Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja komórek Sertoliego i komórek okołokanalikowych z jąder szczura

22.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53389

⸱

8 lutego 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institut für Anatomie und Zellbiologie, Justus-Liebig-Universität Gießen, 2Institut für Zytobiologie und Zytopathologie, Philipps-Universität Marburg

W tym artykule

Podsumowanie

Podstawowe komórki Sertoliego są niezbędne do badania przywilejów immunologicznych jąder, transdukcji sygnału podczas stanu zapalnego lub infekcji oraz wykorzystania ich właściwości immunoprotekcyjnych. Tutaj opisujemy oparty na enzymach protokół izolacji wysoce oczyszczonych pierwotnych komórek Sertoliego i komórek okołokanalikowych z jąder szczurów.

Streszczenie

Jądro, a w szczególności męska gameta, stanowi wyzwanie dla układu odpornościowego w unikalny sposób, ponieważ zróżnicowane plemniki pojawiają się po raz pierwszy w okresie dojrzewania - ponad dziesięć lat po ustaleniu ogólnoustrojowej tolerancji immunologicznej. Komórki spermatogenne wyrażają szereg białek, które mogą być postrzegane przez układ odpornościowy jako niewłasne. Jądro musi być wtedy w stanie z jednej strony ustalić tolerancję na te neoantygeny, ale z drugiej strony nadal być w stanie chronić się przed infekcjami i rozwojem nowotworu. Dlatego jądro jest jednym z niewielu uprzywilejowanych immunologicznie miejsc w organizmie, które tolerują obce antygeny bez wywoływania szkodliwej zapalnej odpowiedzi immunologicznej. Komórki Sertoliego odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu tego uprzywilejowanego immunologicznie środowiska jądra, a także przedłużają przeżycie koprzeszczepionych komórek w obcym środowisku. Dlatego pierwotne komórki Sertoliego są ważnym narzędziem do badania przywilejów immunologicznych jądra, których nie można łatwo zastąpić ustalonymi liniami komórkowymi lub innymi modelami komórkowymi. Tutaj przedstawiamy szczegółowy i kompleksowy protokół izolacji komórek Sertoliego - i w razie potrzeby komórek okołokanalikowatych - z jąder szczurów w ciągu jednego dnia.

Wprowadzenie

Jądra produkują męskie gamety i hormony płciowe, tj. androgeny. Narząd składa się z dwóch komór. W przedziale śródmiąższowym, który stanowi około 10-12% całkowitej objętości jąder1, steroidogeneza zachodzi w komórkach Leydiga. Przedział rurkowy stanowi około 60-80% objętości jąder1 i zawiera komórki rozrodcze oraz dwa typy komórek somatycznych - komórki okołokanalikowe i komórki Sertoliego. Jądro jest podzielone przez przegrody tkanki łącznej na 250-300 zrazików, z których każdy zawiera 1-3 silnie zawiłe kanaliki nasienne. Kanaliki te są otoczone błoną podstawną, arkuszem kolagenu i obwodową warstwą komórek okołorurkowych (ryc. 1A).

Nabłonek zarodkowy znajduje się po stronie światła błony podstawnej. Komórki Sertoliego to duże, wydłużone komórki, które obejmują cały nabłonek rozrodczy od błony podstawnej do światła. Są silnie przymocowane do błony podstawnej i tworzą ciągły arkusz komórkowy przez podstawno-boczne zorganizowane ścisłe połączenia, które zamykają nabłonek zarodkowy od śródmiąższu i reprezentują barierę krew-jądro. Komórki Sertoliego mają wyraźne projekcje cytoplazmatyczne i rozgałęzienia, które umożliwiają im wejście w ścisły kontakt morfologiczny i funkcjonalny ze specyficzną dla gatunku, ale stałą liczbą komórek rozrodczych. Diploidalne rozrodcze komórki macierzyste namnażają się i różnicują w spermatogonię.

Podczas mejozy I generowane są krótkotrwałe tetraploidalne spermatocyty, które rozwijają się dalej w cztery haploidalne spermatydy podczas mejozy II. Wszystkie komórki rozrodcze są połączone mostkami cytoplazmatycznymi, dzięki czemu tworzą sieć komórkową. Głównym zdarzeniem podczas dojrzewania spermiogód jest ekstruzja dużych części cytoplazmy, tworzących ciała resztkowe, w procesie zwanym spermiogenezą. Ciała resztkowe są fagocytozowane przez komórki Sertoliego. Późne spermatydy są następnie uwalniane do światła kanalika i transportowane do najądrza w celu dalszego dojrzewania. Wydaje się, że komórki Sertoliego i komórki rozrodcze wzajemnie koordynują spermatogenezę topograficznie i funkcjonalnie.

Przygotowanie indywidualnych typów komórek jąder rozpoczęło się prawie sto lat temu, kiedy hodowano małe fragmenty jąder i identyfikowano typy komórek za pomocą mikroskopii2. Dzięki starannemu rozwarstwieniu kanalików po otwarciu osłonki białawej za pomocą kleszczy z cienką końcówką udało się później oddzielić przedziały rurkowe i śródmiąższowe3. W 1975 roku Welsh i Wiebe wprowadzili leczenie kolagenazą w celu uwolnienia kanalików od przylegającej tkanki śródmiąższowej oraz leczenie pankreatyną w celu usunięcia zewnętrznej warstwy komórek okołokanalikowatych4. Od samego początku stosowano młode, niedojrzałe szczury (w wieku około 20 dni), u których komórki Sertoliego stanowią dużą część populacji komórek kanalikowatych, ponieważ spermatogeneza jeszcze się nie rozpoczęła. W tym wieku szczurze komórki Sertoliego przestają się dzielić, a między sąsiednimi komórkami tworzą się ścisłe połączenia, tak że ustanawia się bariera krew-jądro5.

