potencjalnie rozszerza korzyści płynące z nanocząstek złota jako narzędzia badawczego dla badaczy z niewielką lub żadną wiedzą specjalistyczną w zakresie syntezy chemicznej.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie odczynników

Uwaga: Zawsze zachowuj ostrożność podczas pracy z chemikaliami i roztworami. Przestrzegaj odpowiednich zasad bezpieczeństwa i przez cały czas noś rękawice, okulary i fartuch laboratoryjny. Należy pamiętać, że nanomateriały mogą wiązać się z dodatkowymi zagrożeniami w porównaniu z ich masowymi odpowiednikami.
Uwaga: Wszystkie roztwory chemiczne są wytwarzane jako molowe (gramy molowe na kg rozpuszczalnika), a nie molowe (gramy molowe na litr roztworu).

  1. Przygotowanie chlorku złota
    1. Rozpuścić 1 g trójwodnego chlorku złota(III) w 100 gH2O, aby uzyskać 25 mM HAuCl4.
  2. Przygotowanie boraksu (Na2B4O7·10H2O)
    1. Rozpuścić 3,81 g boraksu w 100 gH2O, aby uzyskać 0,1 molowego boraksu (w razie potrzeby podgrzać, aby uzyskać pełny roztwór).
  3. Przygotowanie tiocyjanianu sodu
    1. Rozpuścić 8,1 g tiocyjanianu sodu w 100 gH2O, aby uzyskać 1 molowy NaSCN.
  4. Przygotowanie węglanu sodu
    1. Rozpuścić 5,3 g bezwodnego węglanu sodu w 100 gH2O, aby uzyskać 0,5 mola Na2CO3 .
  5. Przygotowanie glutationu
    1. Rozpuścić 154 mg zredukowanego glutationu (GSH) na 1 ml 0,5 molala Na2CO3 uzyskać 0,5 mola GSH.

2. Synteza oligoklastrów złota

  1. Synteza oligoklastrów złota z opóźnieniem w czasie
    1. Dodać 59,5 mlH2Odo czystej szklanej butelki Wheaton o pojemności 125 ml zawierającej mieszadło. Użyj dowolnego czystego szklanego pojemnika z płaskim dnem, ale upewnij się, że jest bardzo czysty.
    2. Dodać 7 ml boraksu o masie 0,1 mola i energicznie zamieszać roztwór.
    3. Dodać 2,8 ml ~25 mM HAuCl4 pod energicznym mieszaniem i odczekać żądany czas opóźnienia (dodanie HAuCl4 rozpoczyna czas opóźnienia). Czasy opóźnień określą wielkość zsyntetyzowanych oligoklastrów, jak pokazano w tabeli 1.
    4. Po upływie pożądanego czasu zwłoki dodać 700 μl 1 molowego NaSCN pod krótkim, energicznym mieszaniem (1 200 obr./min przez 30 sekund).
    5. Usunąć pręt mieszający i pozwolić, aby reakcja przeszła do końca O/N (rozkład wielkości oligoklastrów można jeszcze bardziej poprawić, pozwalając mieszaninie na ciągłe mieszanie O/N, podczas gdy reakcja przechodzi do zakończenia). Po zakończeniu reakcji zsyntetyzowane surowe oligoklastry są stabilne przez tygodnie.
  2. Dodatkowy wzrost oligoklastrów
    1. Połączyć 10 ml zsyntetyzowanych oligoklastrów z 60 ml HG. Stosunek zsyntetyzowanych oligoklastrów do HG określa wielkość powstałych oligoklastrów, zwiększając względną ilość HG tworzących większe oligoklastry.
    2. Dodać 900 μl 1 molowego NaSCN pod krótkim, energicznym mieszaniem (1 200 obr./min przez 30 sekund).
    3. Pozwól, aby reakcja przeszła do końca O/N (rozkład wielkości oligoklastrów można jeszcze bardziej poprawić, pozwalając mieszaninie na ciągłe mieszanie O/N, podczas gdy reakcja przechodzi do zakończenia).

