Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Test bezkomórkowy do badania dekondensacji chromatyny pod koniec mitozy

10.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53407

⸱

19 grudnia 2015

 ,  ,  , 
1Friedrich Miescher Laboratory, Max Planck Society, 2Nencki Institute of Experimental Biology, Polish Academy of Sciences

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Molekularne mechanizmy dekondensacji wysoce zagęszczonej chromatyny mitotycznej są źle zdefiniowane. Przedstawiamy bezkomórkowy test oparty na mitotycznych klastrach chromatyny wyizolowanych z komórek HeLa i ekstraktu z jaj Xenopus laevis, który wiernie odtwarza proces dekondensacji in vitro.

Streszczenie

Podczas cyklu komórkowego kręgowców chromatyna ulega rozległym zmianom strukturalnym i funkcjonalnym. Po wejściu mitotycznym masowo kondensuje się w chromosomy w kształcie pręcików, które są poruszane indywidualnie przez aparat wrzeciona mitotycznego. Kondensacja chromatyny mitotycznej daje chromosomy zagęszczone pięćdziesięciokrotnie gęstsze niż w interfazie. Podczas wychodzenia z mitozy chromosomy muszą ponownie ustanowić swój funkcjonalny stan interfazy, który jest otoczony otoczką jądrową i jest zdolny do replikacji i transkrypcji. Proces dekondensacji jest morfologicznie dobrze opisany, ale w kategoriach molekularnych słabo poznany: brakuje nam wiedzy na temat leżących u ich podstaw zdarzeń molekularnych i w dużym stopniu zaangażowanych czynników, a także ich regulacji. Opisujemy tutaj system bezkomórkowy, który wiernie odwzorowuje dekondensację chromatyny in vitro, w oparciu o mitotyczne klastry chromatyny oczyszczone ze zsynchronizowanych komórek HeLa i ekstraktu z jaj X. laevis. Nasz bezkomórkowy system stanowi ważne narzędzie do dalszej molekularnej charakterystyki dekondensacji chromatyny i jej koordynacji z procesami zachodzącymi jednocześnie podczas wyjścia mitotycznego, takimi jak otoczka jądrowa i ponowne składanie kompleksu porowego.

Wprowadzenie

Ekstrakt z jaj Xenopus laevis jest potężnym i szeroko stosowanym narzędziem do badania skomplikowanych zdarzeń komórkowych w prostocie testu bezkomórkowego. Od czasu ich pierwszego opisu przez Lohkę i Masui 1 były one szeroko wykorzystywane do badania procesów mitotycznych, takich jak kondensacja chromatyny 2, montaż wrzeciona 3, rozpad otoczki jądrowej 4, ale także transport nukleocytoplazmatyczny 5 lub replikacja DNA6. Zdarzenia zachodzące pod koniec mitozy, niezbędne do reformacji jądra międzyfazowego, takie jak reformacja otoczki jądrowej i ponowne złożenie kompleksu porów jądrowych, są znacznie mniej zrozumiałe w porównaniu z wczesnymi zdarzeniami mitotycznymi, ale mogą być podobnie badane przy użyciu ekstraktu z jaj Xenopus 7. Niedawno opracowaliśmy test oparty na ekstrakcie z jaj Xenopus do badania dekondensacji chromatyny pod koniec mitozy 8, niedostatecznie zbadanego procesu, który czeka na szczegółową charakterystykę.

U metazoanów, chromatyna jest wysoce zagęszczona przy wejściu mitotycznym, aby przeprowadzić wierną segregację materiału genetycznego. Aby zapewnić dostęp chromatyny do ekspresji genów i replikacji DNA podczas interfazy, należy ją zdezagęścić pod koniec mitozy. U kręgowców chromatyna jest do pięćdziesięciu razy bardziej zagęszczona podczas mitozy w porównaniu z interfazą 9, w przeciwieństwie do drożdży, u których zagęszczenie mitotyczne jest zwykle znacznie niższe, np. tylko dwukrotnie u S. cerevisiae 10. Dekondensacja chromatyny kręgowców była najczęściej badana w kontekście reorganizacji DNA plemników po zapłodnieniu komórki jajowej. Mechanizm molekularny, w którym nukleoplazmina, obfite białko oocytów, wymienia specyficzne dla plemników protaminy na histony H2A i H2B przechowywane w komórce jajowej. Proces ten został również wyjaśniony przy użyciu ekstraktu z jaj Xenopus 11,12. Jednak ekspresja nukleoplazminy jest ograniczona do oocytów 13, a chromatyna mitotyczna nie zawiera tych protamin specyficznych dla plemników. Dlatego dekondensacja chromatyny pod koniec mitozy jest niezależna od nukleoplazminy 8.

Do reakcji dekondensacji in vitro używamy ekstraktu generowanego z aktywowanych jaj X.laevis oraz klastrów chromatyny wyizolowanych z synchronizowanych komórek HeLa. Traktowanie jaj jonoforem wapnia naśladuje uwalnianie wapnia do oocytu generowane przez wejście plemników podczas zapłodnienia. Fala wapniowa wyzwala wznowienie cyklu komórkowego, a komórka jajowa, zatrzymana w drugiej metafazie mejozy, przechodzi do pierwszej interfazy 14. Dlatego ekstrakty jajowe przygotowane z aktywowanych jaj reprezentują mitotyczny stan wyjścia / interfazy i są zdolne do wywoływania zdarzeń specyficznych dla wyjścia mitotycznego, takich jak dekondensacja chromatyny, otoczka jądrowa i reformacja kompleksu porów. Do izolacji klastrów chromatyny mitotycznej użyliśmy nieco zmodyfikowanej wersji protokołu opublikowanego przez Gasser & Laemmli 15, w którym klastry chromosomów są uwalniane przez lizę z komórek HeLa zsynchronizowanych w mitozie i izolowanych w zawierających poliaminy przez wirowanie gradientowe.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Izolacja klastra chromatyny mitotycznej z komórek HeLa

