Artykuł metodologiczny

Pomiar pH fagosomu za pomocą ratiometrycznej mikroskopii fluorescencyjnej

DOI:

10.3791/53402

⸱

7 grudnia 2015

 ,  , 
1Department of Cellular Physiology and Metabolism, University of Geneva

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

pH fagosomalne wpływa na dojrzewanie fagosomów, produkcję utleniaczy, zabijanie fagosomalów, a także na prezentację antygenu. W tym miejscu opisujemy ratiometryczną metodę pomiaru zmian pH w czasie i punkcie końcowym w poszczególnych fagosomach w żywych fagocytach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fagocytoza to podstawowy proces, w którym wrodzone komórki odpornościowe pochłaniają bakterie, komórki apoptotyczne lub inne obce cząstki w celu zabicia lub zneutralizowania spożytego materiału, lub przedstawienia go jako antygenów i zainicjowania adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych. pH fagosomów jest krytycznym parametrem regulującym rozszczepienie lub fuzję z endobłonami i aktywację enzymów proteolitycznych, zdarzeń, które umożliwiają wakuoli fagocytarnej dojrzewanie do organelli degradacyjnej. Ponadto translokacja H+ jest wymagana do produkcji wysokich poziomów reaktywnych form tlenu (ROS), które są niezbędne do skutecznego zabijania i sygnalizacji do innych tkanek gospodarza. Wiele patogenów wewnątrzkomórkowych obala zabijanie fagocytarne poprzez ograniczanie zakwaszenia fagosomalnego, co podkreśla znaczenie pH w biologii fagosomów. Tutaj opisujemy ratiometryczną metodę pomiaru pH fagosomalnego w neutrofilach przy użyciu zymosanu znakowanego izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) jako celów fagocytarnych oraz obrazowania żywych komórek. Test opiera się na właściwościach fluorescencyjnych FITC, który jest wygaszany przez kwaśne pH przy wzbudzeniu przy 490 nm, ale nie przy wzbudzeniu przy 440 nm, co pozwala na ilościowe określenie stosunku zależnego od pH, a nie bezwzględnej fluorescencji pojedynczego barwnika. Dostępny jest również szczegółowy protokół przeprowadzania kalibracji barwnika in situ i konwersji stosunku do rzeczywistych wartości pH. Metody ratiometryczne z pojedynczym barwnikiem są ogólnie uważane za lepsze od protokołów pseudoratiometrycznych z pojedynczą długością fali lub podwójnym barwnikiem, ponieważ są mniej wrażliwe na zakłócenia, takie jak wybielanie, zmiany ostrości, zmiany lasera i nierównomierne etykietowanie, które zniekształcają mierzony sygnał. Metodę tę można łatwo zmodyfikować w celu pomiaru pH w innych typach komórek fagocytarnych, a zymosan można zastąpić dowolną inną cząstką zawierającą aminy, od obojętnych kulek po żywe mikroorganizmy. Wreszcie, metoda ta może być dostosowana do wykorzystania innych sond fluorescencyjnych wrażliwych na różne zakresy pH lub inne aktywności fagosomalne, co czyni ją uogólnionym protokołem funkcjonalnego obrazowania fagosomów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fagocytoza, proces, w którym wrodzone komórki odpornościowe pochłaniają duże cząsteczki, wyewoluował z mechanizmu jedzenia organizmów jednokomórkowych i polega na związaniu się z celem, owinięciu go błoną i ściśnięciu błony, tworząc wakuolę w cytozolu zwaną fagosomem. Podczas gdy błona fagosomalna wywodzi się z błony plazmatycznej, aktywne sortowanie białek i lipidów, a także fuzja z endomembranami podczas tworzenia fagosomu, przekształcają fagosom w odrębne organelle w komórce o właściwościach degradacyjnych, które umożliwiają zabijanie, neutralizację i rozkład spożytego materiału1-3. Proces ten, zwany dojrzewaniem fagosomalnym, opiera się na dostarczaniu wielu enzymów proteolitycznych i bakteriobójczych, w tym oksydazy fosforanu dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NADPH), która przenosi elektrony do fagosomów, wytwarzając silny utleniaczO2- i jego pochodną reaktywne formy tlenu (ROS) 2,4.