Niezależny od Welsh i Wiebe Dorrington et al. wprowadził kombinację trypsyny i dezoksyrybonukleazy, a następnie inhibitora trypsyny sojowej i leczenia kolagenazą, która została opublikowana w tym samym roku6. Obie grupy używały również siły mechanicznej (wielokrotnie przeciągając strawione fragmenty rurki odpowiednio przez igłę strzykawki lub pipetę Pasteura) w celu wytworzenia jednorodnej zawiesiny komórek do posiewu, która zawiera około 70% komórek Sertoliego. Po 3 dniach w hodowli, przy użyciu pożywki bez surowicy, odsetek komórek Sertoliego wzrasta do około 90%. Można to w dużej mierze przypisać śmierci zanieczyszczających komórek rozrodczych. Pozostałe komórki okołokanalikowe (PTC) pozostają jednak mocno połączone poprzez swoją macierz zewnątrzkomórkową. Wiadomo, że PTC, ale nie komórki Sertoliego, wytwarzają fibronektynę, która może służyć jako białko markerowe do szacowania zanieczyszczenia PTC. Dlatego Tung i wsp. doszli do wniosku, że dodatkowe leczenie hialuronidazą może poprawić czystość frakcji komórek Sertoliego7. W rzeczywistości mogli wykazać, że dodatkowa obróbka była w stanie zmniejszyć zanieczyszczenie PTC około 20-krotnie, co staje się szczególnie widoczne, gdy porównamy to z podłożem zawierającym surowicę do hodowli oczyszczonych komórek Sertoliego. Od tego czasu ulepszona procedura Tunga i wsp. stała się dominującym protokołem i była szeroko stosowana przez inne główne grupy w tej dziedzinie8 (Rysunek 1B).

Podczas leczenia kolagenazą większość PTC jest uwalniana i może być izolowana równolegle do komórek Sertoliego. Podczas gdy PTC energicznie się namnażają i nie reagują na hormon folikulotropowy (FSH), komórki Sertoliego nie ulegają już mitozie i reagują na FSH charakterystycznymi zmianami morfologicznymi i wzrostem stężenia cyklicznego monofosforanu adenozyny (cAMP)9. Bardzo podobne protokoły trawienia enzymatycznego można zastosować do izolacji pierwotnych komórek Sertoliego od innych zwierząt, takich jak człowiek10, mysz11,12, chomik syberyjski13 lub jak14. W celu usunięcia dużych ilości zanieczyszczających komórek rozrodczych można zastosować wstrząs hipotoniczny pod koniec procedury izolacji15. Pozwala to również na skuteczną izolację komórek Sertoliego z jąder dorosłych szczurów16. Wzbogaconą zawiesinę komórek Sertoliego można również oddzielić od komórek rozrodczych poprzez posiew zawiesiny na szalkach lektynowych pokrytych aglutyniną Datura Stramonium 17. Tylko komórki Sertoliego i kilka resztkowych PTC przylegają do płytek lektynowych.

Pierwotne hodowle komórek Sertoliego, głównie od szczurów, były początkowo używane do badania reakcji na hormony lub tworzenia linii komórkowych, takich jak mysia linia komórkowa Sertoliego TM418. Ta linia komórkowa została zbadana w ponad stu badaniach do dnia dzisiejszego. W podejściu translacyjnym komórki Sertoliego zostały wykorzystane do immunoochrony współhodowanych komórek i tkanek, takich jak kotransplantacja kseno- lub allogenicznych wysp trzustkowych w celu długoterminowego przeżycia przeszczepu bez ogólnoustrojowej immunosupresji19. Wyizolowane komórki Sertoliego zostały również wykorzystane w eksperymentach z kokulturą do badania interakcji nabłonkowo-mezenchymalnych (komórki Sertoliego - PTCc) i somatycznych komórek rozrodczych (komórki Sertoliego - komórki rozrodcze)20,21. Ostatnio pierwotne komórki Sertoliego zostały wykorzystane do badania ekspresji receptorów Toll-podobnych i wydzielania cytokin prozapalnych, a także kaskad transdukcji sygnału prowadzących do ekspresji cytokin po zakażeniu niepatogennymi i uropatogennymi E. coli22. Inne niedawne badania wykorzystywały komórki Sertoliego do badania przywilejów immunologicznych jąder23 i wykazały, że wstępne leczenie testosteronem hamuje reakcję zapalną wywołaną przez LPS24.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Oświadczenie o etyce zwierząt

Opisane tutaj eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Regierungspräsidium Giessen, Niemcy, jako władz lokalnych i potwierdzają Niemiecki Kodeks Postępowania w zakresie opieki nad zwierzętami i ich wykorzystywania do celów doświadczalnych (Zezwolenie nr: GI 20/23 Nr. A 31/2012).