1. Przygotowania

  1. Rozwiązania w zakresie hodowli komórkowych
    1. Przygotuj kompletną zmodyfikowaną pożywkę Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco, dodając do DMEM 10% płodowej surowicy cielęcej, 100 jednostek/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 2 mM glutaminy. Przygotować bufor fosforanowy soli fizjologicznej (PBS) zawierający 2,7 mM KCl, 137 mM NaCl, 10 mM Na2HPO42H2O i 2 mM KH2PO4 w wodzie dejonizowanej i dostosować pH do 7,4 za pomocą 10 N NaOH.
      UWAGA: PBS może być przechowywany jako 10x roztwór podstawowy w czasie w temperaturze pokojowej. Rozcieńczyć go wodą dejonizowaną do 1x przed użyciem. Przefiltruj ponownie 1x roztwór, jeśli będzie używany w hodowli komórkowej.
    2. Przygotować 40 mM zapasu roztworu tymidyny (odpowiednia hodowla komórkowa) w pożywce DMEM. Rozpuścić 0,97 g tymidyny w 90 ml pożywki DMEM. Dostosuj końcową objętość do 100 ml. Roztwór podstawowy przechowywać w temperaturze -20 °C. Rozpuścić (UWAGA! pracować pod kapturem chemicznym, nosić rękawice i ochronę ust) nokodazol w roztworze podstawowym o stężeniu 5 mg/ml w DMSO.
  2. Roztwory izolacyjne klastrów mitotycznych
    UWAGA: Wszystkie roztwory opisane w ppkt 1.2 muszą być przechowywane na lodzie po przygotowaniu/rozmrożeniu przez cały czas trwania eksperymentu.
    1. Wodę dejonizowaną w autoklawie należy przechowywać przez 105 minut w temperaturze 121 °C. Rozpuścić tetrachlorowodorek sperminy w autoklawowanej, dejonizowanej wodzie do końcowego stężenia 200 mM (69,6 mg/ml). Przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze -20 °C. Rozpuścić trichlorowodorek spermidyny w autoklawowanej, dejonizowanej wodzie do końcowego stężenia 200 mM (50,8 mg/ml). Przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze -20 °C.
    2. Przygotuj 5 % (w/v) digitoninę (UWAGA! pracować pod kapturem chemicznym, nosić rękawice i ochronę ust) w gorącej, dejonizowanej wodzie. Przefiltrować i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C. Rozpuścić fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF) (UWAGA! pracować pod kapturem chemicznym, nosić rękawice i ochronę ust) do końcowego stężenia 200 mM (35 mg/ml) w 100% etanolu. Przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze -20 °C.
    3. Rozpuścić ditiotreitol (DTT) w wodzie dejonizowanej do końcowego stężenia 1 M (154 mg/ml) (UWAGA! pracować pod kapturem chemicznym, nosić rękawice). Przefiltrować i przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze -20 °C.
    4. Przygotuj 100-krotną mieszaninę inhibitorów proteazy (UWAGA! pracuj pod kapturem chemicznym, noś rękawice), rozpuszczając 10 mg/ml AEBSF (4-(2-aminoetly-)-benzensulfonylofluorku), 0,2 mg/ml leupeptyny, 0,1 mg/ml pepstatyny i 0,2 mg/ml aprotyniny w wodzie dejonizowanej. Przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze -20 °C.
    5. Przygotować 10x roztwór podstawowy buforu A zawierający 150 mM Tris-Cl (pH 7,4), 800 mM KCl, 20 mM EDTA-KOH (pH 7,4), 2 mM tetrachlorowodorek sperminy i 5 mM trichlorowodorek spermidyny. Przechowywać bufor A w temperaturze 4 °C bez tetrachlorowodorku sperminy i trichlorowodorku spermidyny, które należy dodać bezpośrednio przed użyciem.
      UWAGA: EDTA rozpuszcza się tylko przy pH wyższym niż 8, dlatego aby przygotować roztwór podstawowy EDTA-KOH o wysokim stężeniu (zalecane 0,5 M), dodaj 5 N KOH do pH nieco powyżej 8, aby go rozpuścić. Następnie miareczkować do pH 7,4.
    6. Przygotować 20 ml roztworu podstawowego buforu As zawierającego 100 mM Tris-HCl (pH 7,4), 400 mM KCl, 400 mM EDTA-KOH (pH 7,4) i 5 mM trichlorowodorku spermidyny. Bufor As może być przechowywany w takich samych warunkach jak bufor A.
      UWAGA: Roztwory robocze od I do IV (patrz w poniższych krokach), gradient glicerolu i roztwory koloidalnych cząstek krzemionki zawierające cząstki krzemionki (o średnicy 15 do 30 nm) pokryte niedializowalnym poliwinylopirolidonem (PVP) należy przygotować świeżo przed procedurą izolacji (PMSF i digitoninę należy dodać bezpośrednio przed użyciem, ponieważ PMSF jest labilny w roztworach wodnych, a digitonina ma tendencję do wytrącania się podczas długotrwałego przechowywania na lodzie).
    7. Przygotować 100 ml roztworu I, dodając 0,5x bufor A, 1 mM DTT, 1:100 mieszaniny inhibitorów proteazy i 0,1 mM PMSF do autoklawowanej, dejonizowanej wody. Przygotować 50 ml roztworu II (do lizy komórek), dodając 1x bufor A, 1 mM DTT, 1:100 mieszaniny inhibitorów proteazy, 0,1 mM PMSF, 0,1% digitoniny i 10% glicerolu do autoklawowanej, dejonizowanej wody.
    8. Przygotować 200 ml roztworu III zawierającego 0,25x bufor A, 1 mM DTT, 1:100 mieszaniny inhibitorów proteazy, 0,1 mM PMSF i 0,05% digitoniny w autoklawowanej, dejonizowanej wodzie. Przygotować 40 ml roztworu dożylnego zawierającego 1x bufor As, 1 mM DTT, 1:100 mieszaniny inhibitorów proteazy, 0,1 mM PMSF i 0,1% digitoniny w autoklawowanej, dejonizowanej wodzie.
    9. Przygotować 120 ml gradientowego roztworu glicerolu, dodając 25% glicerolu i 0,1% digitoniny do roztworu I.
    10. Przygotować 150 ml roztworu cząstek krzemionki koloidalnej zawierającego 60 % v/v (objętość na objętość) zawiesiny zawierającej cząstki krzemionki (o średnicy 15-30 nm) pokrytej nienadającym się do dializy poliwinylopirolidonem (PVP), 15% glicerolem, 2 mM trichlorowodorku spermidyny i 0,8 mM tetrachlorowodorku sperminy w roztworze IV.
    11. Przygotować bufor do przechowywania klastra zawierający 250 mM sacharozy, 15 mM Hepes (pH 7,4), 0,5 mM trichlorowodorku spermidyny, 0,2 mM tetrachlorowodorku sperminy, 1:100 mieszaniny inhibitorów proteazy, 0,3% BSA i 30% glicerolu. Bufor pamięci masowej klastra może być utrzymywany w temperaturze -20 °C.
    12. Przygotuj roztwór do utrwalania dyni zawierający 10% formaldehydu (UWAGA! pracować pod kapturem chemicznym, nosić rękawice), 50% glicerolu, dwukrotny bufor Zmodyfikowanego Dzwonka Marka (MMR patrz 4.5.) i 0,2 μg/ml DAPI (UWAGA! nosić rękawice). Przechowywać w temperaturze 4 °C w osłoniętych przed światłem probówkach reakcyjnych. Użycie tego przepisu na squash nie jest kluczowe dla eksperymentu, alternatywne przepisy również będą działać.

