Protokoły analizy roli komórek Panetha w regeneracji jelita mysiego przy użyciu warunkowych modeli myszy Cre-lox

Podsumowanie

Komórki macierzyste nabłonka jelitowego (ISC) są zmieszane z komórkami Panetha. Komórki te są zróżnicowanym potomstwem ISC, które wspiera ISC i zapewnia ochronę przeciwbakteryjną. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób wykorzystaliśmy transgeniczne warunkowe modele myszy, aby ustalić, że komórki Panetha odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu nabłonka jelitowego.

Streszczenie

Powierzchnia nabłonka jelita ssaków to dynamiczna tkanka, która odnawia się co 3 - 7 dni. Zrozumienie tego procesu odnowy pozwoliło zidentyfikować populację szybko cyklicznych jelitowych komórek macierzystych (ISC) charakteryzujących się ekspresją genu Lgr5. Są one wspierane przez spokojną populację komórek macierzystych, charakteryzującą się ekspresją Bmi-1, zdolną do zastąpienia ich w przypadku urazu. Badanie interakcji między tymi populacjami ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia ich roli w chorobach i nowotworach. ISC istnieją w kryptach na powierzchni jelita, nisze te wspierają ISC w uzupełnianiu nabłonka. Interakcja między aktywnymi i spokojnymi ISC prawdopodobnie obejmuje inne zróżnicowane komórki w niszy, ponieważ wcześniej wykazano, że "macierzystość" ISC Lgr5 jest ściśle związana z obecnością sąsiednich komórek Panetha. Korzystając z warunkowych modeli myszy cre-lox, przetestowaliśmy efekt usunięcia większości aktywnych komórek ISC w obecności lub braku komórek Panetha. Tutaj opisujemy techniki i analizy podjęte w celu scharakteryzowania jelita i wykazania, że komórki Panetha odgrywają kluczową rolę w niszy ISC we wspomaganiu powrotu do zdrowia po znacznym zniekształceniu.

Wprowadzenie

Na powierzchni świetlnej jelita ssaków znajdują się powtarzające się jednostki krypt i wypustek przypominających palce, zwanych kosmkami, które wystają w światło. Powierzchnia ta jest ciągłym arkuszem nabłonka, który ulega całkowitej samoodnowie mniej więcej co 3 - 4 dni¹. Ta dynamiczna tkanka jest wspierana przez populację szybko zmieniających się komórek macierzystych (ISC; znanych również jako komórki kolumnowe o podstawie krypty), które początkowo zidentyfikowano na podstawie ekspresji genu Lgr5 ^2,3. Komórki te znajdują się w wyspecjalizowanej niszy na dnie krypt Lieberkuhna. Początkowo odkrycie, że ISC szybko zmieniają się cyklicznie, było niezgodne z dominującą ideą, że komórka macierzysta ma charakter spoczynkowy. Przed identyfikacją ISC Lgr5⁺ postulowano, że populacja komórek zatrzymujących spoczynek etykiety w pozycji +4, w stosunku do podstawy krypty, to ISC¹. Ostatnie badania pogodziły te obserwacje, wykazując, że przede wszystkim w każdej krypcie znajduje się pula równosilnych cyklicznych ISC, których los jest regulowany przez sąsiadów^4,5. W przypadku ich utraty mogą one zostać zastąpione komórkami w stanie spoczynku, które zwykle są zaangażowane w linię wydzielniczą, ale mogą powrócić do ISC, jeśli populacja ISC zostanie uszkodzona⁶.

Sąsiedzi ISC mogą być zarówno ISC, jak i ich komórkami potomnymi. ISC wytwarzają naiwne komórki potomne, które namnażają się i różnicują w wyspecjalizowane typy komórek, które składają się na arkusz nabłonka wyściełający światło jelita¹. Komórki kielichowe, enteroendokrynne, enterocyty, kępki i komórki M migrują w górę do powierzchni światła, gdzie pełnią różne funkcje absorpcyjne i regulacyjne, jednak komórki Panetha pozostają na dnie krypty, gdzie występują zmieszane z ISC. W ostatnich latach wykazano, że część naiwnych komórek potomnych przeznaczonych do linii wydzielniczej to komórki spoczynkowe zachowujące Lgr5^lo zdolne do powrotu do ISC po urazie^6,7.

Ze względu na jego znaczenie w regeneracji krypt, priorytetem było zrozumienie interakcji między ISC a jego sąsiadami, szczególnie komórkami Panetha. Komórki Paneth odgrywają kluczową rolę w niszy, która wspiera ISC⁸. Oprócz produktów bakteriobójczych komórki Panetha wytwarzają cząsteczki sygnałowe, które aktywują szlaki rządzące odnową lub różnicowaniem ISC. Wcześniejsze badania wykazały, że ISC Lgr5⁺ mogą istnieć tylko wtedy, gdy mogą konkurować o niezbędne sygnały niszowe dostarczane przez ich córki komórki^{Panath 8}. W badaniach tych oceniano rolę komórek Panetha w prawidłowych ISC Lgr5⁺, a nie w sytuacji, gdy są one uszkodzone i wymagają uzupełnienia z populacji Lgr5^lo.

Aby zrozumieć biologię jelit i modelową chorobę, badamy funkcjonalną rolę komórek i/lub genów za pomocą transgenicznych modeli myszy^9,10. Często modele te wykorzystują technologię cre-lox do warunkowej modyfikacji genu (genów)^9,10. Rekombinaza Cre (powoduje rekombinację) jest specyficzną dla miejsca rekombinazą z rodziny integraz, wyizolowaną z bakteriofaga P1. Cre katalizuje specyficzną dla miejsca rekombinację między zdefiniowanymi miejscami "Lox P" o długości 34 pz (locus χ skrzyżowania P1). Myszy są genetycznie modyfikowane tak, aby zawierały miejsca LoxP, które otaczają obszary zainteresowania, które po ekspresji rekombinazy Cre są wycinane. Powiązanie ekspresji genu Cre z komórką lub specyficznym dla rozwoju promotorem pozwala na dokonywanie zmian w sposób przestrzenny^9,10, co jest szczególnie przydatne w przezwyciężaniu embrionalnych mutacji letalnych. Dalsze powiązanie ekspresji Cre ze szlakiem receptorowym, który może być sztucznie aktywowany, pozwala na zmiany czasowe.

Korzystając z tej technologii, inaktywowaliśmy gen CatnB ¹¹ w nabłonku jelitowym. β-katenina, produkt genu CatnB, jest kluczowym regulatorem kanonicznego szlaku sygnałowego Wnt, który zarządza homeostazą ISC. Dwa wcześniejsze badania wykorzystujące tę strategię przyniosły sprzeczne wyniki^12,13. Badanie przeprowadzone przez Fevr i wsp.¹², wykazały utratę komórek macierzystych i homeostazę jelit. Mając na uwadze, że Irlandia i wsp.^{W 14}badaniu stwierdzono, że po zmniejszeniu żywotności komórek oś krypta-kosmek została ponownie zasiedlona z komórek typu dzikiego wykazujących ekspresję CatnB. Główną różnicą w tych badaniach był promotor używany do ekspresji Cre w nabłonku jelitowym. W badaniu Fevr i wsp. wykorzystano promotor genu villin związany z receptorem estrogenowym, który może być aktywowany przez podanie tamoksyfenu (vil-Cre-ER^T2)^15,16. Z kolei Ireland i wsp. wykorzystali element promotorowy genu cytochromu P450A1 szczura (CYP1A1) do stymulowania ekspresji Cre w odpowiedzi na ksenobiotyk β-naftoflawon (Ah-cre). Charakterystyka tych różnych systemów wygenerowała dwie hipotezy wyjaśniające te różne obserwacje. Po pierwsze, CatnB jest skuteczniej usuwany w ISC przy użyciu systemu vil-Cre-ER^T2 w porównaniu z Ah-cre, zmniejszając w ten sposób liczbę ISC do poziomów subpopulacji. Alternatywnie było to spowodowane różnicową delecją CatnB w zróżnicowanej populacji komórek. System vil-Cre-ER^T2 celuje we wszystkie komórki nabłonkowe krypty i kosmków, podczas gdy system Ah-cre celuje tylko w komórki nie-Paneth niszy i krypty ISC. Systemy te dostarczyły idealnych narzędzi do badania zachowania ISC i ich interakcji z komórkami Panetha. Tutaj przedstawiamy kilka szczegółowych protokołów opartych na tym, jak wykorzystaliśmy te systemy, aby ustalić, że komórki Panetha odgrywają kluczową rolę w pośredniczeniu w odpowiedzi jelitowej na uraz¹⁷.

