Sekwencyjna ekstrakcja rozpuszczalnej i nierozpuszczalnej alfa-synukleiny z mózgów parkinsonowskich

Summary

Tutaj prezentujemy protokół izolacji coraz bardziej nierozpuszczalnej/zagregowanej alfa-synukleiny (α-syn) z pośmiertnej ludzkiej tkanki mózgowej. Dzięki zastosowaniu o zwiększonej mocy detergentu i technikom ultrawirowania z dużą prędkością, można badać zmienne właściwości agregacji α-syn w tkankach chorych i niechorych.

Abstract

Białko alfa-synukleiny (α-syn) występuje obficie głównie w neuronach i występuje w wielu różnych formach - monomerów, tetramerów, oligomerów i włókienek. Podczas choroby α-syn ulega zmianom konformacyjnym, tworząc oligomery i agregaty o dużej masie cząsteczkowej, które mają tendencję do uczynienia białka bardziej nierozpuszczalnym. Nieprawidłowo zagregowane α-syn jest neuropatologiczną cechą choroby Parkinsona (PD), otępienia z ciałami Lewy'ego (DLB) i zaniku wieloukładowego (MSA). Charakterystyka biochemiczna i analiza nierozpuszczalnych α-syn przy użyciu o rosnącej mocy detergentu i szybkiego ultrawirowania stanowi potężne narzędzie do określenia rozwoju patologii α-syn związanej z postępem choroby. Protokół ten opisuje izolację coraz bardziej nierozpuszczalnych/zagregowanych α-syn z pośmiertnej ludzkiej tkanki mózgowej. Metodologia ta może być dostosowana z modyfikacjami do badań normalnej i nieprawidłowej biologii α-syn w transgenicznych modelach zwierzęcych zawierających różne mutacje α-syn, a także w innych chorobach neurodegeneracyjnych, które charakteryzują się nieprawidłowymi złogami fibrylarnymi białek związanych z ich odpowiednimi patologiami.

Introduction

Jedną z kluczowych cech patologicznych wspólnych dla wielu chorób neurodegeneracyjnych jest tworzenie nieprawidłowych agregatów białkowych, które występują w sposób specyficzny dla białka/choroby¹. Tak więc w chorobie Alzheimera (AD) występują charakterystyczne pozaneuronalne blaszki beta-amyloidowe i zagregowane hiperfosforylowane złogi tau w neuronach; zagregowane złogi α-syn w ciałach Lewy'ego (LB), które są inkluzjami wewnątrzneuronalnymi, a także w dystroficznymi procesach neuronalnych zwanych neurytami Lewy'ego (LN) w PD, otępieniu PD i otępieniu z ciałami Lewy'ego (DLB)^2-4. Nieprawidłowe złogi α-syn obserwuje się również w charakterystycznych zmianach glejowych wtrąceń cytoplazmatycznych w MSA⁵. W chorobie Huntingtona występują charakterystyczne złogi Poly-Q, a nieprawidłowe białko wiążące DNA smoło-43 i połączone białka mięsaka (FUS) odkładają się w otępieniach czołowo-skroniowych. Co ważne dla choroby Parkinsona, stwierdzono, że mutacje genu α-syn powodują autosomalną dominującą chorobę PD^6-11. Dodatkowo, tryplikacja genu α-syn¹² i duplikacja¹³ również powoduje rodzinną chorobę Parkinsona, łącząc w ten sposób zwiększoną ekspresję α-syn z patomechanizmami PD. Warto zauważyć, że zarówno sporadyczne, jak i rodzinne przypadki PD zawierają nieprawidłowe depozyty patologii α-syn¹⁴. Obecnie dostępne metody leczenia choroby Parkinsona są wyłącznie paliatywne i nie mają wpływu na zatrzymanie lub opóźnienie nieubłaganego postępu choroby.

α-syn występuje obficie w ludzkim mózgu i stanowi około 1% całego białka mózgowego. Jest obecny bardziej szczegółowo w neuronach, ale może istnieć, choć w mniejszych ilościach w komórkach glejowych. Kwestią sporną jest natywna struktura α-syn, która może istnieć jako losowy monomer¹⁵ lub jako złożony tetramer¹⁶. Podczas choroby α-syn zmienia swoją konformację, co pozwala na jego nieprawidłowe fałdowanie, a proces ten uważa się za przyczynę patogenezy choroby. Pomimo kilku lat badań nad patofizjologicznymi aspektami α-syn i choroby, dokładne przyczyny mechanizmów chorobowych pozostają nieuchwytne14.

