Artykuł metodologiczny

Opracowanie immunochromatograficznego paska testowego na bazie złota koloidalnego do wykrywania mioglobiny waleni

DOI:

10.3791/53433

⸱

13 lipca 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Veterinary Medicine, National Chiayi University, 2Department of Microbiology and Immunology/Graduate Institute of Biomedical and Biopharmaceutical Sciences, National Chiayi University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje rozwój dwóch przeciwciał monoklonalnych klasy IgG (mAb) silnie reaktywnych na mioglobinę u waleni. Te mAb są nakładane na koloidalny złoty immunochromatograficzny pasek testowy oparty na formacie kanapkowym w celu odróżnienia Mb waleni od fok i innych zwierząt.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje rozwój testu immunochromatograficznego ze złota koloidalnego opartego na formacie kanapkowym, który może być użyty do odróżnienia mioglobiny (Mb) waleni od mioglobiny fok i innych zwierząt. Pas ten zapewnia szybką kontrolę przesiewową na miejscu mięsa waleni, ograniczając w ten sposób jego nielegalny handel i konsumpcję. Opracowano dwa przeciwciała monoklonalne (mAb) o reaktywności w kierunku Mb waleni. Sekwencje aminokwasowe antygenowych regionów reaktywnych Mb od różnych zwierząt przeanalizowano w celu zaprojektowania dwóch syntetycznych peptydów (peptydu ogólnego i peptydu specyficznego), a następnie podniesienia mAb (podklasa IgG1). Przeciwciała monoklonalne wybrano z hybrydomy poddanych badaniom przesiewowym metodą pośredniego testu ELISA, western blot i dot blot. CGF5H9 był specyficzny dla Mbs królików, psów, świń, krów, kóz i waleni, podczas gdy wykazywał słabe lub żadne powinowactwo do Mbs kurczaków, tuńczyków i fok. CSF1H13 może wiązać foki i z silnym powinowactwem, ale nie wykazywał powinowactwa do innych zwierząt. W tym badaniu wykorzystano próbki waleni z czterech rodzin (Balaenopteridae, Delphinidae, Phocoenidae i Kogiidae), a wyniki wskazały, że te dwie mAb mają szeroką zdolność wiązania z Mbs od różnych waleni. Te mAb nałożono na pasek testowy immunochromatograficzny ze złota koloidalnego typu sandwich. CGF5H9, który rozpoznaje wiele gatunków, został znakowany złotem koloidalnym i użyty jako przeciwciało wykrywające. CSF1H13, który został pokryty w strefie testowej, wykrył obecność waleni i fok Mbs. Próbki mięśni tuńczyka, kurczaka, foki, pięciu gatunków ssaków lądowych i 15 gatunków waleni przebadano w trzech egzemplarzach. Wszystkie próbki waleni wykazały wyniki pozytywne, a wszystkie inne próbki wykazały wyniki negatywne.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Historycznie, mięso waleni było spożywane w wielu częściach świata i ta konsumpcjatrwa do dziś. Ze względu na poziom troficzny waleni wiadomo, że w ich mięsie występuje wysoki poziom rtęci i innych toksyn2. W związku z tym spożywanie mięsa waleni może prowadzić do problemów zdrowotnych nie tylko dla grup wysokiego ryzyka, takich jak kobiety w ciąży, ale także dla ogółu populacji3. Ponadto zanieczyszczenie mięsa waleni patogenami odzwierzęcymi lub potencjalnie odzwierzęcymi może również wystąpić podczas jego przetwarzania i przechowywania4. Nawet doświadczonym agentom trudno jest zidentyfikować mięso waleni po samym ich wyglądzie. W związku z tym wymagana jest wiarygodna naukowa metoda identyfikacji w celu odróżnienia mięsa waleni od innych rodzajów mięsa. Pomogłoby to ograniczyć spożycie mięsa waleni.

Obecne metody identyfikacji gatunków obejmują techniki molekularne i metody immunologiczne. Techniki molekularne, takie jak reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) i sekwencjonowanie DNA, mogą być stosowane do identyfikacji próbek nie tylko z surowego mięsa5 i próbek rozłożonych6 , ale także z przetworzonej żywności, takiej jak gotowana kiełbasa i pasze7,8. Metody immunologiczne, takie jak test immunoenzymatyczny (ELISA), są powszechnie stosowane w produkcji żywności do wykrywania zawartości mięsa, na przykład w wieprzowinie9, wołowinie10 i sumie11. Dostępna jest analiza DNA oparta na PCR do identyfikacji mięsa waleni12 , która pomogła zapobiec nielegalnemu międzynarodowemu handlowi mięsem waleni w Japonii, Korei Południowej, Filipinach, Tajwanie, Hongkongu, Rosji, Norwegii i Stanach Zjednoczonych1. Metody te są skuteczne i niezawodne, ale ich wykonanie może zająć godziny lub dni i wymagać pracochłonnych kroków. Identyfikacja mięsa waleni opiera się zwykle na technikach molekularnych i obecnie nie ma dostępnej metody immunologicznej. Dla agencji regulacyjnych wysoce pożądane jest opracowanie niezawodnej i szybkiej techniki, która może być stosowana w terenie do identyfikacji mięsa waleni.

