Artykuł metodologiczny

Charakterystyka metaboliczna spolaryzowanych makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego M1 i M2 przy użyciu analizy strumienia zewnątrzkomórkowego w czasie rzeczywistym

DOI:

10.3791/53424

⸱

28 listopada 2015

 ,  , 
1Department of Medical Biochemistry, Experimental Vascular Biology, Academic Medical Center, Amsterdam

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeprogramowanie metaboliczne jest cechą charakterystyczną i warunkiem wstępnym polaryzacji makrofagów M1 i M2. Niniejszy manuskrypt opisuje test do pomiaru podstawowych parametrów glikolizy i funkcji mitochondriów w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy. Narzędzie to można zastosować do zbadania, w jaki sposób poszczególne czynniki wpływają na metabolizm i fenotyp makrofagów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Specyficzne szlaki metaboliczne są coraz częściej uznawane za kluczowe cechy charakterystyczne podzbiorów makrofagów. Podczas gdy indukowane klasycznie aktywowane makrofagi M1 lub M (LPS) indukowane przez LPS są prozapalne, IL-4 indukuje alternatywną aktywację makrofagów, a te tak zwane M2 lub M (IL-4) wspomagają rozwiązywanie stanów zapalnych i gojenie się ran. Najnowsze dowody wskazują na kluczową rolę przeprogramowania metabolicznego w regulacji polaryzacji makrofagów M1 i M2.

W tym manuskrypcie analizator strumienia zewnątrzkomórkowego jest stosowany do oceny cech metabolicznych naiwnych, spolaryzowanych M1 i M2 makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego myszy. Ten instrument wykorzystuje czujniki pH i tlenu do pomiaru wskaźnika zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) i wskaźnika zużycia tlenu (OCR), które mogą być związane z glikolitycznym i mitochondrialnym metabolizmem oksydacyjnym. W związku z tym zarówno glikoliza, jak i mitochondrialny metabolizm oksydacyjny mogą być mierzone w czasie rzeczywistym w jednym teście.

Korzystając z tej techniki, pokazujemy tutaj, że zapalne makrofagi M1 wykazują zwiększony metabolizm glikolityczny i zmniejszoną aktywność mitochondriów. I odwrotnie, przeciwzapalne makrofagi M2 wykazują wysoką mitochondrialną fosforylację oksydacyjną (OXPHOS) i charakteryzują się zwiększoną wolną pojemnością oddechową (SRC).

Prezentowany test funkcjonalny służy jako ramy do zbadania, jak poszczególne cytokiny, związki farmakologiczne, nokautacje genów lub inne interwencje wpływają na fenotyp metaboliczny makrofagów i stan zapalny.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż makrofagi odgrywają kluczową rolę w praktycznie wszystkich chorobach, mechanizmy molekularne regulujące ich fenotyp wciąż nie są w pełni odkryte. Makrofagi wykazują wysoką heterogeniczność i w odpowiedzi na mikrośrodowisko przyjmują różnefenotypy1. Klasycznie aktywowane makrofagi M1 lub M(LPS) indukowane LPS (+ IFNγ) sprzyjają stanowi zapalnemu i chronią gospodarza przed różnymi rodzajami zagrożeń mikrobiologicznych2. Inni używają IFNγ samodzielnie lub w połączeniu z TNF jako bodźców do wywołania polaryzacji M1. IL-4 i/lub IL-13 indukuje alternatywną aktywację makrofagów, a te komórki M2 lub M (IL-4) są silnymi supresorami i kontrolerami trwających odpowiedzi immunologicznych3. Spolaryzowane makrofagi wykazują wyraźną regulację metabolizmu komórkowego, a makrofagi M1 aktywowane przez LPS przechodzą przemianę metaboliczną na zwiększoną glikolizę4-6. I odwrotnie, zwiększone utlenianie kwasów tłuszczowych (FAO) i mitochondrialna fosforylacja oksydacyjna (OXPHOS) zapewniają trwałą energię w makrofagach M2 indukowanych przez IL-47-9. Tak więc zmieniony metabolizm jest nie tylko cechą spolaryzowanych podzbiorów makrofagów, ale jest również warunkiem wstępnym prawidłowej polaryzacji i regulacji stanu zapalnego. Co ważne, wykazano, że hamowanie glikolizy lub OXPHOS/FAO upośledza aktywację M1 lub M2, odpowiednio8,10. W związku z tym identyfikacja zmian metabolicznych w makrofagach może być stosowana jako narzędzie do oceny ich stanu polaryzacji i potencjału zapalnego.