Luminalne pH fagosomów ma głęboki wpływ na kilka zdarzeń wymaganych do funkcjonowania fagosomu. Po pierwsze, pH wpływa ogólnie na transport endobłon, ponieważ zależne od pH zmiany konformacyjne transbłonowych regulatorów transportu zmieniają rekrutację determinantów transportu, takich jak Arfs, Rabs i pęcherzykowe białka płaszcza, które z kolei określają, które pęcherzyki mogą łączyć się z fagosomami 5-8. Po drugie, skład jonowy światła fagosomalnego jest również przekształcany w miarę dojrzewania fagosomów, a niektóre transportery jonów, takie jak wymiennik Na + / H+ lub antyportery Cl- / H+ z rodziny ClC, które promują funkcję fagocytarną, opierają się na translokacji H+ 9,10. Podobnie, produkcja ROS jest ściśle związana z fagosomalnym pH. ROS i jego toksyczne produkty uboczne utleniania od dawna są uznawane za kluczowe dla zabijania fagosomalów w neutrofilach 4,11,12 i wykazano, że odgrywają kluczową rolę w innych fagocytach, w tym makrofagach, komórkach dendrytycznych (DC) i amebach 13-16. Oksydaza NADPH jest enzymem elektrogenicznym, który uwalnia H+ w cytozolu podczas zużywania NADPH, a to wymaga jednoczesnego przenoszenia H+ przez towarzyszące kanały HVCN1 wraz z transportowanymi elektronami do światła fagosomalnego, w celu złagodzenia masywnej depolaryzacji, która w przeciwnym razie doprowadziłaby do samohamowania enzymu 17-21. Wreszcie, kilka enzymów proteolitycznych ma optymalną aktywność przy różnym pH, więc zależne od czasu zmiany pH fagosomalnego mogą wpływać na to, które enzymy są aktywne i kiedy. Znaczenie phagosomalnego pH podkreślają organizmy takie jak Mycobacterium tuberculosis, Franciscella tularensis i Salmonella typherium, które przynajmniej częściowo obalają zabijanie fagocytarów poprzez zmianę pH fagosomalnego 22-24.

U ssaków głównymi fagocytami są neutrofile, makrofagi i komórki dendrytyczne, a w zależności od typu komórki, zależne od czasu zmiany pH fagosomalnego mogą się znacznie różnić i wydają się odgrywać różne role. W makrofagach silne i szybkie zakwaszenie, w którym pośredniczy zależna od ATP wakuolarna ATPaza pompy protonowej (V-ATPaza) jest jednym z kluczowych czynników pośredniczących w zabijaniu 25-27, przypominając mechanizmy obecne w amebach, które wykorzystują fagocytozę jako mechanizm jedzenia 28. Uważa się, że w tych komórkach kluczową rolę odgrywa aktywacja kwaśnych proteaz. W przeciwieństwie do tego, zabijanie neutrofili opiera się bardziej na ROS, a także na HOCl wytwarzanym przez mieloperoksydazę (MPO)11, a pH pozostaje obojętne lub zasadowe przez pierwsze 30 minut, zakwaszając dopiero później 29,30. Sugeruje się, że neutralne pH sprzyja aktywności proteaz oksydacyjnych, takich jak niektóre katepsyny. W DC pH fagosomalne jest kontrowersyjne, przy czym niektóre zgłaszają zakwaszenie, a inne obojętne lub zasadowe pH 31,32, ale ROS i pH mogą głęboko wpływać na zdolność tych komórek do prezentowania antygenów limfocytom T, co jest jedną z ich głównych funkcji 33.

Co ważne, hormony, chemokiny i cytokiny mogą wytwarzać zdarzenia sygnalizacyjne, które indukują dojrzewanie i zmiany w zachowaniu fagocytów, a to z kolei wpływa na pH fagosomalne 34,35. Podobnie leki, na przykład chlorochina przeciwmalaryczna, która jest również brana pod uwagę w terapiach przeciwnowotworowych 36, mogą wpływać na pH fagosomalne, a tym samym na wyniki immunologiczne. W związku z tym wielu biologów komórkowych, immunologów, mikrobiologów i twórców leków może być zainteresowanych pomiarem pH fagosomalnego, starając się zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw wpływu określonego zaburzenia genetycznego, związku bioaktywnego lub mikroorganizmu na wrodzoną i nabytą odpowiedź immunologiczną.