Paski immunochromatograficzne są używane jako narzędzia do wykrywania, których zaletą jest szybkie uzyskanie wyniku za pomocą prostego protokołu, który jest odpowiedni do użytku w terenie. Zasady działania paska immunochromatograficznego i testu ELISA są bardzo podobne i obejmują przeciwciała, antygeny i znaczniki. Wiele różnych znaczników, takich jak złoto koloidalne, węgiel i lateks, zostało wykorzystanych przy opracowywaniu pasków immunochromatograficznych. Obecnie metoda ta jest powszechnie stosowana do wykrywania antybiotyków, toksyn, bakterii i wirusów13, ale rzadko jest stosowana do identyfikacji białek w mięsie14,15. W tym miejscu proponujemy chromatograficzny test immunologiczny z przepływem bocznym do szybkiego wykrywania mioglobiny waleni (Mb).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oświadczenie etyczne: Badanie zostało przeprowadzone zgodnie z międzynarodowymi wytycznymi i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Narodowego Uniwersytetu Chiayi, ID zatwierdzenia: 99022. Wykorzystanie próbki waleni zostało dopuszczone przez Radę Rolnictwa Tajwanu (zezwolenie na badania 100M-02.1-C-99).

1. Przygotowanie próbki mięśni i SDS-PAGE

Uwaga: W tym badaniu wykorzystano próbki mięśni od 23 gatunków, w tym 16 gatunków ssaków morskich, 5 gatunków ssaków lądowych, tuńczyka i kurczaka (Tabela 1). Próbki mięśni waleni pobrano od wyrzuconych na brzeg osobników, przyłowu ryb i konfiskaty. Tkanki mięśniowe królików, szczurów, psów i kurczaków uzyskano z Centrum Diagnostyki Chorób Zwierząt Narodowego Uniwersytetu Chiayi. Próbki wołowiny, wieprzowiny, jagnięciny i tuńczyka zakupiono w lokalnym supermarkecie. Próbka mięśni foki pospolitej (Phoca vitulina) została dostarczona przez Farglory Ocean Park. Elektroforezę w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE) zastosowano do oddzielenia rozpuszczalnych białek o różnej masie cząsteczkowej w próbkach mięśniowych.

  1. Przechowywać wszystkie próbki w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
  2. Zaprawa należy wstępnie schłodzić w temperaturze -20 °C. Następnie włóż do niego 3 g zamrożonej próbki mięśni.
  3. Homogenizować próbkę z 10 ml chłodnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) za pomocą homogenizatora tkankowego.
  4. Odwirować homogenizowaną próbkę o masie 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatanty i przechowywać je w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
  5. Przygotować 5 ml 5% żelu do układania w stosy (3,07 ml wody destylowanej, 1,25 ml 4 x górny bufor żelowy o pH 6,8, 625 μl 40% akrylamidu, 50 μl 10% nadsiarczanu amonu (APS) i 5 μl tetrametyloetylenodiaminy (TEMED)) i 10 ml 15 % żelu rozdzielającego (3,65 ml wody destylowanej, 2,5 ml 4 x dolny bufor żelowy o pH 8,8, 3,75 ml 40% akrylamidu, 100 μl 10% APS i 4 μl TEMED).
    1. W komorze elektroforetycznej wlać żel do układania w stos (5% akrylamidu) na żel separujący (15% akrylamidu) po jego zestaleniu. Włóż grzebień żelowy do żelu do układania.
  6. Wykonaj PAGE zgodnie z następującymi warunkami: początkowy stan pracy: 100 V, 20 min i stan końcowy: 120 V, 40 min.
  7. Zabarwić żel kolorem Coomassie brilliant blue w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aż żel uzyska jednolicie niebieski kolor.
    Uwaga: Barwienie jest zakończone, gdy żel nie jest już widoczny w roztworze barwnika.
  8. Odbarwić go roztworem kwasu octowego (10%) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Zaczną pojawiać się pasma. Kontynuować odbarwianie w temperaturze 4 °C przez noc, aż tło będzie czyste.

