Ta metoda ocenia inwazję komórek rakowych ze sferoid na otaczającą matrycę 3D. Sferoidy są generowane metodą hodowli wiszącej kropli, a następnie osadzane w matrycy składającej się z materiałów błonowych i kolagenu typu I. Inwazja sferoid jest następnie monitorowana.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Test sferoidalny komórek rakowych do oceny inwazji w warunkach 3D
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Uważa się, że inwazyjny charakter linii komórek rakowych koreluje z ich potencjałem przerzutowym. Większość tradycyjnych testów nie bada jednak tych inwazyjnych cech w środowisku trójwymiarowym, a uzyskane dane cierpią z powodu ograniczonej przydatności biologicznej. W tym artykule przedstawiono podejście do wizualizacji zdolności inwazyjnych linii komórkowych w fizjologicznie istotnych warunkach. Test inwazji sferoidów komórek rakowych najpierw wykorzystuje grawitację do generowania sferoid w kroplach pożywki, które zwisają z pokrywy naczynia do hodowli komórek. Następnie sferoidy te są osadzane w matrycy 3D składającej się z mieszaniny materiałów błony podstawnej i kolagenu typu I. Egresja komórek rakowych ze sferoid do otaczającej macierzy jest następnie monitorowana w czasie. Opisana tutaj metoda może być zmodyfikowana w celu zbadania inwazji po kokulturze różnych typów komórek, włączenia leków/inhibitorów lub zmian w składnikach macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM).
Wprowadzenie
Ustalono, że ruchliwość komórek rakowych jest predyktorem potencjału przerzutowego, biorąc pod uwagę, że takie zachowanie ułatwia inwazję przez błonę podstawną i wejście do układu krążenia1. Większość badań nad ruchliwością koncentrowała się na tym, jak komórki zachowują się w dwuwymiarowym (2D) otoczeniu, chociaż powszechnie uznaje się, że ruch komórek w trójwymiarowej (3D) matrycy jest bardziej reprezentatywny dla tego, jak te same komórki będą się zachowywać in vivo2. Systemy hodowli 3D są coraz częściej wykorzystywane do badania zachowań komórkowych, które obejmują morfologię komórek, kinetykę wzrostu i wrażliwość na leki3. Chęć monitorowania inwazji komórek nowotworowych w kontekście środowiska 3D doprowadziła do syntezy wcześniej ustalonych technik obejmujących generowanie agregatów komórek 3D (sferoid) za pomocą metody hodowli wiszącejkropli 4, a następnie osadzanie tych sferoid w trójwymiarowej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) składającej się z kolagenu i materiałów błony podstawnej5. Metoda ta ma na celu ulepszenie tych wcześniej ustalonych technik poprzez zapewnienie uproszczonego podejścia, które można łatwo wykorzystać do porównania inwazji w różnych warunkach eksperymentalnych.
Bardziej tradycyjnymi sposobami oceny ruchliwości komórek in vitro są test ran drapanych i test transwell6. Pierwszy test przedstawia ruchliwość komórek w warunkach 2D, a zatem jest niezależny od różnych cech krytycznych dla inwazji in vivo, np. aktywności proteazy7. Test transwell może lepiej modelować inwazję komórek, gdy wkładki studzienek są pokryte substratami ECM, ale mierzony jest tylko jeden parametr, tj. wygląd komórek na przeciwnej powierzchni błony, a zatem wiele niuansów inwazji komórek nie jest łatwo obserwowalnych. W przeciwieństwie do tych technik, test inwazji sferoidów komórek nowotworowych (ryc. 1) pozwala na monitorowanie inwazji komórek w czasie rzeczywistym w otoczeniu, które jest nie tylko fizjologicznie istotne, ale także pozwala na wizualizację ważnych cech specyficznych dla linii komórkowej, takich jak indywidualna i zbiorowa migracja komórek8. Metoda ta zapewnia również przewagę nad standardowymi testami wzrostu kultur 3D. Generowanie agregatów komórkowych za pomocą metody wiszącej kropli początkowo ogranicza ruch komórek, tak aby komórki były zachęcane do inwazji po zniesieniu tego ograniczenia. Co więcej, po zniesieniu tego ograniczenia wyjście komórki będzie przebiegać w jednolitym kierunku, który można następnie wygodnie określić ilościowo.
