Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Test immunoprecypitacji chromatyny do identyfikacji interakcji białko-DNA Arabidopsis in vivo

20.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53422

⸱

14 stycznia 2016

 ,  ,  , 
1Centro de Biotecnología y Genómica de Plantas (CBGP), Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA)-Universidad Politécnica de Madrid

W tym artykule

Podsumowanie

Immunoprecypitacja chromatyny to potężna technika identyfikacji miejsc wiązania DNA białek Arabidopsis in vivo. Procedura ta obejmuje sieciowanie i fragmentację chromatyny, immunoprecypitację selektywnymi przeciwciałami przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania oraz analizę qPCR związanego DNA. Opisujemy prosty test ChIP zoptymalizowany dla roślin Arabidopsis.

Streszczenie

Skomplikowane sieci regulacji genów koordynują procesy biologiczne i przemiany rozwojowe w roślinach. Selektywna aktywacja transkrypcyjna i wyciszanie genów pośredniczą w odpowiedzi roślin na sygnały środowiskowe i sygnały rozwojowe. Dlatego wgląd w mechanizmy kontrolujące ekspresję genów roślin jest niezbędny do dogłębnego zrozumienia, w jaki sposób procesy biologiczne są regulowane w roślinach. Opisana tutaj technika immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) jest procedurą mającą na celu identyfikację miejsc wiązania DNA białek w genach lub regionach genomu modelowego gatunku Arabidopsis thaliana. Interakcje z DNA białek będących przedmiotem zainteresowania, takich jak czynniki transkrypcyjne, białka chromatyny lub potranslacyjnie zmodyfikowane wersje histonów, mogą być skutecznie analizowane za pomocą protokołu ChIP. Metoda ta opiera się na utrwalaniu interakcji białko-DNA in vivo, losowej fragmentacji chromatyny, immunoprecypitacji kompleksów białko-DNA ze specyficznymi przeciwciałami oraz kwantyfikacji DNA związanego z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania za pomocą technik PCR. Zastosowanie tej metodologii w przypadku rzodkiewnika znacząco przyczyniło się do odkrycia transkrypcyjnych mechanizmów regulacyjnych, które kontrolują różnorodne procesy biologiczne roślin. Podejście to pozwoliło na zidentyfikowanie miejsc wiązania białka chromatyny EBS Arabidopsis z regionami regulatorowymi głównego genu FT podczas kwitnienia. Wpływ tego białka na akumulację określonych znaczników histonowych w regionie genomowym FT został również ujawniony poprzez analizę ChIP.

Wprowadzenie

W ostatnich latach rozwinięto szeroki zakres narzędzi genetycznych, molekularnych i genomicznych w gatunku modelowym Arabidopsis thaliana. Technologia ta ogromnie ułatwiła postęp w zrozumieniu, w jaki sposób regulowany jest rozwój roślin. Wśród procesów rozwojowych badanych przy użyciu rzodkiewnika jako modelu, szeroko analizowano genetyczną kontrolę czasu kwitnienia. Badania te wykazały, że rośliny bardzo precyzyjnie modulują czas kwitnienia w odpowiedzi na endogenne sygnały, takie jak hormony i wiek rośliny, a także na sygnały środowiskowe, takie jak fotoperiod i temperatura, które synchronizują czas kwitnienia z naturalnym cyklem pórroku 1,2. Izolacja i charakterystyka mutantów Arabidopsis ze zmianami w czasie kwitnienia była determinantem w odkryciu złożonej sieci genów, które regulują czas kwitnienia w odpowiedzi na czynniki endogenne i środowiskowe. Te obwody genetyczne są zintegrowane na poziomie kilku głównych genów, które działają jak przełączniki kwitnienia, a dokładny czas inicjacji kwiatowej zależy od równowagi działań promujących i tłumiących kwitnienie, które działają przed genami integratora kwiatów1,3.