2. Synteza peptydów i produkcja przeciwciał monoklonalnych

  1. Pobierz sekwencje aminokwasów Mb z GenBank, w tym tuńczyka, kurczaka, strusia, ssaków domowych, fok i 18 gatunków waleni (tabela 2).
  2. Dopasuj sekwencje za pomocą odpowiedniego oprogramowania16:
    1. Uruchom Eksploratora wyrównania, wybierając opcję Wyrównaj: Edytuj/Buduj wyrównanie na pasku uruchamiania; wybierz opcję Utwórz nową linię trasowania i kliknij przycisk OK. Pojawi się okno dialogowe z pytaniem "Czy budujesz wyrównanie sekwencji DNA lub białka?"
    2. Kliknij przycisk oznaczony "Białko"; wybierz Dane: Otwórz: Pobierz sekwencje z pliku i wybierz plik sekwencji; wybierz polecenie menu Edytuj: Wybierz wszystko, aby wybrać wszystkie miejsca dla każdej sekwencji w zestawie danych w celu utworzenia wyrównania wielu sekwencji.
    3. Wybierz Wyrównanie: Wyrównaj według ClustalW z menu głównego, aby wyrównać wybrane dane sekwencji za pomocą algorytmu ClustalW; wybierz "BLOSUM" jako macierz masy białka, a następnie kliknij przycisk OK.
  3. Przeanalizuj wyrównanie sekwencji:
    1. Skoncentruj się na 5 antygenowych miejscachreaktywnych 17: stanowisku 1 (AKVEADVA, 15-22), miejscu 2 (KASEDLK, 56-62), miejscu 3 (ATKHKI, 94-99), miejscu 4 (HVLHSRH, 113-119) i miejscu 5 (KYKELGY, 145-151) i znajdź fragment zachowany wśród waleni. * (gwiazdka; symbol konsensusu w wyrównaniu (Protokół 2.2.3)) oznacza pozycje, które mają pojedynczą, w pełni zachowaną pozostałość. U waleni znaleziono następujące konserwatywne fragmenty: sekwencję KASEDLKKHG (obejmującą stanowisko 2) i sekwencję HVLHSRHP (obejmującą stanowisko 4).
  4. Zsyntetyzuj fragmenty sekwencji kandydującej zgodnie z analizą sekwencji i sprzęgnij z białkiem albuminy jaja kurzego (OVA) jako białkiem nośnikowym przy użyciu usług komercyjnych.
    1. Dodaj aminokwasy hydrofobowe (np. metioninę) do N-końca antygenowego miejsca reaktywnego, aby zapobiec rozkładowi peptydu (np. M-KASEDLKKHG).
    2. Wydłuż C-koniec antygenowego miejsca reaktywnego w celu wystawienia rdzenia miejsca antygenowego na działanie immunocytów. Ponadto sprzęgnij peptyd z OVA, dodając cysteinę (Cys, C) do C-końca (np. M-KASEDLKKHG-NTVL-C).
  5. Emulgować kompletny adiuwant Freunda dla immunogenu 1 lub niekompletny adiuwant Freunda dla immunogenu 2 z równą objętością każdego syntetycznego peptydu w PBS (3 ml, stężenie końcowe 30-50 μg/100 μl).
  6. Zaszczepić immunogen 1 (0,1 mg) podskórnie każdej z 5 samic myszy BALB/c.
  7. Wykonaj podskórne wstrzyknięcia przypominające pięć razy przy użyciu immunogenu 2 w odstępach dwutygodniowych i pobierz surowice testowe za pomocą klipsa do ogona od myszy przed każdą dawką przypominającą.
  8. Określić miano surowicy dla pierwszego badania przesiewowego.
    1. Rozpuścić 100 μg wolnego peptydu w 25 ml buforu reakcyjnego i podwielokrotność 50 μl roztworu w każdym dołku 96-dołkowej płytki. Dodać 10 μl roztworu odczynnika sprzęgającego do każdej studzienki i wymieszać płytkę. Inkubować płytkę przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
    2. Usuń zawartość studzienki, umyj każdą studzienkę 3 razy wodą destylowaną i zablokuj płytkę, dodając 200 μl roztworu blokującego. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Usuń zawartość i umyj każdą studzienkę 3 razy wodą destylowaną.