3. Derywatyzacja GSH i koncentracja oligoklastrów

  1. Dodać 70 ml zsyntetyzowanych surowych oligoklastrów (lub oligoklastrów z metody dodatkowej) do 70 ml odciętego filtra odśrodkowego o mocy 70 ml i stężeniu 30 kDa.
  2. Wiruj przez 15 minut przy 3,000 x g. W ten sposób cząstki są zagęszczane do objętości ~250 μl.
  3. Odwróć urządzenie i odzyskaj retentat, obracając urządzenie przez 3 minuty przy 500 x g. Odzyskana objętość powinna wynosić ~250 μl.
  4. Zmierz odzyskaną objętość za pomocą mikropipety.
  5. Dodać objętość 0,5 molowego glutationu (lub innego tiolu) równą 1/9 odzyskanej objętości skoncentrowanych oligoklastrów (końcowe stężenie 50 mmolal GSH).
  6. Pozwól, aby reakcja derywatyzacji siedziała w RT przez 5-10 minut. Derywatyzacja następuje szybko. Zbyt długi czas może spowodować rozpuszczenie cząstek.
  7. Rozcieńczyć derywatyzowane oligoklastry w 50 ml roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami Dulbecco. (Na tym etapie można wybrać inne lubH2O, jako rozcieńczalnik/bufor do płukania. Wybór jest zwykle determinowany przez zamierzone dalsze zastosowanie.)
  8. Dodać wszystkie rozcieńczone derywatyzowane oligoklastry do odciętego filtra odśrodkowego o masie 30 kDa.
  9. Obracać filtr odśrodkowy przez 15 minut przy 3 000 x g.
  10. Odwróć urządzenie i odzyskaj retentat, obracając urządzenie przez 3 minuty przy 500 x g. Odzyskana objętość powinna wynosić ~250 μl. Odzyskane skoncentrowane cząstki są gotowe do użycia i są stabilne przez wiele miesięcy w temperaturze 4 °C.