Funkcjonalna charakterystyka genów zidentyfikowanych ze względu na ich rolę w kontroli inicjacji kwitnienia, wspomagana przez niedawne zastosowanie metod genomicznych, ujawniła centralną rolę regulacji transkrypcji w modulacji czasu kwitnienia. W rzeczywistości wiele głównych genów kwitnienia koduje czynniki transkrypcyjne4. Ponadto szereg kompleksów białkowych przebudowujących chromatynę wpływa na ekspresję głównych genów kwitnienia. Okazało się, że pewna liczba mutantów rzodkiewnika wyizolowanych ze względu na ich zmieniony czas kwitnienia jest nosicielami mutacji w genach kodujących różne modyfikatory chromatyny. Różne remodelery chromatyny, które wprowadzają modyfikacje potranslacyjne w ogonach histonów, repozycję nukleosomów względem DNA lub wymianę histonów kanonicznych na warianty histonów, są niezbędne do prawidłowej regulacji kwitnienia u Arabidopsis5,6. Niektóre z tych działań przebudowy chromatyny katalizują osadzanie się lub usuwanie modyfikacji kowalencyjnych, takich jak acetylacja lub metylacja w określonych resztach histonów. Te znaczniki histonowe są specyficznie rozpoznawane przez wyspecjalizowane efektory, które rekrutują inne kompleksy przebudowujące chromatynę, czynniki transkrypcyjne lub składniki maszynerii transkrypcyjnej w celu regulacji aktywności transkrypcyjnej genów kwitnienia.

ImmunoPrecypitacja chromatyny (ChIP) pozwala na identyfikację in vivo miejsc wiązania DNA dla interesujących białek (Rysunek 1). Procedura ta wykorzystuje zdolność niektórych substancji chemicznych do sieciowania białek z DNA. Powstałe kompleksy DNA-białko można następnie immunoprecypitować za pomocą specyficznych przeciwciał przeciwko czynnikom transkrypcyjnym, białkom wiążącym chromatynę lub określonym modyfikacjom i heterologicznym epitopom (powszechnie określanym jako "znaczniki") przyłączonym do wybranego białka. DNA oczyszczone z tych immunoprecypitatów może być wykorzystane jako matryca w ilościowych reakcjach PCR (qPCR) w celu oceny wzbogacenia określonych sekwencji będących przedmiotem zainteresowania. W ten sposób można ustalić miejsca wiązania czynników transkrypcyjnych lub rozmieszczenie znaczników histonowych w poszczególnych genach7,8. Ponadto, w połączeniu z sekwencjonowaniem nowej generacji (NGS), które umożliwia masowe sekwencjonowanie równoległe, technologia ChIP umożliwiła identyfikację miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych w całym genomie, a także odsłonięcie epigenomicznego krajobrazu modyfikacji histonów. Co więcej, jednoczesna analiza ekspresji genów pozwala na monitorowanie, w jaki sposób wiązanie regulatorów transkrypcji lub odkładanie się poszczególnych znaczników histonów koreluje z aktywnością transkrypcyjną genów9.

Użycie protokołów ChIP u Arabidopsis pozwoliło ocenić wpływ różnych regulatorów transkrypcji na organizację chromatyny głównych genów kwitnienia i jak te zmiany strukturalne wpływają na ekspresję genów5,6. Poprzednie wyniki wykazały, że locus Arabidopsis EARLY BOLTING IN SHORT DAYS (EBS) działa jako represor kwitnienia, a mutanty w tym genie wykazują przyspieszenie kwitnienia i regulację w górę głównego genu kwitnienia FT. Ponadto, mutacje powodujące utratę funkcji w FT całkowicie hamują fenotyp wczesnego kwitnienia roślin z mutacją ebs, co wskazuje, że FT jest wymagany do przedwczesnego kwitnienia mutantów ebs i że EBS jest niezbędny do tłumienia tego głównego genu kwitnienia10,11. EBS koduje białko zawierające PHD, które może specyficznie wiązać histon H3 di- i trimetylowany w reszcie lizyny 4 (H3K4me2/3), co sugeruje rolę EBS w represji FT12 za pośrednictwem chromatyny. Zastosowanie podejścia ChIP wykazało, że białko EBS10,11 zawierające rzodkiewnik zawiera PHD, wiąże regiony regulatorowe genu integratora kwiatów FT w celu stłumienia jego ekspresji12. Dodatkowe dane uzyskane dzięki zastosowaniu technologii ChIP wykazały, że białko to jest niezbędne do utrzymania niskiego poziomu acetylacji histonów, cechy charakterystycznej aktywnej transkrypcji, w chromatynie tego głównego genu kwitnienia w początkowych stadiach rozwoju rzodkiewnika. Obserwacje te, wraz z danymi genetycznymi i danymi dotyczącymi ekspresji genów, pokazują, że to białko zawierające rzodkiewnik odgrywa kluczową rolę w precyzyjnym dostrojeniu czasu kwitnienia poprzez modulację ekspresji genu integratora kwiatów FT12. Przedstawione tutaj prace zapewniają zoptymalizowaną metodę przydatną nie tylko do analizy histonów, ale także do innych białek związanych z chromatyną, ze zwiększoną wydajnością i skróconym czasem eksperymentu. Co więcej, raport ten ilustruje, w jaki sposób zastosowanie protokołów ChIP dostarczyło nowych informacji na temat związku między zmianami w modyfikacjach chromatyny a stanami transkrypcyjnymi genów roślinnych oraz jak te mechanizmy kontroli ekspresji genów, w których pośredniczą chromatyna, wpływają na początek kwitnienia rzodkiewnika.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Sieciowanie materiału roślinnego (1 godz.)