Tutaj opisujemy metodę pomiaru pH fagosomalnego u neutrofili, która pozwoliła nam pokazać znaczenie kanału HVCN1 w regulacji pH fagosomalnego neutrofili 19. Metoda opiera się na właściwościach ratiometrycznych izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC), którego emisja fluorescencji przy długości fali 535 nm jest wrażliwa na pH przy wzbudzeniu przy długości fali 490 nm, ale nie przy długości fali 440 nm 37. Kiedy ten barwnik jest chemicznie sprzężony z celem, w tym przypadku zymozanem, można go śledzić za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej o szerokim polu, w której komórki są obrazowane w miarę fagocytozy, a zmiany pH fagosomalnego są mierzone w czasie rzeczywistym w miarę dojrzewania fagosomu. Rzeczywiste pH jest następnie zbierane przez przeprowadzenie eksperymentu kalibracyjnego, w którym komórki, które uległy fagocytozowaniu, są wystawiane na działanie roztworów o różnym pH, które zawierają jonofory nigerycynę i monenzynę, które umożliwiają szybkie zrównoważenie pH w fagosomach z roztworem zewnętrznym. Wartości proporcji są następnie porównywane ze znanym pH roztworów, krzywa kalibracyjna jest konstruowana za pomocą regresji nieliniowej, a wynikowe równanie służy do obliczenia pH na podstawie wartości stosunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oświadczenie etyczne: Wszystkie manipulacje na zwierzętach zostały przeprowadzone w ścisłej zgodności z wytycznymi Komitetu Badań nad Zwierzętami Uniwersytetu Genewskiego.

1. Przygotowanie celów fagocytarnych

  1. Dodać 20 mg suszonego zymosanu do 10 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Wirować i podgrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez 10 minut. Schłodzić i odwirować przy 2 000 x g przez 5 min.
  2. Usunąć supernatant, ponownie zawiesić w 1 ml PBS i poddać sonikacji przez 10 minut w sonikatorze łaźni wodnej. Przenieś 500 μl do dwóch probówek o pojemności 1,5 ml. Wirować przy 11 000 x g przez 5 min.
  3. Powtórz pranie z 500 μl PBS. Ugotowany zymozan można porcjować, zamrażać i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  4. Umyć zymosan dwukrotnie w 500 μl świeżo przygotowanego 0,1 M Na2CO3, pH 9,3 jak wyżej (krok 1.2).
  5. Zawiesić ponownie w 490 μl po ostatnim praniu. Dodać 10 μl 10 mg/ml FITC rozpuszczonego w dimetylosulfotlenku (DMSO), zwirować, przykryć folią i inkubować z mieszaniem przez 4 godziny w temperaturze suchej masy.
  6. Aby usunąć niezwiązany barwnik, przemyj jak wyżej (krok 1.2), najpierw 0,5 ml DMSO + 150 μl PBS, następnie 0,5 ml DMSO + 300 μl PBS, następnie 0,5 ml DMSO + 450 μl PBS, a następnie sam PBS.
  7. Policz zymosan za pomocą hemocytometru. Dodać 1 μl zymosanu do 500 μl PBS, odwirować, a następnie dodać 10 μl do krawędzi komory hemocytometru, gdzie styka się ze szkiełkiem nakrywkowym umieszczonym nad siatką centralną. Zamontuj hemocytometr na mikroskopie jasnego pola wyposażonym w obiektyw 20X.
  8. Skoncentruj się na lewym górnym rogu zawierającym 16 kwadratów i policz wszystkie cząsteczki zymosanu w tym obszarze za pomocą ręcznego licznika zliczania. Powtórz tę czynność z prawym dolnym rogiem. Obliczyć stężenie zymosanu, korzystając z następującego równania: Stężenie zymosanu = Liczba/2 x 500 x 104 zymosan/ml. Znakowany zymozan może być podawany, zamrażany i przechowywany w temperaturze -20 °C.
  9. Opsonizować znakowany zymosan za pomocą króliczego przeciwciała anty-zymosanu w rozcieńczeniu 1:100. Wirować i inkubować przez 1 godzinę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Umyć 500 μl PBS jak wyżej (krok 1.2).
    Uwaga: Sonikacja jest wysoce zalecana, szczególnie po opsonizacji, ponieważ zymosan ma tendencję do tworzenia grudek, które mogą utrudniać późniejszą analizę. Jako alternatywę można zastosować opsonizację 65% v/v surowicy szczurzej lub ludzkiej.
  10. Policz zymozan za pomocą hemocytometru, jak opisano w krokach 1.7-1.8, i rozcieńczyć do 100 x 106 cząstek/ml. Alternatywnie można przeprowadzić opsonizację z innymi stymulatorami fagocytarnymi, takimi jak opsonizacja dopełniacza lub brak opsonizacji.

