Charakterystyka metaboliczna spolaryzowanych makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego M1 i M2 przy użyciu analizy strumienia zewnątrzkomórkowego w czasie rzeczywistym

Podsumowanie

Przeprogramowanie metaboliczne jest cechą charakterystyczną i warunkiem wstępnym polaryzacji makrofagów M1 i M2. Niniejszy manuskrypt opisuje test do pomiaru podstawowych parametrów glikolizy i funkcji mitochondriów w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy. Narzędzie to można zastosować do zbadania, w jaki sposób poszczególne czynniki wpływają na metabolizm i fenotyp makrofagów.

Streszczenie

Specyficzne szlaki metaboliczne są coraz częściej uznawane za kluczowe cechy charakterystyczne podzbiorów makrofagów. Podczas gdy indukowane klasycznie aktywowane makrofagi M1 lub M _(LPS) indukowane przez LPS są prozapalne, IL-4 indukuje alternatywną aktywację makrofagów, a te tak zwane M2 lub M _(IL-4) wspomagają rozwiązywanie stanów zapalnych i gojenie się ran. Najnowsze dowody wskazują na kluczową rolę przeprogramowania metabolicznego w regulacji polaryzacji makrofagów M1 i M2.

W tym manuskrypcie analizator strumienia zewnątrzkomórkowego jest stosowany do oceny cech metabolicznych naiwnych, spolaryzowanych M1 i M2 makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego myszy. Ten instrument wykorzystuje czujniki pH i tlenu do pomiaru wskaźnika zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) i wskaźnika zużycia tlenu (OCR), które mogą być związane z glikolitycznym i mitochondrialnym metabolizmem oksydacyjnym. W związku z tym zarówno glikoliza, jak i mitochondrialny metabolizm oksydacyjny mogą być mierzone w czasie rzeczywistym w jednym teście.

Korzystając z tej techniki, pokazujemy tutaj, że zapalne makrofagi M1 wykazują zwiększony metabolizm glikolityczny i zmniejszoną aktywność mitochondriów. I odwrotnie, przeciwzapalne makrofagi M2 wykazują wysoką mitochondrialną fosforylację oksydacyjną (OXPHOS) i charakteryzują się zwiększoną wolną pojemnością oddechową (SRC).

Prezentowany test funkcjonalny służy jako ramy do zbadania, jak poszczególne cytokiny, związki farmakologiczne, nokautacje genów lub inne interwencje wpływają na fenotyp metaboliczny makrofagów i stan zapalny.

Wprowadzenie

Chociaż makrofagi odgrywają kluczową rolę w praktycznie wszystkich chorobach, mechanizmy molekularne regulujące ich fenotyp wciąż nie są w pełni odkryte. Makrofagi wykazują wysoką heterogeniczność i w odpowiedzi na mikrośrodowisko przyjmują różne^fenotypy1. Klasycznie aktywowane makrofagi M1 lub M_(LPS) indukowane LPS (+ IFNγ) sprzyjają stanowi zapalnemu i chronią gospodarza przed różnymi rodzajami zagrożeń mikrobiologicznych². Inni używają IFNγ samodzielnie lub w połączeniu z TNF jako bodźców do wywołania polaryzacji M1. IL-4 i/lub IL-13 indukuje alternatywną aktywację makrofagów, a te komórki M2 lub M _(IL-4) są silnymi supresorami i kontrolerami trwających odpowiedzi immunologicznych³. Spolaryzowane makrofagi wykazują wyraźną regulację metabolizmu komórkowego, a makrofagi M1 aktywowane przez LPS przechodzą przemianę metaboliczną na zwiększoną glikolizę^4-6. I odwrotnie, zwiększone utlenianie kwasów tłuszczowych (FAO) i mitochondrialna fosforylacja oksydacyjna (OXPHOS) zapewniają trwałą energię w makrofagach M2 indukowanych przez IL-4^7-9. Tak więc zmieniony metabolizm jest nie tylko cechą spolaryzowanych podzbiorów makrofagów, ale jest również warunkiem wstępnym prawidłowej polaryzacji i regulacji stanu zapalnego. Co ważne, wykazano, że hamowanie glikolizy lub OXPHOS/FAO upośledza aktywację M1 lub M2, odpowiednio^8,10. W związku z tym identyfikacja zmian metabolicznych w makrofagach może być stosowana jako narzędzie do oceny ich stanu polaryzacji i potencjału zapalnego.