Badania wykorzystujące analizę pośmiertną mózgów Parkinsona dostarczyły do tej pory ważnych wskazówek dotyczących normalnej i nieprawidłowej biologii α-syn zarówno w sporadycznych PD, jak i PD związanych z mutacjami w genie LRRK2^17-22. W tym miejscu opisano protokół ekstrakcji biochemicznej (patrz schemat przedstawiony na rysunku 1) dla coraz bardziej nierozpuszczalnych złogów α-syn z ludzkiej pośmiertnej tkanki mózgowej PD, które w różnym stopniu zawierają agregaty α-syn. Technika ta może być również zaadaptowana z modyfikacjami w składzie do badania białek zbiorczych z innych chorób neurodegeneracyjnych^23,24, a także z transgenicznej tkanki mózgowej zwierząt^25-27. Głównym czynnikiem branym pod uwagę przy adaptacjach są różnice w rozpuszczalności i całkowitych ilościach odpowiednich białek, z których niektóre są głównie jądrowe i mogą wymagać o wysokiej zawartości soli w celu optymalnej ekstrakcji, jak pokazano dla FUS²⁸.

Protocol

Pośmiertna tkanka mózgowa została przekazana do Queen Square Brain Bank for neurological disorders, University College London, Institute of Neurology przy użyciu etycznie zatwierdzonych protokołów i przechowywana do celów badawczych na podstawie licencji wydanej przez Human Tissue Authority (HTA) UK (nr 12198). Patrz wykaz przypadków stosowanych w tym protokole (Tabela 1).

1. Przygotowanie

1. Przygotuj 1X TBS (buforowany solą fizjologiczną) bufor:
   1. Przygotuj 10X TBS jako roztwór podstawowy z 500 mM Tris-HCl pH 7,4 i 1,500 mM NaCl.
      1. Odważyć 60,5 g Tris-Cl o pH 7,6 i 87,6 g NaCl w 800 ml wody o wysokiej czystości. Dostosować pH za pomocą 1 M HCl i zwiększyć ostateczną objętość zapasu do 1 l.
   2. Przygotuj końcowe stężenie 1X TBS, rozcieńczając bulion 10 razy w wodzie destylowanej.
   3. Dodać inhibitory proteazy (PI) (1 tabletka na 50 ml buforu) i tabletki inhibitora fosfatazy Phos-stop (1 tabletka na 10 ml buforu) w celu zniesienia skutków nieswoistego działania enzymatycznego proteaz i fosfataz.
      Uwaga: Tutaj użyliśmy tabletek z inhibitorami enzymów firmy Roche, ale równie dobrze inne dostępne na rynku inhibitory można stosować zgodnie z instrukcjami producenta.
2. Przygotować bufor TBS-SDS, dodając 5% w/v dodecylosiarczanu sodu (SDS) do 1X TBS (pH 7,4) buforu. Podgrzać roztwór do temperatury 60 °C, ciągle mieszając, za pomocą mieszadła magnetycznego w celu rozpuszczenia SDS.
3. Przygotować bufor TBS-SDS-Mocznik, dodając mocznik do końcowego stężenia 8 M w/v do 1x buforu TBS-SDS (pH 7,4). Podgrzać roztwór do temperatury 60 °C, ciągle mieszając na mieszadle magnetycznym w celu rozpuszczenia mocznika.

2. Homogenizacja próbki i ultrawirowanie różnicowe

Uwaga: Poniższa część pracy obejmuje postępowanie z ludzką tkanką mózgową zgodnie z zasadami HTA UK. Przez cały czas przestrzegane są lokalne standardowe procedury operacyjne. Próbki mózgu są wycinane z zamrożonych bloków mózgowych i materiału tkankowego homogenizowanego w mikrokomorze utrzymywanej pod podciśnieniem. Przez cały czas trwania zabiegu noszone są jednorazowe fartuchy, rękawiczki, maski na twarz, ochraniacze na obuwie i okulary ochronne. Odpady tkanek ludzkich są usuwane po sterylizacji w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 minut w celu bezpiecznego usunięcia. Ostre narzędzia (ostrza skalpela) są umieszczane w odpowiednim pojemniku na ostre przedmioty w celu ich przechowywania i bezpiecznej utylizacji.