Spójny test, który mierzy metabolizm makrofagów, mógłby być zatem wykorzystany do przewidywania, czy lek, powalenie genu lub inne leczenie wpływa na polaryzację i funkcję makrofagów. W tym filmie analizator strumienia zewnątrzkomórkowego jest używany do scharakteryzowania profili bioenergetycznych naiwnych makrofagów M1 i M2.

Ten manuskrypt szczegółowo opisuje zoptymalizowany protokół, który pozwala na pomiar wszystkich istotnych parametrów glikolizy (glikoliza, maksymalna glikoliza i rezerwa glikolityczna) oraz charakterystyki funkcji mitochondriów (oddychanie całkowite, podstawowe oddychanie mitochondrialne, produkcja ATP, wyciek protonów, maksymalne oddychanie i zapasowa pojemność oddechowa) w jednym teście. Korzystając z tego zestawu doświadczalnego, bioenergetyka może być porównana między komórkami kontrolnymi i "zmienionymi" (np. knock down, nadekspresja transgeniczna lub leczenie farmakologiczne).

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla i polaryzacja makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego

  1. Dzień 0: Wyizoluj kości udowe i piszczelowe od 6-10 tygodniowych myszy będących przedmiotem zainteresowania (C57Bl / 6 w tym teście).
  2. Usuń tkankę mięśniową z kości i umieść kości w 9-centymetrowej szalce Petriego wypełnionej lodowatym PBS.
  3. Przenieś kości na 9-centymetrową szalkę Petriego wypełnioną 70% etanolem i delikatnie potrząsaj płytką przez 30 sekund.
  4. Przenieś kości na świeżą 9 cm szalkę Petriego wypełnioną lodowato zimnym sterylnym PBS.
  5. Przetnij kość udową i piszczelową na obu końcach sterylnymi nożyczkami.
  6. Przepłukać kości 10 ml lodowatego sterylnego PBS za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml i igły 25 G. Zebrać szpik kostny do probówki o pojemności 50 ml.
  7. Przenieść komórki szpiku kostnego do nowej probówki o pojemności 50 ml za pomocą igły 23 G.
  8. Powtórz ten krok z igłą 25 G. Uwaga: Te kroki są potrzebne do usunięcia grudek komórek i resztek kostnych.
  9. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  10. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 40 ml pożywki kondycjonowanej komórkami (RPMI-1640 plus 2 mM L-glutamina, 10% FCS, penicylina (100 U/ml), streptomycyna (100 μg/ml) i 15% przefiltrowana pożywka kondycjonowana komórkami L-929 (ATCC, CCL-1) zawierająca M-CSF (lub alternatywnie 10 ng/ml rekombinowanego M-CSF zamiast pożywki kondycjonowanej komórkowo L-929).
    Uwaga: Generacja pożywki kondycjonowanej komórkami L-929 została szczegółowo opisana wcześniej w tym czasopiśmie w 2013 roku. 11
  11. Wyhodować komórki jednej myszy na dwóch 15-centymetrowych szalkach Petriego (nie używać płytek poddanych działaniu hodowli komórkowych, ponieważ makrofagi nie oderwą się od tego tworzywa sztucznego) w 20 ml pożywki hodowlanej na płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  12. Dodać 10 ml świeżej pożywki do hodowli komórkowych w dniu 3, nie usuwając 20 ml starszej pożywki do hodowli komórkowych.
  13. Zastąp starą pożywkę z każdej płytki 20 ml świeżej pożywki hodowlanej w dniu 6. W ten sposób zostaną również usunięte nieprzylegające komórki.
  14. Dzień 8:
    1. Oderwać komórki, inkubując je przez 5 minut w temperaturze 37 °C w 10 ml soli fizjologicznej z cytrynianu (135 mM chlorku potasu plus 15 mM cytrynianu sodu wH2O, autoklawizowany) i przemyć 10 ml PBS. Policz dojrzałe makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego (BMDM) w dniu 8 za pomocą licznika komórek.
    2. Sprawdzić tworzenie się dojrzałego (CD11b+ F4/80+) BMDM za pomocą oględzin lub cytometrii przepływowej. Zablokuj 105 komórek z 1/100 anty-CD16/CD32 w PBS przez 20 minut w 100 μl PBS, inkubuj z 1/200 anty-CD11b-FITC plus 1/200 anty-F4/80-APC-Cy7 w temperaturze RT, przemyj i przeanalizuj za pomocą cytometrii przepływowej.
      Uwaga: Hodowla makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego myszy została szczegółowo opublikowana wcześniej w tym czasopiśmie przez Ying i wsp.Rozdział 11.
  15. Zasiej 50 000 komórek (optymalna liczba komórek musi być zoptymalizowana) na basenie w mikropłytce do hodowli komórkowej w 100 μl pożywki hodowlanej. Nie należy umieszczać komórek w dołkach korekcyjnych w tle (A1, A12, H1, H12) i umieszczać w nich tylko pożywkę (bez komórek). Wskazówka: Trzymaj pipetę pod kątem mniej więcej do połowy boku studzienek, aby uzyskać najbardziej jednorodną warstwę komórek.
  16. Pozwól komórkom osiąść w temperaturze pokojowej w kapturze do hodowli komórkowych przez 1 godzinę. Zapewni to równomierne rozmieszczenie komórek i zmniejszy efekty krawędziowe. Monitorować przestrzeganie zaleceń za pomocą mikroskopu i hodowli w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  17. Trzy godziny po posianiu stymuluj komórki przez 24 godziny za pomocą 10 ng / ml LPS lub 20 ng / ml rekombinowanej myszy IL-4 w celu wytworzenia odpowiednio makrofagów M1 lub M2. Uwzględnij nieleczone wcześniej (M0) makrofagi jako kontrolę. Oceń prawidłową polaryzację makrofagów M1 i M2, mierząc indukowane przez LPS wydzielanie IL-6, IL-12, TNF (ELISA) i indukowanej przez IL-4 aktywności arginazy-1 i/lub ekspresji powierzchniowej MMR (CD206) i MGL (CD301) (cytometria przepływowa), jak opisano wcześniej3,11.
    Uwaga: W tym momencie komórki mogą być (wstępnie) traktowane interesującymi związkami farmakologicznymi lub makrofagi mogą być stymulowane innymi czynnikami. Ponieważ różnice między oddzielnymi studzienkami mogą być znaczne, zaleca się stosowanie co najmniej 4, a najlepiej 6 studzienek na warunek.