Spójny test, który mierzy metabolizm makrofagów, mógłby być zatem wykorzystany do przewidywania, czy lek, powalenie genu lub inne leczenie wpływa na polaryzację i funkcję makrofagów. W tym filmie analizator strumienia zewnątrzkomórkowego jest używany do scharakteryzowania profili bioenergetycznych naiwnych makrofagów M1 i M2.

Ten manuskrypt szczegółowo opisuje zoptymalizowany protokół, który pozwala na pomiar wszystkich istotnych parametrów glikolizy (glikoliza, maksymalna glikoliza i rezerwa glikolityczna) oraz charakterystyki funkcji mitochondriów (oddychanie całkowite, podstawowe oddychanie mitochondrialne, produkcja ATP, wyciek protonów, maksymalne oddychanie i zapasowa pojemność oddechowa) w jednym teście. Korzystając z tego zestawu doświadczalnego, bioenergetyka może być porównana między komórkami kontrolnymi i "zmienionymi" (np. knock down, nadekspresja transgeniczna lub leczenie farmakologiczne).

Protokół

1. Hodowla i polaryzacja makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego

1. Dzień 0: Wyizoluj kości udowe i piszczelowe od 6-10 tygodniowych myszy będących przedmiotem zainteresowania (C57Bl / 6 w tym teście).
2. Usuń tkankę mięśniową z kości i umieść kości w 9-centymetrowej szalce Petriego wypełnionej lodowatym PBS.
3. Przenieś kości na 9-centymetrową szalkę Petriego wypełnioną 70% etanolem i delikatnie potrząsaj płytką przez 30 sekund.
4. Przenieś kości na świeżą 9 cm szalkę Petriego wypełnioną lodowato zimnym sterylnym PBS.
5. Przetnij kość udową i piszczelową na obu końcach sterylnymi nożyczkami.
6. Przepłukać kości 10 ml lodowatego sterylnego PBS za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml i igły 25 G. Zebrać szpik kostny do probówki o pojemności 50 ml.
7. Przenieść komórki szpiku kostnego do nowej probówki o pojemności 50 ml za pomocą igły 23 G.
8. Powtórz ten krok z igłą 25 G. Uwaga: Te kroki są potrzebne do usunięcia grudek komórek i resztek kostnych.
9. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
10. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 40 ml pożywki kondycjonowanej komórkami (RPMI-1640 plus 2 mM L-glutamina, 10% FCS, penicylina (100 U/ml), streptomycyna (100 μg/ml) i 15% przefiltrowana pożywka kondycjonowana komórkami L-929 (ATCC, CCL-1) zawierająca M-CSF (lub alternatywnie 10 ng/ml rekombinowanego M-CSF zamiast pożywki kondycjonowanej komórkowo L-929).
    Uwaga: Generacja pożywki kondycjonowanej komórkami L-929 została szczegółowo opisana wcześniej w tym czasopiśmie w 2013 roku. ¹¹
11. Wyhodować komórki jednej myszy na dwóch 15-centymetrowych szalkach Petriego (nie używać płytek poddanych działaniu hodowli komórkowych, ponieważ makrofagi nie oderwą się od tego tworzywa sztucznego) w 20 ml pożywki hodowlanej na płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