1. Weź kawałek zamrożonej tkanki ludzkiej (około 0,5 g wagi z okolicy zwojów podstawy) i szybko zmiel na małe fragmenty (około 1 mm²) na lodzie za pomocą małej szalki Petriego i sterylnego ostrza skalpela. Do każdej próbki należy użyć oddzielnej szalki Petriego i ostrza skalpela. Zebrać zmieloną tkankę do probówki o pojemności 15 ml i dodać do niej 10 objętości lodowatego buforu 1XTBS.
2. Homogenizować próbki za pomocą homogenizatora mechanicznego z prędkością 20 000 obr./min przez 10 sekund. Schłodzić na lodzie przez 2 minuty. Powtórzyć ten krok trzy razy.
   Uwaga: Odbywa się to w taki sposób, aby próbki nie były podgrzewane podczas homogenizacji.
3. Klarować przez odwirowanie w stężeniu 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Wyrzucić osad z materiału niehomogenizowanego.
4. Weź supernatant (surowy homogenat), dodaj do probówek wirówek z poliwęglanu (rozmiar probówki zależy od wielkości wirnika) i ostrożnie zbalansuj. Wirować przy 100 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
5. Zachować supernatant, ponieważ jest to frakcja rozpuszczalna w TBS.
6. Przemyć osad dwukrotnie w pięciu objętościach buforu 1X TBS i odwirować za każdym razem w stężeniu 100 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatanty.
   1. Ponownie zawiesić końcowy granul poprzez sonikację pastylki przez 10 sekund przy 20 KHz w około 5 woluminach 1X TBS-SDS przy RT.
      Uwaga: Przed dodaniem karty charakterystyki zawierającej bufor próbki należy doprowadzić do temperatury 10 °C, aby uniknąć wytrącania się SDS.
   2. Ultrawirować przy 100 000 x g przez 30 minut w temperaturze 25 °C.
7. Zachować supernatant, ponieważ jest to frakcja rozpuszczalna SDS.
   1. Przemyć osad dwukrotnie w 5 objętościach buforu 1X TBS-SDS w temperaturze pokojowej. Odwirować za każdym razem przy 100 000 x g przez 15 minut w temperaturze 25 °C.
   2. Rozpuścić końcową osadkę w 50 μl buforu 1X TBS-SDS-UREA za pomocą sonikatora ustawionego na 20 KHz przez 10 sekund, aby uzyskać pełną rozpuszczalność; nazywa się to frakcją rozpuszczalną w moczniku.
8. Oznacz każdą frakcję pod kątem całkowitej zawartości białka przy użyciu komercyjnego zestawu do oznaczania białek zgodnie z protokołem producenta. Rozcieńczyć próbki TBS-SDS-Mocznik w stosunku 1:1 buforem 1X TBS, aby zapewnić kompatybilność z odczynnikami do oznaczania białek. Zamrażać próbki w małych porcjach (20 μl) w temperaturze -80 °C w celu skrócenia cykli zamrażania i rozmrażania.
   Uwaga: Dodanie 10% glicerolu do próbek jest zalecane w przypadku długotrwałego przechowywania w temperaturze -80 °C.