2. Synchronizacja komórek

  1. W dniu 1: Wysiewać komórki HeLa w pięciu kolbach o średnicy 75cm2 (250 ml) z pożywką i inkubować w temperaturze 37 °C w 5% CO2,
    UWAGA: Da to około 18 x 106 komórek w dniu izolacji klastra chromatyny.
  2. W dniu 2: Gdy komórki są co najmniej w 50% zlewające się (mniej więcej połowa powierzchni jest pokryta komórkami i nadal jest miejsce na wzrost komórek), dodaj tymidynę do końcowego stężenia 2 mM (blok tymidynowy) i hoduj komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w 5% CO2,
    UWAGA: Spowoduje to zatrzymanie komórek na granicy fazy G1/S.
  3. W dniu 3: Odessać pożywkę zawierającą tymidynę i dodać sterylny PBS. Umyj komórki przez delikatne płukanie sterylnym PBS. Odessać PBS i delikatnie dodać 15-20 ml świeżej, ciepłej, kompletnej pożywki DMEM i komórek hodowlanych przez 3 do 4 godzin w temperaturze 37 °C w 5% CO2 , aby uwolnić je z bloku fazy G1/S.
  4. W dniu 3 (kontynuacja): Po uwolnieniu komórek z bloku fazy G1/S, dodać nokodazol do końcowego stężenia 100 ng/ml. Rozcieńczyć nokodazol przez dodanie 2 μl roztworu podstawowego (5 mg/ml) do 98 μl świeżej pożywki DMEM i dodać 1 μl rozcieńczonego nokodazolu na każdy ml hodowli komórkowej. Hodować komórki przez około 12 godzin w temperaturze 37 °C w 5% CO2 . Spowoduje to zablokowanie komórek w mitozie.

3. Izolacja klastrów mitotycznych

  1. W dniu 4: Wyizoluj klastry mitotyczne. Za pomocą mikroskopii jasnego pola sprawdź, czy większość komórek jest mitotyczna. Jeśli mniej niż 50% komórek jest mitotycznych poczekaj, aż więcej komórek osiągnie mitozę. Zebrać komórki mitotyczne, energicznie stukając w bok kolby (lub delikatnie spryskując pipetą), spowoduje to odłączenie pozostałych komórek mitotycznych. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml.
    UWAGA: Komórki mitotyczne stają się okrągłe i można je łatwo odłączyć od dna kolby (tak jak komórki po trypsynizacji), w przeciwieństwie do komórek w innych etapach cyklu komórkowego, które są płaskie i mocno przymocowane do kolby.
  2. Zebrać komórki mitotyczne, obracając probówki w temperaturze 1 500 x g przez 10 minut (4 °C lub RT), a następnie usuwając supernatant. Zawiesić osad komórkowy w 8 ml PBS, zebrać w jednej stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml, całkowicie napełnić probówkę PBS i ponownie wirować przez 10 minut przy 1 500 x g. Powtórz tę procedurę prania w sumie trzy razy.
  3. Od teraz wykonuj wszystkie kroki na lodzie z zimnymi roztworami. Energicznie zawiesić osad w 37 ml zimnego roztworu II. Przenieść zawiesinę do zimnego homogenizatora szklano-szklanego o pojemności 40 ml za pomocą pipety o pojemności 25 ml i poddać lizie komórki na lodzie, zanurzając je ciasnym tłuczkiem, aż klastry mitotyczne będą wolne od materiału cytoplazmatycznego. Liczba uderzeń jest w dużym stopniu zależna od zapasu digitoniny i może wahać się od 3 do 20 razy.
    UWAGA: Homogenizacja może być dość energiczna, ale powinna być uważana za zakończoną, gdy prawie wszystkie komórki mitotyczne są poddawane lizie, a klastry są wolne od materiału cytoplazmatycznego (patrz 3.4).
  4. Po kilku pociągnięciach zmieszać 5-10 μl zawiesiny komórek w stosunku 1:2 z błękitem trypanowym i sprawdzić pod mikroskopem w komorze Neubauera. Gdy komórki są poddawane lizie, chromatyna jest barwiona na niebiesko i wolna od błon komórkowych (UWAGA: możliwe pozostałości cytoplazmatyczne będą gromadzić się wokół chromatyny zabarwionej na niebiesko i będą łatwe do odróżnienia).
    UWAGA: Komórki mitotyczne ulegają lizie przed komórkami międzyfazowymi, ale mimo to należy uważać, aby nie przesadzić z homogenizacją, aby uniknąć zanieczyszczenia jądrami międzyfazowymi i zniekształconą chromatyną.
  5. Natychmiast ułóż lizat całego ogniwa na gradientach zimnego kroku (z 5 ml 60% roztworu 60% koloidalnych cząstek krzemionki na dnie, z których każdy pokryty jest 19,5 ml roztworu gradientu glicerolu) w pięciu probówkach wirówek z poliwęglanu (28,8 x 107,0 mm, zaleca się umieszczenie probówek na lodzie w celu ich schłodzenia) za pomocą pipety o pojemności 10 ml. Nie należy przechowywać komórek w roztworze II przez długi czas, dlatego zaleca się wcześniejsze przygotowanie probówek i gradientu (np. podczas etapów mycia).
  6. Wirować gradienty przez 30 minut przy 1 000 x g w temperaturze 4 °C w wirniku o stałym kącie nachylenia.
    UWAGA: Jądra, niezlizowane komórki i klastry są odzyskiwane razem na granicy warstw glicerolu i koloidalnych cząstek krzemionki.
  7. Usunąć ciecz powyżej interfazy za pomocą pipety, a resztę przenieść do zimnego homogenizatora. Ponownie homogenizuj mieszaninę przez 3-15 pociągnięć (ponownie w zależności od zapasu digitoniny) za pomocą ciasnego tłuczka, aby wyeliminować agregaty i usunąć włókna cytoszkieletu z klastrów. Po każdych kilku pociągnięciach sprawdź skuteczność homogenizacji. Zmieszać 1 μl próbki z 1 μl squasha fix uzupełnionego DAPI i zbadać pod mikroskopem fluorescencyjnym.
    UWAGA: Kluczowa jest liczba uderzeń, obecność agregatów klastrowych oznacza, że liczba uderzeń jest niewystarczająca, natomiast zniekształcone szczątki chromatyny i jąder wskazują, że homogenizacja była zbyt silna.
  8. Rozprowadzić roztwór w czterech nowych probówkach wirówkowych z poliwęglanu (28,8 x 107,0 mm) (ok. 10 ml roztworu na probówkę) i całkowicie napełnić je 60 % roztworem cząstek krzemionki koloidalnej (ok. 30 ml roztworu cząstek krzemionki koloidalnej na probówkę).
    UWAGA: Unikaj przeciążania gradientu cząstek krzemionki koloidalnej, ponieważ klastry mogą być łatwo uwięzione, jeśli w gradiencie jest zbyt dużo zanieczyszczeń cytoplazmatycznych.
  9. Wirować przez 5 minut przy 3 000 x g, a następnie 30 minut przy 45 440 x g w temperaturze 4 °C w wirniku o stałym kącie nachylenia.
    UWAGA: Tak jak poprzednio, jądra międzyfazowe będą chronione przed wejściem w gradient (jeśli homogenizacja nie została wykonana zbyt mocno, co uwalnia jądra z odłamków cytoplazmatycznych), ale klastry będą gromadzić się około 1,5 cm od dna probówki, często w postaci luźnej kulki.
  10. Usunąć płyn znajdujący się nad klastrami za pomocą pipety, resztę zebrać w jednej probówce, dobrze zawiesić i rozprowadzić do dwóch probówek wirówek z poliwęglanu (28,8 x 107,0 mm). Rozcieńczyć zawiesinę klastra w stosunku 1:4 roztworem III w każdej probówce i dobrze wymieszać. Zaznacz miejsce, w którym będzie znajdował się granulek i wiruj 1,000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C w wirniku o stałym kącie.
  11. Zawiesić osady w roztworze III, zebrać w jednej stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml i napełnić roztworem III. Wirować przy zaledwie 300 x g przez około 10 minut. Nie należy wirować z większą prędkością - może to spowodować nieodwracalną agregację klastrów.
  12. Przemyć ponownie roztworem III w 1,5 lub 2 ml probówkach reakcyjnych (zawiesić granulki i całkowicie napełnić probówki) i odwirować przy sile 300 g. Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety. Ostrożnie zawieś granulat w buforze do przechowywania klastrów o pojemności 250 μl (jeśli masz kilka granulek, użyj 250 μl na wszystkie razem i połącz je). Rozcieńczyć 5-10 μl próbki w stosunku 1:2 błękitem trypanowym i policzyć w komorze Neubauera. W razie potrzeby rozcieńczyć więcej, aby uzyskać przybliżone stężenie 500 klastrów/μl.
  13. Przepchnij zawiesinę przez sitko do komórek o średnicy 100 μm, aby upewnić się, że usunąłeś agregacje klastrów wynikające z niewłaściwego ponownego zawieszenia. Klastry mogą być przechowywane przez wiele miesięcy w temperaturze -80 °C. Aby uniknąć wielokrotnego ponownego zamrażania, należy wykonać odpowiednie porcje i błyskawiczne zamrażanie w ciekłym azocie.