12. Dodać 10 ml świeżej pożywki do hodowli komórkowych w dniu 3, nie usuwając 20 ml starszej pożywki do hodowli komórkowych.
13. Zastąp starą pożywkę z każdej płytki 20 ml świeżej pożywki hodowlanej w dniu 6. W ten sposób zostaną również usunięte nieprzylegające komórki.
14. Dzień 8:
    1. Oderwać komórki, inkubując je przez 5 minut w temperaturze 37 °C w 10 ml soli fizjologicznej z cytrynianu (135 mM chlorku potasu plus 15 mM cytrynianu sodu w_H2O, autoklawizowany) i przemyć 10 ml PBS. Policz dojrzałe makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego (BMDM) w dniu 8 za pomocą licznika komórek.
    2. Sprawdzić tworzenie się dojrzałego (CD11b+ F4/80+) BMDM za pomocą oględzin lub cytometrii przepływowej. Zablokuj 10⁵ komórek z 1/100 anty-CD16/CD32 w PBS przez 20 minut w 100 μl PBS, inkubuj z 1/200 anty-CD11b-FITC plus 1/200 anty-F4/80-APC-Cy7 w temperaturze RT, przemyj i przeanalizuj za pomocą cytometrii przepływowej.
       Uwaga: Hodowla makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego myszy została szczegółowo opublikowana wcześniej w tym czasopiśmie przez Ying i wsp.^{Rozdział 11}.
15. Zasiej 50 000 komórek (optymalna liczba komórek musi być zoptymalizowana) na basenie w mikropłytce do hodowli komórkowej w 100 μl pożywki hodowlanej. Nie należy umieszczać komórek w dołkach korekcyjnych w tle (A1, A12, H1, H12) i umieszczać w nich tylko pożywkę (bez komórek). Wskazówka: Trzymaj pipetę pod kątem mniej więcej do połowy boku studzienek, aby uzyskać najbardziej jednorodną warstwę komórek.
16. Pozwól komórkom osiąść w temperaturze pokojowej w kapturze do hodowli komórkowych przez 1 godzinę. Zapewni to równomierne rozmieszczenie komórek i zmniejszy efekty krawędziowe. Monitorować przestrzeganie zaleceń za pomocą mikroskopu i hodowli w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO_{2 .}
17. Trzy godziny po posianiu stymuluj komórki przez 24 godziny za pomocą 10 ng / ml LPS lub 20 ng / ml rekombinowanej myszy IL-4 w celu wytworzenia odpowiednio makrofagów M1 lub M2. Uwzględnij nieleczone wcześniej (M0) makrofagi jako kontrolę. Oceń prawidłową polaryzację makrofagów M1 i M2, mierząc indukowane przez LPS wydzielanie IL-6, IL-12, TNF (ELISA) i indukowanej przez IL-4 aktywności arginazy-1 i/lub ekspresji powierzchniowej MMR (CD206) i MGL (CD301) (cytometria przepływowa), jak opisano wcześniej^3,11.
    Uwaga: W tym momencie komórki mogą być (wstępnie) traktowane interesującymi związkami farmakologicznymi lub makrofagi mogą być stymulowane innymi czynnikami. Ponieważ różnice między oddzielnymi studzienkami mogą być znaczne, zaleca się stosowanie co najmniej 4, a najlepiej 6 studzienek na warunek.