3. Immunoblotting próbek i analiza wyników

1. Próbki z ekstraktów TBS, TBS-SDS i TBS-SDS-Urea należy umieścić na 10-dołkowym żelu poliakrylamidowym Bis-Tris o stężeniu 4-12% z MOPS jako buforem bieżącym przy użyciu standardowych technik. Zobacz Gallagher i Chakravarti (2008)²⁹, aby uzyskać szczegółowy protokół western blot.
2. Załadować 10 μg białka z każdej próbki na każdy tor wraz ze znacznikiem masy cząsteczkowej dla TBS i SDS oraz frakcji mocznika.
3. Uruchom żel pod napięciem 200 V przez 1 godzinę lub do momentu, gdy niebieski barwnik z bufora ładującego dotrze do dna żelu.
4. Przenieść białka z żeli elektroforetycznie na membrany nylonowe²⁸, wstępnie zwilżone najpierw w 100% metanolu, a następnie do buforu transferowego zawierającego 20% metanolu. Umieść znak identyfikacyjny na plamie, aby określić stronę białka i orientację markerów wielkości masy cząsteczkowej.
   1. Ułóż żel warstwowo z membraną wzdłuż mokrej bibuły filtracyjnej. Prawidłowe ułożenie membrany ma kluczowe znaczenie w przypadku membrany między żelem a anodą. Wykonaj transfer przez 2 godziny przy 40 V.
   2. Uzupełnić 1X bufor PBS-tween (1X PBS-T): Rozpuść 1 tabletkę PBS w 200 ml wody, aby otrzymać 0,01 M bufor fosforanowy, 0,0027 M chlorek potasu i 0,137 M chlorek sodu, pH 7,4.
   3. Zablokować membranę w 5% roztworze BSA w 1X PBS-T na 30 minut z wytrząsaniem przy 70 obr./min. Zapobiega to nieswoistemu wiązaniu przeciwciała pierwszorzędowego z błoną.
5. Zbadać białko blot 6 ml pierwszorzędowego przeciwciała α-syn Syn-1 (BD Biosciences; mysie przeciwciało monoklonalne) w rozcieńczeniu 1:750 (O/N w 4 °C), a następnie wykonać serię płukań 1X PBS-T (3 x 5 min za każdym razem)²⁸.
6. Inkubować blot z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z HRP w rozcieńczeniu 1:2 000 przez 30 minut. Wykonać serię płukań (3 x 5 min za każdym razem) z 1X PBS-T.
   1. Zanurz bloty w roztworze o wzmocnionej chemiluminescencji na 15 sekund w ciemnym pomieszczeniu. Przykryj kleksy folią spożywczą i umieść filmy autoradiograficzne na plamie stroną z białkiem do góry w kasecie odpornej na światło, aby uchwycić odpowiednie sygnały (pasma o odpowiedniej wielkości).
   2. Wywoływanie filmów autoradiograficznych w automatycznym wywoływaniu.
      Uwaga: Bloty można również tworzyć ręcznie za pomocą programisty i fixera ze źródła komercyjnego w przypadku, gdy zautomatyzowana maszyna deweloperska nie jest dostępna.
7. Inkubować western blot z 6 ml buforu do usuwania western blot przez 10 minut, stale wstrząsając, w celu pozbawienia blot sygnału przeciwciała α-syn. Wykonaj kroki od 3.43 do 3.6.2 przy użyciu pierwszorzędowego przeciwciała beta-aktyny (mysiego monoklonalnego) w rozcieńczeniu 1: 8 000.
8. Zeskanuj i przekonwertuj ostateczny obraz na obraz Tiff i zmierz gęstości za pomocą NIH ImageJ do celów ilościowych (bezpłatne oprogramowanie do pobrania).
   Uwaga: Oprogramowanie umożliwia odczyt gęstości względnego obszaru zainteresowania (odpowiednie pasma wielkości), a dane mogą być wyrażone albo jako stosunek gęstości α-syn / β-aktyny (gen utrzymania porządku) jako dowolne jednostki, lub samodzielnie, gdy gen utrzymania porządku nie jest prawidłowy (jak w przypadku próbek rozpuszczalnych w moczniku).

Results

TBS, SDS i białka rozpuszczalne w moczniku wyekstrahowane ze zwojów podstawy zgodnie z protokołem pokazanym na rysunku 1 zostały przeprowadzone na żelach i poddane immunoblottacji mysim przeciwciałem monoklonalnym α-syn Syn-1. Frakcje rozpuszczalne TBS wykazały obecność monomerycznej α-syn (gatunki ~14 KDa) w badanych przypadkach PD i kontrolnych (Figura 2A). Frakcje rozpuszczalne SDS wykazały również obfitość monomerycznej α-syn we wszystkich trzech podtypach badanych przypadków, co wykazano w blot o niskiej ekspozycji (ryc. 2C). Przypadki PD wykazały również gatunki α-syn o wyższej masie cząsteczkowej (MW), jak widać na plamie o wysokiej ekspozycji, które prawdopodobnie są oligomerami (Figura 2C). Frakcje rozpuszczalne w moczniku z przypadków PD wykazały podwyższone ilości monomerów α-syn, oligomerów i gatunków zagregowanych w porównaniu z przypadkami kontrolnymi. Przypadki idiopatycznej choroby Parkinsona w korze nowej wykazują większe ilości zagregowanych gatunków α-syn, podczas gdy przypadki limbiczne wykazują pośrednie poziomy nierozpuszczalnego α-syn. Zarówno SDS, jak i frakcje mocznika z idiopatycznych przypadków PD wykazują zmienne poziomy skróconych produktów α-syn przy 12 kDa i 6 kDa, jak opisano ²⁰. W przeciwieństwie do tego, przypadki kontrolne nie wykazały żadnych nierozpuszczalnych lub zagregowanych α-syn (Figura 2E). Półilościowe pomiary gęstości odzwierciedlają ilość obciążenia LB zgodnie z kategoriami przy użyciu immunohistochemii α-syn, wykazując nierozpuszczalny charakter zagregowanego α-syn (Figura 2B, 2D, 2F) w przypadkach PD kory nowej i limbicznej.