Protokół

Informacje na temat wszystkich użytych materiałów są podane w Tabeli 1. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone na podstawie licencji brytyjskiego Ministerstwa Spraw Wewnętrznych.

1. Usuwanie CatnB za pomocą systemów Ah-cre i vil-Cre-ER^T2

1. Skrzyżowano szczepy myszy, aby wygenerować 10-14-tygodniowe kohorty Ah-cre ⁺ CatnB ^{+ / +}, Ah-cre ⁺ CatnB^{flox / flox}, vil-Cre-ER^T2CatnB +^/+ i vil-Cre-ER^T2CatnB^{/ flox}. Do wizualnej analizy rekombinacji, za pomocą barwienia β-gal, kohorty powinny zawierać reporter Rosa26R-lacZ ¹⁷. Kohorty powinny kontrolować obecność zmodyfikowanych genów i stosowanie środków indukcyjnych, wymagana wielkość kohort powinna być oszacowana za pomocą analizy mocy.
2. W celu indukcji transgenu Ah-cre należy przygotować β-naftoflawon (BNF) lub w przypadku transgenu vil-Cre-ER^T2 tamoksyfen (TAM) w oleju kukurydzianym, aby uzyskać roztwór roboczy 10 mg/ml. UWAGA: Środki należy odważyć pod wyciągiem przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej.
3. Podgrzać roztwory w bursztynowej butelce (BNF jest wrażliwy na światło) do 99,9 °C dla BNF lub 80 °C dla TAM w łaźni wodnej.
4. Przenieść do podgrzewanego mieszadła ustawionego na 100 °C dla BNF lub 80 °C dla TAM i mieszać przez 10 minut.
5. W przypadku BNF powtórz 1,3-1,4 aż do rozpuszczenia (może to zająć >1 godzinę).
6. Przelać do małych bursztynowych butelek (~5 ml), a następnie zamrozić w temperaturze -20 °C. Butelki należy wyrzucić po 3 cyklach zamrażania/rozmrażania. Przed użyciem należy rozmrozić środki i ponownie podgrzać do odpowiedniej temperatury, jeśli wypadły z roztworu. Pozostawić do ostygnięcia do temperatury <37 °C przed wstrzyknięciem.
7. Wstrzyknąć myszom dootrzewnowo (I.P.) dawkę 80 mg/kg, na przykład mysz o wadze 25 g otrzymuje 0,2 ml odpowiedniego środka indukcyjnego. W przypadku Ah-cre należy podać trzy wstrzyknięcia w ciągu 24 godzin, w przypadku vil-Cre-ER^T2 należy podać jedno wstrzyknięcie dziennie przez 4 dni.

2. Sekcja jelita do wizualizacji reporterowej i immunohistochemii (IHC)

1. Poddaj mysz eutanazji za pomocą zwichnięcia szyjki macicy bez wcześniejszego znieczulenia zgodnie z aprobatą etyczną. Umieść mysz w pozycji leżącej na plecach i zwilż sierść za pomocą 70% EtOH, otwórz jamę wewnątrzotrzewnową wzdłuż linii środkowej za pomocą nożyczek.
2. Zabezpiecz żołądek kleszczami i odetnij połączenie z przełykiem. Usuń jelito cienkie aż do wyrostka robaczkowego, delikatnie ciągnąc za żołądek. Usuń jelito grube aż do odbytu, delikatnie pociągając za wyrostek robaczkowy.
3. Po wyizolowaniu jelit usuń żołądek i wyrostek robaczkowy. Przepłukać jelita 1x PBS za pomocą strzykawki z tępo zakończoną końcówką pipety. UWAGA: Każde jelito powinno być natychmiast przetworzone pod kątem jednego z dalszych zastosowań opisanych poniżej.

3. Utrwalanie jelita przez formalinę

1. Pokrój zaczerwienione jelito na 3 równe części i oznacz proksymalne, środkowe i dystalne. Pokrój każdą sekcję na 1 cm kawałki. Weź mały pasek taśmy chirurgicznej 2 cm x 2 cm. Umieść od trzech do pięciu 1-centymetrowych kawałków na środku taśmy chirurgicznej w formie piramidy.
2. Zamknij i uszczelnij taśmę wokół kawałków wzdłuż, aby uzyskać efekt "stosu kłód". Umieścić tkankę w płaskodennym pojemniku zawierającym duży nadmiar neutralnego buforowanego utrwalacza formalinowego, co najmniej 10 razy większą objętość utrwalacza niż objętość tkanki. UWAGA: Unikaj umieszczania nadmiernej ilości tkanki w tubce w celu utrwalenia, podziel ją na wiele pojemników.
3. Umieścić próbki w temperaturze 4 °C przez co najmniej 18-24 godziny przed zatopieniem i podziałem na sekcje. Aby zapobiec utracie jądrowej β-kateniny, nie należy utrwalać jej dłużej niż 24 godziny. Po utrwaleniu przenieść tkankę do płaskodennego pojemnika zawierającego duży nadmiar 70% EtOH, co najmniej 10x objętość tkanki.

4. Utrwalanie jelita przez metakarn

1. Przed preparacją należy przygotować utrwalacz metakarny, łącząc 300 ml MeOH, 150 ml chloroformu i 75 ml lodowatego kwasu octowego (4:2:1). Przetnij zaczerwienione jelito na 3 równej wielkości sekcje: proksymalną, środkową i dystalną.
2. Umieść każdy kawałek jelita obok siebie na kawałku bibuły filtracyjnej (15 cm x 15 cm) i za pomocą nożyczek sprężynowych otwórz go "en face". Umieścić jelito i bibułę filtracyjną w szklanym naczyniu zawierającym metakarnę na 3 - 24 godziny w temperaturze pokojowej. Po utrwaleniu podnieś koniec odcinka jelita za pomocą kleszczy.
3. Owiń jelito wokół kleszczy, aby uformować "szwajcarską bułkę" i zabezpiecz rolkę, lekko otwierając kleszcze i wkładając przez nią igłę 25 G. Umieść tkankę w płaskodennym pojemniku zawierającym duży nadmiar neutralnego buforowanego utrwalacza formalinowego, co najmniej 10 razy większą objętość utrwalacza niż objętość tkanki i przechowuj przez co najmniej 1 godzinę przed przystąpieniem do przetwarzania.

5. Wizualizacja całej góry LacZ (zmodyfikowana z El Marjou et al.¹⁸)

1. Przygotuj płytki woskowe, łącząc stopiony ralwax z olejem mineralnym w stosunku 10:1. Wlać do 15 cm szalek Petriego i odstawić do ostygnięcia. Przygotować utrwalacz X-gal zgodnie z tabelą 1 i przechowywać na lodzie.
2. Usunąć całe jelito i przepłukać lodowatym 1x PBS, jak w sekcji 2. Napraw jelito, przepłukując je 25 ml lodowatego utrwalacza X-gal.
3. Za pomocą nożyczek pokrój jelito na 3 - 5 równych części (maksymalnie 5 na płytkę). Umieść każdą sekcję na woskowej płytce i przypnij każdy koniec, tak aby sekcja była lekko rozciągnięta z linią krezkową do góry; Przytnij nadmiar krezki. Za pomocą nożyczek sprężynowych odetnij jelito wzdłużnie i wytnij po drodze.
4. Zalać płytkę utrwalaczem X-gal w celu przykrycia skrawków i pozostawić na co najmniej 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Usunąć utrwalacz X-gal za pomocą pipety o pojemności 25 ml i przemyć raz 30 ml 1x PBS. Przykryj skrawki 30 ml roztworu odmukowiającego naziemną telewizję cyfrową przez 30 - 60 minut w temperaturze pokojowej, najlepiej na platformie kołyszącej.
5. Usunąć roztwór demucyfizujący za pomocą pipety o pojemności 25 ml i zalać płytkę 30 ml 1x PBS. Za pomocą pipety Pasteura przemyć odcinki jelita 1x PBS w płytce w celu usunięcia śluzu.
6. Usuń 1x PBS za pomocą pipety 25 ml i zalej 30 ml barwnika X-gal. Inkubować przez noc w temperaturze pokojowej w ciemności z delikatnym mieszaniem na kołyszącej się platformie.
7. Po nocnej inkubacji sprawdź, czy na skrawkach pojawiła się niebiesko-zielona plama, jeśli kolor tła jest nadal biały, można dodać świeży roztwór barwiący i monitorować go do momentu powstania zabarwienia. UWAGA: Po zabarwieniu sekcji nie można próbować dalszego barwienia.
8. Usunąć plamę X-gal za pomocą pipety o pojemności 25 ml i zalać płytkę 30 ml 1x PBS i pozostawić na 3 minuty z delikatnym mieszaniem. Usuń szpilki i podnieś kleszczami koniec odcinka jelita. Owiń jelito wokół kleszczy, aby uformować "szwajcarską bułkę", zabezpiecz rolkę, lekko otwierając kleszcze i wbijając w nią igłę 25 G.
9. Umieścić tkankę w płaskodennym pojemniku z szerokim otworem, zawierającym duży nadmiar neutralnego, buforowanego utrwalacza formalinowego, co najmniej 10 razy większą objętość utrwalacza niż objętość tkanki. Umieścić próbki w temperaturze 4 °C na co najmniej 24 godziny przed zatopieniem i podziałem na sekcje.