2. Przygotowanie testu strumienia zewnątrzkomórkowego

1. Uwodnij wkład czujnika na dzień przed uruchomieniem testu:
   1. Umieść wkład czujnika do góry nogami obok tabliczki użytkowej.
   2. Napełnij każdą studzienkę płytki użytkowej roztworem kalibru 200 μl i opuść wkład czujnika na płytkę użytkową, zanurzając czujniki w roztworze kalibru.
   3. Sprawdź, czy poziom roztworu kalibru jest wystarczająco wysoki, aby czujniki były zanurzone i umieść w inkubatorze O/N o temperaturze 37 °C bez emisji_CO2.
2. Przygotować pożywkę do oznaczania w dniu oznaczania w następujący sposób:
   1. Podgrzej 50 ml pożywki bazowej XF do temperatury 37 °C.
   2. Dodaj 500 μl 200 mM L-glutaminy, aby uzyskać końcowe stężenie 2 mM.
   3. Doprowadzić pH do 7,4 za pomocą 1 N NaOH i wysterylizować filtrem 0,2 μM i utrzymać pożywkę testową w temperaturze 37 °C.
3. Delikatnie usunąć pożywkę do hodowli komórkowych ze spolaryzowanych makrofagów i przechowywać ją w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości (np. test ELISA w celu zbadania prawidłowej polaryzacji makrofagów). Przemyć komórki 100 μl pożywki do oznaczania, dodać 180 μl pożywki do oznaczania do studzienki i sprawdzić pod mikroskopem, czy komórki nie zostały wypłukane. Umieścić płytkę do hodowli komórkowej w inkubatorze o temperaturze 37 °C bez CO₂ na 1 godzinę przed testem.
4. Przygotować 10 x mieszaniny związków do wstrzykiwań od A do D, jak opisano w tabeli 1, ogrzać do temperatury 37 °C, dostosować pH do 7,4 i wysterylizować filtr.
   1. Przygotuj wszystkie związki w tych mieszaninach przy 10-krotnym stężeniu końcowym w studzienkach hodowli komórkowej i zoptymalizuj te stężenia dla każdego typu komórek.
5. Załaduj wkład czujnika, korzystając z dostarczonych prowadnic ładowania ze wskazanymi objętościami (Tabela 1) przygotowanych 10 mieszanin związków iniekcyjnych odpowiednio w portach A, B, C i D.

Mieszanina/Iniekcja Związki Objętość dodana w celu uzyskania 10x mieszaniny (μl) Pożywka do oznaczania objętościowego (ml) Objętość wstrzykiwana podczas pracy (μl) Stężenie końcowe w teście ZA 2,5 mln (45%) glukozy 300 szt. 2.7 20 25 mM W 5 mM oligomycyna A (OM) 9 Wersja 3.0 22 Rozdział 22 1,5 μM Z 5 mM FCCP 9 2.7 25 1,5 μM 100 mM roztwór pirogronianu sodu 300 szt. 1 mM D 5 mM antymycyny A (AA) 15 Wersja 3.0 28 2,5 μM 5 mM rotenon (Rot) 7,5 1,25 μM

Tabela 1. Mieszaniny iniekcyjne.

3. Charakterystyka bioenergetyczna spolaryzowanych M1 i M2 BMDM za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego

1. Utwórz szablon testu za pomocą kreatora testu z 2-minutowymi czasami MIX i 3-minutowymi czasami pomiaru oraz (co najmniej) 3 pętlami pomiarów mieszania i szybkości przed każdym z 4 wstrzyknięć (Tabela 1) i po ostatnim wstrzyknięciu.
   Uwaga: Stężenia te są ważne dla makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego i linii komórkowych makrofagów Raw264.7, ale powinny być zoptymalizowane dla każdego typu komórek. Dodanie pirogronianu do mieszaniny FCCP jest potrzebne do zapewnienia maksymalnego oddychania.
2. Rozpocznij bieg, naciskając dolny start i postępuj zgodnie z instrukcjami urządzenia. Najpierw załaduj płytkę wkładu uwodnionymi sondami, aby umożliwić kalibrację za pomocą aparatury, a następnie załaduj płytkę ogniwa.
3. Po wykonaniu testu należy ostrożnie wyrzucić całą pożywkę testową i przechowywać analizowaną mikropłytkę do hodowli komórkowej w temperaturze -20 °C w celu przyszłej normalizacji komórek przy użyciu zestawu do oznaczania proliferacji komórek, zgodnie ze szczegółowym opisem dostawcy.
   1. Krótko mówiąc, przygotuj 1x bufor do lizy komórek, rozcieńczając składnik B 20-krotnie w wodzie destylowanej i rozcieńczając związek A 400-krotnie w 1x buforze do lizy komórek. Dodać 200 μl na studzienkę, inkubować 5 minut w temperaturze RT i zmierzyć fluorescencję z ~180 nm wzbudzeniem i ~520 nm maksimum emisji.
      Uwaga: Podczas pracy z komórkami, które nie przylegają do zaleceń lekarskich lub jeśli problemem jest słabe przyleganie, zestaw do bezpośredniej proliferacji komórek może być używany jako alternatywa, ponieważ protokół ten nie wymaga odrzucenia całej pożywki testowej. Jednak ten bezpośredni protokół jest nieco mniej czuły w porównaniu z protokołem używanym w tym laboratorium.
4. Po pomiarze fluorescencji znormalizuj liczbę komórek w każdym studzience w stosunku, w którym średnia liczba komórek we wszystkich naiwnych studzienkach makrofagów jest ustalona na 1,
   Uwaga: Kwantyfikacja białek (np. przy użyciu testu BCA) może być stosowana jako alternatywny sposób normalizacji liczby komórek. Jednak w naszych rękach ten test był mniej czuły w porównaniu z zestawem do testowania proliferacji komórek.