  1. Hoduj linie Arabidopsis użyte w eksperymencie (typ dziki - WT - kontra mutanty i/lub linie wyrażające znakowaną wersję białka, które Cię interesują, kontra linie wyrażające znacznik niepołączony z żadnym białkiem) przez 12-18 dni na dużych szalkach Petriego (150 mm) z pożywką MS-agar (1 L: 1x sole Murashige i Skoog, 10 g sacharozy, 0,5 g MES, pH 5,7 (KOH), 1% agar). Alternatywnie, uprawiaj rośliny na doniczkach zawierających mieszankę gleby i wermikulitu w proporcji 3:1.
    ostrożność! Formaldehyd jest toksyczny przez drogi oddechowe, w kontakcie ze skórą i po połknięciu, i należy obchodzić się z nim w kapturze chemicznym przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej. Kroki 1.2 – 1.6 należy wykonać pod wyciągiem.
  2. Wykonaj małe otwory w pokrywie probówek o pojemności 50 ml za pomocą igły podgrzewanej w palniku laboratoryjnym. Dodać 40 ml buforu 1x PBS i 1,08 ml formaldehydu do końcowego stężenia 1% (podstawowy 37% roztwór). Zbierz 1,5 g materiału roślinnego w tych 50 ml probówkach. Utrzymuj rurki na lodzie podczas sieciowania.
  3. Zamknąć probówki o pojemności 50 ml pokrywką. Umieścić probówki w eksykatorze i zastosować podciśnienie. Infiltruj próżniowo tkankę przez 10 minut, a następnie ostrożnie zwolnij próżnię, aby zapobiec ubijaniu roztworu. Wymieszać próbkę. Powtórz dwa razy. Po infiltracji obserwuj materiał roślinny i upewnij się, że staje się on lekko przezroczysty i ma tendencję do opadania na dno rurki (ryc. 2).
  4. Dodać 2,5 ml 2 M glicyny, aby uzyskać końcowe stężenie 0,125 M. Stosować próżnię przez 5 minut. Glicyna działa jako konkurencyjny inhibitor sieciowania formaldehydu.
  5. Wyrzucić roztwór formaldehydu i glicyny PBS, odwracając zamkniętą probówkę o pojemności 50 ml z otworami w pokrywce.
  6. Opłucz sadzonki dwukrotnie 1x PBS i raz wodą, wylewając roztwór myjący, jak opisano w kroku 1.5. Osusz je na ręczniku papierowym i zamroź w ciekłym azocie.
    UWAGA: Zamrożoną tkankę można przechowywać w temperaturze –80 °C przez tygodnie.

2. Przygotowanie przeciwciał (1 dzień)

UWAGA: Do immunoprecypitacji zaleca się stosowanie kulek magnetycznych sprzężonych z przeciwciałami za pośrednictwem łącznika białka G lub białka A o wysokim powinowactwie do stałej domeny łańcucha ciężkiego przeciwciała. Kompleksy DNA-białko mogą przyczepiać się niespecyficznie do powierzchni koniugatów kulki-przeciwciało. Z tego powodu konieczne jest przeprowadzanie kontroli bez swoistych przeciwciał w celu ilościowego określenia niespecyficznego wiązania tła.