6. Wydobycie krypt z jelita

1. Odizolować pierwsze 20 cm jelita cienkiego, jak w sekcji 2. Umieść jelito na czystej powierzchni preparacyjnej i za pomocą kleszczy i nożyczek usuń przyczepiony tłuszcz/krezkę. Za pomocą nożyczek sprężynowych otwórz jelito wzdłużnie.
2. Za pomocą szkiełka podstawowego mikroskopu mocno zeskrob światło jelita, aby usunąć kosmki i śluz. Za pomocą nożyczek pokrój jelito na kawałki ~5 mm i przenieś do probówki o pojemności 50 ml z 25 ml 1x HBSS uzupełniony penicyliną (100 U/ml) i streptomycyną (100 U/ml).
3. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej tonacji. Usunąć pożywkę zawierającą antybiotyk, przepuszczając próbki przez sitko do komórek o średnicy 70 μm.
4. Umieścić skrawki jelita w świeżej probówce o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml 1x HBSS i założyć nakrętkę.
5. Delikatnie odwróć dwukrotnie i usuń 1x HBSS, przechodząc przez sitko o wielkości 70 μm. Następnie umyj kawałki jelita, powtarzając 6,4 i 6,5 trzy razy i upewnij się, że końcowa frakcja jest stosunkowo klarowna.
6. Przenieść tkankę do świeżej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml EDTA (8 mM)/1x HBSS i pozostawić w temperaturze pokojowej na 5 minut. Energicznie wstrząsnąć (20 - 30x) lub przemieszać, przepuścić przez sitko do komórek 70 μm i przenieść kawałki tkanki do świeżej probówki o pojemności 50 ml zawierającej EDTA (8 mM)/1x HBSS. UWAGA: Przepływ może zostać odrzucony lub zatrzymany, jeśli wymagana jest analiza nabłonka kosmków.
7. Inkubować kawałki tkanek na lodzie przez 30 minut, energicznie wstrząsnąć próbką (20 - 30 razy) lub odwirować. Przepuść próbki przez sitko komórkowe o średnicy 70 μm i zatrzymaj przepływ, ponieważ zawiera on krypty.
8. Przenieść kawałki tkanki do świeżej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml 1x HBSS. Wstrząsnąć energicznie (20 - 30x) lub odwirować, przepuścić przez sitko o wielkości komórek 70 μm i utrzymać przepływ. Powtórz jeszcze raz, aby zapewnić maksymalne odzyskanie krypt z kawałków jelita. Połączyć przepływ przez frakcje i odwirować przy 300 x g przez 5 minut. Odlać supernatant i zachować osad kryptowy. UWAGA: Granulki mogą być natychmiast użyte do hodowli (jeśli dotyczy) lub przechowywane w temperaturze -80 °C przed standardowymi procedurami ekstrakcji DNA/RNA/białka.

7. Standardowa wizualizacja immunohistochemiczna

1. Wyciąć skrawki 5 μm tkanki zatopionej w parafinie na szkiełkach poli-L-lizynowych (PLL). Uwaga: Standardowy protokół barwienia przeciwciałem B-kateniny podano poniżej, parametry dla innych przeciwciał podano w tabeli 2.
2. Odwoskować za pomocą 2x 3 minutowych płukań w kąpielach szkiełkowych zawierających świeży ksylen. Uzupełnij nawodnienie, przepuszczając szkiełka przez 3 minuty przez kąpiele szkiełkowe zawierające świeże: 100% EtOH (2x), 95% EtOH i 70% EtOH, a na koniec do 1x PBS.
3. Umieścić szkiełka w kąpieli szkiełkowej zawierającej bufor cytrynianowy (pH 6) i podgrzewać 99,9°C przez 20 minut w celu pobrania antygenów. Pozostawić szkiełka do ostygnięcia, a następnie myć 3x 5 min w kąpieli szkiełkowej zawierającej 1xTBS/T przez 5 min. Usuń szkiełka z ostatniego prania, natychmiast obrysuj tkankę pisakiem PAP i przykryj sekcję dostępnym w handlu blokiem peroksydazy lub 1,5% H₂O₂ (w destylowanym H₂O).
4. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej (RT), a następnie myć 3x w kąpielach szkiełkowych zawierających świeże 1x TBS/T przez 5 min. Po umyciu skrawków pokrywy, za pomocą pipety, w 5% normalnej surowicy króliczej (NRS)/1xTBS/T przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby zablokować niespecyficzne wiązanie hydrofobowe przeciwciała pierwszorzędowego.
   1. Usunąć blok NRS za pomocą pipety Pasteura i przykryć sekcję pierwszorzędowym przeciwciałem B-kateniny rozcieńczonym w stosunku 1:200 z 5% NRS. Myć szkiełka przez 3 x 5 minut w kąpielach szkiełkowych zawierających świeży 1xTBS/T. Uwaga - inne przeciwciała będą wymagały optymalizacji pod kątem rozcieńczenia i swoistości. Aby zapewnić swoistość przeciwciała, należy przeprowadzić odpowiednie barwienie kontrolne przeciwciał i izotypów. Kontrola izotypu jest dopasowywana do gatunku gospodarza i izotypu przeciwciała pierwszorzędowego.
5. Wizualizacja za pomocą komercyjnego zestawu do wykrywania HRP lub odpowiedniego znakowanego fluorescencyjnie przeciwciała drugorzędowego (Tabela 2). UWAGA: Czas rozwoju różni się dla każdego przeciwciała, dla β-kateniny zwykle wystarcza 10 - 15 sekund. Aby zoptymalizować rozwój przeciwciała, najpierw ustal czas wymagany do wizualizacji dodatnich komórek za pomocą szkiełka kontroli pozytywnej, a następnie zastosuj go do wszystkich kolejnych slajdów.
6. Myć szkiełka przez 3 x 5 minut w kąpielach szkiełkowych zawierających świeże TBS/T. Preparaty przeciwbarwione można przeciwdziałać barwieniu, zanurzając je w kąpieli szkiełkowej zawierającej hematoksylinę na ~45 sekund (nie jest to wymagane w przypadku stosowania znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał drugorzędowych). Włóż szkiełka do czystej kąpieli szkiełkowej i płucz bieżącą wodą z kranu przez ~1 min, upewniając się, że hematoksylina nie została całkowicie wypłukana.
7. Odwadniać szkiełka, przechodząc przez kąpiele szkiełkowe zawierające coraz większe stężenia alkoholi; 1x 30 s w 70% EtOh, 1x 30 s w 95% EtOH, 2x 30 s mycie w 100% EtOH, 2x 2 min w ksylenie.
8. Zamontuj szkiełka pod szkiełkiem nakrywkowym za pomocą dostępnego w handlu nośnika montażowego. UWAGA: W przypadku stosowania przeciwciała znakowanego fluorescencyjnie zamontuj za pomocą pożywki zawierającej DAPI w celu znakowania jądra.