Wyniki

Po zakończeniu pomiaru strumienia zewnątrzkomórkowego i kwantyfikacji komórek, dane można znormalizować względem liczby komórek i poddać analizie. Zazwyczaj pozwoli to na uzyskanie wykresów ECAR i OCR, takich jak przedstawiono na Ryc. 1A i Ryc. 1B.

Po wstrzyknięciu glukozy (A) wzrost ECAR reprezentuje tempo glikolizy. Dodatkowy wzrost ECAR po zahamowaniu syntazy ATP oligomycyną (B) dostarcza informacji o rezerwie i wydolności glikolitycznej (Rycina 1A). Podczas analizy wartości OCR wstrzyknięcie oligomycyny (B) umożliwia obliczenie zużycia tlenu wykorzystywanego do mitochondrialnej syntezy ATP. FCCP (C) rozsprzęga oddychanie mitochondrialne, a odpowiadające mu pomiary OCR dostarczają danych o maksymalnej i zapasowej wydolności oddechowej. Na koniec wstrzyknięcie rotenonu (Rot) i antymycyny A (AA) blokuje kompleksy I i III mitochondriów, a pozostałe OCR reprezentuje pozamitochondrialne zużycie tlenu (Rycina 1B).

Rycina 1: Parametry metaboliczne uzyskane z testu XF Extracellular flux. (A) Następujące parametry glikolizy komórkowej są obliczane z wartości ECAR (w mpH/min): glikoliza, maksymalna wydolność glikolityczna i rezerwa glikolityczna. (B) Pomiary OCR (w pMoles/min) są wykorzystywane do obliczenia kolejnych podstawowych parametrów funkcji mitochondrialnej: oddychanie podstawowe, produkcja ATP, wyciek protonów, oddychanie maksymalne i rezerwowa wydolność oddechowa. Gluc = glukoza; OM = oligomycyna A; FCCP = cyjanian karbonylu 4-(trifluorometoksy)fenylohydrazonu; AA = antymycyna A; Rot = rotenon Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Po zakończeniu pomiaru wartości ECAR i OCR od 1 do 15 dla każdej studzienki można wyeksportować do programu Excel, a następnie na podstawie pomiarów ECAR obliczyć następujące parametry glikolityczne w poniższy sposób:

Zakwaszenie nieglikolityczne = średnie ECAR_(1,2,3)

Glikoliza = średni ECAR_(4,5,6) – średni ECAR_(1,2,3)

Maksymalna zdolność glikolityczna = średnia ECAR_(7,8,9)– średnia ECAR_(1,2,3)

Rezerwa glikolityczna = średni ECAR_(7,8,9) - średni ECAR_(4,5,6)

Na podstawie wskaźników OCR można określić następujące cechy metaboliczne:

Oddychanie pozimitochondrialne = średnie OCR_(13,14,15)

Oddychanie podstawowe = średnia OCR_(4,5,6) - średnia OCR_(13,14,15)

Produkcja ATP = średni OCR_(4,5,6) - średni OCR_(7,8,9)