Rysunek 1. Schemat ideowy procedury ekstrakcji nierozpuszczalnych α-syn. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Reprezentatywne immunobloty poziomów α-syn z PD i kontrolnej tkanki ludzkiej. TBS, SDS i rozpuszczalne frakcje mocznika ze zwojów podstawy (region, w którym występuje patologia α-syn w przypadkach PD) idiopatycznych przypadków PD i neurologicznie prawidłowych (kontrolnych) mózgów analizowano pod kątem obecności α-syn przy użyciu Western Immunoblot. Na każdą linię załadowano 10 μg białka. We frakcjach TBS (A) we wszystkich przypadkach obecne są głównie monomery α-syn. We frakcjach SDS (C) niektóre oligomery α-syn są widoczne wraz z monomerami, głównie w tkance PD. We frakcjach mocznika (C) monomery, oligomery i zagregowane α-syn są zmiennie wyrażane w przypadkach PD, odzwierciedlając ich odpowiedni ładunek LB. Neurologicznie normalne próbki kontrolne wykazują obecność tylko niewielkich ilości monomerycznej α-syn. Należy pamiętać, że możliwe produkty degradacji α-syn są widoczne w niektórych przypadkach przy dużym obciążeniu LB. Solidny grot strzały reprezentuje monomeryczną formę α-syn. * prawdopodobnie reprezentuje C-końcowo skróconą formę α-syn, jak opisano wcześniej^20,26. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

przypadek płeć Wiek w chwili śmierci lat Opóźnienie pośmiertne (godz.) pH tkanki Kora nowa 1 M Rozdział 82 Rozdział 40 6,3 Kora nowa 2 Z 75 Rozdział Pytanie 35,3 6,4 Układ limbiczny 1 M Rozdział 81 28,5 pkt. 6.2 Układ limbiczny 2 Z 79 Rozdział 36,5 pkt. 6.2 Sterowanie 1 M Rozdział 80 38 Rozdział 38 6.1 Sterowanie 2 Z Rozdział 83 32,5 pkt. 6,3

Tabela 1. Ograniczone dane demograficzne użytych przypadków

Discussion

W artykule opisano biochemiczny protokół ekstrakcji i badania zróżnicowanych właściwości rozpuszczalności monomerycznych, oligomerycznych i zagregowanych α-syn z chorych mózgów przy użyciu denaturujących warunków pracy żelu. Jest to dobrze znana technika badania zagregowanych α-syn^{17, 18, 20, 21} białka, które jest normalnie rozpuszczalne w swojej natywnej postaci, ale uzyskuje amyloidogenne lub zwiększone właściwości agregacyjne wraz z postępem choroby lub mutacjami genetycznymi. Niemniej jednak niektóre grupy stosowały niewielkie różnice w stężeniach SDS w swoich (8% lub 10% zamiast 5%)^21,22,30. SDS jest anionowym detergentem i rozpuszcza oligomery α-syn, które mogą zawierać formy α-syn związane z błoną, podczas gdy mocznik, odczynnik chaotropowy, denaturuje nierozpuszczalne zagregowane i fibrylarne lub amyloidogenne formy α-syn²⁰. W związku z tym w systematycznym badaniu przeprowadzonym przez Paleologou i^wsp.31 zbadano stabilność oligomerów i włókienek α-syn przy różnych stężeniach mocznika (6,5 - 8 M) lub SDS (0,25-2%) i stwierdzono, że oligomery są stabilne w stężeniach SDS, ale nie przy wysokich stężeniach mocznika. Ich przeciwciało FILA-1, specyficzne dla oligomerów i włókienek α-syn, wykryło wyższe stężenia włókienek przy stężeniach mocznika 6,5 M w warunkach niedenaturujących. Stężenia buforowe stosowane w tym protokole ściśle odzwierciedlają to, co zostało opisane w Culvenor i wsp. (1999)^{Lokal mieszkalny 32}.