2. Mikroskopia wideo na żywo

  1. Wyizoluj pierwotne neutrofile myszy, jak opisano szczegółowo w innym miejscu38.
    1. Alternatywnie użyj dowolnego typu komórek fagocytarnych. Przechowywać neutrofile na lodzie w pożywce Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 uzupełnionej 5% płodową surowicą cielęcą (v/v), 200 U penicyliny/streptomycyny, w stężeniu 10 x 106 komórek/ml, aż będzie gotowa do użycia. Inne typy komórek można wysiewać 1-4 dni wcześniej.
  2. Dodać 2 x 105 (20 μl) neutrofili do środka naczynia ze szklanym dnem o średnicy 35 mm, rozprowadzić kroplę, dodając 50 μl pożywki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut, aby umożliwić przyleganie komórek.
  3. Dodać 1 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) ogrzanego do temperatury 37 °C, zawierającego specyficzny inhibitor MPO, hydrazyd 4-aminobenzoesowy (4-ABH, 10 μM). Nieswoiste inhibitory MPO, takie jak azydek sodu (5 mM), mogą być również stosowane, ale ostatnio zasugerowano, że wywierają dodatkowe niespecyficzne skutki na pH 39.
  4. Zamontuj czaszę na szerokokątnym mikroskopie fluorescencyjnym wyposażonym w system grzewczy 37 °C i obiektyw olejowy 40X. Inkubować komórki bez obrazowania przez 10 minut, aby umożliwić komórkom i sprzętowi zrównoważenie się.
  5. Dostosuj ustawienia mikroskopu, aby uzyskać obraz transmisyjny w jasnym polu [kontrast fazowy lub różnicowy kontrast interferencyjny (DIC), jeśli jest dostępny] ze wzbudzeniem 440 nm lub 490 nm i emisją 535 nm co 30 sekund.
  6. Dostosuj czas ekspozycji i częstotliwość akwizycji zgodnie z systemem mikroskopu, aby uniknąć zbyt dużego fotowybielania i fototoksyczności oraz w zależności od zadawanych pytań eksperymentalnych. Rozpocznij akwizycję obrazu.
  7. Po 2 minutach dodaj 10 x 106 (50 μl) opsonizowanego FITC-zymosanu na środek naczynia. Dostosuj proporcje cel:komórka w zależności od rodzaju użytego fagocytu i celu.
  8. Kontynuuj obrazowanie przez 30 minut. Po 30 minutach zatrzymaj akwizycję poklatkową i uruchom stoper. Przesuń scenę i zrób 10 lub więcej migawek w różnych polach widzenia, aby zobrazować inne fagosomy, a wszystko to w ciągu 5 minut.

3. Eksperymenty kalibracyjne i kontrolne

  1. Przygotować roztwory wzorcowe pH (przepisy są opisane w tabeli 1) przed dniem doświadczenia i zamrozić w 10 ml podwielokrotności. Rozmrozić roztwory kalibracyjne i ogrzać je do temperatury 37 °C w łaźni wodnej. Sprawdź pH za pomocą pH-metru i zapisz rzeczywiste pH roztworów.
  2. Zamontuj pompę perystaltyczną na szklanym dnie naczynia przed akwizycją obrazu i wykonaj mikroskopię wideo na żywo, jak opisano powyżej (sekcja 2).
  3. Pod koniec 30-minutowego okresu pobierania włącz pompę, aby usunąć roztwór z naczynia, dodaj 1 ml pierwszego roztworu kalibracyjnego i zatrzymaj pompę.
  4. Poczekaj, aż sygnał się ustabilizuje, zwykle 5 minut. Powtórz z każdym roztworem kalibracyjnym.
    1. Wykonaj co najmniej jedną kalibrację na dzień doświadczalny i kalibruj, zaczynając od najwyższego pH i pracując sekwencyjnie do najniższego, a także zaczynając od najniższego pH i pracując sekwencyjnie w kierunku najwyższego.
  5. Jako kontrolę, dodać 100 μl 100 μM inhibitora oksydazy NADPH jodku difenylopropionium (DPI) rozcieńczonego w HBSS do komórek w 900 μl HBSS w naczyniu ze szklanym dnem i inkubować przez 10 minut.
  6. Rozpocznij akwizycję i dodaj zymosan jak powyżej (krok 2.7). Po 15 minutach fagocytozy dodać 10 μl 10 μM inhibitora V-ATPazy konkanamycyny A (ConcA) rozcieńczonej w HBSS i kontynuować obrazowanie przez dodatkowe 15 minut.