4. Analiza i weryfikacja syntezy oligoklastrów

  1. Elektroforeza żelowa oligoklastrów
    1. Elektroforeza preparatu surowych oligoklastrów
      1. Zsyntetyzowane preparaty oligoklastrów zmieszać w stosunku 2:1 z buforem obciążeniowym zawierającym 60% glicerolu, ~0,15% błękitu bromofenolowego i 150 mmolal GSH (z zapasu 0,5 molowego GSH rozpuszczonego w 0,5 molowym Na2CO3).
      2. Załadować 30 μl na prefabrykowany żel gradientowy z poliakryloamidu (dowolne kDa) i pracować z buforem Tris-Glycine Running (25 mM Tris, 192 mM glicyny; nie stosuje się SDS) przez 26 minut przy stałym napięciu (200 V).
    2. Elektroforeza derywatyzowanych oligoklastrów GSH
      1. Rozcieńczony preparat oligoklastrów derywatyzowany przez GSH w stosunku 1:3 zH2O(zazwyczaj 2 μl GSH-oligoklastrów z 6 μlH2O).
      2. Wymieszaj rozcieńczone oligoklastry derywatyzowane przez GSH w stosunku 2:1 z buforem ładunkowym zawierającym 60% glicerolu, ~0,15% błękitu bromofenolowego i 150 mmolal wodorowęglanu sodu.
      3. Załadować 10 μl na prefabrykowany żel gradientowy z poliakryloamidu (dowolny kDa) i pracować z buforem Tris-Glycine Running (25 mM Tris, 192 mM glicyny; nie stosuje się SDS) przez 26 minut przy stałym napięciu (200 V).
  2. Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM)
    1. Przygotowanie oligoklastrów do TEM
      1. W celu przemycia oligoklastrów należy rozcieńczyć 20 μl skoncentrowanych oligoklastrów w 0,5 mlH2Oi załadować do 0,5 ml odciętego filtra odśrodkowego o masie 0,5 ml i sile 30 kDa.
      2. Wirować z prędkością 14 000 x g przez 10 minut.
      3. Usunąć filtrat i ponownie zawiesić retentat świeżymi 0,5 mlH2O.
      4. Powtórz pranie dwa razy, w sumie 3 prania.
      5. Rozcieńczyć retentat końcowy 500 razy w H2O (oligoklastry są w tym momencie gotowe do siatkowania).
    2. Siatkowanie oligoklastrów
      1. Siatka pokryta węglem z wyładowaniem jarzeniowym.
      2. Umieścić 0,6 μl przemytych i rozcieńczonych oligoklastrów na pokrytej węglem siatce rozładowanej jarzeniowo.
      3. Pozostaw ruszt do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut.
      4. Wizualizacja oligoklastrów za pomocą TEM w powiększeniu 100 000x. Działa pod napięciem 80 kV dla obrazów pokazanych tutaj.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Syntezy oligoklastrów złota analizowano za pomocą elektroforezy żelowej (Rysunek 1) i transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) (Rysunek 2). Wielkość oligoklastrów pokrytych GSH można monitorować za pomocą elektroforezy, ponieważ większe cząstki migrują mniej i wydają się ciemniejsze. Ponadto, jakość preparatu o dowolnym rozmiarze można wywnioskować na podstawie szerokości pasma obserwowanej po elektroforezie (tj. dla danego rozmiaru preparaty o węższym rozkładzie wielkości będą wytwarzać ciaśniejsze prążki niż preparaty o tej samej wielkości i szerszych rozkładach wielkości). Rysunek 2 przedstawia zależność między opóźnieniem czasowym (metoda opóźnienia) lub HG:seed (metoda dodatkowa) a rozmiarem oligoklastra. Średnie średnice obliczone za pomocą TEM są wykorzystywane do określenia czasu opóźnienia i wzrostu zależności od HG:seed oligoklastrów odpowiednio dla metod czasu opóźnienia i metod dodatkowych. Przedstawiono schemat blokowy (rysunek 3) przedstawiający procedurę dla obu metod oraz tabelę (tabela 1) przedstawiającą przewidywane parametry do wytworzenia oligoklastrów o pożądanej wielkości.

figure-results-1
Rysunek 1. Gradientowa elektroforeza żelowa z poliakryloamidu oligoklastrów utworzonych metodami Delay-time i Add-on. Oligoklastry wytworzone metodami opóźnienia i add-on analizowano na gradientowej elektroforezie żelowej. Pasy 2-4: oligoklastry utworzone po różnych czasach opóźnienia (45, 135 i 405 sekund) między wytworzeniem HAuCl4 alkalicznego a dodaniem NaSCN. Pasy 5-8: oligoklastry utworzone metodą rozszerzoną. Zalążek został utworzony metodą opóźnienia w czasie z opóźnieniem 405 sekund, wskazanym przez ↓. Do dodatków użyto różnych ilości HG. Proporcje roztworu HG (1 mM w złocie) do roztworu nasion (1 mM w złocie) użytego do przygotowania każdej próbki są wskazane jako 4xHG, 6xHG, 12xHG i 24xHG. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

