Ta metoda ocenia inwazję komórek rakowych ze sferoid na otaczającą matrycę 3D. Sferoidy są generowane metodą hodowli wiszącej kropli, a następnie osadzane w matrycy składającej się z materiałów błonowych i kolagenu typu I. Inwazja sferoid jest następnie monitorowana.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Test sferoidalny komórek rakowych do oceny inwazji w warunkach 3D
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Uważa się, że inwazyjny charakter linii komórek rakowych koreluje z ich potencjałem przerzutowym. Większość tradycyjnych testów nie bada jednak tych inwazyjnych cech w środowisku trójwymiarowym, a uzyskane dane cierpią z powodu ograniczonej przydatności biologicznej. W tym artykule przedstawiono podejście do wizualizacji zdolności inwazyjnych linii komórkowych w fizjologicznie istotnych warunkach. Test inwazji sferoidów komórek rakowych najpierw wykorzystuje grawitację do generowania sferoid w kroplach pożywki, które zwisają z pokrywy naczynia do hodowli komórek. Następnie sferoidy te są osadzane w matrycy 3D składającej się z mieszaniny materiałów błony podstawnej i kolagenu typu I. Egresja komórek rakowych ze sferoid do otaczającej macierzy jest następnie monitorowana w czasie. Opisana tutaj metoda może być zmodyfikowana w celu zbadania inwazji po kokulturze różnych typów komórek, włączenia leków/inhibitorów lub zmian w składnikach macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM).
Wprowadzenie
Ustalono, że ruchliwość komórek rakowych jest predyktorem potencjału przerzutowego, biorąc pod uwagę, że takie zachowanie ułatwia inwazję przez błonę podstawną i wejście do układu krążenia1. Większość badań nad ruchliwością koncentrowała się na tym, jak komórki zachowują się w dwuwymiarowym (2D) otoczeniu, chociaż powszechnie uznaje się, że ruch komórek w trójwymiarowej (3D) matrycy jest bardziej reprezentatywny dla tego, jak te same komórki będą się zachowywać in vivo2. Systemy hodowli 3D są coraz częściej wykorzystywane do badania zachowań komórkowych, które obejmują morfologię komórek, kinetykę wzrostu i wrażliwość na leki3....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Generacja sferoid
- Przygotuj zawiesinę jednokomórkową do zawieszania kultur kroplowych, odłączając przylegające hodowle komórek rakowych o konfluencji ~ 70% za pomocą płukania PBS, a następnie wystawiając na działanie 0,05% roztworu trypsyny-EDTA.
- Zneutralizować roztwór trypsyny za pomocą pożywki do hodowli komórkowych i policzyć komórki, używając podwielokrotności zawiesiny komórkowej. Uwaga: Konkretne podłoże do hodowli komórkowych będzie zależeć od testowanej linii komórkowej. Postępuj zgodnie z zaleceniami pożywek ATCC, w których pożywka do hodowli komórkowych to zwykle DMEM + 10% FBS. Więcej informacji można znaleźć w Tabeli Materiałów.<....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wykorzystując test inwazji sferoidów (Rycina 1), panel linii komórkowych raka przebadano pod kątem zdolności do tworzenia sferoidów, a także stopnia emigracji komórek po implantacji w macierz 3D składającą się z materiałów błony podstawnej i kolagenu typu I (Tabela 1). Wyniki te pokazują, że nie każda linia komórkowa raka tworzy dobrze uformowane sferoidy, przy czym linie komórkowe o morfologii nabłonkowej in vitro miały tendencję do tworzenia regularnych i gładkich agregatów. Z.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W badaniu tym oceniano wydajność panelu linii komórek nowotworowych w teście inwazji sferoidalnej (Tabela 1). Ogólnie rzecz biorąc, stwierdzamy, że tworzenie sferoidów jest wzmocnione w bardziej nabłonkowych liniach komórkowych, gdzie obecność połączeń komórka-komórka sprzyja tworzeniu się architektury podobnej do sferoidy. Znane linie komórkowe, które przeszły przejście nabłonkowo-mezenchymalne, takie jak komórki MDA-MB-231, nie tworzą sferoid w hodowli wiszącej kropli, najprawdopodobniej z powodu zmnie.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Wspierane przez NIH przyznaje P30 CA051008 i T32 CA009686 (ATR).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | CB-40234 | |
| Kolagen typu I, ogon szczura, 100 mg | miliporów | 08-115 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
| RPMI 1640 Średni | Life Technologies | 11875-093 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| 0,05% trypsyna-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Płodowa surowica bydlęca, inaktywowana termicznie | Omega Scientific | FB-12 | |
| 100 mm naczynia poddane działaniu TC | Corning Incorporated | 430167 | |
| 24-dołkowe talerze z powłoką TC | NEST Biotechnlology | 702001 | |
| Olympus IX-71 Inverted Microscope | |||
| Linie komórkowe utrzymywano w DMEM + 10% FBS, z oczekiwaniem komórek BT-474 i LNCaP, które były utrzymywane w RPMI + 10% FBS. |
Bibliografia
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Metastasis: Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev. Cancer. 2 (8), (2002).
- Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