2. Przygotowanie testu strumienia zewnątrzkomórkowego

  1. Uwodnij wkład czujnika na dzień przed uruchomieniem testu:
    1. Umieść wkład czujnika do góry nogami obok tabliczki użytkowej.
    2. Napełnij każdą studzienkę płytki użytkowej roztworem kalibru 200 μl i opuść wkład czujnika na płytkę użytkową, zanurzając czujniki w roztworze kalibru.
    3. Sprawdź, czy poziom roztworu kalibru jest wystarczająco wysoki, aby czujniki były zanurzone i umieść w inkubatorze O/N o temperaturze 37 °C bez emisjiCO2.
  2. Przygotować pożywkę do oznaczania w dniu oznaczania w następujący sposób:
    1. Podgrzej 50 ml pożywki bazowej XF do temperatury 37 °C.
    2. Dodaj 500 μl 200 mM L-glutaminy, aby uzyskać końcowe stężenie 2 mM.
    3. Doprowadzić pH do 7,4 za pomocą 1 N NaOH i wysterylizować filtrem 0,2 μM i utrzymać pożywkę testową w temperaturze 37 °C.
  3. Delikatnie usunąć pożywkę do hodowli komórkowych ze spolaryzowanych makrofagów i przechowywać ją w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości (np. test ELISA w celu zbadania prawidłowej polaryzacji makrofagów). Przemyć komórki 100 μl pożywki do oznaczania, dodać 180 μl pożywki do oznaczania do studzienki i sprawdzić pod mikroskopem, czy komórki nie zostały wypłukane. Umieścić płytkę do hodowli komórkowej w inkubatorze o temperaturze 37 °C bez CO2 na 1 godzinę przed testem.
  4. Przygotować 10 x mieszaniny związków do wstrzykiwań od A do D, jak opisano w tabeli 1, ogrzać do temperatury 37 °C, dostosować pH do 7,4 i wysterylizować filtr.
    1. Przygotuj wszystkie związki w tych mieszaninach przy 10-krotnym stężeniu końcowym w studzienkach hodowli komórkowej i zoptymalizuj te stężenia dla każdego typu komórek.
  5. Załaduj wkład czujnika, korzystając z dostarczonych prowadnic ładowania ze wskazanymi objętościami (Tabela 1) przygotowanych 10 mieszanin związków iniekcyjnych odpowiednio w portach A, B, C i D.
Mieszanina/Iniekcja Związki Objętość dodana w celu uzyskania 10x mieszaniny (μl) Pożywka do oznaczania objętościowego (ml) Objętość wstrzykiwana podczas pracy (μl) Stężenie końcowe w teście ZA 2,5 mln (45%) glukozy 300 szt. 2.7 20 25 mM W 5 mM oligomycyna A (OM) 9 Wersja 3.0 22 Rozdział 22 1,5 μM Z 5 mM FCCP 9 2.7 25 1,5 μM 100 mM roztwór pirogronianu sodu 300 szt. 1 mM D 5 mM antymycyny A (AA) 15 Wersja 3.0 28 2,5 μM 5 mM rotenon (Rot) 7,5 1,25 μM

Tabela 1. Mieszaniny iniekcyjne.