  1. Do każdej immunoprecypitacji należy przygotować 15 μl kulek magnetycznych w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Ilość kulek zależy od ilości chromatyny użytej do immunoprecypitacji, a także od przeciwciał.
  2. Aby przemyć, dodać 1 ml buforu rozcieńczającego immunoprecypitację chromatyny (ChIP) do kulek, wymieszać przez obracanie i umieścić 1,5 ml probówki mikrowirówkowej w stojaku magnetycznym. Odczekaj około 1 minuty, aby koraliki przyczepiły się do magnesu. Gdy probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml nadal znajdują się w stojaku, usunąć supernatant przez pipetowanie. Powtórz dwa razy.
    UWAGA: Dla każdej linii roślin potrzebne są dwa zestawy immunoprecypitacyjne: jeden z kulkami i przeciwciałami (Ab) oraz drugi z grupą kontrolną bez przeciwciał (No-Ab) z samymi kulkami magnetycznymi.
  3. Zawiesić kulki w 200 μl buforu rozcieńczającego ChIP. Dodać wymaganą ilość określonego Ab do jednej z dwóch probówek przygotowanych dla każdej linii roślinnej (dokładne rozcieńczenie różni się dla każdego Ab i musi być zoptymalizowane eksperymentalnie lub, w przypadku przeciwciał dostępnych na rynku, postępować zgodnie z instrukcjami producenta). Użyj tej próbki do immunoprecypitacji. Dodać taką samą ilość niespecyficznej IgG do drugiej probówki, która zostanie użyta jako kontrola ujemna.
  4. Inkubować O/N na obracającym się kole w temperaturze 4 °C, aby przeciwciało mogło przyłączyć się do kulek.

3. Ekstrakcja chromatyny (4 godz.)

  1. Dokładnie zmiel zamrożony materiał roślinny w ciekłym azocie za pomocą moździerza i tłuczka, aż proszek stanie się jednorodny i jasnozielony. Przenieść proszek do nowej probówki o pojemności 50 ml.
  2. W przypadku stopni 3.2 – 3.6 pracuj pod wyciągiem. Dodać 30 ml buforu ekstrakcyjnego 1 (ExB 1) i dobrze wymieszać, aby namoczyć sproszkowaną tkankę. Począwszy od tego etapu, próbki należy utrzymywać w temperaturze 4 °C przez cały czas. Zamrożona tkanka i resztki ciekłego azotu spowodują zamarznięcie buforu. Upewnij się, że całkowicie rozmroziłeś zamrożoną tkankę, odwracając probówki 4-5 razy co 2 minuty.
  3. Oczyścić gnojowicę, przepuszczając ją przez tkankę filtracyjną o wielkości porów 22-25 μm do nowej probówki o pojemności 50 ml i odwirować przy 1 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Na tym etapie jądra i wszystkie organelle zostaną osadzone. ExB 1 zawiera wystarczającą ilość sacharozy, aby zapewnić wysoką gęstość i zapobiec zaburzeniu struktury organelli.
  4. Delikatnie usunąć supernatant przez dekantację. Na tym etapie obserwuj zieloną granulkę o pojemności około 2 ml.
  5. Zawiesić osad w 5 ml ExB 2. Ponowne zawieszenie śrutu będzie w tym momencie trudne. Wirować przy 1 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: ExB 2 zawiera 1% Triton X-100, który pomaga rozerwać chloroplasty i usunąć chlorofil.
  6. Zawiesić osad w 300 μl buforu ekstrakcyjnego 3 (ExB 3).
  7. Do czystej probówki do mikrofuge dodaj 600 μl ExB 3. Weź ponownie zawieszony osad z kroku 3.6 i ostrożnie ułóż go na wierzchu czystego ExB 3.
  8. Wirować przez 1 godzinę w temperaturze 16 000 x g w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Ten krok pomaga usunąć detergent z próbki.
  9. Usunąć supernatant przez zasysanie pipetą. Zawiesić osad jądrowy w 300 μl buforu sonikacyjnego, powoli pipetując w górę iw dół, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków, które mogą wpływać na wydajność sonikacji. Ostrożnie odpipetować całą zawiesinę i przenieść ją do czystej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
    UWAGA: Ten bufor zawiera SDS, do lizy jąder i uwalniania chromatyny.
  10. Sonikować zawiesinę, aby lizować jądra i losowo ścinać chromatynę na małe fragmenty. Stosować warunki sonikacji, które powodują, że chromatyna jest wzbogacona we fragmenty w zakresie 200-800 pz (20-30 cykli z ustawieniami 30 sekund WŁĄCZONYCH / 30 sekund WYŁĄCZONYCH w temperaturze 4 °C dla dostępnego urządzenia do sonikacji opisanego w Tabeli materiałów/odczynników). Sprawdź skuteczność sonikacji poprzez elektroforetyczne rozdzielanie otrzymanych fragmentów DNA na żelu agarozowym13, ładując 2 μl sonikowanej chromatyny (ryc. 3).
    ostrożność! Upewnij się, że nosisz sprzęt ochronny słuchu podczas etapu sonikacji, na wypadek, gdyby urządzenie ultrasonograficzne nie znajdowało się w dźwiękoszczelnej szafce.
    Kluczowy krok! Fragmentacja chromatyny w dużej mierze zależy od sprzętu do sonikacji. Warunki sonikacji powinny być dostosowane tak, aby osiągnąć wzbogacenie w odpowiednie rozmiary DNA. Na rysunku 3 przedstawiono przykład optymalizacji fragmentacji chromatyny.
  11. Wirować roztwór raz w temperaturze 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant przez pipetowanie do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Wyrzuć granulkę. Pobrać 1/10 supernatantu do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, oznaczyć ją jako Wejście i zamrozić w temperaturze -20 °C.
  12. Rozcieńczyć chromatynę 10x buforem rozcieńczającym ChIP w celu rozcieńczenia SDS do końcowego stężenia 0,1%.
    Uwaga: Próbki można zamrażać i przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka tygodni.