8. Histologiczna identyfikacja specyficznych komórek nabłonka jelitowego

1. Enterocyty
   1. Przygotować skrawki, korzystając z sekcji 7 z przeciwciałem villin i w warunkach opisanych w Tabeli 2.
2. Komórki entero-endokrynne (barwienie Grimelius ^18,19).
   1. Przygotuj sekcje, wykonując kroki 7.1-7.2. Myć szkiełka w kąpieli szkiełkowej zawierającej ultraczystą wodę przez 3 minuty. Przenieść szkiełka do kąpieli szkiełkowej zawierającej wstępnie podgrzany roztwór srebra (tabela 1) i inkubować w temperaturze 60 °C przez 3 godziny.
   2. Wyjąć szkiełka z roztworu srebra i umieścić w kąpieli szkiełkowej zawierającej świeżo przygotowany, wstępnie podgrzany roztwór reduktora (Tabela 2) w temperaturze 45 °C na 3 minuty. Wyjąć szkiełka i umieścić w kąpieli szkiełkowej zawierającej świeżą ultraczystą wodę na 3 minuty. Postępować zgodnie z krokami 7.6-7.8 z rozdziału 7.
3. Komórki kubkowe (barwienie błękitem alcyjskim).
   1. Przygotuj sekcje, wykonując kroki 7.1-7.2. Przenieść szkiełka do kąpieli szkiełkowej zawierającej Alcian Blue pH 2,5 na 5 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć plamę z niebieskiego szkiełka Alcian za pomocą pipety i umieścić kąpiel szkiełkową pod bieżącą wodą na 3 - 5 minut. Wykonaj kroki 7.6-7.8. UWAGA: Roztwór błękitu alcijskiego można zachować do dalszego wykorzystania.
4. Międzynarodowe Centra Naukowe.
   1. W celu zidentyfikowania ISC należy zapoznać się z sekcją 9.
5. Komórki Panetha.
   1. Przygotować sekcje po sekcji 7, stosując przeciwciało lizozymu i warunki opisane w Tabeli 2.

9. Wykrywanie RNA in situ w jelicie mysim^19-21

1. Umieścić 5 μm skrawków z jelita utrwalonego formaliną (sekcja 3) na szkiełkach PLL. Przygotować zlinearyzowaną sondę RNA znakowaną digoksygeniną do wykrywania ekspresji Olfm4 ²¹. Odwoskuj i ponownie uwodnij sekcje zgodnie z sekcją 7. UWAGA: Ten protokół powinien być wykonywany w środowisku wolnym od RNAzy, aby zapobiec degradacji sondy RNA.
2. Narysuj tkankę za pomocą pisaka PAP, aby zminimalizować ilość odczynników. Inkubować skrawki w kąpieli szkiełkowej z 6%_H2O2(w destylowanym_H2O) przez 30 min. Przemyć dwukrotnie w kąpieli szkiełkowej ze świeżym 1x PBS przez 3 min. Wyrzuć 1x PBS i za pomocą pipety przykryj część 4% paraformaldehydem na 20 minut na lodzie.
3. Umyć dwukrotnie w kąpieli szkiełkowej ze świeżym 1x PBS przez 3 min. Za pomocą pipety pokryć sekcje roztworem proteinazy K przez 5 min Myć w kąpieli szkiełkowej ze świeżym 1x PBS przez 3 min. Za pomocą pipety po utrwaleniu skrawków pokrywając 4% paraformaldehydem przez 5 min w temperaturze pokojowej.
4. Myć w kąpieli szkiełkowej z H₂0 nasączonym DEPC przez 2 min. Za pomocą pipety pokrywać sekcje w roztworze bezwodnika octowego przez 10 minut z mieszaniem. Umyć w kąpieli szkiełkowej ze świeżą skórą 1x PBS/3 min, a następnie 1x sól fizjologiczna/3 min. Przepuszczać szkiełka przez kąpiele zawierające coraz większe stężenia alkoholi; 1x 30 sekund w 70% EtOh, 1x 30 sekund w 95% EtOH, 2x 30 sekund myć w świeżym 100% EtOH, 2x 2 min w świeżym ksylenie i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu.
5. Rozcieńczyć sondę Olfm4 w stosunku 1:100 w buforze hybrydyzacyjnym i sondzie denaturacyjnym, podgrzewając do 80°C przez 3 minuty. Nanieść 100 μl sondy na każdą sekcję i przykryć parafilmem, aby zapobiec odwodnieniu szkiełka. Inkubować przez noc w ciemnej, wilgotnej komorze w temperaturze 65 °C.
6. Myć w kąpieli szkiełkowej z 5× SSC w temperaturze 65 °C przez 15 min. Przemywać skrawki w kąpieli szkiełkowej dwukrotnie świeżymi 50% formamidem/5× SSC/1% SDS przez 30 min w temperaturze 65 °C. Przemywać skrawki dwukrotnie w kąpieli szkiełkowej w świeżym PBT przez 10 minut, pierwszy w temperaturze 65 °C, a drugi w temperaturze przet. Przy użyciu pipety zakrywającej sekcje z PBT zawierającym 25 μg Enzym RNAzy przez 45 min w temperaturze 37 °C. Przemywać skrawki w kąpieli szkiełkowej w PBT przez 5 min w temperaturze pokojowej.
7. Umyć skrawki w kąpieli szkiełkowej dwukrotnie świeżym 50% formamidem/5× SSC przez 30 minut w temperaturze 65 °C. Aby zablokować, przykryj skrawki za pomocą pipety z 10% owczą surowicą w PBT i przechowuj w ciemnej, wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez 2 - 3 godziny.
8. Przygotować przeciwciało, rozcieńczając przeciwciało sprzężone z fosfatazą alkaliczną anty-digoksygeniny w stosunku 1:500 z 10% surowicą owczą w PBT zawierającym 5 mg / ml proszku jelitowego myszy. Inkubować przez 3 godziny w temperaturze 4 °C w ciemności na kołyszącej się platformie. Odwirować, aby usunąć nadmiar proszku jelitowego i dodać 3 razy więcej 1% surowicy owczej w PBT do supernatantu.
9. Usunąć blok ze szkiełek za pomocą pipety i dodać 100 μl roztworu przeciwciała do każdej sekcji, przykryć parafilmem i inkubować w ciemnej, wilgotnej komorze w temperaturze 4°C przez noc. Umyć skrawki w kąpieli szkiełkowej 3× świeżym PBT przez 5 min. Aby zablokować sekcje, myć w kąpieli szkiełkowej 3× świeżym buforem NTMT przez 5 min.
10. Aby to zobrazować, za pomocą pipety pokryj każdą sekcję fioletowym BM i inkubuj w ciemności w temperaturze RT przez 24 - 72 godziny, aż rozwinie się wystarczająco mocny kolor. Umyć skrawki w kąpieli szkiełkowej raz w PBT i przeciwbarwić, zanurzając w eozynie na 1 minutę. Usunąć nadmiar eozyny, myjąc sekcje w kąpieli szkiełkowej pod bieżącą wodą na 3 - 5 minut. Zanurzyć szkiełka w ksylenie i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu. Zamontuj pod szkiełkiem nakrywkowym przy użyciu komercyjnych nośników.

10. Charakterystyka histologiczna nabłonka jelitowego

1. Umieść 5 μm skrawków z utrwalonej tkanki (sekcja 3 i 4) na szkiełkach PLL. Przeanalizuj ≥25 losowych całych (lub ≥50 połowa) krypt od ≥4 myszy z każdej kohorty dla każdego z poniższych parametrów. UWAGA: Aby zachować spójność, analizuj krypty z tego samego miejsca każdego jelita (używaj tylko bliższego końca).
2. Parametry komórkowe ze standardowych skrawków barwionych H&E (o ile nie zaznaczono inaczej): liczba krypt, wysokość, apoptoza i mitoza.
   1. Numer krypty.
      1. Użyj powiększenia o małej mocy (np. 4X lub 10X), aby ręcznie policzyć liczbę krypt stykających się z warstwą podstawną. Policz ≥10 poprzecznych odcinków bliższego jelita od co najmniej 4 myszy.
   2. Wysokość krypty.
      1. Użyj powiększenia o dużej mocy (np. 20X lub 40X), aby ręcznie policzyć liczbę komórek od dna krypty do osi krypty/kosmków (Rysunek 3b).
   3. Apoptoza^22,23.
      1. Metoda 1: Użyj powiększenia o dużej mocy (np. 20X lub 40X), aby ręcznie policzyć liczbę komórek apoptotycznych w każdej krypcie. Komórki apoptotyczne można zidentyfikować na podstawie kurczenia się komórek, kondensacji chromatyny, tworzenia pęcherzyków cytoplazmatycznych i ciał apoptotycznych (ryc. 3a).
      2. Metoda 2: Wykonaj barwienie IHC (sekcja 7) dla kaspazy-3 w warunkach opisanych w Tabeli 2. Używając powiększenia o dużej mocy (np. 20X lub 40X), ręcznie policz liczbę dodatnich komórek w każdej krypcie, aby określić ilościowo komórki w fazie wykonywania apoptozy.
   4. mitoza.
      1. Użyj powiększenia o dużej mocy (np. 20X lub 40X), aby ręcznie policzyć liczbę komórek mitotycznych w każdej krypcie. Komórki mitotyczne zawierają skondensowany materiał DNA i są zazwyczaj symetryczne i dobrze uformowane (ryc. 3b).
   5. proliferacja.
      1. Wykonać barwienie IHC (sekcja 7) dla Ki-67 w warunkach opisanych w Tabeli 2. Ręcznie policz komórki dodatnie, aby określić ilościowo proporcję proliferujących komórek crypt.