3. Charakterystyka bioenergetyczna spolaryzowanych M1 i M2 BMDM za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego

  1. Utwórz szablon testu za pomocą kreatora testu z 2-minutowymi czasami MIX i 3-minutowymi czasami pomiaru oraz (co najmniej) 3 pętlami pomiarów mieszania i szybkości przed każdym z 4 wstrzyknięć (Tabela 1) i po ostatnim wstrzyknięciu.
    Uwaga: Stężenia te są ważne dla makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego i linii komórkowych makrofagów Raw264.7, ale powinny być zoptymalizowane dla każdego typu komórek. Dodanie pirogronianu do mieszaniny FCCP jest potrzebne do zapewnienia maksymalnego oddychania.
  2. Rozpocznij bieg, naciskając dolny start i postępuj zgodnie z instrukcjami urządzenia. Najpierw załaduj płytkę wkładu uwodnionymi sondami, aby umożliwić kalibrację za pomocą aparatury, a następnie załaduj płytkę ogniwa.
  3. Po wykonaniu testu należy ostrożnie wyrzucić całą pożywkę testową i przechowywać analizowaną mikropłytkę do hodowli komórkowej w temperaturze -20 °C w celu przyszłej normalizacji komórek przy użyciu zestawu do oznaczania proliferacji komórek, zgodnie ze szczegółowym opisem dostawcy.
    1. Krótko mówiąc, przygotuj 1x bufor do lizy komórek, rozcieńczając składnik B 20-krotnie w wodzie destylowanej i rozcieńczając związek A 400-krotnie w 1x buforze do lizy komórek. Dodać 200 μl na studzienkę, inkubować 5 minut w temperaturze RT i zmierzyć fluorescencję z ~180 nm wzbudzeniem i ~520 nm maksimum emisji.
      Uwaga: Podczas pracy z komórkami, które nie przylegają do zaleceń lekarskich lub jeśli problemem jest słabe przyleganie, zestaw do bezpośredniej proliferacji komórek może być używany jako alternatywa, ponieważ protokół ten nie wymaga odrzucenia całej pożywki testowej. Jednak ten bezpośredni protokół jest nieco mniej czuły w porównaniu z protokołem używanym w tym laboratorium.
  4. Po pomiarze fluorescencji znormalizuj liczbę komórek w każdym studzience w stosunku, w którym średnia liczba komórek we wszystkich naiwnych studzienkach makrofagów jest ustalona na 1,
    Uwaga: Kwantyfikacja białek (np. przy użyciu testu BCA) może być stosowana jako alternatywny sposób normalizacji liczby komórek. Jednak w naszych rękach ten test był mniej czuły w porównaniu z zestawem do testowania proliferacji komórek.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po zakończeniu badania strumienia zewnątrzkomórkowego i kwantyfikacji komórek, dane mogą być znormalizowane dla liczby komórek i przeanalizowane. Zazwyczaj daje to wykresy ECAR i OCR, jak pokazano na rysunkach 1A i 1B.

Po wstrzyknięciu glukozy (A), wzrost ECAR reprezentuje szybkość glikolizy. Dodatkowy wzrost ECAR po zahamowaniu syntazy ATP za pomocą oligomycyny (B) dostarcza informacji o rezerwie glikolitycznej i pojemności (Figura 1A). Analizując wartości OCR, iniekcja oligomycyny (B) pozwala na obliczenie zużycia tlenu wykorzystywanego do syntezy mitochondrialnego ATP. FCCP (C) rozłącza oddychanie mitochondrialne, a odpowiednie pomiary OCR dostarczają danych o maksymalnej i wolnej pojemności oddechowej. Wreszcie, wstrzyknięcie rotenonu (Rot) i antymycyny A (AA) blokuje kompleks mitochondrialny I i III, a resztkowy OCR reprezentuje niemitochondrialne zużycie tlenu (Figura 1B).