4. Przygotowanie buforu do międzyfazowego ekstraktu z jaj Xenopus laevis

UWAGA: Żaby Xenopus laevis są utrzymywane i traktowane zgodnie z wytycznymi i przepisami określonymi przez Konwencję Rady Europy o ochronie zwierząt kręgowych wykorzystywanych do celów doświadczalnych i innych (ratyfikowana przez UE w 1998 roku) oraz niemiecką ustawę dotyczącą wykorzystywania kręgowców w badaniach.

  1. Przygotować naziemną telewizję cyfrową i 100-krotną mieszaninę inhibitorów proteazy zgodnie z ppkt 1.2.3 i 1.2.4. Rozpuścić cytochalazynę B do końcowego stężenia 10 mg/ml w DMSO, podwielokrotność (zalecane 10 lub 20 μl) i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  2. Rozpuścić cykloheksymid do końcowego stężenia 20 mg/ml w etanolu, podwielokrotności (zalecane 500 μl) i przechowywać w temperaturze -20 °C. Rozpuścić jonofor wapnia A23187 do końcowego stężenia 2 mg/ml w podwielokrotności alkoholu etylowego i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: PI, DTT, cytochalazyna B, cykloheksymid i A23187 mogą być wielokrotnie zamrażane i rozmrażane.
  3. Przygotować 20x zmodyfikowany bufor Ringera Marka (MMR) zawierający 2 M NaCl, 40 mM KCl, 20 mM MgCl2, 40 mM CaCl2, 2 mM EDTA i 100 mM Hepes, dostosować pH do 8,0 za pomocą 5 N KOH.
    UWAGA: 20x MMR może być przechowywany przez długi czas w RT. W zależności od ilości jaj, na jedno przygotowanie międzyfazowego ekstraktu jaj konieczne jest 1 L 1x MMR na wstrzykniętą żabę i dodatkowe 5-10 litrów na etapy mycia. Ponownie dostosuj pH 1x MMR do 8,0 za pomocą 5 N KOH. 1x MMR przygotowany do trzymania żab w O/N x 1 powinien być w RT. 1x MMR przygotowany do przygotowania ekstraktu powinien być przechowywany w niskiej temperaturze do momentu użycia, jednak nie jest kluczowe dla eksperymentu, że 1x MMR jest naprawdę zimny.
  4. Przygotować 1 l buforu sacharozy zawierającego 250 mM sacharozy, 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl2 i 10 mM Hepes pH 7,5. Bufor sacharozy powinien być przygotowany dzień przed użyciem sterylnej wody i powinien być przechowywany w temperaturze 4 °C.
  5. Przygotować roztwór dejellingu na świeżo rano w dniu eksperymentu, rozpuszczając 2% L-cysteiny w 0,25x MMR. Dostosuj pH do 7,8 za pomocą 5 N KOH. Przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.