Anatomiczne obszary mózgu do biochemicznej ekstrakcji nierozpuszczalnego α-syn powinny być starannie dobrane, co powinno odzwierciedlać obciążenie α-syn LB i LN w zależności od postępu choroby^33,34. Użyte tutaj przypadki to próbki zwojów podstawy z podtypów kory nowej i limbicznej PD, odzwierciedlające późne i pośrednie etapy progresji PD według McKeith ctriteria³⁴. W Queen Square Brain Bank jedna połowa mózgu jest rutynowo utrwalana w formalinie do analizy histochemicznej, a druga połowa jest starannie preparowana na różne obszary anatomiczne i błyskawicznie zamrażana i przechowywana w zamrażarkach o temperaturze -80 ^oC do dalszych badań biochemicznych i analizy DNA/RNA. Po utrwaleniu mózgów formaliną i rozbiorzeniu przez neuropatologów, przeprowadza się immunohistochemię przy użyciu przeciwciała α-syn, a wyniki archiwizuje. Również rutynowo mierzy się pH tkanki mózgowej po przybyciu jako miarę stanu agonalnego tkanki mózgowej. Stanowi to solidną podstawę dla jakości konserwacji tkanek do analizy biochemicznej.

Nasze dane pokazują, że w przypadkach PD jest więcej rozpuszczalnego monomeru α-syn SDS w porównaniu z grupą kontrolną; w szczególności przypadki PD w korze nowej mają wyższe obciążenie α-syn w porównaniu z odmianą limbiczną PD. Przypadki kory nowej reprezentują większy postęp patologii PD α-syn w obszarach kory nowej, takich jak kora czołowa i ciemieniowa^33,34. Przypadki limbicznej choroby Parkinsona mają wyższe wyniki LB w obszarach podstawy przodomózgowia / limbicznych, takich jak ciało migdałowate, obszary przezśródwęchowe i obręcz. Aby uzyskać miarodajne dane i analizę statystyczną, należy przeprowadzić co najmniej 4 przypadki z każdej kohorty. Podobnie, nie podjęliśmy próby analizy statystycznej przedstawionych tutaj danych dotyczących plam.

Należy również zauważyć, że różne przeciwciała mogą rozpoznawać różne formy/skład oligomerów α-syn wyższego rzędu, a każdy z nich może mieć swoją własną względną czułość i preferencje. Wynika to wyraźnie z wyników Tong i wsp. ²⁹ , w których wykazują, że 4 różne przeciwciała α-syn (Syn-1, SS, Onco i LB509) dają zmienne wyniki przynajmniej dla oligomerów/agregatów α-syn. Monomery α-syn zostały rozpoznane w podobnym stopniu przez wszystkie 4 przeciwciała, chociaż mogą one różnić się w zależności od tego, czy epitop przeciwciała α-syn znajduje się w N-końcu, czy C-końcu²⁹. Podobnie, swoiste przeciwciała przeciwko fosfo-alfa synukleiny determinują odrębne gatunki α synukleiny o wysokiej masie cząsteczkowej 20,21 o dużej masie cząsteczkowej^20,21. W opisanym tutaj protokole zastosowano wysoce scharakteryzowane przeciwciało Syn-1^19-21_.

Jednak ważne jest, aby rozważyć walidację każdego nowego przeciwciała na western blot poprzez eksperymenty przed wchłanianiem przeciwciał, a także nadekspresję i knockdown białka w komórkach.

Ważne jest, aby wziąć pod uwagę inne warianty, które zostały zastosowane przez badaczy do określenia mniejszych fragmentów form α-syn i/lub niestabilnych tetramerycznych form α-syn. Może to obejmować łagodne wiązanie błon za pomocą 0,4% PFA w PBS w celu zachowania skróconych form α-syn³⁵ lub traktowanie homogenatów próbki sieciami w celu stabilizacji tetramerów³⁶.