figure-results-1
Rycina 1: Parametry metaboliczne uzyskane z testu XF Zewnątrzkomórkowy przepływ. (A) Na podstawie wartości ECAR (w mpH/min) oblicza się następujące parametry glikolizy komórkowej: glikoliza, maksymalna pojemność glikolityczną i rezerwa glikolityczna. (B) Pomiary OCR (w pMoles/min) służą do obliczania kolejnych podstawowych parametrów funkcji mitochondriów: oddychania podstawowego, produkcji ATP, wycieku protonów, maksymalnego oddychania i wolnej pojemności oddechowej. Gluc = glukoza; OM = oligomycyna A; FCCP = 4-(trifluorometoksy)fenylohydrazon cyjanku karbonylu; AA = antymycyna A; Rot = Rotenone Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Po przeprowadzeniu, pomiary ECAR i OCR od 1 do 15 dla każdego dołka mogą być eksportowane do Excela, a następujące parametry glikolityczne mogą być obliczane na podstawie pomiarów ECAR w następujący sposób:

Zakwaszenie nieglikolityczne = śr. ECAR(1,2,3)

Glikoliza = średnia ECAR(4,5,6)– średnia ECAR(1,2,3)

Maksymalna pojemność glikolityczną = średnia ECAR(7,8,9)– średnia ECAR(1,2,3)

Rezerwa glikolityczna= średnia ECAR(7,8,9) - średnia ECAR(4,5,6)

Na podstawie wskaźników OCR można określić następujące cechy metaboliczne:

Oddychanie niemitochondrialne = średnia OCR(13,14,15)

Oddychanie podstawowe = średnia OCR(4,5,6) - średnia OCR(13,14,15)

Produkcja ATP = średnia OCR(4,5,6) - średnia OCR(7,8,9)

Wyciek protonów = średnia OCR(7,8,9) - średnia OCR(13,14,15)

Maksymalne oddychanie = średnia OCR(10,11,12) - średnia OCR(13,14,15)

Zapasowa pojemność oddechowa (SRC) = średnia OCR(10,11,12) - średnia OCR(4,5,6)

figure-results-2
Rycina 2: Charakterystyka metaboliczna makrofagów spolaryzowanych naiwnie (M0), LPS- (M1) i IL-4- (M2). Dla każdego pomiaru przedstawiono średnią i błąd standardowy średniej (SEM) z 8 pojedynczych studzienek. (A) Wskaźniki zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR, w mpH/min) i (B) wskaźniki zużycia tlenu (OCR, w pMoles/min) są mierzone dla różnie spolaryzowanych (M1 i M2) i naiwnych makrofagów (M0). Wszystkie pomiary zostały znormalizowane pod kątem liczby komórek (mierzonej za pomocą CyQUANT), a średnia liczba komórek naiwnych makrofagów została ustalona na poziomie 1. Wstrzyknięcie A = glukoza; B = oligomycyna; C = FCCP; D = antymycyna A + rotenon. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Jak pokazano na rysunku 2A, aktywacja makrofagów za pomocą LPS indukuje zwiększony metabolizm glikolityczny. Różnice między makrofagami traktowanymi LPS i IL-4 są jeszcze bardziej widoczne, gdy spojrzymy na wskaźniki zużycia tlenu (OCR) na rysunku 2B. Rzeczywiście, podczas gdy maksymalny metabolizm oksydacyjny jest silnie stłumiony w M (LPS), IL-4 indukuje oddychanie podstawowe, a zwłaszcza maksymalne w makrofagach M2. Należy zauważyć, że zwiększony glikolit jest raczej unikalny dla makrofagów M (LPS) i niekoniecznie jest cechą makrofagów M1, ponieważ makrofagi M (IFNγ) nie wykazują zwiększonej glikolizy.