2. Przygotowanie pożywek, roztworów enzymatycznych i zwierząt

  1. Przygotuj 1% alkoholu jodowego, rozpuszczając 1 g jodu w 100 ml etanolu.
  2. Przygotować 2x 500 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) firmy Dulbecco bez Ca2+ i Mg2+ uzupełnionych każdym o 7,5 ml D-glukozy (100 g / L) i 5 ml 100 x roztwór podstawowy penicyliny/streptomycyny (15 mg / ml D-glukozy, 50 U / ml penicyliny i 50 μg / ml Streptomycyny końcowej).
  3. Suplement 1x 500 ml pożywki Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 z 5 ml 100x roztwór podstawowy penicyliny/streptomycyny (50 j./ml penicyliny i 50 μg/ml streptomycyny końcowej).
  4. Przygotować roztwór trypsyny-DNazy I (2,5 mg/ml trypsyny i 10 μg/ml DNazy I), dodając 25 mg trypsyny i 0,1 ml DNazy I (1 mg/ml DNazy I) do 9,9 ml PBS.
  5. Rozpuścić 50 mg inhibitora trypsyny w 5 ml PBS dla roztworu inhibitora trypsyny A (10 mg/ml). Rozpuścić 25 mg inhibitora trypsyny w 10 ml PBS dla roztworu inhibitora trypsyny B (2,5 mg/ml).
  6. W przypadku roztworu kolagenazy-hialuronidazy-dezoksyrybonukleazy I (DNazy I) rozpuścić 10 mg kolagenazy A (1 mg/ml finał), 10 mg hialuronidazy (1 mg/ml finału) i 0,1 ml DNazy I (1 mg/ml DNazy I) (10 μg/ml finału) w 10 ml PBS.
  7. Przygotować roztwór hialuronidazy-DNazy I, dodając 10 mg hialuronidazy (1 mg/ml ostateczny) i 0,1 ml roztworu DNazy I (1 mg/ml) (10 μg/ml końcowy) do 9,9 ml PBS.
  8. Zamów szczury Wistar na czas, tak aby w dniu izolacji komórek Sertoliego miały 19 dni.
    Uwaga: Opisany protokół jest przeznaczony dla 10 szczurów, ale może być zmodyfikowany dla minimum 5 i maksimum 20 szczurów. Objętości wszystkich roztworów muszą być odpowiednio dostosowane.
  9. Przygotować roztwór podstawowy czerwieni olejowej O, rozpuszczając 0,35 g czerwieni olejowej O w 100 ml izopropanolu. Wymieszać O/N, przefiltrować przez 0,2 μm i przechowywać w temperaturze pokojowej przez okres do jednego roku.
  10. Przygotować roztwór barwiący czerwień olejową O, mieszając 6 ml roztworu podstawowego czerwieni olejowej O z 4 ml wody (3:2). Po 10-20 minutach przefiltrować przez 0,2 μm. Zużyć w ciągu najbliższych 2 godzin.
  11. Przygotuj 4% (w/v) roztwór formaldehydu w wentylowanym kapturze, dodając 4 g proszku paraformaldehydu (PFA) do 80 ml 1x PBS, delikatnie mieszając. Podgrzać do ~60 °C, dodać 1 ml 1 M NaOH i kontynuować mieszanie, aż paraformaldehyd się rozpuści. Pozostawić roztwór do ostygnięcia do temperatury pokojowej, dostosować pH do 7,4 za pomocą 1 M HCl, a objętość do 100 ml za pomocą 1x PBS. Przefiltrować roztwór (0,45 μm) i użyć świeżego lub przechowywać w porcjach w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy.
    Uwaga: Spolimeryzowany formaldehyd (PFA) depolimeryzuje do monomerycznego formaldehydu w wodzie. Proces ten jest katalizowany przez umiarkowane ogrzewanie i lekko zasadowe pH. Wszystkie roztwory enzymatyczne należy przygotować na świeżo i przefiltrować, wysterylizować (0,2 μM) w dniu użycia. Jeśli stosowany jest enzym innego producenta (patrz tabela materiałów/sprzętu), należy ostrożnie dostosować jego stężenie/aktywność.
    W poniższym protokole "pipeta" oznacza pipetę serologiczną.