figure-results-2
Rysunek 2. Średnice oligoklastrów złota utworzonych metodą opóźnienia i metody dodatkową. Oligoklastry przygotowane metodą opóźnienia i add-on zostały przeanalizowane przez TEM. A) i B) są adaptowane za zgodą ref.16, Copyright 2014 American Chemical Society. (A) Reprezentatywne obrazy TEM obszarów siatek o wymiarach 50 nm x 50 nm przygotowane z próbek wykonanych metodą opóźnienia w czasie. Wskazana jest średnica cząstek (oś Y) oraz czasy opóźnienia stosowane przy ich przygotowaniu (oś X), obie osie są logarytmiczne. Ciężka linia (R2 = 0,973) najlepiej pasuje do empirycznego 3-parametrowego równania Dczas opóźnienia = D0 + a(1 - e-bt), gdzie Dczas opóźnienia jest średnią średnicą klastrów w nm, D0 jest minimalną średnicą klastrów (~3,5 nm); A to maksymalny wzrost wielkości rdzenia spowodowany wydłużeniem czasu opóźnienia (~20 nm), a b = 0,0021 s-1. (B) Średnice oligoklastrów powstałych po różnych czasach opóźnienia przed dodaniem NaSCN (metoda opóźnienia w czasie) przedstawione w skali liniowej. (C) Średnice oligoklastrów utworzonych po dodaniu (metoda add-on) różnych ilości HG do wstępnie uformowanych nasion złota utworzonych metodą opóźnienia w czasie z czasem opóźnienia wynoszącym 405 sekund. Jak pokazuje gruba linia, można łatwo zauważyć, że średnica oligoklastrów utworzonych metodą rozszerzoną wynosi figure-results-3, gdzie cHG i cNasiona są stężeniami kwasu chloroaurowego użytymi odpowiednio do wytwarzania roztworu HG w metodzie dodatkowej i do tworzenia oligoklastrów metodą opóźnionego czasu. Podobnie VHG i VSeeds są odpowiednimi objętościami. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

figure-results-4
Rysunek 3. Diagram wykresu ściennego z metodami czasu opóźnienia i dodatków do tworzenia oligoklastrów złota o różnych rozmiarach. Schemat blokowy przedstawiający procedury syntezy oligoklastrów złota o różnych rozmiarach przy użyciu metody czasu opóźnienia lub metody dodatkowej. Alkaliczny roztwór kwasu chloroaurowego jest niebieski. HG jest czerwony. Nasiona nanocząstek złota i oligoklastry są czarne. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. Rozdział pkt. pkt. pkt. Rozdział Rozdział Rozdział Rozdział szt. Rozdział szt. szt. szt. LIPCA TGL Rozdział Rozdział szt. szt. TGL szt. TGL TGL TGL szt. szt. szt. szt. Rozdział szt. szt. szt. Rozdział szt. Rozdział szt. Rozdział Rozdział lipca
Procedura opóźnieniaProcedura dodatku
przewidywana średnica (nm)
Czas opóźnienia (s)Czas opóźnienia (min)Przewidywana średnica (nm)Zmierzona średnica ± S.D. (Nm)4×HG6×HG12×HG24×HG100×HG1000×HG
10,023,5
cyfra arabska0,033.63.1±1.36.16,98.4Pytanie 10,5Rozdział 16,736
30,053.6
40,073.7
50,083.72,6±1,16,37,18,7Rozdział 10.8Rozdział 17,337
60,103.8
70,123.8
80,133.8
90,153,9
100,173,96.77,5Pytanie 9,2Pytanie 11,4Rozdział 1839 Rozdział 39
110,18Wersja 4.0
120,20Wersja 4.0
130,22Wersja 4.0
140,234.1
150,254.13,3±1,57,07,9Pytanie 9,712,0Rozdział 19Rozdział 41
200,334.3
250,42Rozdział 4.5
Rozdział 300,50Rozdział 4.7
350,58Pytanie 4.9
Rozdział 400,675.1
Rozdział 450,755.36,4±2Rozdział 9.1Rozdział 10.1Rozdział 12,515,52553 Rozdział 53
601,0Pozycja 5.9
751.36,4
901,56,9
1051.87,5
1202.08,0
135 Rozdział 1352.38.411±314,4Rozdział 16.1202539 Rozdział 39Rozdział 84
1652.8Pytanie 9,4
Rozdział 1953.310
2253.811
2554.312
Rozdział 285Rozdział 4.813
Rozdział 3155.313
3455,814
Okręg wyborczy 3756,314
Rejon 4056.81514±5262935Rozdział 4470150
Z numerem 4357,315
4657,816
Okręg wyborczy 4958.316
5258,817
Okręg wyborczy 5559,317
Okręg wyborczy 585Pytanie 9,8Rozdział 18
Okręg wyborczy 61510Rozdział 18
9001520
12002022 Rozdział 22godz. 20±113742 Rozdział 4251 Rozdział 51Rozdział 64Rozdział 102Rozdział 219
15002523
Rok 1800Rozdział 3023
21003523
2400Rozdział 4023
2700Rozdział 4523
30005023
33005523
36006023Środa 25±11Rozdział 40Rozdział 4555Rozdział 69Rozdział 109Z dnia 235