Ogólnie rzecz biorąc, ta analiza strumienia zewnątrzkomórkowego pokazuje, że makrofagi M2 indukowane przez IL-4 charakteryzują się zwiększonym metabolizmem oksydacyjnym, a zwłaszcza wysoką zapasową pojemnością oddechową (SRC), podczas gdy makrofagi aktywowane LPS wykazują zwiększony metabolizm glikolityczny i nie posiadają żadnej wolnej pojemności oddechowej.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem naszego laboratorium jest zrozumienie, w jaki sposób można wpływać na polaryzację i funkcję makrofagów, a ostatecznym celem jest poprawa wyników miażdżycy i innych stanów zapalnych12. Aby ocenić polaryzację makrofagów, zazwyczaj mierzy się indukowaną przez LPS (+ IFNγ) i indukowaną IL-4 ekspresję genów markerów M1 i M2 (qPCR), określa wydzielanie IL-6, IL-12, TNF i NO (za pomocą reakcji ELISA i Griessa) oraz bada indukowaną przez IL-4 ekspresję powierzchniową CD71, CD206, CD273 i CD301 (za pomocą cytometrii przepływowej) oraz aktywność arginazy3,13. Dodatkowo można przeprowadzić testy apoptozy (przez barwienie Aneksyną-V / PI), testy fagocytozy (z fluorescencyjnymi kulkami lateksowymi i / lub pHrodo E. coli) i testy tworzenia komórek piankowatych (przez wychwyt DiI-oxLDL, barwienie neutralnymi lipidami LipidTOX) w celu oceny funkcjonalności makrofagów14. Dodatkowo, analiza strumienia zewnątrzkomórkowego może być przeprowadzona w celu zmierzenia profili bioenergetycznych spolaryzowanych makrofagów jako nowy i alternatywny odczyt funkcjonalny.

Ten manuskrypt pokazuje, że polaryzacja makrofagów indukuje przeprogramowanie metaboliczne, a makrofagi indukowane przez LPS przełączają się na zwiększoną glikolizę jako źródło energii. I odwrotnie, makrofagi M2 indukowane przez IL-4 wykorzystują mitochondrialną fosforylację oksydacyjną jako główne źródło ATP. Co ważne, przeprogramowanie metaboliczne nie tylko dostarcza energii na szczególne wymagania makrofagów spolaryzowanych M1 i M2. Rzeczywiście, zmiany metaboliczne wpływają na stężenia metabolitów, które są bezpośrednimi regulatorami fenotypu makrofagów 10,15,16. W związku z tym metabolizm makrofagów jest nie tylko cechą charakterystyczną (jak pokazano na rysunku 2), ale także czynnikiem napędzającym różne stany polaryzacji makrofagów, a ta nowa wiedza wspierała szybki rozwój obszaru badań nad immunometabolizmem w ciągu ostatnich kilku lat.

Jednak dokładne pomiary profili metabolicznych makrofagów pozostały trudne i miały swoje ograniczenia. W tym badaniu analizator strumienia zewnątrzkomórkowego jest stosowany do solidnego pomiaru glikolizy, rezerwy glikolitycznej, maksymalnej pojemności glikolitycznej, zakwaszenia nieglikolitycznego, oddychania podstawowego i maksymalnego, produkcji ATP, wolnej pojemności oddechowej, wycieku protonów i oddychania niemitochondrialnego w czasie rzeczywistym przy minimalnej ilości makrofagów.

Dlatego zmodyfikowaliśmy i ulepszyliśmy protokoły producenta w następujący sposób. Standardowy test wysiłkowy Mito (# 103015-100) sugeruje użycie pożywki z glukozą i pirogronianem oraz protokołu z 3 wstrzyknięciami (OM, FCCP, AA/Rot). Decydujemy się rozpocząć test od podłoża wolnego od glukozy/pirogronianu, dodać glukozę jako pierwsze wstrzyknięcie do portu A (jak w teście stresu glikolizy # 103020-100) i dodać pirogronian razem z rozłącznikiem FCCP w porcie C. W ten sposób wszystkie istotne parametry glikolizy pochodzą z pomiarów ECAR 1-9, a wszystkie istotne informacje o funkcji mitochondriów z pomiarów OCR 4-15.

Należy pamiętać, że bardzo ważne jest wstrzykiwanie pirogronianu razem z FCCP, aby zapewnić maksymalne oddychanie po rozłączeniu. Przed zastosowaniem tego połączonego protokołu należy również sprawdzić, czy 2-Deoksy-D-Glucose (2-DG) obniża poziomy ECAR po teście do wartości podstawowych (1-3) i czy zarejestrowane wskaźniki ECAR 4-6 są rzeczywiście spowodowane glikolizą. Ponadto należy zrozumieć, że stężenia związków i liczby komórek użyte w tym manuskrypcie są ważne dla makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego i linii komórkowych makrofagów Raw264.7 i powinny być zoptymalizowane dla innych typów komórek. Ponadto należy zauważyć, że M-CSF, który jest używany do generowania makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego, promuje fenotyp przeciwzapalny podobny do M2. Przedstawione wyniki dotyczące makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego mogą zatem nie być w pełni porównywalne z pomiarami z pierwotnymi makrofagami rezydującymi w tkankach lub liniami komórkowymi makrofagów, które nie wymagają M-CSF podczas hodowli komórek.