Najbardziej popularnymi materiałami ECM używanymi do testów sferoidów komórek rakowych są Matrigel i kolagen typu I, gdzie każdy z tych składników odgrywa ważną i odrębną rolę w wpływaniu na zachowanie przerzutowe. Matrigel jest wydzielaną mieszaniną białek wytwarzanych przez komórki mięsaka myszy Engelbreth-Holm Swarm i jest wzbogacony w białka błony podstawnej, takie jak laminina, entaktyna i kolagen typu IV9. Z tego powodu Matrigel jest odtąd określany jako "materiały membranowe podstawne". Te materiały błony podstawnej dostarczają niezbędnych ligandów potrzebnych do adhezji integryn podczas inwazji komórek rakowych10, a także wielu innych białek, które wywierają szereg skutków na zachowanie komórki11. Dla porównania, kolagen typu I, powszechnie wytwarzany z kwaśnych trawień ścięgien i innych gęstych struktur kolagenowych12, jest znacznie prostszym materiałem macierzy, który służy jako główny element strukturalny tkanki łącznej i zrębu tkanek podporowych i narządów ciała. Wykazano, że fizyczne cechy kolagenu mogą regulować szereg cech ruchliwości komórek; Na przykład ułożenie włókien kolagenowych na granicy guz-zręb pozwala komórkom rakowym na późniejszą migrację wzdłuż tych włókien podczas inwazji na zrąb13. W przedstawionym tutaj teście zarówno kolagen typu I, jak i materiały błony podstawnej są wykorzystywane jako narzędzia do badania interakcji 3D komórek rakowych - zrębu.
Efekt hamowania lub stymulacji szlaków kontrolujących inwazję może być monitorowany po umieszczeniu komórek w matrycy 3D. Komórki mogą być poddawane wstępnej obróbce podczas wzrostu w wiszących kroplach lub po przeniesieniu do hodowli 3D, w zależności od tego, czy do modulacji inwazji będzie wymagane długotrwałe leczenie. W przypadku krótszych zabiegów zaleca się, aby po pobraniu leku wymieszać z zawiesiną sferoidalną, a także z pożywką, która będzie otaczać hodowle 3D, aby ułatwić odpowiednią ekspozycję leku na komórki. Następnie normalne lub związane z nowotworem komórki zrębu można mieszać z materiałem macierzy, aby ocenić ich rolę w modulowaniu inwazji komórek nowotworowych lub określić, w jaki sposób sygnalizacja parakrynna i autokrynna wpływa na zachowanie komórki. Pomysł ten został pokazany w badaniu, w którym kokultura raka jelita grubego i komórek śródbłonka w wiszących kroplach doprowadziła do powstania sieci naczyniowej w sferoidach14. Wreszcie, składniki ECM mogą być również zmienione, ponieważ na inwazję komórek rakowych wpływają różne substraty15. Przedstawiona poniżej metoda zapewni zatem ramy do oceny inwazji komórek nowotworowych w różnych warunkach. Ogólnie rzecz biorąc, stwierdzono, że nie wszystkie linie komórkowe tworzą sferoidy w wiszących kroplach, a linie komórkowe wyglądające jak nabłonek zazwyczaj tworzą regularne kule.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Generacja sferoid
- Przygotuj zawiesinę jednokomórkową do zawieszania kultur kroplowych, odłączając przylegające hodowle komórek rakowych o konfluencji ~ 70% za pomocą płukania PBS, a następnie wystawiając na działanie 0,05% roztworu trypsyny-EDTA.