3. Przygotowanie kanalików nasiennych

  1. Znieczulij 10 samców szczurów rasy Wistar jeden po drugim w eksykatorze przy użyciu CO2 i natężenia przepływu, które przemieszcza co najmniej 20% objętości komory na minutę. Poczekaj, aż oddech przestanie oddychać, przetestuj znieczulenie, ściskając poduszkę stopy, a jeśli nie ma reakcji, poddaj każdego szczura eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy. Spuść krew, przecinając żyłę szyjną i tętnicę szyjną (vagina carotica) pod płynącą wodą. Zdezynfekuj brzuch, przecierając go 70% etanolem.
  2. Za pomocą kleszczy podnieś skórę z mięśni brzucha i wytnij owalny płat skóry, który rozciąga się od spojenia łonowego do mostka (ryc. 2A) i przesuń go w górę na klatkę piersiową. Następnie chwyć mięśnie brzucha i wykonaj przyśrodkowe nacięcie od spojenia łonowego do mostka.
    1. Ściśnij brzuch kciukami od miednicy do góry, aby wypchnąć jądra z dolnej miednicy. Wybierz poduszeczkę tłuszczową najądrza (ryc. 2B) za pomocą kleszczy, aby dalej podciągnąć jądro. Przeciąć powrózek nasienny (ryc. 2B), pozostawiając osłonkę białawą nienaruszoną, i zebrać wszystkie jądra w 20 ml PBS w stożkowej probówce o pojemności 50 ml (ryc. 2C).
  3. Po zebraniu wszystkich jąder zdezynfekuj je, dodając równą objętość (20 ml) 1% (w/v) jodu w etanolu. Odwrócić probówkę dwukrotnie i natychmiast zdekantować supernatant. Szybko przemyj jądra dwukrotnie po 25 ml PBS (ryc. 2D).
  4. Przenieść jądra na szalkę Petriego zawierającą 15 ml PBS (ryc. 2E). Chwyć mocno każde jądro kleszczami na jednym końcu, wykonaj małe nacięcie w osłonce białawej na przeciwległym końcu i wyciśnij kanaliki za pomocą zamkniętych ostrzy nożyczek jako narzędzia do skrobania.
    Uwaga: Kanaliki powinny nadal tworzyć zwarty pęczek w kształcie jądra, z zaledwie kilkoma kanalikami rozciągającymi się w roztwór, aby umożliwić jednorodne trawienie enzymatyczne (ryc. 2F).
  5. Przenieść pozbawione kapsułki jądra do 100 ml butelki z zakrętką zawierającej 10 ml roztworu trypsyny-DNazy I. Trawienie przeprowadzić w wytrząsającej łaźni wodnej w temperaturze 32 °C (120 oscylacji/min). Po 4 minutach oceń kanaliki gołym okiem pod kątem dyspersji kanalików. Gdy kanaliki zaczną rozpraszać się w roztworze, natychmiast przerwij trawienie. W razie potrzeby kontynuować inkubację do 2 minut.
  6. Zatrzymaj trawienie trypsyny, dodając 5 ml roztworu inhibitora trypsyny A. Dokładnie wymieszaj roztwór, pipetując w górę i w dół 3-4 razy za pomocą pipety o pojemności 10 ml i przenieś go do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
  7. Po 5 minutach inkubacji obserwuj, jak kanaliki osiadają pod wpływem jednostkowej grawitacji, ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety o pojemności 10 ml z kroku 3.6 i dodać 10 ml roztworu inhibitora trypsyny B w celu całkowitego zatrzymania trawienia trypsyny. Ponownie zawiesić kanaliki, pipetując w górę i w dół 2-3 razy.
  8. W celu usunięcia zanieczyszczających komórek śródmiąższowych należy przemyć kanaliki 9 razy po 25 ml PBS każdy. Ponownie zawiesić kanaliki w każdym płukaniu za pomocą pipety o pojemności 25 ml i pozostawić je do ustabilizowania się pod wpływem jednostkowej grawitacji przez 10 minut. Do pipetowania PBS, ponownego wymieszania i usuwania supernatantu należy zawsze używać tej samej pipety o pojemności 25 ml.

4. Usuwanie/izolacja komórek okołokanalikowych (PTC)

  1. Przenieś wszystkie kanaliki do butelki z zakrętką o pojemności 100 ml i dodaj roztwór kolagenazy-hialuronidazy-DNazy I (ryc. 3A). Trawienie należy przeprowadzać przez 10 minut w wytrząsającej łaźni wodnej w temperaturze 32 °C (120 oscylacji/min).
  2. Odpipetuj kroplę zawiesiny na szklane szkiełko i szybko sprawdź kanaliki pod mikroskopem światła odwróconego pod kątem rutynowej hodowli komórkowej w 100-krotnym powiększeniu. Jeśli trawienie nie jest wystarczająco zaawansowane, kontynuuj inkubację przez dodatkowe 2 minuty (nie licz czasu potrzebnego na kontrolę mikroskopową).
    Uwaga: Na tym etapie wszystkie kanaliki ulegają skróceniu, a krawędzie kanalików powinny stać się szorstkie (ryc. 3B i C). Szorstkie krawędzie wskazują na uwalnianie komórek okołokanalikowych.
  3. Przenieść zawiesinę z przetrawionymi kanalikami do stożkowej probówki o pojemności 50 ml za pomocą pipety o pojemności 25 ml opisanej w kroku 3.8. Umyj butelkę o pojemności 100 ml 10 ml PBS i dodaj ją do kanalików w stożkowej probówce. Pozostawić strawione kanaliki do ustabilizowania się pod wpływem jednostkowej grawitacji przez 10 minut, a następnie ostrożnie zassać supernatant zawierający PTC, ponownie używając pipety o pojemności 25 ml i przenieść go do nowej stożkowej probówki. Do aspiracji ostatnich kilku mililitrów należy użyć pipety o pojemności 5 ml, aby zapobiec przenoszeniu kanalików.
  4. Dodać 20 ml pożywki RPMI 1640 uzupełnionej 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS) do zebranych supernatantów kanalików, wymieszać i odwirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej bez użycia przerwy.
  5. Ostrożnie zdekantować supernatant i ponownie zawiesić granulowane PTC w 20 ml pożywki RPMI 1640 uzupełnionej 10% inaktywowanym termicznie FBS i nasionach po 4 ml na pięciu kolbach T75 zawierających 16 ml pożywki każda. Inkubować w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 (rysunek 4A).
  6. W 3 dniu hodowli trypsynować PTC i rozdzielać je 1:2 na kolbach T75 zawierających 16 ml pożywki RPMI 1640 uzupełnionej 10% inaktywowanym termicznie FBS każda (daje łącznie 10 kolb) (Rysunek 4B). Kontynuować inkubację w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%CO2
    7. .
  7. W 5 dniu hodowli ponownie trypsynizować PTC i umieścić je na płytkach 6-dołkowych lub 24-dołkowych, w zależności od eksperymentu (jedna kolba T75 na płytkę). Eksperymenty można przeprowadzić w 6 dniu.