Wyniki

Porównanie efektywności rekombinacji ISC w systemach Ah-cre i Vil-Cre-ER^T2

Użycie tych systemów cre-lox do oceny roli komórek Panetha w ponownym zasiedleniu jelita po uszkodzeniu, wymagało scharakteryzowania efektywności rekombinacji w ISCs. Korzystając z warunkowego reportera Rosa26R-lacZ wykazaliśmy, że w obu systemach 3 dni po indukcji (d.p.i.) zachodzi ~100% rekombinacja w jelicie cienkim (ryc. 1a). Ilościowe określenie obecności rekombinowanego allelu za pomocą qPCR było zakłócone przez różnice we wzorcach ekspresji Cre między systemami. System vil-Cre-ER^T2 wykazał 3,53-krotny wzrost obecności rekombinowanego allelu w porównaniu z układem Ah-cre, ze względu na jego ekspresję w większej proporcji nabłonka¹⁶. Aby temu zaradzić, przyjęliśmy inną strategię, która pozwoliła nam bezpośrednio porównać systemy. Indukowaliśmy myszy różnymi reżimami indukcji i analizowaliśmy w 30 d.p.i., w którym to momencie LacZ dodatnie krypty i kosmki reprezentują zdarzenie rekombinacji ISC. Stosując to podejście, wykazaliśmy, że w obu systemach 3 wstrzyknięcia środka indukującego (dostarczonego I.P. w dawce 80 mg/kg w ciągu 24 godzin), rekombinowane w równoważnej liczbie ISC, mimo że początkowe poziomy rekombinacji były znacznie wyższe w systemie vil-Cre-ER^{T2 16} (Figura 1b-d). Ponadto, używając DNA wyekstrahowanego z rekombinowanych krypt, qPCR dla repołączonych alleli wykazał nieistotny wzrost rekombinacji przy użyciu systemu vil-Cre-ER ^T2, potencjalnie z powodu rekombinacji w komórkach Paneth, której nie zaobserwowano przy użyciu systemu Ah-cre (Figura 1d). Co więcej, barwienie typów komórek nabłonka nie wykazało żadnych zmian we wzorcu różnicowania, reprezentatywne obrazy każdego badanego typu komórek pokazano na rysunku 2e-2h.

Charakterystyka nabłonka jelitowego po delecji CatnB

Kwantyfikacja utraty krypty

Scharakteryzowanie kinetyki rekombinacji w tych systemach Cre umożliwiło nam analizę jelita myszy, gdy równoważne liczby ISC są rekombinowane. Korzystając z reportera LacZ, oba systemy wykazały całkowitą utratę zrekombinowanych (niebieskich) komórek przy 3 d.p.i. (Figura 2a). Jak wcześniej informowano, trzy dni po usunięciu CatnB, myszy Ah-cre wykazały częściową utratę krypty, podczas gdy myszy vil-Cre-ER^T2 wykazały całkowite zniszczenie osi krypta / kosmek^13,16,24 (Figura 2b-d).

Dynamika ponownego zasiedlania nabłonka

Korzystając z powyższych technik, scharakteryzowaliśmy wiele parametrów, które umożliwiły nam zrozumienie tej obserwacji. Reprezentatywne obrazy parametrów i typów komórek analizowanych przy użyciu protokołów 7 - 10 przedstawiono na rysunku (Rysunek 3a i 3b). Krótko mówiąc, utrata krypt była zgodna z podwyższonymi poziomami apoptozy wykazywanymi w obu systemach (Rysunek 3e). Jednak dane dotyczące mitozy, proliferacji, wysokości komórki krypty, krypty i ekspresji (nie pokazane) wskazują, że system Ah-cre może się odbudować, prawdopodobnie z powodu ponownego zasiedlenia przez nierekombinowane ISC (Figura 3c). W ostrym porównaniu, vil-Cre-ER^T2 nie udało się odzyskać pomimo zachowania nabłonkowych komórek krypty (ryc. 3d).

Charakterystyka fenotypów komórkowych w krypcie

Aby zrozumieć, dlaczego krypty myszy Ah-cre mogły się ponownie zasiedlić, podczas gdy vil-Cre-ER^T2 nie, scharakteryzowaliśmy komórki nabłonkowe trzy dni po usunięciu CatnB. Stosując hybrydyzację in situ (sekcja 9) i analizę IHC (sekcja 7, 8 i 10) wykazaliśmy, że komórki krypty u myszy vil-Cre-ER^T2 CatnB^{flox / flox} były nieproliferacyjne i nie miały ekspresji markera ISC Olfm4, w przeciwieństwie do krypt u myszy Ah-cre (Figura 4c i f). Ponieważ wstępna charakterystyka wykazała, że rekombinacja w kryptach była równoważna, przystąpiliśmy do zbadania roli komórek Panetha. Przeprowadziliśmy podwójnie fluorescencyjne IHC przeciwko CatnB i Lyz1, aby zidentyfikować, które komórki straciły β-kateninę i czy były to komórki Panetha (Figura 5a-5c). Jak opisano wcześniej, wykazaliśmy, że wszystkie komórki krypty są atakowane za pomocą systemu vil-Cre-ER^T2. Dla porównania, system Ah-cre oszczędził komórki Panetha i nabłonek kosmków. Dalsze komórki Paneth zaobserwowano dopiero po delecji CatnB przy użyciu systemu vil-Cre-ER^T2 (Figura 5d i 5e).

Rysunek 1: Porównanie swoistości i skuteczności rekombinacji Cre/Lox w obrębie nabłonka jelitowego przy użyciu systemów Ah-cre i Vil-Cre-ER^T2. (a): Wizualizacja Ah-creLacZ wyrażenie reporterowe w wholemount small (S.I.; *dystalny koniec) i dużym (L.I.; *dystalny koniec) od myszy typu dzikiego. (b): Wyniki qPCR wykazujące zmianę krotności dla rekombinowanego allelu ^floksa CatnB przy 1 d.p.i. w celu porównania różnych reżimów indukcji w Ah-cre CatnB^flox/flox (indukowany BNF) i vil-Cre-ER^T2 CatnB^flox/flox (indukowany TAM); *P >0,05 (Mann-Whitney [2-ogon] w porównaniu z kontrolą). (c)-(e): Całe jelito cienkie wykazujące LacZ dodatnią kryptę 30 d.p.i. Panel (b)-(e) zmodyfikowany z Parry et al.¹⁶. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Porównanie systemów Ah-cre i Vil-Cre-ER^T2 do warunkowego usuwania CatnB w nabłonku jelita cienkiego. (a): Całe jelito cienkie wykazujące utratę zrekombinowanych komórek w Ah-cre CatnB^flox/floxLacZ⁺ myszy przez 3 dni. (b): Kwantyfikacja utraty krypty 3 dni po usunięciu CatnB; *P >0,05 (Mann-Whitney [2-ogon] w porównaniu z kontrolą). (c&d): Poprzeczne odcinki H&E jelita utrwalonego formaliną wykazujące utratę krypt po delecji CatnB. (e)-(h) Przykłady typów komórek od myszy kontrolnych: (e) komórki entero-endokrynne, (f) komórki kubkowe, (g) CatnB IHC wskazujące na ISC (→) z jądrową B-kateniną i (h) komórki Panetha. Panel (b) zmodyfikowany z Parry et al.¹⁶. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Charakterystyka początku fenotypu przy użyciu systemów Ah-cre i Vil-Cre-ER^T2 do warunkowego usuwania CatnB w podobnej liczbie ISC w nabłonku jelita cienkiego. lit. a&b) H&E barwił formalinę utrwalonymi sekcjami wskazującymi lokalizację wysokości krypty ([), komórki apoptotycznej (←) i mitotycznej (↓). Kwantyfikacja średniej liczby komórek na kryptę między myszami typu dzikiego (niebieskiego) i CatnB^flox (pomarańczowym) w trzech punktach czasowych (d.p.i.), (c) wysokości krypty, (d) mitozy i (e) apoptozy (słupki błędów wskazują odchylenie standardowe). Panel (c)-(e) zmodyfikowany z Parry et al¹⁶. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Porównanie charakterystyk ISC przy użyciu systemów Ah-cre i Vil-Cre-ER^T2 do warunkowego usuwania CatnB w nabłonku jelita cienkiego. Nabłonkowe komórki kryptalne 3 dni po delecji CatnB przy użyciu systemu Ah-cre (a-c) lub vil-Cre-ER^T2 (d-f). (a&d) Sekcja BHP pokazująca obszary utraty krypty; Panie przewodniczący, panie i panowie! Ki-67 IHC wykazujący utratę komórek proliferacyjnych za pomocą vil-Cre-ER^T2 ; Panie przewodniczący, panie i panowie! Olfm4 in situ wykazujące obecność funkcjonalnych ISC przy użyciu Ah-cre. Panel (a)-(f) zmodyfikowany z Parry et al¹⁶. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 5: Charakterystyka komórek Paneth po delecji CatnB przy użyciu systemów Vil-Cre-ER^T2 i Ah-cre. (a-c): Obrazy immunofluorescencyjne krypt przedstawiające komórkę Panetha (czerwona), B-kateninę (zielona) i jądro (niebieska), strzałka wskazuje błonę związaną β-kateniną; (D-E) IHC dla kaspazy-3 wskazujące na apoptozę komórek Panetha jest nieobecne w Ah-cre (d), ale obecne w systemie vil-Cre-ER^T2 (e). Panel (a)-(e) zmodyfikowany z Parry i wsp. ¹⁶. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