    3. Wykonać pośredni test ELISA (protokół 5.1-5.7) w celu określenia miana surowicy dla pierwszego badania przesiewowego. Wybierz mysz o najwyższym mianie (najwyższej gęstości optycznej) do pobierania śledziony.
  9. Trzy dni przed pobraniem śledziony należy wstrzyknąć podskórnie 0,1 mg immunogenu 1 myszy o najwyższym mianie.
  10. Zbierz komórki śledziony od wybranych immunizowanych myszy i połącz je z komórkami szpiczaka mysiego F0 (sp2/0-Ag14), aby uzyskać komórki hybrydoma dla generacjimAb 18.
  11. 14 dni po fuzji wybierz dodatnie klony, badając reaktywność supernatantów hybrydoma w kierunku wolnego syntetycznego peptydu za pomocą pośredniego testu ELISA (protokół 5.1-5.7).
  12. Rozcieńczyć komórki do odpowiedniej liczby na studzienkę, aby zmaksymalizować proporcję studzienek, które zawierają tylko jeden pojedynczy klon (klonowanie przez rozcieńczenie).
    1. Dodać 100 μl pożywki do hodowli komórkowych do wszystkich studzienek na płytce 96-dołkowej, z wyjątkiem basenika A1, który pozostaje pusty.
    2. Dodać 200 μl zawiesiny komórek do dołka A1. Następnie szybko przenieś 100 μl z punktu A1 do punktu B1 i delikatnie wymieszaj, pipetując. Powtórzyć te rozcieńczenia 1:2 w dół całej kolumny, a następnie odrzucić 100 μl z H1, tak aby uzyskać taką samą objętość, jak studzienki nad nią.
    3. Dodać dodatkowe 100 μl pożywki do kolumny 1 za pomocą 8-kanałowej mikropipety. Następnie szybko przenieść 100 μl z każdej ze studzienek w kolumnie 1 do studzienek w kolumnie 2 za pomocą tej samej pipety i wymieszać, delikatnie pipetując.
    4. Używając tych samych końcówek, powtórz te rozcieńczenia 1:2 na całej płytce. Odrzucić 100 μl z każdej ze studzienek w ostatniej kolumnie.
    5. Doprowadzić końcową objętość wszystkich studzienek do 200 μl, dodając 100 μl pożywki do każdej studzienki. Inkubować płytkę w stanie niezakłóconym w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze CO2 .
    6. Sprawdź każdą studzienkę i zaznacz wszystkie studzienki, które zawierają tylko jedną kolonię. Przeprowadzić dwa lub więcej klonów, aż >90% studzienek zawierających pojedyncze klony będzie dodatnich pod względem produkcji przeciwciał.
  13. Przesiewaj klony za pomocą western blot i dot blot (protokół 3.1-4.6). Następnie subkulturuj kolonie ze studni do większych naczyń, aby rozszerzyć komórki w celu uzyskania mAb. Zwykle każdy klon jest przenoszony do pojedynczego dołka na płytce 12- lub 24-dołkowej.
  14. Zmierz powinowactwo między mAb a ekstraktami mięśniowymi z krów, kóz, świń, psów, królików, tuńczyków, kurczaków, fok i czterech reprezentatywnych gatunków waleni za pomocą western blot i dot blot (protokół 3.1-4.6).
  15. Zaszczepić wybrane komórki hybrydoma (do 3 x 106) dootrzewnowo myszom w celu wywołania wodobrzusza. Obrzęk brzucha jest zwykle widoczny w ciągu 7-10 dni po wstrzyknięciu hybrydomy. Zebrać płyn za pomocą igły podskórnej (mniej niż 20 g).
  16. Wirówka wodobrzusza płyn (10 000 x g przez 10 min) w celu usunięcia komórek i zanieczyszczeń. Przefiltruj przez filtr 0,45 μm. Dodać 1 do 20 ml próbki, 15 ml buforu wiążącego i 3-5 ml buforu elucyjnego do kolumny białka G Sepharose. Zbierz frakcję elucyjną zawierającą oczyszczone przeciwciało z płynu wodobrzusza myszy.
  17. Określ izotyp przeciwciała za pomocą zestawu do izotypowania przeciwciał, korzystając z instrukcji producenta.