5. Izolacja komórek Sertoliego (SC)

  1. Ponownie zawiesić osadzone kanaliki z kroku 4.3 dokładnie w 25 ml PBS za pomocą pipety o pojemności 25 ml i pozostawić je do osadzenia się pod wpływem jednostkowej grawitacji przez 12 minut. Użyć tej samej pipety o pojemności 25 ml do pipetowania PBS, ponownego zawieszenia kanalików i usuwania sklarowanych nadpokojów. Powtórz pranie 3 razy (w sumie 4 prania).
  2. Po ostatnim przepłukaniu przełóż strawione kanaliki do kolejnej butelki z nakrętką o pojemności 100 ml zawierającej roztwór hialuronidazy-DNazy I. Trawienie przeprowadzić w wytrząsającej łaźni wodnej w temperaturze 32 °C (120 oscylacji/min).
  3. Po 5 minutach ponownie sprawdź kanaliki za pomocą mikroskopowej kontroli świetlnej przy 100-krotnym powiększeniu, jak opisano w kroku 4.2.
    Uwaga: Krótkie kanaliki, agregaty rurowe i uwolnione komórki powinny być widoczne (rysunek 3D).
    1. Pozostawić agregaty rurkowe na 10 minut i odessać supernatant za pomocą pipety o pojemności 25 ml. Przemyć kruszywa 4 razy przy użyciu 25 ml PBS i czasie sedymentacji wynoszącym 10 minut dla każdego etapu płukania (rysunek 3E).
  4. Dodać 20 ml pożywki RPMI 1640 i przepuścić zawiesinę 10 razy przez igłę 18 G zamontowaną na strzykawce o pojemności 20 ml. Unikaj pęcherzyków powietrza.
    Uwaga: Wciąganie i wysuwanie zawiesiny przez igłę uważa się za jedno przejście. Rozbijanie i homogenizacja komórek przez ścinanie hydrodynamiczne jest standardową techniką przygotowania komórek, które mają tendencję do agregacji. Jest mało prawdopodobne, aby przechodzenie komórek przez igłę podskórną o małej średnicy wewnętrznej miało wpływ na ich właściwości funkcjonalne25. Rycina 5C i D pokazuje normalną ultrastrukturę oczyszczonych komórek Sertoliego w 4 dniu hodowli.
    1. Odpipetuj kroplę zawiesiny na szklane szkiełko i szybko sprawdź kanaliki pod mikroskopem światła odwróconego pod kątem rutynowej hodowli komórkowej przy 10-krotnym powiększeniu, jeśli wszystkie agregaty są rozproszone (ryc. 3F). Przefiltrować zawiesinę komórek przez sitko o wielkości 70 μm w celu uzyskania czystej zawiesiny jednokomórkowej w filtracie.
  5. Odwirować filtrat z etapu 5.4 przy 200 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej bez użycia przerwy. Ostrożnie odessać supernatant za pomocą pipety o pojemności 25 ml i ponownie zawiesić komórki Sertoliego w 40 ml pożywki RPMI 1640 (bez surowicy).
  6. Zmieszać 100 μl zawiesiny komórek ze 100 μl barwienia błękitem trypanowym i policzyć komórki za pomocą komory Neubauer Improved. Dostosuj stężenie komórek do 3 x 106 komórek/ml zgodnie z wynikiem zliczania. Wysiewać 1 ml na dołek na płytce 6-dołkowej (= dzień 1). Jeśli planowane jest barwienie czerwienią olejową O (krok 6), przed wysiewem komórek Sertoliego umieść szkiełko nakrywkowe w jednym lub kilku dołkach.
    Uwaga: Komórki Sertoliego w zawiesinie szybko osiadają, tak że probówkę należy krótko wstrząsnąć za każdym razem przed pobraniem porcji komórek za pomocą pipety. Do 4 dnia mocno przyczepiają się do podłoża.
  7. W celu usunięcia pływających lub przylegających komórek rozrodczych w dniu 4 (Rysunek 4C) należy przemyć każdą studzienkę z 6-dołkowych płytek używanych do posiewu izolowanych komórek Sertoliego (krok 5.6) PBS (Rysunek 4D). Odessać pożywkę, dodać 1-2 ml PBS do każdej studzienki i energicznie potrząsnąć 6-dołkowymi płytkami poziomo na stole, ale bez rozlewania PBS. Powtórz pranie 3 razy i wykonaj tę samą procedurę prania w 5 i 6 dniu (Rysunek 4E).
    Uwaga: W dniu 4 komórki Sertoliego mocno się przyczepiły i wykazują wzór przypominający bruk pod mikroskopem światła odwróconego (Ryc. 4C). Eksperymenty można przeprowadzać od 7 dnia.
    1. (Alternatywa dla kroku 5.7) W celu usunięcia pływających i przylegających komórek rozrodczych należy przeprowadzić wstrząs hipotoniczny 3 dni po wysianiu na płytkach 6-dołkowych. Wyjmij pożywkę i dodaj 1 ml 20 mM Tris pH 7,5 pobranych bezpośrednio z lodówki. Zassać bufor Tris po 90 do 120 sekundach, ale nie później. Umyj komórki dwukrotnie PBS i dodaj 2 ml pożywki RPMI 1640 (bez surowicy). Opcjonalnie przeprowadź eksperymenty następnego dnia.
      Uwaga: Im dłuższy jest czas trwania wstrząsu hipotonicznego, tym więcej komórek rozrodczych można usunąć, ale tym więcej komórek Sertoliego również zostaje utraconych. Pierwsze płukanie PBS należy wykonać szybko, ale ostrożnie, aby nie przemieścić żadnych komórek Sertoliego. Bezpośrednio po leczeniu hipotonicznym można zaobserwować liczne wakuole o różnych rozmiarach w cytoplazmie za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym. Wakuole znikają w ciągu kilku godzin po leczeniu hipotonicznym.