Tabela 1. Tabela przewidywania wielkości oligoklastrów. Przewidywane średnice oligoklastrów złota utworzonych przy użyciu metody opóźnienia lub metody dodatkowej. Przewidywaną średnicę dla metody czasu opóźnienia oblicza się przy użyciu wzoru empirycznego na średnią średnicę oligoklastra Dczas opóźnienia = D0 + a(1 - e-bt), gdzie D jest średnią średnicą oligoklastrów złota w nm, D0 jest minimalną średnicą (3,5 nm), a jest maksymalnym przyrostem wielkości rdzenia (20 nm), a b wynosi 0,0021 sec-1, Jak pokazano wcześniej, 16. Przewidywana średnica dla metody dodatkowej jest obliczana z uwzględnieniem faktu, że nowe nanocząstki nie mogą tworzyć się z HG, a raczej są osadzane równomiernie wokół wstępnie uformowanych kulistych nasion, co czyni je większymi. Żadne inne założenie nie jest konieczne. Można łatwo zauważyć, że średnica oligoklastrów utworzonych metodą rozszerzoną wynosi figure-results-5, gdzie cHG i cNasiona są stężeniami kwasu chloroaurowego użytymi odpowiednio do przygotowania roztworu HG w metodzie rozszerzonej i do wytworzenia oligoklastrów metodą opóźnienia. Podobnie VHG i VSeeds są odpowiednimi objętościami.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejszy manuskrypt zawiera szczegółowy protokół laboratoryjnej syntezy monodyspersyjnych oligoklastrów złota (ryc. 3). Metoda ta jest w stanie wytworzyć szeroki zakres rozmiarów poprzez prostą zmianę czasu między dodaniem HAuCl4 do roztworu alkalicznego a późniejszym dodaniem środka redukującego, tiocyjanianu sodu. Dodanie HAuCl4 do alkalicznego buforowanego roztworu wodnego powoduje zależną od czasu hydroksylację HAuCl4 do hydroksylowanego złota (Na+[Au(OH4-x)Clx]-). Ta hydroksylacja powoduje, że dostępna jest mniejsza ilość HAuCl4 , chociaż hydroksylacja nie przechodzi do końca, ponieważ jest to reakcja równowagi. Zarodkowanie i tworzenie monomerów złota de novo może być zainicjowane tylko przez HAuCl4. Hydroksylowane złoto jest zdolne do dodawania się tylko do istniejących nanocząstek złota, co powoduje tworzenie oligoklastrów złota; Nasza metoda dodatkowa wykorzystuje to 16. Oligoklastry utworzone metodą opóźnienia w czasie mogą być używane jako nasiona, na których osadza się hydroksylowane złoto, zwiększając w ten sposób rozmiar zasianych oligoklastrów. Wzrost zasiewów można kontrolować, zmieniając stosunek hydroksylowanego złota (HG) do zsyntetyzowanego oligoklastra (ryc. 1). W obu metodach wielkość cząstek można łatwo przewidzieć, wybierając odpowiednie opóźnienie czasowe (rysunek 2A, B) lub wybierając odpowiednie początkowe nasiona i odpowiedni stosunek dodanego hydroksylowanego złota (HG) (rysunek 2C). Przedstawiono prognozy dotyczące najbardziej użytecznych rozmiarów cząstek (tabela 1). Rosnący rozmiar derywatyzowanych oligoklastrów GSH może być monitorowany za pomocą elektroforezy, ponieważ większe cząstki migrują mniej i wydają się znacznie ciemniejsze, co wynika z faktu, że współczynnik ekstynkcji nanocząstek złota wzrasta proporcjonalnie do wielkości cząstek.