W porównaniu z istniejącymi metodami, protokół ten wymaga minimalnych ilości makrofagów i szybko zapewnia praktycznie wszystkie podstawowe cechy metaboliczne komórek. Powoduje to wystarczającą nadwyżkę komórek do przeprowadzenia innych testów immunologicznych, a nawet komórki użyte do profilowania bioenergetycznego mogą być nadal wykorzystywane do innych celów po teście. Co więcej, specjalny format płytki 96-dołkowej pozwala na ocenę wielu warunków w czasie rzeczywistym w tym samym czasie. Jednak różnice między poszczególnymi studniami mogą być znaczne, dlatego często pożądane jest użycie co najmniej 4 studni na warunek. Biorąc pod uwagę to ograniczenie, opisana analiza strumienia zewnątrzkomórkowego nadal pozwala na przeprowadzenie jednocześnie więcej niż 10 warunków eksperymentalnych (n = 6), czyli znacznie więcej niż w przypadku tradycyjnych technik.

Ogólnie rzecz biorąc, ten artykuł zawiera łatwy i powtarzalny test funkcjonalny, który umożliwia pomiar wszystkich istotnych parametrów glikolizy i mitochondriów w spolaryzowanych podzbiorach makrofagów. Technika ta może służyć jako przyszłe zastosowanie do oceny funkcji makrofagów i oceny wpływu różnych manipulacji (np. knock down, nowych leków itp.) na fenotyp (metaboliczny) makrofagów. W związku z tym dane dotyczące strumienia zewnątrzkomórkowego mogą być wykorzystywane w połączeniu z innymi testami, aby umożliwić dogłębną charakterystykę stanu aktywacji makrofagów.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bezpłatny dostęp do tego artykułu jest sponsorowany przez Seahorse Bioscience.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jan Van den Bossche otrzymał stypendium podoktorskie od Netherlands Heart Foundation (2013T003) oraz stypendium VENI od ZonMW (91615052). Menno de Winther jest uznanym badaczem w Netherlands Heart Foundation (2007T067), jest wspierany przez grant Netherlands Heart Foundation (2010B022) i posiada stypendium AMC. Dziękujemy również za wsparcie ze strony Holenderskiej Inicjatywy Badań nad Układem Sercowo-Naczyniowym, Holenderskiej Federacji Uniwersyteckich Centrów Medycznych, Holenderskiej Organizacji Badań i Rozwoju Zdrowia oraz Królewskiej Holenderskiej Akademii Nauk dla projektu GENIUS "Generowanie najlepszych opartych na dowodach celów farmaceutycznych dla miażdżycy" (CVON2011-19). Dziękujemy firmie Seahorse Bioscience za umożliwienie publikacji w otwartym dostępie. Autorzy dziękują Riekeltowi Houtkooperowi i Vincentowi de Boerowi (Laboratorium Genetycznych Chorób Metabolicznych, Akademickie Centrum Medyczne, Amsterdam, Holandia) za wszelką wcześniejszą pomoc przy analizatorze Seahorse.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Igły 23G i 25GBecton Dickinson#300800 i #300600Do zaczerwienionego szpiku kostnego
Strzykawki 10 mlBecton Dickinson#307736Do zaczerwienionego szpiku kostnego
szalki PetriegoGreiner#639161Do hodowli komórek szpiku kostnego
Zestaw do oznaczania proliferacji komórek CyQUANT Sondy molekularne#C7026Do kwantyfikacji komórek w późniejszym czasie (działa tylko w przypadku komórek przylegających)
Zestaw do bezpośredniego testu proliferacji komórek CyQUANT Sondy molekularne#35011Do oznaczania ilościowego komórek bezpośrednio po teście (komórki nieprzylegające)
XFe96 mikropłytka do hodowli komórkowejSeahorse Bioscience#101085-00496-dołkowa płytka, w której hoduje się komórki i w której przeprowadza się
test rekombinowana mysia interleukina-4 (IL-4)Peprotech#214-14-BSłuży do indukowania alternatywnej aktywacji
makrofagówlipopolisacharyd (LPS)Sigma#L2637Prozapalny bodziec
Wkład czujnika konika morskiego Seahorse Bioscience#102416-100Zawiera sondy do pomiaru pH i O2
Seahorse XF Calibrant Seahorse Bioscience#100840-000Potrzebne do nawodnienia sond przez noc 
Podstawa XF średnia Seahorse Bioscience#102353-100Pożywka bez buforu, która umożliwia skuteczny pomiar zmian pH
L-glutaminaLife Technologies#25030-081
D-(+)-glukozaSigma#G8769Napędza glikolizę po dodaniu do komórek
oligomycyna ASigma#75351Hamuje mitochondrialną syntazę ATP
FCCP ( 4-(trifluorometoksy cyjanku karbonylu)fenylohydrazon)Sigma#C2920Rozprzęga oddychanie mitochondrialne
100 mM roztwór pirogronianu soduLonza#BE13-115EUmożliwia maksymalne oddychanie mitochondrialne bez konieczności glikolizy
Antymycyna ASigma#BE13-115EA8674Hamuje kompleks III mitochondriów
RotenonSigma#BE13-115EA8674R8875Hamuje kompleks I mitochondria
Casy Cell Counter RocheDiagnostics#05 651 697 001Przyrząd do liczenia komórek
anty-CD16/CD32eBioscience#14-0161Cytometria przepływowa blokowa receptora Fc
anty-F4/80-APC-eFluor780eBioscience#47-4801Przeciwciało do barwienia makrofagów
anty-CD11b-FITCeBioscience#11-0112Przeciwciało przeciwko makrofagom barwiącym