6. Barwienie na czerwono olejowe

  1. Wykonaj wszystkie kroki w RT. W 7 dniu należy dwukrotnie przemyć komórki Sertoliego wyhodowane na szkiełku nakrywkowym (krok 5.6) PBS i utrwalić je 10% formaliną w PBS. Po 10 minutach zastąp formalinę świeżym roztworem i kontynuuj utrwalanie przez kolejne 60 minut.
    Uwaga: Wszystkie roztwory dodaje się do studzienki (studzienek) za pomocą szkiełka nakrywkowego i odsysa przed następnym krokiem.
  2. Odessać formalinę, dwukrotnie umyć komórki wodą i dodać 60% izopropanolu. Po 5 minutach pozostaw komórki do wyschnięcia na powietrzu przez kilka minut.
  3. Dodać 1 ml roztworu barwiącego Oil Red O do studzienki i inkubować przez 10 minut. Odessać roztwór i natychmiast przemyć komórki 4 razy wodą i zamontować szkiełka nakrywkowe w glicerolu-PBS (9:1). Wykonaj zdjęcia w jasnym polu za pomocą rutynowego mikroskopu świetlnego (rysunek 4F).

7. Barwienie immunofluorescencyjne

  1. Przemyć PTC (z kroku 4.5) lub komórki Sertoliego (z kroku 5.5) wyhodowane na szkiełku nakrywkowym za pomocą PBS dwukrotnie i utrwalić je 4% PFA przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Inkubować z 5% BSA w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Odrzucić roztwór BSA-PBS i dodać świeży roztwór BSA-PBS zawierający aktynę (mięśnie gładkie) (dla PTC) lub wimentynę (dla komórek Sertoliego) (rozcieńczenie 1:100 dla obu przeciwciał) i inkubować w temperaturze 4 °C O/N.
    Uwaga: Inkubacja z BSA blokuje niespecyficzne wiązanie przeciwciała pierwszorzędowego.
  3. Umyj szkiełka nakrywkowe 3 razy przez 5 minut w PBS-0,1% Tween 20 i inkubuj z zielono-fluorescencyjnym barwnikiem sprzężonym z kozim przeciwciałem wtórnym przeciwko mysim (rozcieńczenie 1:1,000) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę w ciemności.
  4. Szkiełka nakrywkowe należy umyć 3 razy przez 5 minut w PBS-0,1% Tween 20 i zamontować je w medium montażowym DAPI.