5. Protokół dla Międzyfazowego Ekstraktu z Jaj Xenopus laevis

  1. Wstrzyknąć 120 I.E. gonadotropiny surowicy ciężarnej klaczy (PMSG) do grzbietowego worka limfatycznego każdej żaby 3-10 dni przed eksperymentem (strzykawki 5 ml, igły 27 G 3/4'').
    UWAGA: To wstrzyknięcie wywoła owulację. Ilość jaj składanych przez jedną żabę jest bardzo zróżnicowana. Żaba dobrze znosząca może wyprodukować jaja o objętości do 7 ml po odżalinowaniu, co odpowiada do 3,5 ml surowego ekstraktu. Należy jednak wziąć pod uwagę, że niektóre żaby mogą nie składać lub będą składać złe jaja.
  2. Wstrzyknąć 500 tj. ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (hCG) na żabę wieczorem przed eksperymentem (strzykawki 5 ml, igły 27G 3/4''). Spowoduje to uwolnienie jaj. Przechowywać żaby przez 13-17 godzin w temperaturze 18 °C w oddzielnych zbiornikach zawierających 1,2 l 1x MMR (pH 8).
  3. Zbierz jaja, wsypując je do szklanych zlewek o pojemności 600-1 000 ml.
    UWAGA: Weź tylko dobre partie jaj, które są składane pojedynczo, podobnej wielkości i wyraźnie zabarwione ciemną i jasną połową. Nie bierz jajek, które tworzą sznurki lub wyglądają na puszyste i białe. Powinny one być sortowane przez cały czas trwania procedury za pomocą plastikowej pipety Pasteura. Szczegółowy opis dobrych i złych jaj można znaleźć w Gillespie i wsp. 6
  4. Umyć jaja intensywnie, około 4 razy, 1x MMR, dekantując supernatant, gdy jaja się usiądą, a następnie ponownie napełniając zlewkę świeżym buforem.
    UWAGA: Jaja są stabilne przed ich deżelinacją, a bufor do płukania można nakładać bezpośrednio na jaja.
  5. Dejellynate jaja przez inkubację w 2% roztworze cysteiny. Wymienić bufor raz po 2-4 minutach, dekantując bufor i ostrożnie napełniając zlewkę świeżym buforem. Uważa się, że jest to zakończone, gdy objętość jaj drastycznie się zmniejsza, a jaja stają się gęściej upakowane.
    UWAGA: Dejellying trwa około 5-7 minut i należy go przerwać, gdy jest widoczny, ale najpóźniej po 10 minutach.
  6. Umyć jaja około 4 razy za pomocą 1x MMR, dekantując i uzupełniając bufor supernatant.
    UWAGA: Jaja są bardziej kruche po dejellynacji, dlatego etapy mycia muszą być wykonywane ostrożniej. Szczepionkę MMR należy raczej wypłukać na ściance zlewki, a nie bezpośrednio na jaja.
  7. Aktywuj jaja w 100 ml 1x MMR, dodając 8 μl jonoforu wapnia (2 mg/ml w etanolu). Zatrzymaj aktywację, gdy skurcz czapki zwierzęcia stanie się widoczny lub po 10 min.
    UWAGA: Skurcz kapelusza zwierzęcego można rozpoznać po zagęszczeniu czarnej połowy jaja.
  8. Przemyć dokładnie 4 razy 1x MMR, dekantując i uzupełniając supernatant buforowy.
  9. Wysiaduj jaja przez 20 minut w 1x MMR przy RT.
  10. Przygotować probówki wirówkowe w czasie inkubacji: Umieścić 50 μl buforu sacharozy, 50 μl 100-krotnej mieszanki inhibitorów proteazy, 5 μl 1 M DTT, 12,5 μl cykloheksymidu (w celu zapobieżenia translacji, zwłaszcza cykliny B) i 2,5 μl cytochalazyny B (w celu zapobieżenia polimeryzacji aktyny) w probówkach wirówkowych o pojemności 5 ml (13 x 51 mm). Alternatywnie w przypadku jaj o objętości większej niż 30 ml można użyć probówek o pojemności 14 ml (14 x 95 mm), w tym przypadku zwiększając objętość 2,4 razy.
  11. Jaja umyć dwukrotnie zimnym buforem sacharozy (zdekantować i uzupełnić bufor w szklanej zlewce) i przenieść je do probówek wirówkowych za pomocą plastikowej pipety Pasteura z szerokim otworem (odciąć wąski koniec).
  12. Jaja należy pakować przez obracanie przez 1 minutę w formacie 130 x g. W tym celu umieścić probówki w stożkowych probówkach wirówkowych o pojemności 15 ml (odpowiednio 14 ml probówek w stożkowych probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml). Celem jest usunięcie jak największej ilości buforu, aby zapobiec rozcieńczeniu ekstraktu. Po odwirowaniu usuń nadmiar buforu za pomocą plastikowej pipety Pasteura i ostatecznie napełnij więcej jaj na wierzchu.
  13. Wirować w rotorze obrotowym o pojemności 6 x 5 ml przez 20 minut w temperaturze 21 000 x g w temperaturze 4 °C.
  14. Usuń ekstrakt o niskiej prędkości za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml z igłą 16 G 1 1/2'', między żółtym żółtkiem na górze a ciemnymi rozbitymi resztkami jaj na dole. W tym celu należy przepchnąć igłę strzykawki przez ściankę probówki wirówkowej tuż nad warstwą rozbitych resztek jaj na dnie. Trzymaj rurkę pod oporem podczas pchania igłą.
    UWAGA: Napełniona 5 ml probówka wirówkowa daje od 1,8 do 2,5 ml ekstraktu.
  15. Na 1 ml ekstraktu dodać 10 μl 100-krotnej mieszaniny inhibitorów proteazy, 1 μl 1 M DTT, 2,5 μl cykloheksymidu (20 mg/ml) i 0,5 μl cytochalazyny B (10 mg/ml). Trzymaj ekstrakt na lodzie.
    UWAGA: Ekstrakt może być użyty bezpośrednio do eksperymentu lub podzielony, zamrożony i przechowywany w ciekłym azocie przez kilka miesięcy. Zamrożenie ekstraktu zmniejszy jego aktywność. W przypadku delikatnych eksperymentów, takich jak utrata odporności, zdecydowanie zaleca się natychmiastowe użycie świeżego ekstraktu.