4. Analiza

  1. Analiza filmów poklatkowych i migawek fagosomów.
    Uwaga: Poniższe instrukcje dotyczą ImageJ. Instrukcje krok po kroku mogą się znacznie różnić w zależności od używanego oprogramowania, ale funkcje opisane w tej sekcji są dostępne w większości profesjonalnych programów do analizy obrazu.
    1. Otwórz obrazy za pomocą profesjonalnego oprogramowania do analizy obrazu. Odejmij tło w kanale 490, rysując mały kwadratowy ROI za pomocą narzędzia do zaznaczania wielokątów kwadratowych w obszarze, w którym nie ma komórek, i klikając Wtyczki> Odejmowanie BG od ROI. Następnie prześlij ten sam zwrot z inwestycji na kanale 440, klikając Edytuj> Wybór> Przywróć zaznaczenie i powtórz.
    2. Utwórz obraz o proporcjach 32-bitowych kanału 490 podzielony przez kanał 440, klikając Process>Image Calculator... , wybierając odpowiednie obrazy z menu rozwijanych Image1 i Image2, a następnie wybierając opcję "Divide" w menu rozwijanym Operation (Operacja) i zaznaczając pole wyboru 32-bit (float) result.
    3. Zmień tabelę odnośników kodowania kolorami na tabelę kolorów zgodną ze stosunkiem, klikając pozycję Obraz> Tabele przeglądowe> Tęcza RGB. Określ próg proporcji obrazu, aby wyeliminować piksele 0 i nieskończoności, klikając Obraz> Dostosuj> Próg.... Dostosuj paski przewijania tak, aby zymosan był wyświetlany na czerwono i kliknij przycisk Zastosuj, upewniając się, że pole wyboru Ustaw piksele tła na NaN jest zaznaczone.
    4. Połącz ten stos proporcji z kanałem jasnego pola w kompozyt wielokanałowy, klikając opcję Obraz> Kolor> Scal kanały i wybierając obraz w jasnym polu z menu rozwijanego kanału szarego oraz obraz proporcji w menu rozwijanym kanału zielonego, a następnie zaznaczając pole wyboru Zachowaj obrazy źródłowe. Zeskanuj filmy poklatkowe lub migawki, aby określić, które fagosomy mają być analizowane. Kanał jasnego pola jest do tego przydatny.
    5. Narysuj obszary zainteresowania (ROI) za pomocą narzędzia do zaznaczania owalnych wielokątów wokół fagosomów i dodaj je do menedżera ROI, klikając Analizuj> Narzędzia > Menedżer ROI> Dodaj. Zmierz ich współczynnik intensywności zymozanu, klikając Więcej> Multi-Measure i usuwając zaznaczenie pola wyboru Jeden wiersz na plasterek.
    6. W przypadku filmów poklatkowych śledź fagosomy pojedynczo, rysując ROI, wpisując Ctrl + M, aby zmierzyć każdy punkt czasowy i przesuwając ROI, gdy to konieczne, aby śledzić wartości intensywności w czasie. Skopiuj pomiary z okna Wyniki do arkusza kalkulacyjnego.
      Uwaga: Analiza 15 (5 kursów czasowych na eksperyment x 3) niezależnych eksperymentów jest idealna, ale może być wymagana mniej więcej w zależności od zaobserwowanej zmienności. Zapisywanie zwrotów z inwestycji jest zawsze zalecane. Niektóre pakiety oprogramowania umożliwiają rejestrację obrazu i dynamiczną aktualizację ROI, ułatwiając tę część analizy.
  2. Konwersja z wartości fluorescencji na wartości pH
    1. Zmierzyć stosunek 490/440 dla fagosomów w filmach poklatkowych z kalibracji, jak opisano w sekcji 4.1.
    2. W arkuszu kalkulacyjnym wykreśl wartości proporcji w czasie i oblicz średnie wartości proporcji ze wszystkich fagosomów w polu widzenia (zwykle od 5 do 20) z 5 punktów czasowych w środku okresu odpowiadającego każdemu roztworowi kalibracyjnemu pH. (Patrz również czerwone pola na rysunku 5A.)
    3. Wykreśl te średnie wartości proporcji 490/440 w stosunku do rzeczywistego zmierzonego pH. Połącz co najmniej 3 niezależne kalibracje w jeden wykres. Użyj pakietu oprogramowania statystycznego lub numerycznego, aby wykonać regresję nieliniową (krzywą najlepszego dopasowania), zwykle do równania sigmoidalnego.
      Uwaga: Na przykład na rysunku 5B użyte równanie było sigmoidalnym Boltzmannem [Y = Dół + ((Góra-Dół)/(1+EXP((V50-X)/Nachylenie))], gdzie wartości Y to proporcje 490/440, X to wartości pH, a parametry górne, dolne, V50 i nachylenie są obliczane przez oprogramowanie.
    4. Użyj uzyskanego równania, aby przekształcić wartości proporcji na pH,
      Uwaga: Na przykład na rysunku 5B równanie otrzymane dla krzywej kalibracyjnej w obecności azydku sodu to stosunek 490/440 = 1,103 + [(2,89-1,103)/(1+EXP((6,993-pH)/0,9291)]. Rozwiązanie dla pH daje następujące równanie: pH = 6,993 - 0,9291*[LN((1,178/(Stosunek-1,103))-1))].