3. Western Blot

  1. Przygotować 2x bufor ładujący zawierający β-merkaptoetanol (BME) przez zmieszanie 950 μl 2x buforu próbki Laemmli z 50 μl BME. Rozcieńczyć supernatanty mięśniowe (protokół 1.1-1.4) w buforze ładującym w odpowiednim stosunku do uzyskania dobrych sygnałów: 1:50 (i foka) i 1:5 (zwierzęta domowe i tuńczyk) w przypadku stosowania poliklonalnego królika przeciwko ludzkiemu przeciwciału Mb oraz 1:1 (świnia, królik, kurczak i tuńczyk), 1:5 (krowa, koza i pies) i 1:25 (i foka), gdy przeciwciało pochodzi z supernatantu hybrydoma.
  2. Podgrzewać próbkę w temperaturze 95 °C przez 5 minut. Próbki należy załadować do studzienek z żelem SDS-PAGE (4% akryloamidu w stosy i 12% w oddzieleniu akrylamidu) wraz ze znacznikami masy cząsteczkowej. Uruchom żel na 5 minut przy 50 V, a następnie zwiększ napięcie do 150 V, aby zakończyć pracę w około 1 godzinę.
  3. Umieść żel w 1x buforze transferowym na 15 minut. Przenieś oddzielone białko do membran nitrocelulozowych (NC) po ich rozdzieleniu przez PAGE. Transfer może odbywać się przy napięciu 100 V przez 60-90 min.
  4. Przygotuj roztwór blokujący: 1x PBS zawierający 0,1% Tween 20 z 5% odtłuszczonego mleka w proszku. Zablokować membranę NC w 25 ml roztworu blokującego w temperaturze pokojowej na 1 godzinę. Przemyć trzy razy przez 5 minut każdy 15 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami za pomocą Tween 20 (PBST).
  5. Inkubować błonę i przeciwciało pierwszorzędowe (płyn wodobrzuszny lub supernatant hybrydoma) w 10 ml buforu do rozcieńczania przeciwciał rozcieńczonym 5% roztworem blokującym w temperaturze 4 °C przez noc.
  6. Ponownie przemyć membranę trzy razy PBST, aby usunąć nadmiar przeciwciał.
  7. Inkubować błonę z kozią anty-mysią IgG sprzężoną z fosfatazą alkaliczną w stosunku 1:1,250 w roztworze blokera z delikatnym mieszaniem przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  8. Ponownie umyć membranę i inkubować ją w mieszaninie substratu fosfatazy 5-bromo-4-chloro-3-indolilowo-fosforanowej/p-nitroniebieskiego chlorku tetrazolu (BCIP/NBT) przez 10 do 20 minut, aż do uzyskania koloru.
  9. Zatrzymaj reakcję, myjąc membranę w kilku zmianach wody destylowanej.

4. Plama punktowa

  1. Rozcieńczyć supernatanty mięśniowe (protokół 1.1-1.4) w 5% albuminie surowicy bydlęcej (BSA) w PBST w odpowiednim stosunku dla uzyskania dobrych sygnałów: 1:5 dla zwierząt domowych i tuńczyka oraz 1:25 dla waleni i fok. Umieścić 5 μl próbek na membranie. Zminimalizuj obszar, w który wnika roztwór (zwykle o średnicy 3-4 mm), nakładając go powoli.
  2. Wysuszyć membranę w temperaturze pokojowej (np. w przepływie laminarnym przez 30-60 minut), zablokować ją roztworem blokującym na szalce Petriego na 1 godzinę w temperaturze pokojowej i przemyć PBST.
  3. Inkubować błonę z pierwszorzędowym przeciwciałem (mAb z supernatantu hybrydoma w stosunku 1:10 000 lub płyn wodobrzuszny w stosunku 1:100 000 rozcieńczony w 5% roztworze blokującym) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  4. Użyj PBST do trzykrotnego przemycia membrany przez 5 minut w celu usunięcia nadmiaru przeciwciała, a następnie inkubuj ją z przeciwciałem drugorzędowym (kozia anty-mysia IgG sprzężona z fosfatazą alkaliczną w stosunku 1:1,250 w 5% roztworze blokującym) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  5. Ponownie umyć membranę i inkubować ją w mieszaninie substratu fosfatazy BCIP/NBT w ciągu 10 do 20 minut, aż do uzyskania koloru.
  6. Zatrzymaj reakcję, myjąc membranę w kilku zmianach wody destylowanej.

5. Pośredni ELISA

  1. Przygotować bufor do przemywania (0,002 M soli fizjologicznej buforowanej imidazolem z 0,02% Tween 20). Umyj płytkę 3 razy buforem myjącym między każdym kolejnym krokiem (protokół 5.2-5.5).
  2. Przygotować rozcieńczenie supernatantów mięśniowych w stosunku 1:25 (protokół 1.1-1.4) w buforze powlekającym. Pokryć 96-dołkową płytkę ELISA 100 μl rozcieńczonymi supernatantami w temperaturze 4 °C przez noc i zablokować ją buforem blokującym (1% BSA w PBS) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  3. Przygotować rozcieńczenie oczyszczonego mAb w stosunku 1:2,000 z rozcieńczonym buforem i dodać 100 μl rozcieńczonego mAb do każdego dołka. Inkubować płytkę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  4. Dodać kozią antymysią IgG sprzężoną z peroksydazą chrzanową (rozcieńczenie 1:200 w rozcieńczonym buforze) do dalszej inkubacji.
  5. Dodać substrat peroksydazy do każdego dołka (100 μl/dołek) i inkubować przez 10-15 minut.
  6. Zatrzymać reakcję enzymatyczną za pomocą roztworu zatrzymującego peroksydazę (100 μl/dołek), gdy obserwuje się rozwój koloru.
  7. Odczytaj gęstość optyczną przy 450 nm za pomocą spektrofotometru mikropłytkowego.