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41, 14-20 (2014).
  2. Hoeksema, M. A., et al. IFN gamma Priming of Macrophages Represses a Part of the Inflammatory Program and Attenuates Neutrophil Recruitment. J Immunol. , (2015).
  3. Vanden Bossche, J., et al. Pivotal Advance Arginase 1 independent polyamine production stimulates the expression of IL 4 induced alternatively activated macrophage markers while inhibiting LPS-induced expression of inflammatory genes. Journal of leukocyte biology. 91, 685-699 (2012).
  4. Pearce, E. L., Pearce, E. J. Metabolic pathways in immune cell activation and quiescence. Immunity. 38, 633-643 (2013).
  5. Yang, L., et al. PKM2 regulates the Warburg effect and promotes HMGB1 release in sepsis. Nature communications. 5, 4436(2014).
  6. Freemerman, A. J., et al. Metabolic reprogramming of macrophages glucose transporter 1 (GLUT1) mediated glucose metabolism drives a proinflammatory phenotype. The Journal of biological chemistry. 289, 7884-7896 (2014).
  7. Tavakoli, S., Zamora, D., Ullevig, S., Asmis, R. Bioenergetic profiles diverge during macrophage polarization implications for the interpretation of 18F FDG PET imaging of atherosclerosis. J Nucl Med. 54, 1661-1667 (2013).
  8. Vats, D., et al. Oxidative metabolism and PGC 1beta attenuate macrophage mediated inflammation. Cell metabolism. 4, 13-24 (2006).
  9. Huang, S. C., et al. Cell intrinsic lysosomal lipolysis is essential for alternative activation of macrophages. Nature immunology. 15, 846-855 (2014).
  10. Tannahill, G. M., et al. Succinate is an inflammatory signal that induces IL 1beta through HIF 1alpha. Nature. 496, 238-242 (2013).
  11. Ying, W., Cheruku, P. S., Bazer, F. W., Safe, S. H., Zhou, B. Investigation of macrophage polarization using bone marrow derived macrophages. J Vis Exp. (76), (2013).
  12. Hoeksema, M. A., et al. Targeting macrophage Histone deacetylase 3 stabilizes atherosclerotic lesions. EMBO Mol Med. 6, 1124-1132 (2014).
  13. Vanden Bossche, J., et al. Alternatively activated macrophages engage in homotypic and heterotypic interactions through IL 4 and polyamine induced E cadherin catenin complexes. Blood. 114, 4664-4674 (2009).
  14. Van den Bossche, J., et al. Inhibiting epigenetic enzymes to improve atherogenic macrophage functions. Biochem Biophys Res Commun. 455, 396-402 (2014).
  15. Galvan Pena, S., O Neill, L. A. Metabolic reprograming in macrophage polarization. Frontiers in immunology. 5, 420(2014).
  16. Zhu, L., Zhao, Q., Yang, T., Ding, W., Zhao, Y. Cellular metabolism and macrophage functional polarization. International reviews of immunology. 34, 82-100 (2015).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Polaryzacja makrofag w M1polaryzacja makrofag w M2metabolizm glikolitycznymitochondrialny metabolizm oksydacyjnytempo zu ycia tlenutempo zakwaszenia zewn trzkom rkowegorezerwowa zdolno oddechowaanaliza metaboliczna w czasie rzeczywistym

Powiązane artykuły