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poniżej znajdują się reprezentatywne wyniki eksperymentu, w którym porównano pH fagosomalnych pierwotnych neutrofili myszy wyizolowanych ze szpiku kostnego myszy typu dzikiego lub Hvcn1-//. Aby eksperyment zakończył się sukcesem, ważne jest, aby uzyskać wystarczającą liczbę fagosomów w polu widzenia przez cały czas trwania filmu poklatkowego, unikając jednocześnie zbyt wielu fagosomów, które później będą trudniejsze do segmentacji podczas analizy obrazu. Rysunek 1 p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż mikroskopia jest bardziej czasochłonna niż metody alternatywne, takie jak spektroskopia i FACS, które wykorzystują podobną strategię stosowania barwnika wrażliwego na pH w połączeniu z celami, ale mierzą średnie pH populacji fagosomów, ma kilka zalet. Po pierwsze, cząstki związane wewnętrznie i zewnętrznie, ale nie zinternalizowane, można łatwo odróżnić bez konieczności dodawania innych substancji chemicznych, takich jak błękit trypanowy lub przeciwciała, w celu odpowiednio wygaszenia lub oznakowania cząstek zewn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy są wspierani finansowo przez Szwajcarską Narodową Fundację Nauki poprzez grant operacyjny nr 31003A-149566 (dla N.D.) oraz The Sir Jules Thorn Charitable Overseas Trust poprzez dotację dla młodych badaczy (dla P.N.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zymosan A w proszkuSigma-AldrichZ4250Istnieją różni dostawcy
Izotiocyjanian fluoresceinySigma-AldrichF7250Istnieją różni dostawcy Przeciwciało
anty-zymozanowe (odczynnik opsonizujący Zymosan A Bioarticles)Life TechnologiesZ2850Sigma-Aldrich O6637 jest równoważnym produktem. Alternatywnie 25% surowicy może być użyta jako odczynnik opsonizujący.
Hydrazyd 4-aminobenzoesowy (4-ABH)Santa Cruzsc-204107Toksyczny, używaj rękawiczek, istnieją różni dostawcy
Chlorek difenyleniodonium (DPI)Sigma-AldrichD2926Toksyczny, używaj rękawiczek, istnieją różni dostawcy
Konkanamycyna A (ConcA)Sigma-Aldrich27689Toksyczny, używaj rękawiczek, istnieją różni dostawcy
NigericinSigma-AldrichN7143Toksyczne, używaj rękawiczek, istnieją różni dostawcy
MonensinEnzoALX-380-026-G001Toksyczne, używaj rękawiczek, istnieją różni dostawcy
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Life Technologies14200-075Toksyczne, używaj rękawiczek, istnieją różni dostawcy
Roztwór soli równowagi HankaTechnologies14025092Zbilansowany roztwór soli Ringera lub inne przezroczyste fizjologiczne mogą zostać zastąpione.
Węglan sodu (Na2CO3)Sigma-AldrichS7795Istnieją różni dostawcy Kwas
2-(N-Morfolino)etanosulfonowy (MES)Sigma-AldrichM3671 Istnieją różni dostawcy
Kwas 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowy (HEPES)Sigma-AldrichH3375Istnieją różni dostawcy
N-metylo-D-glukamina (NMDG)Sigma-AldrichM2004 Istnieją różni dostawcy
Kwas glikolu etylenowego-bis(2-aminoetyloeter)-N,N,N′,N′-tetraoctowy (EGTA)Sigma-Aldrich3777Istnieją różni dostawcy
Tris(hydroksymetylo)aminometan (Tris)Sigma-AldrichT1503 Istnieją różni dostawcy
Chlorek potasu (KCl)Sigma-AldrichP9333Istnieją różni dostawcy
Chlorek sodu (NaCl)Sigma-AldrichS7653Istnieją różni dostawcy
Chlorek magnezu (MgCl2)Sigma-AldrichM8266Istnieją różni dostawcy
Etanol absolutny (EtOH)Sigma-Aldrich2860Istnieją
różni dostawcyPłytki Petriego ze szklanym dnem 35 mm (fluorodish)World Precision InstrumentsFD35-100Ibidi &mikro-przezroczyste szalki lub szkiełka nakrywkowe z odpowiednimi komorami obrazowania mogą być zastąpione
Sonikująca łaźnia wodnaO. Kleiner AGZamiast tego można użyć sonikatora, istnieją różni dostawcy instrumentów
HeamocytometrMarienfeld GmbHIstnieją
różni dostawcy instrumentówMikroskop do obrazowania na żywo o szerokim poluwidzenia Carl Zeiss AGIstnieje wielu dostawców instrumentów, ale mikroskop musi być w stanie obrazować odpowiednio wzbudzenie/emisję 440/535 i 490/535. Konfokalne konfokalne z wirującym dyskiem z możliwością jasnego pola mogą zostać zastąpione, ale zymosan ma tendencję do częstszego wychodzenia z ostrości.  
Pompa perystaltyczna (Dynamax RP-1)RaininIstnieją różni dostawcy przyrządów
pH-metrSchott Gerate GmbHIstnieją różni dostawcy przyrządów
Licznik ręcznyMilian SAIstnieją różni dostawcy przyrządów
Life