6. Przygotowanie mAb znakowanego złotem koloidalnym

Uwaga: Kolor roztworu złota koloidalnego i mieszaniny powinien być zawsze czerwony. Dostosuj pH, stężenie mAb, prędkość wirowania, gdy zauważy się osad. Kroki 6.1 i 6.2 są krokami optymalizacji.

  1. Dodać oczyszczony wykrywający mAb (50 μg/ml, 3 μl) do 100 μl koloidalnego roztworu złota o wartościach pH w zakresie 5-9. Minimalne pH, które utrzymuje kolor czerwony przez dwie godziny, jest uważane za optymalne pH. Uwaga: W tym badaniu użyto 0,1 M węglanu potasu do dostosowania roztworu złota koloidalnego (40 nm) do pH 8,0 (optymalne pH).
  2. Dodać różne ilości oczyszczonego wykrywającego mAb (500 μg/ml, 1-20 μl) do 100 μl roztworu złota koloidalnego o pH 8,0. Uwaga: Optymalne stężenie w tym badaniu wynosi 6 μg/ml (bez czarnego osadu).
  3. Zgodnie z powyższymi wynikami dodać kroplami 60 μg oczyszczonego mAb wykrywającego do 10 ml roztworu złota koloidalnego. Mieszaninę delikatnie emulgować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Dodać 2 ml 5% roztworu BSA w PBS (pH 7,4) do mieszaniny i delikatnie emulgować w temperaturze pokojowej przez 15 minut, aby zmniejszyć zakłócenia tła.
  4. Odwirować mieszaninę przy 10 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Ostrożnie usunąć supernatant z niesprzężonym przeciwciałem i zawiesić powstałe osadki w 4 ml PBST zawierającym 1% BSA i 0,1% Tween 20, a następnie powtórzyć kilkakrotnie wirowanie i zawiesinę.
  6. Zawiesić końcowe osady w 1 ml PBST i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu ich wykorzystania.

7. Budowa paska odpornościowego

Uwaga: Rysunek 1 przedstawia projekt paska odpornościowego. Przygotuj i zmontuj paski w warunkach laboratoryjnych o niskiej wilgotności (< 20% wilgotności względnej), aby przedłużyć okres przechowywania (> 1 rok). Wymiary bloczków i membrany to: podkładka sprzężona 300 mm x 10 mm, podkładka chłonna 300 mm x 24 mm, podkładka na próbkę 300 mm x 24 mm, membrana NC 300 mm x 25 mm, tektura 300 mm x 80 mm.

  1. Dodać roztwór mAb znakowany złotem koloidalnym z kroku 6.6 za pomocą mikropipety, aby nasycić koniugatową podkładkę, a następnie wysuszyć ją w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę przed złożeniem.
  2. Rozprowadzić swoiste mAb wychwytujące antygen (500 μg/ml) w strefie testowej i królicze przeciwciało anty-mysie IgG (500 μg/ml) w strefie kontrolnej w celu wykrycia mAb na membranie NC za pomocą pipety lub drukarki immunopaskowej. Zachowaj odległość (>5 mm) między dwiema strefami, aby uniknąć zakłóceń.
  3. Wklej sprzężoną podkładkę, podkładkę chłonną i membranę NC na tekturę za pomocą taśmy dwustronnej.
    Uwaga: Nakładaj na siebie podkładki po każdej stronie membrany NC na około 2 mm. Niewłaściwa konstrukcja paska spowoduje niepełny test.
  4. Umieść podkładkę próbki na bloczku sprzężonym (2 mm) i wklej ją na tekturze.
  5. Utwórz paski o szerokości 6 mm za pomocą gilotyny do papieru. Zapakuj paski w torebkę z folii aluminiowej ze środkiem osuszającym i przechowuj je w temperaturze 4 °C do czasu użycia.