Metoda add-on ma dwa ograniczenia, z których pierwszym są duże objętości reakcji wymagane przy wysokich proporcjach HG:seed. Drugie ograniczenie metody add-on wynika z wyżej wspomnianego faktu, że hydroksylacja HAuCl4 jest reakcją równowagi i nie przechodzi do zakończenia. Niepełna hydroksylacja HAuCl4 ma minimalny wpływ na reakcję add-on, gdy stężenie nasion oligoklastrów pozostaje wysokie. Gdy stężenie nasion oligoklastrów jest niskie, jak ma to miejsce w przypadku stosowania nasion o długim czasie opóźnienia i wysokich proporcji HG:nasiona, wpływ niehydroksylowanego HAuCl4 może stać się znaczący. W tych warunkach HAuCl4 jest zdolny do zarodkowania syntezy nowych oligoklastrów, w wyniku czego powstają niejednorodne populacje oligoklastrów.

Zsyntetyzowane oligoklastry wytworzone metodą opóźnienia lub metodą add-on są stabilne przez tygodnie, wytwarzając tylko śladowe ilości osadu złota. Nawet po 300-krotnym zagęszczeniu oligoklastry pozostają stabilne i odporne na agregację. Opisane tutaj oligoklastry złota mają również dodatkową zaletę polegającą na tym, że mogą być zagęszczane bez uprzedniej derywatyzacji, co pozwala na stosowanie drogich środków derywatyzujących w mniejszych ilościach. Po derywatyzacji glutationem (GSH) klastry pozostawały stabilne do jednego roku. Derywatyzacja GSH zapewnia również silny ładunek ujemny 13 , który sprawia, że są odporne na agregację pod wpływem fizjologicznych lub osocza zwierzęcego, dzięki czemu nadają się do eksperymentów in vivo . Derywatyzację można osiągnąć za pomocą szerokiej gamy odczynników zawierających grupy tiolowe.

Zdolność oligoklastrów do derywatyzacji z innymi cząsteczkami zawierającymi tiol 17,18 pozwala na wygodną i łatwą modyfikację monowarstwy powierzchniowej, kontrolując w ten sposób chemię powierzchni i reaktywność oligoklastrów. Inne substancje chemiczne stosowane w tym protokole mogą być łatwo zastąpione podobnymi chemikaliami bez uszczerbku dla syntezy. Obejmuje to zastąpienie boraksu innymi alkalicznymi (np. węglanem) i tiocyjanianem sodu innymi solami tiocyjanianów (np. KSCN).

Główną cechą tego protokołu jest jego prostota, którą należy podkreślić. Do produkcji oligoklastrów złota o jakości handlowej potrzebna jest tylko waga miligramowa i mieszadło magnetyczne, które mogą być wykorzystywane do zaawansowanych zastosowań biologicznych i materiałowych. Szerokie zastosowanie jest wspomagane przez szeroki zakres rozmiarów, które można wyprodukować, oraz przez monodyspersyjność. Dodatkowo produkcja we własnym zakresie jest tania.