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yeung, T., Grinstein, S. Lipid signaling and the modulation of surface charge during phagocytosis. Immunol Rev. 219, 17-36 (2007).
  2. Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annu Rev Pathol. 7, 61-98 (2012).
  3. Fairn, G. D., Grinstein, S. How nascent phagosomes mature to become phagolysosomes. Trends Immunol. 33 (8), 397-405 (2012).
  4. Nunes, P., Demaurex, N., Dinauer, M. C. Regulation of the NADPH oxidase and associated ion fluxes during phagocytosis. Traffic. 14 (11), 1118-1131 (2013).
  5. Binder, B., Holzhutter, H. G. A hypothetical model of cargo-selective rab recruitment during organelle maturation. Cell Biochem Biophys. 63 (1), 59-71 (2012).
  6. Hurtado-Lorenzo, A., et al. V-ATPase interacts with ARNO and Arf6 in early endosomes and regulates the protein degradative pathway. Nat Cell Biol. 8 (2), 124-136 (2006).
  7. Weisz, O. A. Acidification and protein traffic. Int Rev Cytol. 226, 259-319 (2003).
  8. Huynh, K. K., Grinstein, S. Regulation of vacuolar pH and its modulation by some microbial species. Microbiol Mol Biol Rev. 71 (3), 452-462 (2007).
  9. De Vito, P. The sodium/hydrogen exchanger: a possible mediator of immunity. Cell Immunol. 240 (2), 69-85 (2006).
  10. Moreland, J. G., Davis, A. P., Bailey, G., Nauseef, W. M., Lamb, F. S. Anion channels, including ClC-3, are required for normal neutrophil oxidative function, phagocytosis, and transendothelial migration. J Biol Chem. 281 (18), 12277-12288 (2006).
  11. Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. Redox reactions and microbial killing in the neutrophil phagosome. Antioxid Redox Signal. 18 (6), 642-660 (2013).
  12. Seredenina, T., Demaurex, N., Krause, K. H. Voltage-Gated Proton Channels as Novel Drug Targets: From NADPH Oxidase Regulation to Sperm Biology. Antioxid Redox Signal. , (2014).
  13. Kotsias, F., Hoffmann, E., Amigorena, S., Savina, A. Reactive oxygen species production in the phagosome: impact on antigen presentation in dendritic cells. Antioxid Redox Signal. 18 (6), 714-729 (2013).
  14. Grimm, M. J., et al. Monocyte- and macrophage-targeted NADPH oxidase mediates antifungal host defense and regulation of acute inflammation in mice. J Immunol. 190 (8), 4175-4184 (2013).
  15. West, A. P., et al. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472 (7344), 476-480 (2011).
  16. Bloomfield, G., Pears, C. Superoxide signalling required for multicellular development of Dictyostelium. J Cell Sci.. 116 (Pt 16), 3387-3397 (2003).
  17. Ramsey, I. S., Moran, M. M., Chong, J. A., Clapham, D. E. A voltage-gated proton-selective channel lacking the pore domain. Nature. 440 (7088), 1213-1216 (2006).
  18. El Chemaly, A., Demaurex, N. Do Hv1 proton channels regulate the ionic and redox homeostasis of phagosomes? Mol Cell Endocrinol. 353 (1-2), 82-87 (2012).
  19. El Chemaly, A., Nunes, P., Jimaja, W., Castelbou, C., Demaurex, N. Hv1 proton channels differentially regulate the pH of neutrophil and macrophage phagosomes by sustaining the production of phagosomal ROS that inhibit the delivery of vacuolar ATPases. J Leukoc Biol. , (2014).
  20. Decoursey, T. E. Voltage-gated proton channels. Compr Physiol. 2 (2), 1355-1385 (2012).
  21. Ramsey, I. S., Ruchti, E., Kaczmarek, J. S., Clapham, D. E. Hv1 proton channels are required for high-level NADPH oxidase-dependent superoxide production during the phagocyte respiratory burst. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (18), 7642-7647 (2009).
  22. Sturgill-Koszycki, S., et al. Lack of acidification in Mycobacterium phagosomes produced by exclusion of the vesicular proton-ATPase. Science. 263 (5147), 678-681 (1994).
  23. Clemens, D. L., Lee, B. Y., Horwitz, M. A. Virulent and avirulent strains of Francisella tularensis prevent acidification and maturation of their phagosomes and escape into the cytoplasm in human macrophages. Infect Immun. 72 (6), 3204-3217 (2004).