8. Test reaktywności krzyżowej

  1. Homogenizować 0,03 g próbki surowych mięśni z 1 ml PBS (zawierającym 0,1% BSA) w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml za pomocą bambusowego patyczka lub pręta szlifierskiego.
  2. Przytrzymaj pasek za koniec przeciwny do obszarów testowych i zanurz część podkładki próbki w próbce na 5-10 minut i obserwuj wynik bezpośrednio.
    1. Opcjonalnie: Zebrać 500 μl supernatantu i przenieść go do nowej probówki wirówkowej.
      Uwaga: Ten krok jest zalecany, jeśli sygnał nie jest oczywisty, gdy pasek jest bezpośrednio zanurzony w supernatantze.
  3. Przetestuj różne próbki mięśni w trzech egzemplarzach.
    Uwaga: Tutaj przetestowaliśmy tuńczyka, kurczaka, fokę, 15 gatunków waleni i 5 gatunków ssaków lądowych.
  4. Niech pięciu niezależnych inspektorów powtórzy punkt 8.3 pięć razy, tj. zużywa w sumie 575 pasków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Charakterystyka przeciwciał monoklonalnych

Opracowaliśmy dwa mAb IgG1 (CGF5H9 i CSF1H13) rozpoznające odpowiednio dwa syntetyczne peptydy (MKASEDLKKHGNTVLC i AIIHVLHSRHPAEFGC) waleni Mb, które zostały użyte do skonstruowania testowego testu immunochromatograficznego z koloidalnego złota typu kanapkowego do szybkiego wykrywania Mb waleni. Rysunek 2 pokazuje, że CGF5H9 wykrywa i inne ssaki jako pojedyncze barwione prążki o przewidywanej masie cząstec...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stosowanie syntetycznego peptydu sprzężonego z białkiem nośnikowym jest znacznie skuteczniejsze w porównaniu z białkiem pokrewnym. W przypadku techniki opartej na kanapkach, ponieważ mAb jest opracowywany przy użyciu epitopów o znanych względnych lokalizacjach, jest mało prawdopodobne, aby dwa mAb w tym badaniu zakłócały wzajemną interakcję z docelowym epitopem antygenu. Co więcej, reaktywność między białkiem natywnym a przeciwciałem myszy immunizowanych syntetycznym koniugatem peptydowym może być silniejsza niż reaktywn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy kolegom z Tajwańskiego Towarzystwa Waleni, Biologii Morskiej i Centrum Badań nad Waleniami Narodowego Uniwersytetu Cheng Kung, Farglory Ocean Park oraz Centrum Diagnostyki Chorób Zwierząt Narodowego Uniwersytetu Chiayi za pobranie próbek. Projekt ten został sfinansowany z grantu dla WCY z Rady Rolnictwa Tajwanu (100AS-02.1-FB99).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Solanka fizjologiczna buforowana fosforanamiAMRESCOJ373
Białko G HP SpinTrap GE  Opieka zdrowotna28-9031-34kolumna wirowa zawierająca białko G Sepharose
IsoStrip Mysz Zestaw do izotypowania przeciwciał monoklonalnychRoche11493027001Paski izotypowe, wstępnie pokryte przeciwciałami anty-mysim Ig specyficznymi dla podklas i łańcuchów lekkich
Mini Trans-BlotBio-Rad170-3935
Membrana nitrocelulozowaPrzeciwciało WhatmanZ613630
Rozwiązanie blokujące LTK BioLaboratoriesW celu zminimalizowania niespecyficznych oddziaływań wiążących niespecyficznych IgG w próbkach
Substrat fosfatazy BCIP/NBT KPL50-81-00
Detektor białek HRP Microwell Kit, Anti-MouseKPL54-62-18
Nunc Immunoplate MaxiSorp Płytka ELISATermo  Fisher ScientificEW-01928-08
Multiskan  Czytnik EX ELISA Termo  Elektron  Corporation51118170
roztwór złota koloidalnego (40 nm) REGA biotechnologia Inc.40-50 nm jest odpowiedni dla
albuminy surowicy bydlęcejimmunostrip Gibco15561-020
Szybki test drukarki immno-stripREGA biotechnology Inc.AGISMART RP-1000 Nadaje się tylko do produkcji na małą skalę pasków immunologicznych do celów badawczo-rozwojowych
Elementy paskowe (membrany NC, podkładki na próbki (#33 szkło, S& S), pady sprzężone (#16S, S& S) i wkłady chłonne (CF6, Whatman)REGAbiotechnology Inc.
Freund' s adiuwant i niepełny Freund' s adiuwant Sigma-AldrichF5881, F5506Służy do wytwarzania emulsji typu woda w oleju immunogenów
Akrylamid, bufor żelowy, nadsiarczan amonu (APS), tetrametyloetylenodiamina (TEMED) ProtechPreparat żelowy do SDS-PAGE
Coomassie błękit brylantowy R-250Bio-Rad1610436Barwienie białek w żelach SDS-PAGE
Bufor do próbek Laemmli i β-merkaptoetanolBio-Rad1610737, 1610710Rozcieńczyć próbki białek przed załadowaniem na żele SDS-PAGE