Oligoklastry są szczególnie cenne dla badań przepuszczalności błon podstawnych i barier krwi. Można je łatwo podawać z solą fizjologiczną różnymi drogami i śledzić in vivo 19-21. Uzyskane próbki tkanek można następnie badać pod mikroskopem elektronowym 16,22. Oprócz przepuszczalności, dystrybucja biologiczna dostarcza cennych informacji farmakologicznych, a podawanie mieszaniny oligoklastrów o różnych rozmiarach dostarcza cennych informacji na temat zależnego od wielkości rozmieszczenia cząstek w organizmie 23-25. Wreszcie, ze względu na swoją unikalną strukturę, nie wykazują one zlokalizowanego powierzchniowego rezonansu plazmonowego (LSPR), co może czynić je idealnymi kandydatami do znakowania fluorescencyjnego, co nie jest łatwo osiągalne w nanocząstkach złota, ponieważ interferencja między LSPR a fluoroforem powoduje prawie całkowite wygaszenie fluorescencji 26.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

T.K. dziękuje za wsparcie ze strony Słoweńskiej Agencji Badawczej (ARRS, granty BI-US/13-14-040 i J3-6803). O.S. dziękuje za wsparcie z grantu Narodowego Instytutu Zdrowia (NIH) RO1HL49277.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
125 ml szklane butelki WheatonFisher ScientificSC-06-404F
Boraks (Na2B4O7· 10H2O)Fisher ScientificS25537
Trójwodny chlorek złota(III)Sigma AldrichG4022
Tiocyjanian soduSigma Aldrich251410
Węglan soduSigma AldrichS7795
GlutationSigma AldrichG4251
Fosforan Dulbecco buforowany sól fizjologiczna (DPBS)Corning21-031-CV
Centricon Plus - 70MiliporeUCF703008
Wodorowęglan soduSigma AldrichS6014
CF200-Cu Folia węglowa na siatkach miedzianych o siatce 200 Mikroskopia elektronowa Sciences71150
10x Bufor Tris/GlycineBio-Rad161-0734
Dowolny kD Mini-PROTEAN TGX GelBio-Rad456-9033