4. Immunoprecypitacja białka będącego przedmiotem zainteresowania i ratowanie DNA (1 dzień, 3 godziny)

  1. Przemyć kulki pokryte Ab z kroku 2.4 trzykrotnie 1 ml buforu rozcieńczającego ChIP w celu usunięcia nadmiaru przeciwciała, jak opisano w kroku 2.2. Zawiesić w 200 μl buforu rozcieńczającego ChIP. Dodać 50 μl wyizolowanej chromatyny. Inkubować O/N na obracającym się kole w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Sprawdź stężenie chromatyny w mikroobjętościowym spektrofotometrze UV-Vis. 50 μl wyizolowanej chromatyny powinno zawierać więcej niż 10 μg DNA.
  2. Dla stopni 4.2-4.5 pracować w 4 °C. Umyć kulki dwukrotnie w 1 ml buforu do płukania o niskiej zawartości soli, jak opisano w kroku 2.2.
  3. Umyj kulki raz w 1 ml buforu do prania o wysokiej zawartości soli.
  4. Umyj kulki raz w 1 ml buforu myjącego LiCl.
  5. Umyj kulki dwukrotnie w 1 ml buforu TE. Po ostatnim praniu należy upewnić się, że bufor TE pozostawiony w probówce został całkowicie usunięty przez zassanie pipetą.
  6. Wyjmij próbki INPUT (krok 3.9). Przenieść 5 μl INPUT do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i kontynuować tak jak w przypadku próbek ChIP. Odwrotne sieciowanie poprzez dodanie 200 μl 5% chelatującej żywicy jonowymiennej i inkubację przez 10 minut w temperaturze 95 °C, wytrząsając co 2-3 minuty. Wirować w temperaturze 16 000 x g przez 30 sekund i ostrożnie przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki, pipetując.
    UWAGA: Podczas gdy tradycyjna metoda odwrócenia sieciowania obejmuje inkubację O/N z NaCl, inkubacja z chelatującą żywicą jonową w temperaturze 95 °C pozwala na skuteczne sieciowanie i elucję DNA w ciągu 10 minut, dzięki czemu protokół jest o jeden dzień krótszy
    7. .
  7. Dodać 2 μl proteinazy K (10 mg/ml) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut w celu strawienia białek i uwolnienia DNA.
  8. Zatrzymać reakcję przez inkubację w temperaturze 95 °C przez 10 minut.
  9. Szybko wirować z prędkością 16 000 x g przez 30 sekund i przenieść supernatant do nowej probówki metodą pipetowania.
  10. Wyczyść wyizolowane DNA za pomocą standardowego zestawu do oczyszczania fragmentów DNA.
    UWAGA: Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.
  11. Przenieś kolumnę wiążącą DNA z zestawu do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Eluować oczyszczone DNA, dodając 20 μl wody wolnej od DNaz do środka kolumny i wirując z prędkością 16 000 x g przez 60 sekund. Punkt zatrzymania: Próbki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez kilka tygodni.