- Zneutralizować roztwór trypsyny za pomocą pożywki do hodowli komórkowych i policzyć komórki, używając podwielokrotności zawiesiny komórkowej. Uwaga: Konkretne podłoże do hodowli komórkowych będzie zależeć od testowanej linii komórkowej. Postępuj zgodnie z zaleceniami pożywek ATCC, w których pożywka do hodowli komórkowych to zwykle DMEM + 10% FBS. Więcej informacji można znaleźć w Tabeli Materiałów.
- Wykonać rozcieńczenie, aby umożliwić wysiew 500-1000 komórek na 20 μl kropli pożywki do hodowli komórkowych.
- Zaopatrz się w 10-centymetrowe naczynie i dodaj na dno 5 ml sterylnego PBS. Uwaga: Ten krok chroni wiszące krople przed parowaniem. Tańsze szalki "klasy bakteriologicznej" mogą być używane zamiast szalek klasy hodowli komórkowej, ponieważ komórki nie będą stykać się z powierzchnią hodowli.
- Za pomocą pipety wielokanałowej przenieść 20 μl kropelek rozcieńczonej zawiesiny komórek na wewnętrzną powierzchnię pokrywki.
- Odpipetować 40 kropli (5 rzędów po 8 kropli) na pokrywkę naczynia o średnicy 10 cm.
- Odwróć pokrywkę i umieść na naczyniu hodowlanym. Inkubować wiszące kultury kroplowe w temperaturze 37 °C przez 72 godziny w celu wytworzenia sferoid.
- Odwróć pokrywę w pewny, ale kontrolowany sposób. Uwaga: Zbyt szybkie lub zbyt wolne odwracanie pokrywy może spowodować przesuwanie się kropel. Niektóre linie komórkowe mogą tworzyć sferoidy w ciągu 48 godzin lub krócej, podczas gdy inne mogą wymagać więcej niż 72 godzin do wytworzenia zwartych agregatów.
2. Osadzanie sferoid w matrycy 3D
- Rozmrozić podwielokrotność materiałów membranowych podstawy o obniżonym współczynniku wzrostu w temperaturze 4 °C przez noc przed osadzeniem sferoid.
- Opcjonalnie: Z wyprzedzeniem należy wykonać warstwy z ECM, aby zapobiec potencjalnej interakcji sferoidowej z powierzchnią kultury tkankowej.
- Odpipetować 200 μl ECM na studzienkę na płytkę 24-dołkową.
- Przechylić płytkę, aby upewnić się, że ECM pokrywa całą powierzchnię studzienki.
- Ostrożnie usunąć nadmiar ECM za pomocą pipety.
- Inkubować płytkę do momentu wyschnięcia studzienek: 3 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
- Opcjonalnie: Z wyprzedzeniem należy wykonać warstwy z ECM, aby zapobiec potencjalnej interakcji sferoidowej z powierzchnią kultury tkankowej.
- Zebrać sferoidy, przechylając pokrywę naczynia do hodowli tkankowych i zbierając pożywkę. Przenieś pożywkę ze sferoidami do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
- Odczekaj 10 minut, aż sferoidy osiądą na dnie probówki do mikrowirówki. Sferoidy powinny być widoczne gołym okiem.
- Wymieszać 100 μl materiałów membrany podstawnej ze 100 μl zimnego (4 °C) kolagenu typu I w oddzielnej, wstępnie schłodzonej probówce. Utrzymywać mieszaninę w temperaturze 4 °C, aby zapobiec przedwczesnemu zestaleniu się któregokolwiek z żeli.
- Do przenoszenia małych objętości należy używać wstępnie schłodzonych końcówek do pipet.
- Zachowaj ostrożność podczas mieszania materiałów błony podstawnej i kolagenu typu I, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza. Uwaga: Pęcherzyki powietrza mogą utrudniać obrazowanie w dalszej części protokołu, jeśli zostaną osadzone w żelu.