powiedział: powiedział: ) cyfrowa powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: Waluta) powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: TGL powiedział: TGL powiedział:

Bufor octanowy	*	*	Na 100 ml: 4,8 ml 0,2 M kwasu octowego, 45,2 ml 0,2 M octanu sodu i 50 ml wody destylowanej
kwas octowy	Fisher Naukowy	Nr kat. C/0400/PB17
Bezwodnik octowy	Sigma	Nr kat. A6404
Roztwór bezwodnika octowego	*	*	2 M bezwodnik octowy w 0,1 M chlorowodorku trietanoloaminy
Błękit alcki	Sigma	Ciągnik siodłowy A5268
Błękit Alcian PH 2,5	*	*	Przygotowanie 500 ml: 15 ml kwasu octowego, 5 g błękitu alckiego i 485 ml wody destylowanej
przeciwciało sprzężone z fosfatazą alkaliczną anty-digoksygeniny	Księga Abcam	ab119345
B(beta)-naftoflawon	Sigma	N3633	BNF, wstrzykiwać, nie dopuszczając do zbytniego ostygnięcia roztworu, ponieważ związek wypadnie z roztworu. Roztwór może być ponownie użyty – przechowywać w temperaturze -20 °C między użyciami, nie podgrzewać więcej niż dwa razy.
Bloxall powiedział:	Laboratoria wektorowe	Zobacz materiał SP-6000
BM fioletowy	Roche	11442074001
Bsa	Sigma	A4503 (wersja angielska	Albumina surowicy bydlęcej
chloroform	Fisher Naukowy	Sprawa C/4920/17
Roztwór demaskujący bufor cytrynianowy/antygen	Laboratoria wektorowe	H-3300
Olej kukurydziany	Sigma	Zobacz materiał C8627
Rozwiązanie demucyfijujące	*	*	Na 500 ml: 50 ml glicerolu, 50 ml Tris 0,1M pH8,8, 100 ml EtOH, 300 ml soli fizjologicznej (0,9% NaCl w wodzie), DTT 1,7 g. Roztwór odmukowiający można przygotować wcześniej i przechowywać, ale należy dodać DTT tuż przed inkubacją (340 mg/100 ml).
Woda uzdatniona DEPC	Technologie życiowe	750023
Naziemna telewizja	Sigma	101509944
Edta	Sigma	O3690	0,5 mln
etanol	Fisher Naukowy	E/0650DF/17
Bibuła filtracyjna	Whatman	3000917
Formaldehyd	Sigma	F8775
Formalina	Sigma	SLBL11382V	Neutralna buforowana formalina
Formamid	Sigma	F5786
Aldehye glutarowy	Sigma	G6257
H2O2	Sigma	216763
Hematoksylina	Rajmund Baranek	12698616
HBSS (Sieć HBSS)	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 14175-053	HBSS (-MgCl2+; -CaCl2)
Bufor hybrydyzacyjny	*	*	5× SSC, 50% formamid, 5% SDS, 1 mg/ml heparyny, 1 mg/ml tRNA wątroby cielęcej
Hydrochinonu	Sigma	H9003
Peroksydaza ImmPACT DAB	Laboratoria wektorowe	Zobacz materiał SK-4105
Zestaw Immpress HRP Anti-Mouse IgG	Laboratoria wektorowe	Zobacz materiał MP-7402
Immpress HRP Zestaw przeciw królikom IgG	Laboratoria wektorowe	Zobacz materiał MP-7401
Tkanka jelitowa w proszku	*	*	Jelito cienkie 5 dorosłych myszy połączono i zhomogenizowano w minimalnej objętości lodowatego PBS. Do homogenizowanego jelita dodano 4 objętości lodowatego acetonu, który dokładnie wymieszano i inkubowano na lodzie przez 30 minut. Zostało to odwirowane, a granulat przemyto lodowatym acetonem. Poddano je dalszemu odwirowaniu, a powstały granulat rozprowadzono na bibule filtracyjnej i pozostawiono do wyschnięcia. Po dokładnym wyschnięciu materiał mielono na drobny proszek za pomocą tłuczka i moździerza.
K-żelazocyjanek	Sigma	Zobacz materiał P-3667
K-żelazocyjanek	Sigma	Zobacz materiał P3289
Lewamizol	Sigma	L0380000
Methacarn (Metalowa	*	*	60% Metanol: 30% Chloroform: 10% Kwas octowy
metanol	Fisher Naukowy	Nr kat. M/4000/17
MgCl2	Sigma	Zobacz materiał M8266
Normalna surowica kozia	Laboratoria wektorowe	S-1012	Sieć NGS
Normalna surowica królika	Dako Dako	Zobacz materiał X0902	NRS (Krajowy Łańcuch
Protokół NTMT	*	*	100 mM NaCl, 100 mM Tris HCl, 50 mM MgCl2, 0,1% Tween20, 2 mM Lewamizol
Długopis PAP	wektor	H-400
Paraformaldehyd	Sigma	Zobacz materiał P6148
Pbt	*	*	0,5 M NaCl, 10 mM TrisHCL pH 7,5, 0,1% Tween 20
Penicylina/Streptomycyna	Gibco (firma Gibco)	Rozdział 15140-122	100x solutiuon.
Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (10x)	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP3994	Rozcieńczony w stosunku 1:10 wodą destylowaną do uzyskania 1x
Zjeżdżalnie PLL	Sigma	P0425-72EA	Szkiełka mikroskopowe z poli-L-lizyny
Proteinaza K	Sigma	Zobacz materiał P2308
Roztwór proteinazy k	*	*	Rozcieńczyć proteinazę K w stężeniu 200 μg/ml w 50 mM Tris, 5 mM EDTA.
Wosk Ralwax	BDH (Międzynarodowa Organizacja T	36154 7N
Rozwiązanie reduktora	*	*	Na 100 ml: 1 g hydrochinonu, 5 g siarczynu sodu i 100 ml wody destylowanej
Rnaza A	Sigma	Czynnik R6148
słony	*	*	0,9% NaCl w wodzie destylowanej
Sds	Sigma	I3771
Surowica owcza	Sigma	Zobacz materiał S3772
Azotan srebra	Sigma	Nr kat. S/1240/46
Srebrne rozwiązanie	*	*	Przygotowanie 100 ml: 10 ml buforu octanowego, 87 ml wody destylowanej, 3 ml 1% azotanu srebra
Octan sodu	Fisher Naukowy	Nr kat. S/2120/53
chlorek sodu	Sigma	Zobacz materiał S6753	Zawartość NaCl
Siarczyn sodu	Sigma	239321
Ssc	Sigma	Numer katalogowy: 93017	20x sól fizjologiczna z cytrynianu sodu
Taśma chirurgiczna	Fisher Naukowy	12960495
Tamoksyfen	Sigma	Zobacz materiał T5648	TAM, wstrzyknąć, nie dopuszczając do zbytniego ostygnięcia roztworu, ponieważ związek wypadnie z roztworu. Roztwór może być ponownie użyty – przechowywać w temperaturze -20 °C między użyciami, nie podgrzewać więcej niż dwa razy.
TBS/T	Sygnalizacja komórkowa	#9997
Chlorowodorek trietanoloaminy	Sigma	Zobacz materiał T1502
Tris-HCL	Invitrogen	Numer katalogowy: 15567-027
Kanał Tween20	Sigma	Zobacz materiał TP9416
VectaMount	Laboratoria wektorowe	H-5000
Montaż VectaShield Hardset Medium z DAPI	Laboratoria wektorowe	H-1500
Zestaw ABC Vectastain	Laboratoria wektorowe	PK-4001
Procesor X-gal	Preparat Promega	Zobacz materiał V3941
Utrwalacz X-gal	*	*	2% formaldehydu, 0,1% aldehydu glutarowego w 1xPBS
Bejca X-gal	*	*	Barwienie X-gal; 200 μl X-gal (A) w 50 ml roztworu B (0,214 g MgCl2, 0,48 g K-żelazocyjanku, 0,734 g K-żelazocyjanku w 500 ml PBS). Roztwór B można wcześniej przygotować i przechowywać w temperaturze 4 °C
ksylen	Fisher Naukowy	Ks. X/0200/21