6. Przygotowanie do rekonstytucji in vitro dekondensacji chromatyny

  1. Przygotować roztwór podstawowy mieszanki energetycznej zawierający 25 mM ATP, 25 mM GTP, 127,5 mg/ml fosforanu kreatyny i 2,5 mg/ml kinazy kreatynowej w buforze zawierającym 250 mM sacharozy, 1,2 mM Hepes, 5,9 mM KCl i 0,3 mM MgCl2. Porcję i przechowywać w temperaturze -80 °C. Stosować świeżo po rozmrożeniu, nie zamrażać ponownie.
  2. Rozpuścić 0,2 g/ml glikogenu w wodzie dejonizowanej. Przechowywać w temperaturze -20 °C. Rozpuścić 6-dimetyloaminopurynę (DMAP) do końcowego stężenia 0,25 M w DMSO. Porcję i przechowywać w temperaturze -20 °C. Stosować świeżo po rozmrożeniu, nie zamrażać ponownie.
  3. Przygotować 30 % (w/v) sacharozy w PBS, przefiltrować i przechowywać w temperaturze 4 °C. Przygotować 4 % roztwór VikiFix zawierający 80 mM RURY pH 6,8, 1 mM MgCl2, 150 mM sacharozy i 4 % paraformaldehydu (PFA) (UWAGA! pracować pod kapturem chemicznym, nosić rękawice i ochronę ust).
    UWAGA: PFA jest trudny do rozpuszczenia, dlatego zaleca się robienie tego w następujący sposób: Na 1 l Viki-Fix rozpuść 24,2 g PIPES i 40 g PFA w oddzielnych zlewkach, oba w gorącej (prawie wrzącej) wodzie dejonizowanej. Oba rozpuszczą się przez dodanie 10 N NaOH, ale należy uważać, aby nie dodać zbyt dużo. Dodać 51,4 g sacharozy i 1 ml 1 M MgCl2 do roztworu PFA. Dodaj roztwór PIPES do drugiej mieszanki. Napełnij do 1 l końcowej objętości i dostosuj pH do neutralnego, dodając NaOH.
  4. Rozpuścić 10 mg/ml 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI) w wodzie (UWAGA! nosić rękawice). Przechowywać w ciemności w temperaturze -20 °C.

7. Protokół odtworzenia dekondensacji chromatyny in vitro

  1. Wirować ekstrakt międzyfazowy z małą prędkością przez 12 minut w temperaturze 386 000 x g pod stałym kątem 20 x 0,2 ml lub przy 355 000 x g w rotorze o wymiarach 10 x 2,0 ml.
  2. Delikatnie usunąć warstwę lipidową na wierzchu za pomocą pompy próżniowej lub pipety i pobrać supernatant (zwany dalej ekstraktem o dużej prędkości), unikając zanieczyszczenia membrany z dolnej warstwy i wyrzucić granulkę.
    UWAGA: W celu zmniejszenia możliwego zanieczyszczenia błony zaleca się dwukrotne odwirowanie ekstraktu lub rozcieńczenie ekstraktu w 20 % objętości buforem sacharozy przed odwirowaniem. Jednak rozcieńczanie i dodatkowe etapy wirowania mogą zmniejszyć aktywność ekstraktu.
  3. Odpipetować 18 μl ekstraktu o dużej prędkości do probówki reakcyjnej o pojemności 1,5 ml, dodać 0,7 μl klastra mitotycznego (ilość może się nieznacznie różnić w zależności od stężenia wyjściowego chromatyny), 0,5 μl glikogenu, 0,5 μl mieszanki energetycznej i 0,3 μl DMAP. Użyj końcówek z szerokim otworem, aby wymieszać reakcję zaraz po dodaniu chromatyny, aby zapobiec ścinaniu dekondensującej chromatyny.
    UWAGA: Reakcję można przeprowadzić w obecności lub bez błon (patrz rysunek 3). Aby zdekondensować chromatynę w obecności błon, dodaj 2 μl pływających membran przygotowanych zgodnie z protokołem opisanym przez Eisenhardta i wsp. 16
  4. Mieszaninę reakcyjną inkubować przez maksymalnie 2 godziny (lub krócej w celu zbadania wcześniejszych punktów czasowych procesu dekondensacji) w temperaturze 20 °C.
  5. Utrwalić próbkę, dodając lodowato zimny 0,5 ml Viki-Fix zawierający 0,5% aldehydu glutarowego i 0,1 mg/ml DAPI i inkubować przez 20-30 minut na lodzie.
    UWAGA: Jeśli próbki będą dalej przetwarzane pod kątem immunofluorescencji, utrwalanie powinno odbywać się bez aldehydu glutarowego, ponieważ często zakłóca to barwienie przeciwciał. Jeśli jednak analizowane będzie tylko barwienie DAPI, dodanie aldehydu glutarowego pozwoli zachować ładniejszą strukturę chromatyny.
  6. Inkubować okrągłe szkiełka nakrywkowe (średnica 12 mm) przez 5 minut w roztworze poli-L-lizyny, aby zwiększyć powinowactwo szkiełek nakrywkowych do chromatyny. Następnie wysuszyć szkiełka nakrywkowe na bibule filtracyjnej.
  7. Złożyć probówki wirówkowe z płaskim dnem (6 ml, 16/55 mm), umieszczając szkiełka nakrywkowe z pokrytym miejscem na górze na dnie probówki wirówkowej. Dodać 800 μl 30 % poduszki sacharozy i utrwaloć utrwaloną próbkę na wierzchu.
  8. Wirować przez 15 minut w temperaturze 2 500 x g w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Probówki wirówkowe z płaskim dnem pasują do wirników, które przyjmują stożkowe probówki wirówkowe o pojemności 15 ml.
  9. Zdekantować supernatant, a następnie usunąć szkiełka nakrywkowe z probówek, ostrożnie nakłuwając dno probówki wirówkowej igłą strzykawkową 16 G 1 1/2''. W tym celu należy skleić wieczko igły i samą igłę taśmą na ich dole i odciąć przedni koniec wieczka tak, aby igła wystawała na około 3 mm na zewnątrz. Gdy szkiełko nakrywkowe zostanie podniesione przez igłę w jednym miejscu, użyj pęsety, aby usunąć szkiełko nakrywkowe.
  10. Szybko umyj szkiełko nakrywkowe, zanurzając je w wodzie dejonizowanej, delikatnie wysusz, dotykając jego boku bibuły filtracyjnej i umieść je na szkiełku mikroskopowym na kropli materiału montażowego. Uszczelnij go lakierem do paznokci, wysusz i przechowuj w ciemności.
    UWAGA: Próbki utrwalone bez aldehydu glutarowego mogą być przechowywane w PBS na płytce 24-dołkowej i dalej wykorzystywane do barwienia immunofluorescencyjnego. W przypadku przechowywania przez kilka dni należy dodać 0,05% azydku sodu (UWAGA! nosić rękawiczki) do PBS, aby uniknąć zanieczyszczenia bakteriami.
  11. Próbki należy przeanalizować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej sygnału DAPI (przy użyciu np. mikroskopu konfokalnego z laserem o długości fali 405 nm).