- Odessać sferoidy z dolnej części probówki mikrowirówki o pojemności 40 μl i połączyć z materiałami błony podstawnej/mieszaniną kolagenu typu I. Uważaj, aby podczas mieszania nie tworzyły się pęcherzyki powietrza. Uwaga: Roztwór zawierający 100 μl materiałów błony podstawnej, 100 μl kolagenu typu I i 40 μl sferoidów stworzy wystarczającą ilość materiału dla 4 niezależnych kultur 3D. Można to skalować w górę lub w dół.
- Odpipetować 40 μl kropli lepkiej mieszaniny do środków studzienek na 24-dołkowej płytce. Utrzymuj talerz poziomo, aby mieszanina nie spływała na bok studni. Uwaga: Pojedyncza kolumna na płytce 24-dołkowej – 4 dołki – jest zalecana dla każdego testowanego stanu.
- Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C i pozostawić w spokoju na 30 minut. W tym okresie kultura 3D ulegnie polimeryzacji.
- Powoli zanurz kultury 3D w 1 ml pożywki do hodowli komórkowych.
- Upewnij się, że podłoże jest ciepłe podczas dodawania go do studzienek, aby jeszcze bardziej promować polimeryzację żelu.
- KROK KRYTYCZNY: Delikatnie dodaj pożywkę do kultur 3D. Zbyt szybkie pipetowanie pożywki do studzienek może prowadzić do oderwania kultur 3D od powierzchni hodowli tkankowej.
3. Monitorowanie i analizowanie inwazji sferoidów
- Inwazja obrazu ze sferoid do otaczającej matrycy 3D w punktach czasowych określonych przez badacza. Rób zdjęcia za pomocą odwróconego mikroskopu z obiektywem 20x. Uwaga: Idealne punkty czasowe będą się różnić w zależności od testowanej linii komórkowej. Bardziej inwazyjne linie komórkowe zaczną wychodzić ze sferoid wkrótce po posiewaniu, a zatem wykonają pierwsze zdjęcia w ciągu kilku godzin po posiewaniu. Generalnie zdjęcia są wykonywane po 0 godzinach (po poszyciu), 24 godzinach i 48 godzinach. Inwazja zwykle kończy się od 24 do 48 godzin po poszyciu.
- Określ ilościowo zdolność inwazyjną za pomocą oprogramowania do analizy obrazu, takiego jak Image J.
- Analizuj inwazję jako odległość komórki od krawędzi sferoidy.
- Użyj narzędzia Rysowanie proste, aby zaznaczyć promień i/lub maksymalną odległość inwazyjną.
- Kliknij "Analizuj" w górnym menu, a następnie kliknij "Zmierz", aby wyświetlić pomiar długości.
- Analizuj inwazję jako całkowity obszar inwazyjny poza sferoidą.
- Użyj narzędzia do rysowania odręcznego, aby obrysować granicę sferoidy i/lub całkowity obszar inwazyjny.
- Kliknij "Analizuj" w górnym menu, a następnie kliknij "Zmierz", aby wyświetlić pomiar obszaru.
- Użyj wtyczki, takiej jak ROI Manager Tools, aby utworzyć pomiary dla stosu obrazów.