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Robards, M. D., Reeves, R. R. The global extent and character of marine mammal consumption by humans: 1970-2009. Biol. Conserv. 144, 2770-2786 (2011).
  2. Booth, S., Zeller, D. Mercury, food webs, and marine mammals: implications of diet and climate change for human health. Environ. Health Perspect. 113, 521-526 (2005).
  3. Endo, T., et al. Total mercury, methyl mercury, and selenium levels in the red meat of small cetaceans sold for human consumption in Japan. Environ. Sci. Technol. 39, 5703-5708 (2005).
  4. Tryland, M., et al. Human pathogens in marine mammal meat. Norwegian Scientific Committee for Food Safety (VKM). , (2011).
  5. Matsunaga, T., et al. A quick and simple method for the identification of meat species and meat products by PCR assay. Meat Sci. 51, 143-148 (1999).
  6. Dalebout, M. L., Helden, A. V., van Waerebeek, K., Baker, C. S. Molecular genetic identification of southern hemisphere beaked whales (Cetacea: Ziphiidae). Mol. Ecol. 7, 687-694 (1998).
  7. Dalmasso, A., et al. A multiplex PCR assay for the identification of animal species in feedstuffs. Mol. Cell. Probes. 18, 81-87 (2004).
  8. Kesmen, Z., Sahin, F., Yetim, H. PCR assay for the identification of animal species in cooked sausages. Meat Sci. 77, 649-653 (2007).
  9. Liu, L., Chen, F. -C., Dorsey, J. L., Hsieh, Y. -H. P. Sensitive Monoclonal Antibody-based Sandwich ELISA for the Detection of Porcine Skeletal Muscle in Meat and Feed Products. J. Food Sci. 71, 1-6 (2006).
  10. Kotoura, S., et al. A Sandwich ELISA for the Determination of Beef Meat Content in Processed Foods. Food Sci. Techno. Res. 15, 613-618 (2009).
  11. Hsieh, Y. H., Chen, Y. T., Gajewski, K. Monoclonal antibody-based sandwich ELISA for reliable identification of imported Pangasius catfish. J. Food Sci. 74, 602-607 (2009).
  12. Ross, H. A., et al. DNA surveillance: web-based molecular identification of whales, dolphins, and porpoises. J.Hered. 94, 111-114 (2003).
  13. Ngom, B., Guo, Y., Wang, X., Bi, D. Development and application of lateral flow test strip technology for detection of infectious agents and chemical contaminants: a review. Anal. Bioanal. Chem. 397, 1113-1135 (2010).
  14. Muldoon, M. T., Onisk, D. V., Brown, M. C., Stave, J. W. Targets and methods for the detection of processed animal proteins in animal feedstuffs. Int. J. Food Sci. Technol. 39, 851-861 (2004).
  15. Rao, Q., Hsieh, Y. H. Evaluation of a commercial lateral flow feed test for rapid detection of beef and sheep content in raw and cooked meats. Meat Sci. 76, 489-494 (2007).
  16. Tamura, K., et al. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol. Biol. Evol. 28, 2731-2739 (2011).
  17. Atassi, M. Z. Antigenic structure of myoglobin: the complete immunochemical anatomy of a protein and conclusions relating to antigenic structures of proteins. Immunochemistry. 12, 423-438 (1975).
  18. Zhang, C. Hybridoma technology for the generation of monoclonal antibodies. Methods Mol. Biol. 901, 117-135 (2012).
  19. Kao, D. J., Hodges, R. S. Advantages of a synthetic peptide immunogen over a protein immunogen in the development of an anti-pilus vaccine for Pseudomonas aeruginosa. Chem. Biol. Drug Des. 74, 33-42 (2009).
  20. Dolar, M. L., Suarez, P., Ponganis, P. J., Kooyman, G. L. Myoglobin in pelagic small cetaceans. J. Exp. Biol. 202, 227-236 (1999).
  21. Lo, C., et al. Rapid immune colloidal gold strip for cetacean meat restraining illegal trade and consumption: implications for conservation and public health. PLoS ONE. 8, e60704(2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Colloidal Gold Immunochromatographic Test StripCetacean Myoglobin DetectionMonoclonal Antibody DevelopmentPeptide Sequence AnalysisWestern Blot AnalysisDot Blot AnalysisIndirect ELISA ScreeningMuscle Sample HomogenizationNitrocellulose Membrane AssemblyRapid Field Detection

Powiązane artykuły