Przeciek protonowy = średnia OCR_(7,8,9) - średnia OCR_(13,14,15)

Maksymalna respiracja = średni OCR_(10,11,12) - średni OCR_(13,14,15)

Rezerwowa wydolność oddechowa (SRC) = średnia OCR_(10,11,12) - średnia OCR_(4,5,6)

Rycina 2: Charakterystyka metaboliczna makrofagów naiwnych (M0) oraz spolaryzowanych LPS (M1) i IL-4 (M2). Dla każdego pomiaru przedstawiono średnią oraz błąd standardowy średniej (SEM) z 8 pojedynczych studzienek. (A) Zmierzono wskaźniki zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR, w mpH/min) oraz (B) wskaźniki zużycia tlenu (OCR, w pMoles/min) dla makrofagów różnie spolaryzowanych (M1 i M2) oraz naiwnych (M0). Wszystkie pomiary znormalizowano do liczby komórek (mierzonej za pomocą CyQUANT), przyjmując średnią liczbę komórek makrofagów naiwnych jako 1. Iniekcja A = glukoza; B = oligomycyna; C = FCCP; D= antymycyna A + rotenon. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Jak pokazano na Rysunku 2A, aktywacja makrofagów za pomocą LPS indukuje zwiększony metabolizm glikolityczny. Różnice między makrofagami traktowanymi LPS a tymi traktowanymi IL-4 są jeszcze bardziej widoczne przy analizie tempa zużycia tlenu (OCR) na Rysunku 2B. Rzeczywiście, podczas gdy maksymalny metabolizm oksydacyjny jest silnie stłumiony w M_(LPS), IL-4 indukuje respirację bazalną, a zwłaszcza maksymalną w makrofagach M2. Należy zauważyć, że zwiększona glikoliza jest raczej charakterystyczna dla makrofagów M_(LPS) i niekoniecznie jest cechą makrofagów M1, ponieważ makrofagi M_(IFNγ) nie wykazują nasilonej glikolizy.

Ogólnie rzecz biorąc, ta analiza strumienia zewnątrzkomórkowego wykazuje, że makrofagi M2 indukowane IL-4 charakteryzują się zwiększonym metabolizmem oksydacyjnym i zwłaszcza wysoką rezerwową wydolnością oddechową (SRC), podczas gdy makrofagi aktywowane LPS wykazują zwiększony metabolizm glikolityczny i nie posiadają żadnej rezerwowej wydolności oddechowej.

Dyskusja

Celem naszego laboratorium jest zrozumienie, w jaki sposób można wpływać na polaryzację i funkcję makrofagów, a ostatecznym celem jest poprawa wyników miażdżycy i innych stanów zapalnych¹². Aby ocenić polaryzację makrofagów, zazwyczaj mierzy się indukowaną przez LPS (+ IFNγ) i indukowaną IL-4 ekspresję genów markerów M1 i M2 (qPCR), określa wydzielanie IL-6, IL-12, TNF i NO (za pomocą reakcji ELISA i Griessa) oraz bada indukowaną przez IL-4 ekspresję powierzchniową CD71, CD206, CD273 i CD301 (za pomocą cytometrii przepływowej) oraz aktywność arginazy^3,13. Dodatkowo można przeprowadzić testy apoptozy (przez barwienie Aneksyną-V / PI), testy fagocytozy (z fluorescencyjnymi kulkami lateksowymi i / lub pHrodo E. coli) i testy tworzenia komórek piankowatych (przez wychwyt DiI-oxLDL, barwienie neutralnymi lipidami LipidTOX) w celu oceny funkcjonalności makrofagów¹⁴. Dodatkowo, analiza strumienia zewnątrzkomórkowego może być przeprowadzona w celu zmierzenia profili bioenergetycznych spolaryzowanych makrofagów jako nowy i alternatywny odczyt funkcjonalny.