- Analizuj inwazję jako odległość komórki od krawędzi sferoidy.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wykorzystując test inwazji sferoidów (Rycina 1), panel linii komórkowych raka przebadano pod kątem zdolności do tworzenia sferoidów, a także stopnia emigracji komórek po implantacji w macierz 3D składającą się z materiałów błony podstawnej i kolagenu typu I (Tabela 1). Wyniki te pokazują, że nie każda linia komórkowa raka tworzy dobrze uformowane sferoidy, przy czym linie komórkowe o morfologii nabłonkowej in vitro miały tendencję do tworzenia regularnych i gładkich agregatów. Z...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W badaniu tym oceniano wydajność panelu linii komórek nowotworowych w teście inwazji sferoidalnej (Tabela 1). Ogólnie rzecz biorąc, stwierdzamy, że tworzenie sferoidów jest wzmocnione w bardziej nabłonkowych liniach komórkowych, gdzie obecność połączeń komórka-komórka sprzyja tworzeniu się architektury podobnej do sferoidy. Znane linie komórkowe, które przeszły przejście nabłonkowo-mezenchymalne, takie jak komórki MDA-MB-231, nie tworzą sferoid w hodowli wiszącej kropli, najprawdopodobniej z powodu zmnie...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Wspierane przez NIH przyznaje P30 CA051008 i T32 CA009686 (ATR).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | CB-40234 | |
| Kolagen typu I, ogon szczura, 100 mg | miliporów | 08-115 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
| RPMI 1640 Średni | Life Technologies | 11875-093 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| 0,05% trypsyna-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Płodowa surowica bydlęca, inaktywowana termicznie | Omega Scientific | FB-12 | |
| 100 mm naczynia poddane działaniu TC | Corning Incorporated | 430167 | |
| 24-dołkowe talerze z powłoką TC | NEST Biotechnlology | 702001 | |
| Olympus IX-71 Inverted Microscope | |||
| Linie komórkowe utrzymywano w DMEM + 10% FBS, z oczekiwaniem komórek BT-474 i LNCaP, które były utrzymywane w RPMI + 10% FBS. |
Bibliografia
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Metastasis: Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev. Cancer. 2 (8), (2002).
- Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. J Cell Sci. 116 (12), 2377-2388 (2003).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), (2007).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J Vis Exp. 51, (2011).
- Del Duca,, Werbowetski, D., T,, Del Maestro,, F, R. Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion. J Neuro-Oncol. 67 (3), (2004).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. J Vis Exp. 88, (2014).
- Ramos-DeSimone, N., Hahn-Dantona, E., Sipley, J., Nagase, H., French, D. L., Quigley, J. P. Activation of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) via a converging plasmin/stromelysin-1 cascade enhances tumor cell invasion. J Bio Chem. 274 (19), Forthcoming.
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Rev. Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: Basement membrane matrix with biological activity. Semin Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).
- Shaw, L. M., Chao, C., Wewer, U. M., Mercurio, A. M. Function of the integrin α6β1 in metastatic breast carcinoma cells assessed by expression of a dominant-negative receptor. Cancer Res. 56 (5), 959-963 (1996).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), (2010).
- Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat Protoc. 1 (6), (2006).
- Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Campbell, J. M. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4 (1), (2006).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods Mol Med. 140, 141-151 (2007).
- Brenner, W., Groß, S., Steinbach, F., Horn, S., Hohenfellner, R., Thüroff, J. W. Differential inhibition of renal cancer cell invasion mediated by fibronectin, collagen IV and laminin. Cancer Lett. 155, 199-205 (2000).
- Nieman, M. T., Prudoff, R. S., Johnson, K. R., Wheelock, M. J. N-cadherin promotes motility in human breast cancer cells regardless of their E-cadherin expression. J Cell Biol. 147 (3), Forthcoming.
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), (2013).
- Sodek, K. L., Brown, T. J., Ringuette, M. J. Collagen I but not Matrigel matrices provide an MMP-dependent barrier to ovarian cancer cell penetration. BMC Cancer. 8 (1), 223-2210 (2008).
- Nguyen-Ngoc, K. V., Ewald, A. J. Mammary ductal elongation and myoepithelial migration are regulated by the composition of the extracellular matrix. J Microsc. 251 (3), 212-223 (2013).
- Glinskii, A. B., Smith, B. A., Jiang, P., Li, X., Yang, M., Hoffman, R. M., Glinsky, G. V. Viable circulating metastatic cells produced in orthotopic but not ectopic prostate cancer models. Cancer Res. 63 (14), 4239-4243 (2003).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