5. Pomiar obfitości miejsc wiązania w immunologicznie wytrąconym DNA za pomocą qPCR (4 godz.)

UWAGA: DNA wyizolowane z wytrąconej chromatyny musi być analizowane w celu określenia, które fragmenty DNA zostały ChIP z całkowitej chromatyny, ze względu na jego wiązanie z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania.

  1. Zaprojektuj startery dla interesujących regionów genomu o temperaturze topnienia (Tm) 60 °C i zawartości GC 30%-80%. Ponieważ chromatyna ulega fragmentacji w procesie sonikacji, długość amplifikowanej sekwencji nie powinna być dłuższa niż 150-200 nukleotydów (Tabela 1).
    UWAGA: Przydatnym narzędziem do projektowania podkładów jest program Primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). Dodatkowe wytyczne dotyczące projektowania podkładów są dostępne w poprzednich raportach 8,14,15.
  2. Użyj programu BLAST, aby upewnić się, że startery są specyficzne (zwłaszcza promotory mogą mieć podobne sekwencje wiążące TF) i przetestuj skuteczność startera za pomocą rozcieńczeń 1:10 w wodzie wejściowego DNA (krok 4.9). Niektóre regiony genomu zostaną oczyszczone lepiej niż inne. Dlatego ważne jest, aby zaprojektować startery PCR i sprawdzić je na rozcieńczonym wejściowym DNA.
  3. Rozcieńczyć oczyszczony DNA w stosunku 1:10 wodą i odpipetować 5 μl rozcieńczonego DNA w probówce PCR dla każdej reakcji.
    UWAGA: Rozcieńczyć tylko potrzebną ilość, ponieważ DNA może przyczepić się do ścianek probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Wielokrotne cykle rozmrażania i zamrażania zwiększają liczbę przyłączonych cząsteczek DNA. Dla każdej pary starterów należy przeanalizować wzmocnienie na wejściu, Ab-ChIP i No-Ab ChIP.
  4. Aby uzupełnić mieszaninę PCR, dodaj mieszankę główną Sybr Green PCR do końcowego stężenia 1x i 0,5 μM każdego startera. Napełnij do 20 μl wodą wolną od DNaz.
  5. Reakcję qPCR należy przeprowadzić zgodnie z instrukcjami producenta mieszanki wzorcowej Sybr Green PCR.

6. Analiza danych

UWAGA: Spośród istniejących sposobów analizy danych ChIP, najczęściej używane są dwa. Pierwszą z nich jest metoda wzbogacania fałdowego, nazywana również "wzbogaceniem względnym", "sygnałem na tle" lub "względem kontroli bez przeciwciał". Druga metoda nosi nazwę "% danych wejściowych".

