Pomiar pH fagosomu za pomocą ratiometrycznej mikroskopii fluorescencyjnej

Summary

pH fagosomalne wpływa na dojrzewanie fagosomów, produkcję utleniaczy, zabijanie fagosomalów, a także na prezentację antygenu. W tym miejscu opisujemy ratiometryczną metodę pomiaru zmian pH w czasie i punkcie końcowym w poszczególnych fagosomach w żywych fagocytach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Abstract

Fagocytoza to podstawowy proces, w którym wrodzone komórki odpornościowe pochłaniają bakterie, komórki apoptotyczne lub inne obce cząstki w celu zabicia lub zneutralizowania spożytego materiału, lub przedstawienia go jako antygenów i zainicjowania adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych. pH fagosomów jest krytycznym parametrem regulującym rozszczepienie lub fuzję z endobłonami i aktywację enzymów proteolitycznych, zdarzeń, które umożliwiają wakuoli fagocytarnej dojrzewanie do organelli degradacyjnej. Ponadto translokacja H⁺ jest wymagana do produkcji wysokich poziomów reaktywnych form tlenu (ROS), które są niezbędne do skutecznego zabijania i sygnalizacji do innych tkanek gospodarza. Wiele patogenów wewnątrzkomórkowych obala zabijanie fagocytarne poprzez ograniczanie zakwaszenia fagosomalnego, co podkreśla znaczenie pH w biologii fagosomów. Tutaj opisujemy ratiometryczną metodę pomiaru pH fagosomalnego w neutrofilach przy użyciu zymosanu znakowanego izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) jako celów fagocytarnych oraz obrazowania żywych komórek. Test opiera się na właściwościach fluorescencyjnych FITC, który jest wygaszany przez kwaśne pH przy wzbudzeniu przy 490 nm, ale nie przy wzbudzeniu przy 440 nm, co pozwala na ilościowe określenie stosunku zależnego od pH, a nie bezwzględnej fluorescencji pojedynczego barwnika. Dostępny jest również szczegółowy protokół przeprowadzania kalibracji barwnika in situ i konwersji stosunku do rzeczywistych wartości pH. Metody ratiometryczne z pojedynczym barwnikiem są ogólnie uważane za lepsze od protokołów pseudoratiometrycznych z pojedynczą długością fali lub podwójnym barwnikiem, ponieważ są mniej wrażliwe na zakłócenia, takie jak wybielanie, zmiany ostrości, zmiany lasera i nierównomierne etykietowanie, które zniekształcają mierzony sygnał. Metodę tę można łatwo zmodyfikować w celu pomiaru pH w innych typach komórek fagocytarnych, a zymosan można zastąpić dowolną inną cząstką zawierającą aminy, od obojętnych kulek po żywe mikroorganizmy. Wreszcie, metoda ta może być dostosowana do wykorzystania innych sond fluorescencyjnych wrażliwych na różne zakresy pH lub inne aktywności fagosomalne, co czyni ją uogólnionym protokołem funkcjonalnego obrazowania fagosomów.

Introduction

Fagocytoza, proces, w którym wrodzone komórki odpornościowe pochłaniają duże cząsteczki, wyewoluował z mechanizmu jedzenia organizmów jednokomórkowych i polega na związaniu się z celem, owinięciu go błoną i ściśnięciu błony, tworząc wakuolę w cytozolu zwaną fagosomem. Podczas gdy błona fagosomalna wywodzi się z błony plazmatycznej, aktywne sortowanie białek i lipidów, a także fuzja z endomembranami podczas tworzenia fagosomu, przekształcają fagosom w odrębne organelle w komórce o właściwościach degradacyjnych, które umożliwiają zabijanie, neutralizację i rozkład spożytego materiału^1-3. Proces ten, zwany dojrzewaniem fagosomalnym, opiera się na dostarczaniu ....

Protocol

Oświadczenie etyczne: Wszystkie manipulacje na zwierzętach zostały przeprowadzone w ścisłej zgodności z wytycznymi Komitetu Badań nad Zwierzętami Uniwersytetu Genewskiego.

1. Przygotowanie celów fagocytarnych

1. Dodać 20 mg suszonego zymosanu do 10 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Wirować i podgrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez 10 minut. Schłodzić i odwirować przy 2 000 x g przez 5 min.
2. Usunąć supernatant, ponownie zawiesić w 1 ml PBS i poddać sonikacji przez 10 minut w sonikatorze łaźni wodnej. Przenieś 500 μl do dwóch probówek o pojemności 1,5 ml. Wirować przy 11 0....