8. Przygotowanie buforu do barwienia immunofluorescencyjnego próbek dekondensacji chromatyny odtworzonych in vitro

  1. Przygotować PBS zgodnie z ppkt 1.1.1. Rozpuścić NH4Cl do końcowego stężenia 50 mM w PBS. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C. Rozpuścić 5 μg/ml DAPI w PBS (przygotować na świeżo). Dodać 0,1 % Triton X-100 do PBS. Przechowywać w temperaturze 4 °C. Przed użyciem przygotować świeżo bufor blokujący, rozcieńczając 3 % albuminę surowicy bydlęcej (BSA) w PBS + 0,1 % Triton X-100.

9. Protokół barwienia immunofluorescencyjnego próbek dekondensacji chromatyny odtworzonych in vitro

UWAGA: Wszystkie następne inkubacje szkiełek nakrywkowych są wykonywane na 24-dołkowej płytce z co najmniej 250 μl roztworu na studzienkę, jeśli nie zaznaczono inaczej. Próbki chromatyny zdekondensowanej in vitro są bardziej wrażliwe niż komórki stałe, dlatego należy zachować ostrożność podczas dodawania lub usuwania roztworów. Zaleca się stosowanie plastikowych pipet Pasteura o nacięciu kątowym. W przypadku etapów mycia i wtórnej inkubacji przeciwciał należy umieścić płytkę w temperaturze pokojowej na platformie kołyszącej się lub obrotowej, poruszając się nie szybciej niż 100 obr./min.

  1. Próbki należy schłodzić przez inkubację szkiełek nakrywkowych z 1 ml NH4Cl w PBS przez 5 minut. Próbki blokować przez inkubację z 1 ml buforu blokującego przez co najmniej 30 minut.
  2. Zmontuj komorę wilgotnościową do inkubacji z pierwotnym przeciwciałem: Umieść mokrą chusteczkę na dnie zamykanego pudełka, a pokrywkę 24-dołkowej płytki do góry nogami na mokrej chusteczce. Umieścić parafilm w pokrywce i dodać 70 μl roztworu przeciwciała na próbkę na parafilmie. W przypadku roztworu przeciwciała rozcieńczyć surowicę lub przeciwciała oczyszczone z powinowactwa w stosunku 1:100 w buforze blokującym.
  3. Umieścić szkiełka nakrywkowe do góry nogami na roztworze przeciwciała i inkubować je przez 1 do 2 godzin. Umieścić szkiełka nakrywkowe z powrotem na płytce 24-dołkowej stroną z próbką skierowaną do góry i przemyć próbki trzykrotnie przez 10 minut 1 ml 0,1 % Triton X-100 w PBS.
  4. Szkiełka nakrywkowe inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w 250 μl wtórnego przeciwciała znakowanego fluorescencyjnie rozcieńczonego w buforze blokującym do stężenia zalecanego przez producenta. Chronić przed światłem. Umyć trzy razy przez 10 minut 1 ml 0,1 % Triton X-100 w PBS.
  5. Inkubować próbki przez 10 minut z 1 ml 5 μg/ml DAPI w PBS. Płukać trzy razy przez 5 minut 1 ml 0,1 % Triton X-100 w PBS.
  6. Szybko umyj szkiełko nakrywkowe, zanurzając je w wodzie dejonizowanej, delikatnie wysusz, dotykając bokiem bibuły filtracyjnej i umieść je na szkiełku mikroskopowym na kropli podłoża montażowego. Uszczelnij lakierem do paznokci, wysusz i przechowuj w temperaturze 4 °C w ciemności do momentu użycia. Analizować próbki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zależność reakcji dekondensacji od czasu

Rysunek 1 przedstawia typowy przebieg czasowy testu dekondensacji. Zagregowane chromosomy widoczne na początku reakcji ulegają dekondensacji i zlewają się w jedno, okrągłe i gładkie jądro komórkowe. W przypadku zastąpienia ekstraktu z jajecznych buforem sacharozowym klaster chromosomów pozostaje skondensowany, co sugeruje, że w ekstrakcie z jajecznym obecna jest aktywność odpowiedzialna za dekondensację.

Deko...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ekstrakty z jaj Xenopus laevis są bardzo przydatnym narzędziem do wiernego odtworzenia procesów komórkowych in vitro, a system ten został z powodzeniem wykorzystany w charakterystyce cyklu komórkowego i zdarzeń podziału komórki 2,3,5,6,17. Ze względu na duże zapasy składników jądrowych sekwestrowanych w jaju podczas oogenezy, ekstrakty z jaj są doskonałym źródłem składników komórkowych. W porównaniu z innymi podejściami, takimi jak RNAi na liniach komórkowych tkanek ssaków lub mani...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Niemiecką Fundację Badawczą i ERC (AN377/3-2 i 309528 CHROMDECON do W.A.) oraz stypendium doktoranckie Boehringer Ingelheim Fonds dla A.K.S. Rysunek 1 i 2 są przedrukowane z Developmental Cell 31(3), Magalska et al., ATPazy podobne do RuvB funkcjonują w dekondensacji chromatyny na końcu mitozy, 305-318, 2014, za uprzejmą zgodą Elsevier.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Tetrachlorowodorek sperminyFluka analityczny85610-25G
trichlorowodorek spermidynySigma S2501-5G
digitonina o wysokiej czystościMillipore300410-1GMtoksyczny
PMSFApplichemA0999,0100toksyczna
tymidynaCalbiochem6060
nokodazolCalbiochem487928toksyczny
37% roztwór formaldehyduRoth7398-1toksyczny
roztwór błękitu trypanowego (0,4% )SigmaT8154toksyczny
1,4-ditiotreitol (DTT)Roth6908.2
Chlorowodorek AEBSFApplichemA1421,0001
pepstatynaRoth2936.1/2/3
leupeptynaRoth CN334
aprotyninaRothA162.3
Percoll (koloidalne cząstki krzemionki roztwór)GE Healthcare17-0891-01
glutaminaGibco25030-024
Penicylina-StreptomycynaGibco15140-122
75 cm² kolby do hodowli tkankowychGreiner Bio-one658175
inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca (FBS)Gibco10500-064
Homogenizator (40 ml maszynka do mielenia tkanek)Wheaton357546
Komora NeubaueraAssistent441/1
  Probówki wirówkowe Oak Ridge, poliwęglan (50 ml)Nalgene3118-0050
100 µ m sitko komórkowe, nylonBD Falcon352360
cytochalazyna BApplichemA7657,0010toksyczny
cykloheksymidRoth8682.3toksyczna
L-cysteinaMerck1 028 381 000
hCG dostępny jako OvogestMSD1431593
PMSG dostępny jako IntergonanMSD1431015
A23187 (mieszanina soli wapniowo-magnezowej)EnzoALX-450-002-M010toksyczne
igły do strzykawek (1,20 x 40 mm, 18 G x 1 1/2")Braun4665120
ATPServa10920.03
GTP, 2 Na x 3 H20RothK056.1/2/3/4
sól disodowa fosforanu kreatynyCalbiochem2380
Fosfokinaza kreatynowaSigmaC3755-35KU
DMAPSigmaD2629-1G
DAPI Roche10236276001
ToksycznePFA SigmaP-6148
do TLA 100 (7 x 10 mm, 5/16 x 13/16 cala)Beckman Coulter343775
"Cell-Saver" (końcówki z szerokim otworem, 1,000 µ l)Biozym729065
50% roztwór aldehydu glutarowego, stopień ISigma alderichG7651-10 mltoksyczny
0,1% (w/v) roztwór poli-L-lizynySigmaP8920-100 ml
probówki płaskodenne (6 ml, 16,0/55 mm)Greiner Bio-one145211
Vectashield podłoże montażoweVector laboratoriesH1000
rurki do TLA120 (11 x 34 mm, 7/16 x 1 3/8 cala)Beckman Coulter343778
"Cell-Saver" (końcówki z szerokim otworem, 200 &mikro; SzkiełkaBiozym729055
12 mmThermo Scientific0784 #1
probówki wirowe nakrywkowe