  1. Analiza danych metodą wzbogacania fałd.
    1. Utwórz arkusz kalkulacyjny z nazwami próbek i surowymi wartościami Ct, które zostały uzyskane po reakcji qPCR.
    2. Dla każdej próbki należy odjąć od jej surowej wartości Ct wartość surowego Ct uzyskaną dla odpowiedniej kontroli No-Ab. UWAGA: Po tej operacji matematycznej wartość Ct dla próbki No-Ab będzie równa 0.
    3. Obliczać wzbogacanie krotne przez operację potęgowania o podstawie 2 i wykładniku (potęga) równym ujemnej reszcie uzyskanej w kroku 6.1.2 (tabela 2).
      wzbogacenie fałdy = 2 - (Ct(próbka) - Ct(No-Ab))
      UWAGA: W tej metodzie liczebność określonego fragmentu DNA w próbce ChIP-ed jest porównywana z obfitością tego fragmentu w kontroli No-Ab. Założeniem tej metody jest to, że poziom sygnału tła jest odtwarzalny między różnymi zestawami starterów, próbkami i powtórzonymi eksperymentami. Jednak te poziomy sygnału "szumu" różnią się między zestawami starterów, próbkami i eksperymentami.
  2. Analiza danych metodą % danych wejściowych.
    1. Utwórz arkusz kalkulacyjny z nazwami próbek i surowymi wartościami Ct, które zostały dla nich uzyskane po reakcji qPCR.
    2. Dostosuj surowe wartości Ct dla próbek wejściowych, odejmując wartość logarytmu o podstawie 2 od frakcji całkowitej wyekstrahowanej chromatyny, która została przyjęta jako dane wejściowe.
      UWAGA: W tym protokole odjęta wartość wynosi 3,32, ponieważ 10% całkowitej chromatyny zostało przyjęte jako dane wejściowe w tym protokole. Log2(10) równa się 3,32.
    3. Obliczyć % danych wejściowych, mnożąc przez 100 wartość operacji potęgowania o podstawie 2 i wykładniku (potędze) równą pozostałości skorygowanych wartości wejściowych odjętych od surowych wartości Ct próbki (tabela 3).
      % danych wejściowych = 100*2 (skorygowane wejście – Ct(próbka))
      UWAGA: W tej procedurze oblicza się zależność między określoną obfitością DNA w próbce ChIP-ed a całkowitą izolowaną chromatyną (próbką wejściową). Więcej szczegółów na temat analizy danych ChIP można znaleźć w Haring et al.Rozdział 8.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W tym protokole ChIP służącym do identyfikacji oddziaływań białko-DNA in vivo można wyróżnić osiem głównych etapów, obejmujących hodowlę i zbiór materiału roślinnego, sieciowanie chromatyny, izolację chromatyny, fragmentację chromatyny, selektywną izolację kompleksów DNA i badanego białka poprzez immunoprecypitację, trawienie białek, puryfikację DNA oraz analizę qPCR (Rysunek 1). Kluczowym etapem protokołu ChIP jest utrwalenie oddziaływań DNA-białko w reakcji sieciowania. W ChIP roślin stosuje s...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisany tutaj protokół ChIP jest powtarzalną i potężną techniką analizy interakcji między białkami i określonymi sekwencjami DNA in vivo u roślin Arabidopsis. Skuteczna identyfikacja miejsc wiązania białek będących przedmiotem zainteresowania wymaga odpowiedniego doboru organów roślinnych lub etapów rozwoju, w których faktycznie zachodzą odpowiednie interakcje. Ponadto bardzo ważne jest uzyskanie odpowiedniego utrwalenia materiału roślinnego i optymalnego ścinania chromatyny za pomocą sonikacji. Niezbędne są rów...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować The Plant Cell za umożliwienie wykorzystania niektórych danych opublikowanych w tym czasopiśmie do opracowania reprezentatywnych wyników opisanych tutaj na rysunku 4. Prace te były wspierane przez unijną sieć szkoleń wstępnych Marie Curie-Curie-EpiTRAITS (umowa o grant 316965) oraz przez hiszpańskie Ministerio de Economìa y Competitividad (granty BIO2010-15589 i BIO2013-43098-R).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
MESSigmaM8250
MS (mieszanina soli bazalnej Murashige i Skoog)SigmaM5524
Formaldehyd 37% SigmaF8775-25Stosować pod wyciągiem
Mieszanka inhibitorów proteazy cOmplete ULTRA Tabletki, Mini, bez EDTA, EASYpackRoche5892791001
(UCD200TO)
GlycineSigma50046
QIAquick PCR Purification KitQiagen28104
Koraliki magnetyczne Dynabeads sprzężone z białkiem A lub białkiem GLife Technologies10003D/10001DSprawdź producenta" s instrukcja powinowactwa przeciwciał
MiraclothMerck Millipore475855
Triton X-100 Surfact-Amps Detergent Solution LifeTechnologies85112
(mysz, szczur, królik i hellip;)-IgGDiagenodeC15400001, C15420001, C15410206
Stojak magnetyczny - Przeciwciało poliklonalne DynaMag-2Life Technologies12321D
H3K9/14ac - Premium DiagenodeC15410200-10
Żywica Chelex 100Bio-Rad142-2832
Proteinaza KLife Technologies17916
Przeciwciało Anti-Myc Tag, klon 4A6Millipore05-724
LightCycler 480 SYBR Green I MasterRoche4707516001
Bioruptor Standardowe urządzenie do sonikacji Diagenode B01010002