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dreaden, E. C., Austin, L. A., Mackey, M. A., El-Sayed, M. A. Size matters: gold nanoparticles in targeted cancer drug delivery. Ther. Deliv. 3 (4), 457-478 (2012).
  2. Huang, X., Jain, P., El-Sayed, I., El-Sayed, M. Plasmonic photothermal therapy (PPTT) using gold nanoparticles. Lasers Med. Sci. 23 (3), 217-228 (2008).
  3. Notarianni, M., et al. Plasmonic effect of gold nanoparticles in organic solar cells. Sol. Energy. 106, 23-37 (2013).
  4. Jain, P. K., Huang, X., El-Sayed, I. H., El-Sayed, M. A. Noble Metals on the Nanoscale: Optical and Photothermal Properties and Some Applications in Imaging, Sensing, Biology, and Medicine. Acc. Chem. Res. 41 (12), 1578-1586 (2008).
  5. Huang, X., El-Sayed, M. A. Gold nanoparticles: Optical properties and implementations in cancer diagnosis and photothermal therapy. J. Adv. Res. 1 (1), 13-28 (2010).
  6. Cioffi, N., et al. Electrosynthesis and characterization of gold nanoparticles for electronic capacitance sensing of pollutants. Electrochim. Acta. 56 (10), 3713-3720 (2011).
  7. Mikami, Y., Dhakshinamoorthy, A., Alvaro, M., Garcia, H. Catalytic activity of unsupported gold nanoparticles. Catal. Sci. Tech. 3 (1), 58-69 (2012).
  8. González, A. L., Noguez, C., Barnard, A. S. Map of the Structural and Optical Properties of Gold Nanoparticles at Thermal Equilibrium. J. Phys. Chem. C. 116 (26), 14170-14175 (2012).
  9. Neeley, A., et al. Selective Detection of Chemical and Biological Toxins Using Gold-Nanoparticle-Based Two-Photon Scattering Assay. IEEE Trans. Nanotechnol. 10 (1), 26-34 (2011).
  10. An, H., Jin, B. Prospects of nanoparticle-DNA binding and its implications in medical biotechnology. Biotechnol. Adv. 30 (6), 1721-1732 (2012).
  11. Wang, S., Qian, K., Bi, X., Huang, W. Influence of Speciation of Aqueous HAuCl4 on the Synthesis, Structure, and Property of Au Colloids. J. Phys. Chem. C. 113 (16), 6505-6510 (2009).
  12. Britton, H. T. S., Dodd, E. N. Electrometric studies of the precipitation of hydroxides. Part V. Tervalent gold chloride solutions. J. Chem. Soc. , 2464-2467 (1932).
  13. Schaaff, T. G., Knight, G., Shafigullin, M. N., Borkman, R. F., Whetten, R. L. Isolation and Selected Properties of a 10.4 kDa Gold:Glutathione Cluster Compound. J. Phys. Chem. B. 102 (52), 10643-10646 (1998).
  14. Baschong, W., Lucocq, J. M., Roth, J. Thiocyanate gold: Small (2-3 nm) Colloidal Gold for Affinity Cytochemical Labeling in Electron Microscopy. Histochemistry. 83 (5), 409-411 (1985).
  15. De Brouckère, L., Casimir, J. Préparation d'hydrosols d'or homéodisperses très stables. Bull. Soc. Chim. Belg. 57 (10-12), 517-524 (1948).
  16. Smithies, O., et al. Stable Oligomeric Clusters of Gold Nanoparticles: Preparation, Size Distribution, Derivatization, and Physical and Biological Properties. Langmuir. 30 (44), 13394-13404 (2014).
  17. Bartz, M., et al. Monothiols derived from glycols as agents for stabilizing gold colloids in water: synthesis, self-assembly and use as crystallization templates. J. Mater. Chem. 9 (5), 1121-1125 (1999).
  18. Hainfeld, J. F., Slatkin, D. N., Focella, T. M., Smilowitz, H. M. Gold nanoparticles: a new X-ray contrast agent. Br. J. Radiol. 79 (939), 248-253 (2006).
  19. Nam, S. Y., Ricles, L. M., Suggs, L. J., Emelianov, S. Y. Ultrasound and Photoacoustic Monitoring of Mesenchymal Stem Cells Labeled with Gold Nanotracers. PLoS One. 7 (5), (2013).
  20. Jokerst, J. V., Thangaraj, M., Kempen, P. J., Sinclair, R., Gambhir, S. S. Photoacoustic Imaging of Mesenchymal Stem Cells in Living Mice via Silica-Coated Gold Nanorods. ACS Nano. 6 (7), 5920-5930 (2013).
  21. Astolfo, A., et al. In vivo visualization of gold-loaded cells in mice using x-ray computed tomography. Nanomed. Nanotechnol. Biol. Med. 9 (2), 284-292 (2013).
  22. Menk, R. H., et al. Gold nanoparticle labeling of cells is a sensitive method to investigate cell distribution and migration in animal models of human disease. Nanomed. Nanotechnol. Biol. Med. 7 (5), 647-654 (2011).
  23. Kumar, A., Zhang, X., Liang, X. J. Gold nanoparticles: Emerging paradigm for targeted drug delivery system. Biotechnol. Adv. 31 (5), 593-606 (2013).
  24. Paciotti, G. F., et al. Colloidal Gold: A Novel Nanoparticle Vector for Tumor Directed Drug Delivery. Drug Deliv. 11 (3), 169-183 (2004).
  25. Khlebtsov, N., Dykman, L. Biodistribution and toxicity of engineered gold nanoparticles: a review of in vitro and in vivo studies. Chem. Soc. Rev. 40 (3), 1647-1671 (2011).
  26. Nerambourg, N., Werts, M. H., Charlot, M., Blanchard-Desce, M. Quenching of Molecular Fluorescence on the Surface of Monolayer-Protected Gold Nanoparticles Investigated Using Place Exchange Equilibria. Langmuir. 23 (10), 5563-5570 (2007).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Gold NanoparticlesOligomeric ClustersDelay Time MethodAdd On MethodSize Controlled SynthesisAmbient ConditionsGel ElectrophoresisTransmission Electron MicroscopySodium ThiocyanateHydroxylated Gold Chloride

Powiązane artykuły