8. Analiza ultrastrukturalna

  1. Komórki Sertoliego (z kroku 5.6) wyhodowane na 6 cm płytce do hodowli komórkowej przemyć PBS i utrwalić je na 2 godziny w temperaturze 4 °C w mieszaninie 2,5% aldehydu glutarowego, 2,5% paraformaldehydu i 0,05% kwasu pikrynowego w 67 mM buforze kakodylowym (pH 7,4) zgodnie z Ito i Karnovsky26.
  2. Przeprowadzić utrwalenie w 1% tetratlenku osmu, a następnie inkubację O/N w 0,3% octanie uranylu rozpuszczonym w 50 mM buforze maleinianu (pH 5). Osadzaj próbki w nośnikach do zatapiania zgodnie ze standardowymi procedurami. Wytnij cienkie kawałki, porównaj je z cytrynianem ołowiu i zbadaj pod mikroskopem elektronowym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opisana procedura pozwala na wyizolowanie około 12 x 107 komórek Sertolego z 10 jąder szczura. Na każdą studzienkę płytki 6-dołkowej wysiewa się 3 x 106 komórek, dzięki czemu w 7. dniu uzyskuje się od sześciu do siedmiu płytek 6-dołkowych do celów eksperymentalnych. Trawienie trypsyną i DNazą I jest najbardziej krytycznym etapem izolacji komórek Sertolego. Jeśli trawienie na tym etapie zajdzie zbyt intensywnie, stosunek komórek rozrodczych do komórek Sertolego będzie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Kanaliki nasienne są ograniczone okrągłą warstwą komórek okołorurkowych i blaszką podstawną po stronie światła. Komórki Sertoliego spoczywają na blaszce podstawnej, tworzą barierę jądra krwi poprzez tworzenie połączeń okluzyjnych między sąsiednimi komórkami i zapewniają ramy strukturalne dla organizacji nabłonka nasiennego. Komórki Sertoliego i sąsiednie komórki plemnikotwórcze utrzymują bliskie kontakty przez cały okres rozwoju komórek rozrodczych, zapewniając zarówno kontakt fizyczny, jak i komunikację. Dlatego, gdy ko...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Guido Verhoevenowi i Ludo Deboelowi, Leuven, którzy byli niezwykle pomocni w ustaleniu izolacji pierwotnych komórek Sertoliego w laboratorium Meinhardt w Giessen. Monika Fijak, Gießen, jest ceniona za pomoc przy rysunku 1A i porady. Badania były wspierane przez Deutsche Forschungsgemeinschaft poprzez grant BH 93/1-1 (S.B.) oraz finansowanie przez International Research Graduate College JLU Gießen (Niemcy)/Monash University (Melbourne, Australia) GRK 1871 (S.B.). Wsparcie uzyskano również z grantu kraju związkowego Hesja w ramach programu "Landes-Offensive zur Entwicklung Wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz" (LOEWE) o nazwie "Männliche Infertilität bei Infektion & Entzündung" (MIBIE).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Klon przeciwciała aktynowego (mięśni gładkich) 1A4DakoM0851Monoklonalne mysie przeciwciało przeciw człowiekowi.
Do immunofluorescencji stosować rozcieńczenie 1:100.
Albumina frakcja bydlęca V
Gatunek standardowy, liofilizowany		Serva11930.04Filtr (0,45 &mikro; m) roztwory BSA stosowane do immunofluorescencji.
Sitka do komórek Corning 70  &mikro; mCorning431751Kolor biały
Kolagenaza A od Clostridium histolyticumRoche10103586001
Mocowanie DAPI ProLong Gold AntifadeLife technologieP-36931
D-glucoseSigmaG8644100 g/L
Dulbecco´ s PBS bez Ca2+/Mg2+Gibco14190-094
DNase IRoche10104159001
Mikroskop elektronowyZeissEM 109S
Mikroskop fluorescencyjnyZeissAxioplan 2
Hialuronidaza z jądra bydlęcegoSigmaH3506
Odwrócone światło mikroskopOlympusCKX41Rutynowy mikroskop do hodowli komórkowych
Mysie przeciwciało wtórne IgG / IgM (H+L) poliklonalne
 		Technologie życioweA-10684Alexa Fluor 488 sprzężony
olej Red OSigmaO0625Zastąpił Sudan III i Sudan IV ze względu na jaśniejszy kolor.
ParaformaldehydSigmaP6148
Penicylina (5,000  U/ml)/
Streptomycyna (5 000 &mikro; g/ml)		Gibco15070-063100x roztwór
RPMI-1640Gibco21875-034Zawiera 300 mg/L L-glutaminy
Trypsyna z trzustki świniSigmaT5266
Trypan Blue Stain (0,4%)Gibco15250-061
Inhibitor trypsyny z soiSigmaT6522Produkt Sigma jest znacznie tańszy od dotychczas stosowanego
BPTI (Aprotinin) firmy Roche.
Przeciwciało przeciwko wimentynie (V9)SigmaV6630Monoklonalne mysie przeciwciało przeciwko wimentynie u świń.  Użyj rozcieńczenia 1:100 do immunofluorescencji.
Szczury Wistar WUCharles RiverPowinny mieć 19 dni w dniu eksperymentu.