Tabela 1: Materiały i metody

powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: Nożnej (

cel	beta-katenina	Lizozymu	Ki67	Kaspaza-3	Villin
Komercyjne źródło pierwotnego Ab	Laboratoria transdukcyjne	Neomarkery	Laboratoria wektorowe	Systemy badawczo-rozwojowe	Santa Cruz
Numer katalogowy	610154	RB-372	VP-K452	AF835	Zobacz materiał SC-7672
Pierwotne Ab podniesione w	Mysz (mAb)	Królik (pAb)	Mysz (mAb)	Królik (pAb)	Koza (pAb)
Pobieranie antygenu	Wrząca łaźnia wodna/bufor cytrynianowy	Wrząca łaźnia wodna/bufor cytrynianu	Wrząca łaźnia wodna/bufor cytrynianu	Wrząca łaźnia wodna/bufor cytrynianu	Wrząca łaźnia wodna/bufor cytrynianu
Blok peroksydazy	Bloxall lub 2% H2O2, 45 s	Bloxall lub 1,5% H2O2, 30 min	Bloxall lub 0,5% H2O2, 20 min	Bloxall lub 2% H2O2, 45 s	Bloxall lub 3% H2O2, 20 min
Blok surowicy	1% BSA, 30 min	10% NGS, 30min	20% NRS, 20 min	10% NGS, 45 min	10% NRS, 30 min
Bufor do płukania	Pbs	TBS/T	TBS/T	Pbs	TBS/T
Warunki dla pierwotnego Ab	1/300, 2 godz. w RT	1/100, 1 godz. w RT	1/50, 1 godz. w RT	1/750, o/n przy 4°C	1/500, 1 godz. w RT
Drugorzędne Ab	Zestaw Immpress HRP Anti-Mouse IgG	Immpress HRP Zestaw przeciw królikom IgG	Biotynylowany królik anty-Mouse	Biotynylowany kozioł anty-królik	Biotynylowany królik anty-kozioł
Warunki dla wtórnego Ab	1 godz. w RT	30 minut w RT	1/200, 30 min w RT	1/200, 30 min w RT	1/200, 30 min w RT
Wzmocnienie sygnału	N/a	N/a	Zestaw ABC	Zestaw ABC	Zestaw ABC
Detekcja sygnału	Peroksydaza ImmPACT DAB	Peroksydaza ImmPACT DAB	Peroksydaza ImmPACT DAB	Peroksydaza ImmPACT DAB	Peroksydaza ImmPACT DAB
Przeciwciało immunofluorescencyjne	Alexafluor 488	Alexafluor 594	N/a	N/a	N/a
Właściwości immunofluorescencyjne	Wzbudzenie Max 488/Emisja Max 525	Wzbudzenie Max 595/Emisja Max 617
Wspólny zestaw filtrów	Międzynarodowa Federacja Piłki	Teksańska czerwień

Tabela 2: Przeciwciała IHC i warunki

Dyskusja

Wykorzystanie warunkowych myszy transgenicznych cre-lox do analizy funkcji genów i komórek jest powszechnie stosowanym podejściem. Modele te zostały wykorzystane z dużym powodzeniem w jelicie do identyfikacji i scharakteryzowania komórek macierzystych^2,4-6 oraz zrozumienia ich roli w chorobie²⁵. Pełne wykorzystanie tych modeli wymaga kompleksowej charakterystyki systemu, która umożliwi prawidłową interpretację danych. Pełne zrozumienie tych systemów jest trudne do osiągnięcia ze względu na to, że geny rzadko są specyficzne dla pojedynczego typu komórki lub lokalizacji, brak wiedzy biologicznej i nieskuteczność systemów wykorzystywanych do indukowania ekspresji Cre . Opisane tutaj metody pokazują, w jaki sposób przezwyciężamy te problemy poprzez projektowanie eksperymentalne i zastosowanie istniejącej wiedzy. Chociaż użyliśmy tych metod, aby odpowiedzieć na konkretne pytanie badawcze, przedstawione tutaj techniki są ogólne i mogą być wykorzystane w dowolnych badaniach dotyczących jelita mysiego.

Przygotowanie tkanki jelitowej

Kluczowym krokiem do zapewnienia solidnych wyników jest pobranie i przetworzenie tkanki, która musi być przetworzona w odpowiednim czasie i musi być ściśle przestrzegana zgodnie z protokołami utrwalania. Ponieważ prawie wszystkie istotne problemy można przypisać artefaktom związanym z wysychaniem tkanki i/lub niepełnym utrwaleniem. Czas ma kluczowe znaczenie dla zapobiegania degradacji architektury tkanek i/lub kwasów nukleinowych i białek. Niepełne lub nadgorliwe utrwalenie może spowodować utratę rozdzielczości histochemicznej. Niepełna fiksacja spowodowana niewystarczającą ilością czasu lub sekcjami zbyt grubymi, aby umożliwić penetrację utrwalacza, może spowodować utratę rozdzielczości w kryptach jelitowych, którą można zaobserwować jako "znak pływu" podczas analizy IHC. Ponadto ważne jest, aby utrwalanie nie trwało zbyt długo, ponieważ jądrowa β-katenina może dyfundować z jądra, chyba że zostanie natychmiast przetworzona i zatopiona w wosku po utrwaleniu formaliny.

Rola komórek Panetha w niszy ISC

Przedstawione dane skutecznie pokazują znaczenie komórek Panetha w regeneracji krypt w jelicie dorosłego osobnika po utracie ISC. Istniała jednak możliwość, że Ah-cre oszczędzi populację ISC, które vil-Cre-ER^T2 jest celem ataku. Tian i wsp.²⁶ elegancko wykazało, że Lgr5^hi ISC są zastępowane przez populację Lgr5^lo reserve ISC. Obecnie wydaje się prawdopodobne, że te ISC są oszczędzane w systemie Ah-cre ze względu na to, że populacja rezerwowa została zidentyfikowana jako prekursory komórek wydzielniczych^6,7. Znaczenie dojrzałej komórki Panetha we wspieraniu tych prekursorów komórek wydzielniczych, gdy wymagane jest powrót do stanu ISC, pozostaje bez odpowiedzi. Ponieważ komórki Panetha stanowią niszę ISC⁸ i odgrywają rolę w regulacji odpowiedzi ISC na spożycie kalorii²⁷ i stan zapalny²⁸ , prawdopodobne jest, że ich funkcje pielęgniarskie rozszerzą się na ich własne prekursory.

Nowe podejścia i technologie do skutecznego modelowania ludzkiego raka jelita grubego

Odkrycie ISC doprowadziło do identyfikacji genów, które są obecnie wykorzystywane do generowania nowych modeli myszy do badania ról genów i komórek w biologii jelit i chorobach, dokonanych przez Clarke'a i^wsp.9. Jedynym ograniczeniem tej techniki jest identyfikacja genów odpowiedzialnych za ekspresję białka Cre. Obecnie ISC są rutynowo badane przy użyciu warunkowo transgenicznych myszy w oparciu o wzorzec ekspresji genu Lgr5 . Myszy, które eksprymują Cre z promotora Lgr5 , zostały wykorzystane do usunięcia Apc, genu najczęściej zmutowanego w raku jelita grubego (CRC), wykazując ISC jako komórkę pochodzenia²⁵. Selektywne usuwanie innych genów CRC w tych komórkach dostarcza informacji na temat progresji i rozprzestrzeniania się choroby, np. PTEN²⁹. Dalsze informacje na temat funkcji ISC są uzyskiwane poprzez specyficzną ablację komórek wyrażających ekspresję Lgr5 u myszy przy użyciu genu ludzkiego receptora toksyny błoniczej (DTR) wbitego do locus Lgr5 ²⁶. Inne strategie wykorzystują system Tet-O, który umożliwia ciągłą odwracalną ekspresję zmutowanych białek³⁰. Wykorzystanie tych narzędzi do modyfikacji genów w różnych komórkach³¹ i lokalizacjach^32,33 służy do zrozumienia, w jaki sposób rak inicjuje, postępuje i daje przerzuty³⁴. Alternatywnie, mutageneza z wykorzystaniem systemu transpozonów śpiącej królewny identyfikuje nowe czynniki powodujące CRC. Ciągły rozwój myszy, technik i strategii zmian genetycznych prowadzi do opracowania modeli bardziej odpowiednich dla pacjentów.