Bibliografia

  1. Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220, 719-721 (1983).
  2. de la Barre, A. E., Robert-Nicoud, M., Dimitrov, S. Assembly of mitotic chromosomes in Xenopus egg extract. Methods Mol Biol. 119, 219-229 (1999).
  3. Maresca, T. J., Heald, R. Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).
  4. Galy, V., et al. A role for gp210 in mitotic nuclear-envelope breakdown. J Cell Sci. 121, 317-328 (2008).
  5. Chan, R. C., Forbes, D. I. In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).
  6. Gillespie, P. J., Gambus, A., Blow, J. J. Preparation and use of Xenopus egg extracts to study DNA replication and chromatin associated proteins. Methods. 57, 203-213 (2012).
  7. Gant, T. M., Wilson, K. L. Nuclear assembly. Annu Rev Cell Dev Biol. 13, 669-695 (1997).
  8. Magalska, A., et al. RuvB-like ATPases function in chromatin decondensation at the end of mitosis. Developmental Cell. 31, 305-318 (2014).
  9. Belmont, A. S. Mitotic chromosome structure and condensation. Curr Opin Cell Biol. 18, 632-638 (2006).
  10. Lavoie, B. D., Tuffo, K. M., Oh, S., Koshland, D., Holm, C. Mitotic chromosome condensation requires Brn1p, the yeast homologue of Barren. Mol Biol Cell. 11, 1293-1304 (2000).
  11. Philpott, A., Leno, G. H. Nucleoplasmin remodels sperm chromatin in Xenopus egg extracts. Cell. 69, 759-767 (1992).
  12. Philpott, A., Leno, G. H., Laskey, R. A. Sperm decondensation in Xenopus egg cytoplasm is mediated by nucleoplasmin. Cell. 65, 569-578 (1991).
  13. Burglin, T. R., Mattaj, I. W., Newmeyer, D. D., Zeller, R., De Robertis, E. M. Cloning of nucleoplasmin from Xenopus laevis oocytes and analysis of its developmental expression. Genes Dev. 1, 97-107 (1987).
  14. Whitaker, M. Calcium at fertilization and in early development. Physiological reviews. 86, 25-88 (2006).
  15. Gasser, S. M., Laemmli, U. K. Improved methods for the isolation of individual and clustered mitotic chromosomes. Exp Cell Res. 173, 85-98 (1987).
  16. Eisenhardt, N., Schooley, A., Antonin, W. Xenopus in vitro assays to analyze the function of transmembrane nucleoporins and targeting of inner nuclear membrane proteins. Methods Cell Biol. 122, 193-218 (2014).
  17. Wignall, S. M., Deehan, R., Maresca, T. J., Heald, R. The condensin complex is required for proper spindle assembly and chromosome segregation in Xenopus egg extracts. J Cell Biol. 161, 1041-1051 (2003).
  18. Forbes, D. J., Kirschner, M. W., Newport, J. W. Spontaneous formation of nucleus-like structures around bacteriophage DNA microinjected into Xenopus eggs. Cell. 34, 13-23 (1983).
  19. Hartl, P., Olson, E., Dang, T., Forbes, D. J. Nuclear assembly with lambda DNA in fractionated Xenopus egg extracts: an unexpected role for glycogen in formation of a higher order chromatin intermediate. J Cell Biol. 124, 235-248 (1994).
  20. Sandaltzopoulos, R., Blank, T., Becker, P. B. Transcriptional repression by nucleosomes but not H1 in reconstituted preblastoderm Drosophila chromatin. EMBO J. 13, 373-379 (1994).
  21. Ulbert, S., Platani, M., Boue, S., Mattaj, I. W. Direct membrane protein-DNA interactions required early in nuclear envelope assembly. J Cell Biol. 173, 469-476 (2006).
  22. Zhang, C., Clarke, P. R. Chromatin-independent nuclear envelope assembly induced by Ran GTPase in Xenopus egg extracts. Science. 288, 1429-1432 (2000).
  23. Paulson, J. R. Isolation of chromosome clusters from metaphase-arrested HeLa cells. Chromosoma. 85, 571-581 (1982).
  24. Ramadan, K., et al. Cdc48/p97 promotes reformation of the nucleus by extracting the kinase Aurora B from chromatin. Nature. 450, 1258-1262 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

wyjście z mitozyekstrakt z jaj Xenopusklastry chromatyny mitotycznejkomórki HeLaponowna organizacja otoczki jądrowejekstrakt wysokoprędkościowywirowanie na poduszce sacharozowejfiksacja paraformaldehydem
Test bezkomórkowy do badania dekondensacji chromatyny pod koniec mitozy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.