Bibliografia

  1. Andrology. Male Reproductive Health and Dysfunction. Nieschlag, E., Behre, H., Nieschlag, S. , 3rd ed, Springer. (2010).
  2. Esaki, S. Über Kulturen des Hodengewebes der Säugetiere und über die Natur des interstitiellen Hodengewebes und der Zwischenzellen. Z. Mikrosk. Anat. Forsch. 15, 368-404 (1928).
  3. Hall, P. F., Irby, D. C., De Kretser, D. M. Conversion of cholesterol to androgens by rat testes: comparison of interstitial cells and seminiferous tubules. Endocrinology. 84, 488-496 (1969).
  4. Welsh, M. J., Wiebe, J. P. Rat sertoli cells: a rapid method for obtaining viable cells. Endocrinology. 96, 618-624 (1975).
  5. Vitale, R., Fawcett, D. W., Dym, M. The normal development of the blood-testis barrier and the effects of clomiphene and estrogen treatment. Anat. Rec. 176, 331-344 (1973).
  6. Dorrington, J. H., Roller, N. F., Fritz, I. B. Effects of follicle-stimulating hormone on cultures of Sertoli cell preparations. Mol. Cell. Endocrinol. 3, 57-70 (1975).
  7. Tung, P. S., Skinner, M. K., Fritz, I. B. Fibronectin synthesis is a marker for peritubular cell contaminants in Sertoli cell-enriched cultures. Biol. Reprod. 30, 199-211 (1984).
  8. Verhoeven, G., Cailleau, J. Testicular peritubular cells secrete a protein under androgen control that inhibits induction of aromatase activity in Sertoli cells. Endocrinology. 123, 2100-2110 (1988).
  9. Tung, P. S., Dorrington, J. H., Fritz, I. B. Structural changes induced by follicle-stimulating hormone or dibutyryl cyclic AMP on presumptive Sertoli cells in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 72, 1838-1842 (1975).
  10. Teng, Y., et al. Isolation and culture of adult Sertoli cells and their effects on the function of co-cultured allogeneic islets in vitro. Chin. Med. J. (Engl.). 118, 1857-1862 (2005).
  11. Kohno, S., Ziparo, E., Marek, L. F., Tung, K. S. Murine Sertoli cells: major histocompatibility antigens and glycoconjugates. J. Reprod. Immunol. 5, 339-350 (1983).
  12. Dufour, J. M., et al. Sertoli cell line lacks the immunoprotective properties associated with primary Sertoli cells. Cell Transplant. 17, 525-534 (2008).
  13. Majumdar, S. S., Tsuruta, J., Griswold, M. D., Bartke, A. Isolation and culture of Sertoli cells from the testes of adult Siberian hamsters: analysis of proteins synthesized and secreted by Sertoli cells cultured from hamsters raised in a long or a short photoperiod. Biol. Reprod. 52, 658-666 (1995).
  14. Zhang, H., Liu, B., Qiu, Y., Fan, J., Yu, S. Pure cultures and characterization of yak Sertoli cells. Tissue Cell. 45, 414-420 (2013).
  15. Ziparo, E., Geremia, R., Russo, M. A., Stefanini, M. Surface interaction in vitro between Sertoli cells and germ cells at different stages of spermatogenesis. Am. J. Anat. 159, 385-388 (1980).
  16. Anway, M. D., Folmer, J., Wright, W. W., Zirkin, B. R. Isolation of Sertoli cells from adult rat testes: an approach to ex vivo studies of Sertoli cell function. Biol. Reprod. 68, 996-1002 (2003).
  17. Scarpino, S., et al. A rapid method of Sertoli cell isolation by DSA lectin, allowing mitotic analyses. Mol. Cell. Endocrinol. 146, 121-127 (1998).
  18. Mather, J. P. Establishment and characterization of two distinct mouse testicular epithelial cell lines. Biol. Reprod. 23, 243-252 (1980).
  19. Korbutt, G. S., Elliott, J. F., Rajotte, R. V. Cotransplantation of allogeneic islets with allogeneic testicular cell aggregates allows long-term graft survival without systemic immunosuppression. Diabetes. 46, 317-322 (1997).
  20. Fritz, I. B. Somatic cell-germ cell relationships in mammalian testes during development and spermatogenesis. Ciba Found. Symp. 182, 271-281 (1994).
  21. Whaley, P. D., Chaudhary, J., Cupp, A., Skinner, M. K. Role of specific response elements of the c-fos promoter and involvement of intermediate transcription factor(s) in the induction of Sertoli cell differentiation (transferrin promoter activation) by the testicular paracrine factor PModS. Endocrinology. 136, 3046-3053 (1995).
  22. Bhushan, S., et al. Uropathogenic Escherichia coli block MyD88-dependent and activate MyD88-independent signaling pathways in rat testicular cells. J. Immunol. 180, 5537-5547 (2008).
  23. Meinhardt, A., Hedger, M. P. Immunological, paracrine and endocrine aspects of testicular immune privilege. Mol. Cell. Endocrinol. 335, 60-68 (2011).
  24. Fijak, M., et al. Influence of Testosterone on Inflammatory Response in Testicular Cells and Expression of Transcription Factor Foxp3 in T Cells. Am. J. Reprod. Immunol. , 12-25 (2015).
  25. Mamidi, M. K., et al. Impact of passing mesenchymal stem cells through smaller bore size needles for subsequent use in patients for clinical or cosmetic indications. J. Transl. Med. 10, 229(2012).
  26. Ito, S., Karnovsky, M. J. Formaldehyde-glutaraldehyde fixatives containing trinitro compounds. J. Cell. Biol. 39, 168-169 (1968).
  27. Galdieri, M., Ziparo, E., Palombi, F., Russo, M. A., Stefanini, M. Pure Sertoli cell cultures: a new model for the study of somatic-germ cell interactions. J. Androl. 5, 249-254 (1981).
  28. Fijak, M., Meinhardt, A. The testis in immune privilege. Immunol. Rev. 213, 66-81 (2006).
  29. Jegou, B. The Sertoli cell in vivo and in vitro. Cell Biol. Toxicol. 8, 49-54 (1992).
  30. Pineau, C., Le Magueresse, B., Courtens, J. L., Jegou, B. Study in vitro the phagocytic function of Sertoli cells in the rat. Cell Tissue Res. 264, 589-598 (1991).
  31. Ren, Y., Savill, J. Apoptosis: the importance of being eaten. Cell Death Differ. 5, 563-568 (1998).
  32. Ducray, A., et al. Establishment of a mouse Sertoli cell line producing rat androgen-binding protein (ABP). Steroids. 63, 285-287 (1998).
  33. Konrad, L., et al. Rat Sertoli cells express epithelial but also mesenchymal genes after immortalization with SV40. Biochim. Biophys. Acta. 1722, 6-14 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Izolacja komórektrawienie enzymatycznetrypsynaDNaza 1kolagenazahialuronidazaznakowanie immunologicznehodowla komórkowabarwienie na wimentynę
Izolacja komórek Sertoliego i komórek okołokanalikowych z jąder szczura
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.