Dokładna ocena biochemiczna białek za pomocą tkanek pośmiertnych wymaga zminimalizowania enzymatycznej degradacji i modyfikacji białek. Dlatego zaleca się stosowanie tkanek z najkrótszymi opóźnieniami pośmiertnymi i/lub wybieranie dopasowanych próbek w obrębie kohort przypadków. Przed rozpoczęciem protokołu izolacji należy przeprowadzić immunohistochemię z użyciem standardowych przeciwciał do immunohistochemii α-syn. Zakres patologii α-syn jest bardzo zmienny i może się różnić w zależności od wybranych regionów. Wskazane jest, aby wybierać regiony z obfitą patologią jako kontrolę pozytywną w celu uzyskania optymalnej wydajności przy każdym biegu. Kluczowe znaczenie ma stosowanie inhibitorów proteazy i, w razie potrzeby, inhibitorów fosfatazy w celu zapobieżenia niepożądanej degradacji enzymatycznej po uwolnieniu wewnątrzkomórkowych proteaz lub fosfataz występujących podczas lizy komórek i utrzymywania próbek w temperaturze 4 °C.

Ważne jest, aby wszystkie próbki w partii doświadczeń były traktowane równomiernie i konsekwentnie, aby uniknąć zmian między użytkownikami; Należy unikać wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania, ponieważ może to potencjalnie cofnąć modyfikacje potranslacyjne, takie jak fosforylacja. Krytycznym punktem, o którym należy pamiętać podczas badania dużej liczby próbek, jest to, że dane z immunoblotów powinny być znormalizowane do jednej próbki, która powinna przebiegać równolegle do wszystkich innych próbek na żelach i wszystkich danych odnoszących się do tej próbki. Ma to na celu zapewnienie normalizacji danych immunoblot między kilkoma plamami. Jest to metoda przyjęta w naszym niedawnym badaniu²².

Należy zauważyć, że w celu utrzymania niskiego poziomu ECL w tle, nie należy dopuścić do wyschnięcia blot w żadnym momencie podczas protokołu western blot. Ponadto należy unikać bardzo długich ekspozycji (>10 min) na kliszach autoradiograficznych, ponieważ doprowadzi to do nasycenia sygnału ECL i doprowadzi do niedokładnej oceny ilościowej.

Powyższy protokół jest stosunkowo prostą techniką wykorzystującą powszechnie stosowane odczynniki i instrumenty laboratoryjne i może być cennym narzędziem do badania patofizjologii białka α-syn w badaniach nad chorobą Parkinsona. Metodologia ta może być nie tylko rozszerzona o odpowiednie modyfikacje do badania biologii α-syn u zwierząt transgenicznych α-syn, ale także do innych chorób neurodegeneracyjnych charakteryzujących się nieprawidłowymi złogami zagregowanych białek, takich jak AD, MSA, DLB, HD i demencje czołowo-skroniowe. Jednak opisane tutaj dane dotyczące western blot można również zweryfikować za pomocą testów immunoenzymatycznych z użyciem przeciwciał przeciwko specyficznym formom α-syn³¹.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris-HCL	Sigma	T5912
chlorek sodu	VWR	27800.291
SDS	Fluka	71727
Mocznik	Sigma	U5378
Inhibitor proteazy tabletki	Roche	04 693 116001
Tabletki z inhibitorem fosfatazy	Roche	04 906 837001
Tabletki soli fizjologicznej buforowane fosforanami	Sigma	P4417
Tween-20	Sigma	P9416
Bufor biegowy NuPAGE MOPS SDS	Invitrogen	NP0001
Bufor transferowy NuPAGE	Membrana Invitrogen	NP0006-1
Hybond-P	GE Healthcare	RPN303F
Bibuła filtracyjna Whatman 3MM	Sigma	WHA30306185
Bis-tris żele 4-12%	Invitrogen
Podłoże chemiluminescencyjne Supersignal West Pico	Pierce	34080
Bio-RAD DC	Bio-Rad	500-0112
Grubościenne rurki poliwęglanowe	Beckman Beckman	355630
Bufor do usuwania Western blot	Thermo scientific	46430
Przeciwciało pierwszorzędowe Syn-1 (mysie przeciwciało monoklonalne)	BD Biosciences	610786
Pierwotne przeciwciało beta-aktyny (monoklonalne mysie	Sigma	A5441
HRP sprzężone kozie przeciwciało wtórne przeciwko myszom	Santa Cruz	sc-2031
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma	A7030
Instrument	Company	Rotor / model nr
Ultrawirówka stołowa Optima Max	Beckman	MLA-80
Sonicator	Heat Systems	XL20-20
Homogenizator	Jenke i Kunkel	TP18/10