Ten manuskrypt pokazuje, że polaryzacja makrofagów indukuje przeprogramowanie metaboliczne, a makrofagi indukowane przez LPS przełączają się na zwiększoną glikolizę jako źródło energii. I odwrotnie, makrofagi M2 indukowane przez IL-4 wykorzystują mitochondrialną fosforylację oksydacyjną jako główne źródło ATP. Co ważne, przeprogramowanie metaboliczne nie tylko dostarcza energii na szczególne wymagania makrofagów spolaryzowanych M1 i M2. Rzeczywiście, zmiany metaboliczne wpływają na stężenia metabolitów, które są bezpośrednimi regulatorami fenotypu makrofagów ^10,15,16. W związku z tym metabolizm makrofagów jest nie tylko cechą charakterystyczną (jak pokazano na rysunku 2), ale także czynnikiem napędzającym różne stany polaryzacji makrofagów, a ta nowa wiedza wspierała szybki rozwój obszaru badań nad immunometabolizmem w ciągu ostatnich kilku lat.

Jednak dokładne pomiary profili metabolicznych makrofagów pozostały trudne i miały swoje ograniczenia. W tym badaniu analizator strumienia zewnątrzkomórkowego jest stosowany do solidnego pomiaru glikolizy, rezerwy glikolitycznej, maksymalnej pojemności glikolitycznej, zakwaszenia nieglikolitycznego, oddychania podstawowego i maksymalnego, produkcji ATP, wolnej pojemności oddechowej, wycieku protonów i oddychania niemitochondrialnego w czasie rzeczywistym przy minimalnej ilości makrofagów.

Dlatego zmodyfikowaliśmy i ulepszyliśmy protokoły producenta w następujący sposób. Standardowy test wysiłkowy Mito (# 103015-100) sugeruje użycie pożywki z glukozą i pirogronianem oraz protokołu z 3 wstrzyknięciami (OM, FCCP, AA/Rot). Decydujemy się rozpocząć test od podłoża wolnego od glukozy/pirogronianu, dodać glukozę jako pierwsze wstrzyknięcie do portu A (jak w teście stresu glikolizy # 103020-100) i dodać pirogronian razem z rozłącznikiem FCCP w porcie C. W ten sposób wszystkie istotne parametry glikolizy pochodzą z pomiarów ECAR 1-9, a wszystkie istotne informacje o funkcji mitochondriów z pomiarów OCR 4-15.

Należy pamiętać, że bardzo ważne jest wstrzykiwanie pirogronianu razem z FCCP, aby zapewnić maksymalne oddychanie po rozłączeniu. Przed zastosowaniem tego połączonego protokołu należy również sprawdzić, czy 2-Deoksy-D-Glucose (2-DG) obniża poziomy ECAR po teście do wartości podstawowych (1-3) i czy zarejestrowane wskaźniki ECAR 4-6 są rzeczywiście spowodowane glikolizą. Ponadto należy zrozumieć, że stężenia związków i liczby komórek użyte w tym manuskrypcie są ważne dla makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego i linii komórkowych makrofagów Raw264.7 i powinny być zoptymalizowane dla innych typów komórek. Ponadto należy zauważyć, że M-CSF, który jest używany do generowania makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego, promuje fenotyp przeciwzapalny podobny do M2. Przedstawione wyniki dotyczące makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego mogą zatem nie być w pełni porównywalne z pomiarami z pierwotnymi makrofagami rezydującymi w tkankach lub liniami komórkowymi makrofagów, które nie wymagają M-CSF podczas hodowli komórek.

W porównaniu z istniejącymi metodami, protokół ten wymaga minimalnych ilości makrofagów i szybko zapewnia praktycznie wszystkie podstawowe cechy metaboliczne komórek. Powoduje to wystarczającą nadwyżkę komórek do przeprowadzenia innych testów immunologicznych, a nawet komórki użyte do profilowania bioenergetycznego mogą być nadal wykorzystywane do innych celów po teście. Co więcej, specjalny format płytki 96-dołkowej pozwala na ocenę wielu warunków w czasie rzeczywistym w tym samym czasie. Jednak różnice między poszczególnymi studniami mogą być znaczne, dlatego często pożądane jest użycie co najmniej 4 studni na warunek. Biorąc pod uwagę to ograniczenie, opisana analiza strumienia zewnątrzkomórkowego nadal pozwala na przeprowadzenie jednocześnie więcej niż 10 warunków eksperymentalnych (n = 6), czyli znacznie więcej niż w przypadku tradycyjnych technik.