Results

Poniżej znajdują się reprezentatywne wyniki eksperymentu, w którym porównano pH fagosomalnych pierwotnych neutrofili myszy wyizolowanych ze szpiku kostnego myszy typu dzikiego lub Hvcn1^-//. Aby eksperyment zakończył się sukcesem, ważne jest, aby uzyskać wystarczającą liczbę fagosomów w polu widzenia przez cały czas trwania filmu poklatkowego, unikając jednocześnie zbyt wielu fagosomów, które później będą trudniejsze do segmentacji podczas analizy obrazu. Rysunek 1 p.......

Discussion

Chociaż mikroskopia jest bardziej czasochłonna niż metody alternatywne, takie jak spektroskopia i FACS, które wykorzystują podobną strategię stosowania barwnika wrażliwego na pH w połączeniu z celami, ale mierzą średnie pH populacji fagosomów, ma kilka zalet. Po pierwsze, cząstki związane wewnętrznie i zewnętrznie, ale nie zinternalizowane, można łatwo odróżnić bez konieczności dodawania innych substancji chemicznych, takich jak błękit trypanowy lub przeciwciała, w celu odpowiednio wygaszenia lub oznakowania cząstek zewn.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zymosan A w proszku	Sigma-Aldrich	Z4250	Istnieją różni dostawcy
Izotiocyjanian fluoresceiny	Sigma-Aldrich	F7250	Istnieją różni dostawcy Przeciwciało
anty-zymozanowe (odczynnik opsonizujący Zymosan A Bioarticles)	Life Technologies	Z2850	Sigma-Aldrich O6637 jest równoważnym produktem. Alternatywnie 25% surowicy może być użyta jako odczynnik opsonizujący.
Hydrazyd 4-aminobenzoesowy (4-ABH)	Santa Cruz	sc-204107	Toksyczny, używaj rękawiczek, istnieją różni dostawcy
Chlorek difenyleniodonium (DPI)	Sigma-Aldrich	D2926	Toksyczny, używaj rękawiczek, istnieją różni dostawcy
Konkanamycyna A (ConcA)	Sigma-Aldrich	27689	Toksyczny, używaj rękawiczek, istnieją różni dostawcy
Nigericin	Sigma-Aldrich	N7143	Toksyczne, używaj rękawiczek, istnieją różni dostawcy
Monensin	Enzo	ALX-380-026-G001	Toksyczne, używaj rękawiczek, istnieją różni dostawcy
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Life Technologies	14200-075	Toksyczne, używaj rękawiczek, istnieją różni dostawcy
Roztwór soli równowagi Hanka	Technologies	14025092	Zbilansowany roztwór soli Ringera lub inne przezroczyste fizjologiczne mogą zostać zastąpione.
Węglan sodu (Na2CO3)	Sigma-Aldrich	S7795	Istnieją różni dostawcy Kwas
2-(N-Morfolino)etanosulfonowy (MES)	Sigma-Aldrich	M3671	Istnieją różni dostawcy
Kwas 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowy (HEPES)	Sigma-Aldrich	H3375	Istnieją różni dostawcy
N-metylo-D-glukamina (NMDG)	Sigma-Aldrich	M2004	Istnieją różni dostawcy
Kwas glikolu etylenowego-bis(2-aminoetyloeter)-N,N,N′,N′-tetraoctowy (EGTA)	Sigma-Aldrich	3777	Istnieją różni dostawcy
Tris(hydroksymetylo)aminometan (Tris)	Sigma-Aldrich	T1503	Istnieją różni dostawcy
Chlorek potasu (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333	Istnieją różni dostawcy
Chlorek sodu (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	Istnieją różni dostawcy
Chlorek magnezu (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266	Istnieją różni dostawcy
Etanol absolutny (EtOH)	Sigma-Aldrich	2860	Istnieją
różni dostawcyPłytki Petriego ze szklanym dnem 35 mm (fluorodish)	World Precision Instruments	FD35-100	Ibidi &mikro-przezroczyste szalki lub szkiełka nakrywkowe z odpowiednimi komorami obrazowania mogą być zastąpione
Sonikująca łaźnia wodna	O. Kleiner AG		Zamiast tego można użyć sonikatora, istnieją różni dostawcy instrumentów
Heamocytometr	Marienfeld GmbH		Istnieją
różni dostawcy instrumentówMikroskop do obrazowania na żywo o szerokim polu	widzenia Carl Zeiss AG		Istnieje wielu dostawców instrumentów, ale mikroskop musi być w stanie obrazować odpowiednio wzbudzenie/emisję 440/535 i 490/535. Konfokalne konfokalne z wirującym dyskiem z możliwością jasnego pola mogą zostać zastąpione, ale zymosan ma tendencję do częstszego wychodzenia z ostrości.
Pompa perystaltyczna (Dynamax RP-1)	Rainin		Istnieją różni dostawcy przyrządów
pH-metr	Schott Gerate GmbH		Istnieją różni dostawcy przyrządów
Licznik ręczny	Milian SA		Istnieją różni dostawcy przyrządów