Bibliografia

  1. Andres, F., Coupland, G. The genetic basis of flowering responses to seasonal cues. Nat Rev Genet. 13 (9), 627-639 (2012).
  2. Capovilla, G., Schmid, M., Pose, D. Control of flowering by ambient temperature. J Exp Bot. 66 (1), 59-69 (2015).
  3. Jarillo, J. A., Piñeiro, M. Timing is everything in plant development. The central role of floral repressors. Plant Science. 181 (4), 364-378 (2011).
  4. Pajoro, A., et al. The (r)evolution of gene regulatory networks controlling Arabidopsis plant reproduction: a two-decade history. J Exp Bot. 65 (17), 4731-4745 (2014).
  5. He, Y. Chromatin regulation of flowering. Trends Plant Sci. 17 (9), 556-562 (2012).
  6. Jarillo, J. A., Pineiro, M., Cubas, P., Martinez-Zapater, J. M. Chromatin remodeling in plant development. International Journal of Developmental Biology. 53 (8-10), 1581-1596 (2009).
  7. Saleh, A., Alvarez-Venegas, R., Avramova, Z. An efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) protocol for studying histone modifications in Arabidopsis plants. Nat Protoc. 3 (6), 1018-1025 (2008).
  8. Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3, 11(2007).
  9. Kaufmann, K., et al. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) of plant transcription factors followed by sequencing (ChIP-SEQ) or hybridization to whole genome arrays (ChIP-CHIP). Nat Protoc. 5 (3), 457-472 (2010).
  10. Gomez-Mena, C., et al. early bolting in short days: An Arabidopsis mutation that causes early flowering and partially suppresses the floral phenotype of leafy. Plant Cell. 13 (5), 1011-1024 (2001).
  11. Piñeiro, M., Gomez-Mena, C., Schaffer, R., Martinez-Zapater, J. M., Coupland, G. EARLY BOLTING IN SHORT DAYS is related to chromatin remodeling factors and regulates flowering in Arabidopsis by repressing FT. Plant Cell. 15 (7), 1552-1562 (2003).
  12. Lopez-Gonzalez, L., et al. Chromatin-dependent repression of the Arabidopsis floral integrator genes involves plant specific PHD-containing proteins. Plant Cell. 26 (10), 3922-3938 (2014).
  13. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor. Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1989).
  14. Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. , e3998(2012).
  15. Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).
  16. Dedon, P. C., Soults, J. A., Allis, C. D., Gorovsky, M. A. A simplified formaldehyde fixation and immunoprecipitation technique for studying protein-DNA interactions. Anal Biochem. 197 (1), 83-90 (1991).
  17. Yu, C. W., et al. HISTONE DEACETYLASE6 interacts with FLOWERING LOCUS D and regulates flowering in Arabidopsis. Plant Physiology. 156 (1), 173-184 (2011).
  18. Zhou, J., et al. Genome-wide profiling of histone H3 lysine 9 acetylation and dimethylation in Arabidopsis reveals correlation between multiple histone marks and gene expression. Plant Mol Biol. 72 (6), 585-595 (2010).
  19. Lafos, M., et al. Dynamic regulation of H3K27 trimethylation during Arabidopsis differentiation. PLoS Genet. 7 (4), e1002040(2011).
  20. Barcala, M., Fenoll, C., Escobar, C. Laser microdissection of cells and isolation of high-quality RNA after cryosectioning. Methods Mol Biol. 883, 87-95 (2012).
  21. Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses. Int J Dev Biol. 57 (6-8), 545-552 (2013).
  22. Deal, R. B., Henikoff, S. The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana. Nat Protoc. 6 (1), 56-68 (2011).
  23. Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 41 (6), 694-698 (2006).
  24. Das, P. M., Ramachandran, K., vanWert, J., Singal, R. Chromatin immunoprecipitation assay. Biotechniques. 37 (6), 961-969 (2004).
  25. Kaufmann, K., et al. Target genes of the MADS transcription factor SEPALLATA3: integration of developmental and hormonal pathways in the Arabidopsis flower. PLoS Biol. 7 (4), e1000090(2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Arabidopsis thalianawiązanie czynników transkrypcyjnychanaliza modyfikacji histonowychprocedura sieciowaniafragmentacja sonikacyjnaimmunoprecypitacja na kulkach magnetycznychilościowe qPCRregulacja genu FT
Test immunoprecypitacji chromatyny do identyfikacji interakcji białko-DNA Arabidopsis in vivo
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.