Ogólnie rzecz biorąc, ten artykuł zawiera łatwy i powtarzalny test funkcjonalny, który umożliwia pomiar wszystkich istotnych parametrów glikolizy i mitochondriów w spolaryzowanych podzbiorach makrofagów. Technika ta może służyć jako przyszłe zastosowanie do oceny funkcji makrofagów i oceny wpływu różnych manipulacji (np. knock down, nowych leków itp.) na fenotyp (metaboliczny) makrofagów. W związku z tym dane dotyczące strumienia zewnątrzkomórkowego mogą być wykorzystywane w połączeniu z innymi testami, aby umożliwić dogłębną charakterystykę stanu aktywacji makrofagów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Igły 23G i 25G	Becton Dickinson	#300800 i #300600	Do zaczerwienionego szpiku kostnego
Strzykawki 10 ml	Becton Dickinson	#307736	Do zaczerwienionego szpiku kostnego
szalki Petriego	Greiner	#639161	Do hodowli komórek szpiku kostnego
Zestaw do oznaczania proliferacji komórek CyQUANT	Sondy molekularne	#C7026	Do kwantyfikacji komórek w późniejszym czasie (działa tylko w przypadku komórek przylegających)
Zestaw do bezpośredniego testu proliferacji komórek CyQUANT	Sondy molekularne	#35011	Do oznaczania ilościowego komórek bezpośrednio po teście (komórki nieprzylegające)
XFe96 mikropłytka do hodowli komórkowej	Seahorse Bioscience	#101085-004	96-dołkowa płytka, w której hoduje się komórki i w której przeprowadza się
test rekombinowana mysia interleukina-4 (IL-4)	Peprotech	#214-14-B	Służy do indukowania alternatywnej aktywacji
makrofagówlipopolisacharyd (LPS)	Sigma	#L2637	Prozapalny bodziec
Wkład czujnika konika morskiego	Seahorse Bioscience	#102416-100	Zawiera sondy do pomiaru pH i O2
Seahorse XF Calibrant	Seahorse Bioscience	#100840-000	Potrzebne do nawodnienia sond przez noc
Podstawa XF średnia	Seahorse Bioscience	#102353-100	Pożywka bez buforu, która umożliwia skuteczny pomiar zmian pH
L-glutamina	Life Technologies	#25030-081
D-(+)-glukoza	Sigma	#G8769	Napędza glikolizę po dodaniu do komórek
oligomycyna A	Sigma	#75351	Hamuje mitochondrialną syntazę ATP
FCCP ( 4-(trifluorometoksy cyjanku karbonylu)fenylohydrazon)	Sigma	#C2920	Rozprzęga oddychanie mitochondrialne
100 mM roztwór pirogronianu sodu	Lonza	#BE13-115E	Umożliwia maksymalne oddychanie mitochondrialne bez konieczności glikolizy
Antymycyna A	Sigma	#BE13-115EA8674	Hamuje kompleks III mitochondriów
Rotenon	Sigma	#BE13-115EA8674R8875	Hamuje kompleks I mitochondria
Casy Cell Counter Roche	Diagnostics	#05 651 697 001	Przyrząd do liczenia komórek
anty-CD16/CD32	eBioscience	#14-0161	Cytometria przepływowa blokowa receptora Fc
anty-F4/80-APC-eFluor780	eBioscience	#47-4801	Przeciwciało do barwienia makrofagów
anty-CD11b-FITC	eBioscience	#11-0112	Przeciwciało przeciwko makrofagom barwiącym