  24. Alpuche-Aranda, C. M., Swanson, J. A., Loomis, W. P., Miller, S. I. Salmonella typhimurium activates virulence gene transcription within acidified macrophage phagosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (21), 10079-10083 (1992).
  25. Lukacs, G. L., Rotstein, O. D., Grinstein, S. Determinants of the phagosomal pH in macrophages. In situ assessment of vacuolar H(+)-ATPase activity, counterion conductance, and H+ 'leak'. J Biol Chem. 266 (36), 24540-24548 (1991).
  26. Watanabe, K., Kagaya, K., Yamada, T., Fukazawa, Y. Mechanism for candidacidal activity in macrophages activated by recombinant gamma interferon. Infect Immun. 59 (2), 521-528 (1991).
  27. Ip, W. K., et al. Phagocytosis and phagosome acidification are required for pathogen processing and MyD88-dependent responses to Staphylococcus aureus. J Immunol. 184 (12), 7071-7081 (2010).
  28. Clarke, M., Maddera, L. Phagocyte meets prey: uptake, internalization, and killing of bacteria by Dictyostelium amoebae. Eur J Cell Biol. 85 (9-10), 1001-1010 (2006).
  29. Jankowski, A., Scott, C. C., Grinstein, S. Determinants of the phagosomal pH in neutrophils. J Biol Chem. 277 (8), 6059-6066 (2002).
  30. Segal, A. W., Geisow, M., Garcia, R., Harper, A., Miller, R. The respiratory burst of phagocytic cells is associated with a rise in vacuolar pH. Nature. 290 (5805), 406-409 (1981).
  31. Savina, A., et al. NOX2 controls phagosomal pH to regulate antigen processing during crosspresentation by dendritic cells. Cell. 126 (1), 205-218 (2006).
  32. Rybicka, J. M., Balce, D. R., Chaudhuri, S., Allan, E. R., Yates, R. M. Phagosomal proteolysis in dendritic cells is modulated by NADPH oxidase in a pH-independent manner. EMBO J. 31 (4), 932-944 (2012).
  33. Mantegazza, A. R., et al. NADPH oxidase controls phagosomal pH and antigen cross-presentation in human dendritic cells. Blood. 112 (12), 4712-4722 (2008).
  34. Balce, D. R., Allan, E. R., McKenna, N., Yates, R. M. gamma-Interferon-inducible lysosomal thiol reductase (GILT) maintains phagosomal proteolysis in alternatively activated macrophages. J Biol Chem. 289 (46), 31891-31904 (2014).
  35. Sanjurjo, L., et al. The scavenger protein apoptosis inhibitor of macrophages (AIM) potentiates the antimicrobial response against Mycobacterium tuberculosis by enhancing autophagy. PLoS One. 8 (11), e79670(2013).
  36. Yuan, Z., Zhi, L., Li-Juan, Z., Hong-Tao, X. The Utility of Chloroquine in Cancer Therapy. Curr Med Res Opin. , 1-12 (2015).
  37. Ohkuma, S., Poole, B. Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents. Proc Natl Acad Sci U S A. 75 (7), 3327-3331 (1978).
  38. El Chemaly, A., et al. VSOP/Hv1 proton channels sustain calcium entry, neutrophil migration, and superoxide production by limiting cell depolarization and acidification. J Exp Med. 207 (1), 129-139 (2010).
  39. Levine, A. P., Duchen, M. R., Segal, A. W. The HVCN1 channel conducts protons into the phagocytic vacuole of neutrophils to produce a physiologically alkaline pH. bioRxiv. , (2014).
  40. Al-Fageeh, M. B., Smales, C. M. Control and regulation of the cellular responses to cold shock: the responses in yeast and mammalian systems. Biochem J. 397 (2), 247-259 (2006).
  41. Yui, N., et al. Basolateral targeting and microtubule-dependent transcytosis of the aquaporin-2 water channel. Am J Physiol Cell Physiol. 304 (1), C38-C48 (2013).
  42. Griffiths, G. On phagosome individuality and membrane signalling networks. Trends Cell Biol. 14 (7), 343-351 (2004).
  43. Poburko, D., Santo-Domingo, J., Demaurex, N. Dynamic regulation of the mitochondrial proton gradient during cytosolic calcium elevations. J Biol Chem. 286 (13), 11672-11684 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Zymosan znakowany FITCfagocytoza neutrofiliobrazowanie ywych kom rekkalibracja pHobrazowanie stosunkowe ratio imagingdojrzewanie fagosom wreaktywne formy tlenu

Powiązane artykuły