Opracowano nowe metody charakterystyki nabłonka jelitowego i ISC. Charakterystykę stosunku typów komórek nabłonkowych można uzyskać za pomocą cytometrii przepływowej opartej na zróżnicowanej ekspresji lektyny i CD24³⁵. Potencjalnie największy postęp w zrozumieniu biologii ISC i jej roli w chorobach zostanie osiągnięty przy użyciu systemu hodowli organoidów ex vivo ³⁶. System ten umożliwia hodowlę normalnych i złośliwych ISC w 3D, gdzie replikują się i różnicują w bardziej fizjologicznie istotny sposób. Oczekuje się, że umożliwią one bezpośrednie testowanie leków na próbkach pobranych od pacjentów in vitro, torując drogę dla medycyny spersonalizowanej³⁷.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bufor octanowy	*	*	Aby przygotować 100 ml: 4,8 ml 0,2 M kwasu octowego, 45,2 ml 0,2 M octanu sodu i 50 ml wody destylowanej
Kwas octowy	Fisher Scientific	C/0400/PB17
Bezwodnik octowy	Sigma	A6404
Roztwór bezwodnika octowego	*	*	2 M Bezwodnik octowy w 0,1 M chlorowodorku trietanoloaminy
Błękit alciański	Sigma	A5268
Alcian Blue pH 2,5	*	*	Aby przygotować 500 ml: 15 ml kwasu octowego, 5 g Alcian Blue i 485 ml wody destylowanej
sprzężone z fosfatazą alkaliczną antydigoksygeniny	Abcam	ab119345
B(beta)-naftoflawon	Sigma	N3633	BNF, wstrzykiwać, nie dopuszczając do zbytniego ostygnięcia roztworu, ponieważ związek wypadnie z roztworu. Roztwór może być ponownie użyty – Przechowywać w temperaturze -20 & C między użyciami nie podgrzewaj więcej niż dwa razy.
Bloxall	Vector Labs	SP-6000
BM fioletowy	Roche	11442074001
BSA	Sigma	A4503	Albumina surowicy bydlęcej
Chloroform Fisher	Scientific	C/4920/17
Bufor cytrynianowy/roztwór demaskujący antygen	Vector Labs	H-3300
Olej kukurydziany	Sigma	C8627
Roztwór demucyfizujący	*	*	Dla 500 ml: 50 ml glicerolu, 50 ml Tris 0,1M pH8,8, 100 ml EtOH, 300 ml soli fizjologicznej (0,9% NaCl w wodzie), DTT 1,7 g. Roztwór odmukowiający można przygotować z wyprzedzeniem i przechowywać, ale DTT należy dodać tuż przed inkubacją (340 mg/100 ml).
Woda uzdatniona DEPC	Life Technologies	750023
DTT	Sigma 101509944
EDTA	Sigma	O3690	0,5 M
Etanol	Fisher Scientific	E/0650DF/17
Bibuła filtracyjna	Whatman	3000917
Formaldehyd	Sigma	F8775
Formalina	Sigma	SLBL11382V	Neutralna buforowana formalina
Formamid	Sigma	F5786
Aldehye glutaraldehye	Sigma	G6257
H2O2	Sigma	216763
Hematoksylina	Raymond A Jagnięcina	12698616
HBSS	Gibco	14175-053	HBSS (-MgCl2+; -CaCl2)
Bufor hybrydyzacyjny	*	*	5 i razy; SSC, 50% formamidu, 5% SDS, 1 mg/ml heparyny, 1 mg/ml tRNA wątroby cielęcej
Hydrochinon	Sigma	H9003
ImmPACT DAB Peroksydaza	Vector Labs	SK-4105
Immpress HRP Anti-Mouse IgG	Kit Vector Labs	MP-7402
Immpress HRP Anti-Rabbit IgG	Kit Vector Labs	MP-7401
Proszek do tkanki jelitowej	*	*	Jelito cienkie 5 dorosłych myszy połączono i zhomogenizowano w minimalnej objętości lodowatego PBS. Do homogenizowanego jelita dodano 4 objętości lodowatego acetonu, który dokładnie wymieszano i inkubowano na lodzie przez 30 minut. Zostało to odwirowane, a granulat przemyto lodowatym acetonem. Poddano je dalszemu odwirowaniu, a powstały granulat rozprowadzono na bibule filtracyjnej i pozostawiono do wyschnięcia. Po dokładnym wyschnięciu materiał został zmielony na drobny proszek za pomocą tłuczka i moździerza.
K-żelazocyjanek	Sigma	P-3667
K-żelazocyjanek	Sigma	P3289
Lewamizol	Sigma	L0380000
Methacarn	*	*	60% Metanol:30% Chloroform:10% Kwas octowy
Metanol	Fisher Scientific	M/4000/17
MgCl2	Sigma	M8266
Normalna surowica kozia	Vector Labs	S-1012	NGS
Normalna surowica królicza	Dako	X0902	NRS
NTMT	*	*	100 mM NaCl, 100 mM Tris HCl, 50 mM MgCl2, 0,1% Tween20, 2 mM Lewamizol
PAP długopis	Vector	H-400
Paraformaldehyd	Sigma	P6148
PBT	*	*	0,5 M NaCl, 10 mM TrisHCL pH 7,5, 0,1% Tween 20
Penicylina / Streptomycyna	Gibco	15140-122	100x roztwor
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (10x)	Fisher Scientific	BP3994	Rozcieńczony 1:10 wodą destylowaną do wykonania 1x
szkiełka PLL	Sigma	P0425-72EA	Szkiełka mikroskopowe z poli-L-lizyną
Proteinaza K	Sigma	P2308
Roztwór proteinazy k	*	*	Rozcieńczyć proteinazę K w 200 &mikro; g/ml w 50 mM Tris, 5 mM EDTA.
Ralwax	BDH	36154 Roztwór
	*	*	Aby przygotować 100 ml: 1 g hydrochinonu, 5 g siarczynu sodu i 100 ml wody destylowanej
RnaseA	Sigma	R6148
Sól fizjologiczna	*	*	0,9% NaCl w wodzie destylowanej
SDS	Sigma	I3771
Surowica owcza	Sigma	S3772
Azotan srebra	Sigma	S/1240/46
Roztwór srebra	*	*	Aby przygotować 100 ml: 10 ml buforu octanowego, 87 ml wody destylowanej, 3 ml 1% azotanu
srebra Octan sodu	Fisher Scientific	S/2120/53
Chlorek sodu	Sigma	S6753	NaCl
Siarczyn sodu	Sigma	239321
SSC	Sigma	93017	20x sól fizjologiczna cytrynian sodu
Taśma chirurgiczna	Fisher Scientific	12960495
Tamoxifen	Sigma	T5648	TAM, wstrzyknąć, nie dopuszczając do zbytniego ostygnięcia roztworu, ponieważ związek wypadnie z roztworu. Roztwór może być ponownie użyty – Przechowywać w temperaturze -20 & C między użyciami nie podgrzewaj więcej niż dwa razy.
Sygnalizacja komórkowa	TBS/T	#9997
Chlorowodorek trietanoloaminy	Sigma	T1502
Tris-HCL	Invitrogen	15567-027
Tween20	Sigma	TP9416
VectaMount	Vector Labs	H-5000
VectaShield Hardset Medium montażowe z DAPI	Vector Labs	H-1500
Vectastain ABC Kit	Vector Labs	PK-4001
X-gal	Promega	V3941
Utrwalacz X-gal		*	2% formaldehydu, 0,1% aldehydu glutarowego w 1x
barwie PBS X-gal	*	*	Barwienie X-gal; 200 μ l X-gal (A) w 50 ml roztworu B (0,214 g MgCl2, 0,48 g K-żelazocyjanku, 0,734 g K-żelazocyjanku w 500 ml PBS).  Roztwór B można przygotować wcześniej i przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C
Ksylen	Fisher Scientific	X/0200/21