Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Obrazowanie struktur subkomórkowych w żywym zarodku danio pręgowanego

11.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53456

⸱

2 kwietnia 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Neuronal Cell Biology, Technische Universität München, 2Cell Biology, Department of Biology, Faculty of Science, Utrecht University, 3Faculty of Biology, Ludwig-Maximilians-Universität-München, 4Adolf-Butenandt-Institute, Biochemistry, Ludwig-Maximilians-Universität-München, 5German Center for Neurodegenerative Diseases, 6Laboratory of Brain Development and Repair, The Rockefeller University

W tym artykule

Podsumowanie

Obrazowanie dynamicznego zachowania organelli i innych struktur subkomórkowych in vivo może rzucić światło na ich funkcję w warunkach fizjologicznych i chorobowych. W tym artykule przedstawiono metody genetycznego znakowania dwóch organelli, centrosomów i mitochondriów oraz obrazowania ich dynamiki w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą mikroskopii szerokokątnej i konfokalnej.

Streszczenie

Obrazowanie in vivo zapewnia bezprecedensowy dostęp do dynamicznego zachowania struktur komórkowych i subkomórkowych w ich naturalnym kontekście. Przeprowadzanie takich eksperymentów obrazowych u wyższych kręgowców, takich jak ssaki, zazwyczaj wymaga chirurgicznego dostępu do badanego systemu. Dostępność optyczna embrionalnych i larwalnych danio pręgowanego pozwala na obejście takich inwazyjnych procedur i umożliwia obrazowanie w nienaruszonym organizmie. Rzeczywiście, danio pręgowany jest obecnie dobrze ugruntowanym modelem do wizualizacji dynamicznych zachowań komórkowych przy użyciu mikroskopii in vivo w szerokim zakresie kontekstów rozwojowych, od proliferacji po migrację i różnicowanie. Nowszym osiągnięciem jest coraz częstsze wykorzystanie danio pręgowanego do badania zdarzeń subkomórkowych, w tym transportu mitochondrialnego i dynamiki centrosomów. Względna łatwość, z jaką te subkomórkowe struktury mogą być genetycznie znakowane przez białka fluorescencyjne i zastosowanie technik mikroskopii świetlnej do ich obrazowania, przekształca danio pręgowanego w model biologii komórki in vivo. Tutaj opisujemy metody generowania konstruktów genetycznych, które fluorescencyjnie znakują organelle, podkreślając mitochondria i centrosomy jako konkretne przykłady. Używamy dwuczęściowego systemu Gal4-UAS w wielu konfiguracjach, aby ograniczyć ekspresję do określonych typów komórek i zapewnić protokoły do generowania przejściowo eksprymujących i stabilnych ryb transgenicznych. Na koniec podajemy wskazówki dotyczące wyboru metod mikroskopii świetlnej, które są najbardziej odpowiednie do obrazowania dynamiki subkomórkowej.

Wprowadzenie

Obrazowanie in vivo zapewnia bezpośrednią wizualizację zachowań komórek w najbardziej fizjologicznym kontekście. Przezroczystość zarodków danio pręgowanego, ich szybki i zewnętrzny rozwój oraz bogaty wachlarz narzędzi genetycznych, które umożliwiają znakowanie fluorescencyjne, przyczyniły się do coraz powszechniejszego stosowania mikroskopii in vivo w celu wyjaśnienia dynamiki kluczowych zdarzeń rozwojowych. Na przykład badania obrazowe rozwoju układu nerwowego u danio pręgowanego znacznie poszerzyły naszą wiedzę na temat zachowania neuronalnych komórek progenitorowych i losu ich potomstwa, w tym ich późniejszej migracji, różnicowania i integracji obwodów.

Scena jest teraz gotowa do zbadania dynamiki subkomórkowej leżącej u podstaw tych zachowań komórkowych. Danio pręgowany jest już wykorzystywany jako narzędzia w biologii komórki in vivo. Obecnie możliwe jest uwidocznienie mitochondriów9-11, centrosomów2,8,12-14, Golgiego15, cytoszkieletu mikrotubuli4 i aktyny16, endosomów17 i składników kompleksu błony wierzchołkowej1,18, wśród innych struktur subkomórkowych w zarodkach danio pręgowanego in vivo. Jak dotąd wiele z tego, co wiadomo o funkcji tych organelli, pochodzi z badania ich zachowania w hodowanych komórkach. Podczas gdy badania in vitro przyniosły ogromny wgląd w biologię komórki, komórki w hodowli nie reprezentują w pełni złożoności sytuacji in vivo, a zatem niekoniecznie odzwierciedlają funkcję i dynamikę organelli subkomórkowych in vivo. Zarodki danio pręgowanego stanowią realną alternatywę in vivo dla badania dynamiki subkomórkowej.

Jako kręgowce, danio pręgowany posiada wiele układów narządów (np. siatkówkę nerwową), które są homologiczne do tych występujących u gatunków ssaków. Ponadto zarodki danio pręgowanego są coraz częściej wykorzystywane do modelowania chorób człowieka19,20, w tym związanych z funkcją centrosomalną (np. małogłowie21 i wrodzona ślepota Lebera22) oraz funkcją mitochondriów (np. choroba Parkinsona23, tauopapatie10,24 i zespół Bartha25). Obrazowanie in vivo na poziomie komórkowym i subkomórkowym w tych przypadkach pozwoli lepiej zrozumieć biologię komórki leżącą u podstaw tych stanów patologicznych.

Ogólnym celem opisanych tutaj metod jest dostarczenie kompleksowego przewodnika do badania organelli i innych struktur subkomórkowych w zarodkach danio pręgowanego za pomocą mikroskopii świetlnej in vivo. Opisano cały przepływ pracy związany z wizualizacją i śledzeniem struktur subkomórkowych in vivo - od podejść do znakowania genetycznego, przez generowanie przejściowo eksprymujących i stabilnych ryb transgenicznych, a na końcu do obrazowania za pomocą mikroskopii szerokokątnej i konfokalnej. Podczas gdy każda z tych procedur jest stosowana przez liczne laboratoria danio pręgowanego, opisane protokoły są zoptymalizowane i usprawnione pod kątem badania dynamiki struktur subkomórkowych. Warto wspomnieć o dwóch konkretnych aspektach opisanej tu pracy: Po pierwsze, zastosowanie systemu ekspresji Gal4-UAS w wielu konfiguracjach do genetycznego znakowania organelli w określonych typach komórek. Po drugie, bezpośrednie porównanie mikroskopii szerokokątnej i konfokalnej z obrazowaniem struktur subkomórkowych in vivo.

Obecne strategie genetycznego znakowania organelli i innych struktur subkomórkowych u ryb danio pręgowanych wykorzystują mRNA1,4,8 z czapeczką lub konstrukty oparte na DNA, gdzie elementy promotora bezpośrednio sterują ekspresją białek fuzyjnych9,14,15. Transkrybowane in vitro ograniczone RNA powoduje szybką i szeroką ekspresję, która nie jest jednak specyficzna dla tkanki. Ponadto poziomy ekspresji zmniejszają się z czasem, gdy zakryte RNA jest rozcieńczane lub degradowane. W związku z tym zastosowanie konstruktów opartych na RNA do badania dynamiki organelli na późniejszych etapach rozwoju jest ograniczone (zwykle do 3 dni po zapłodnieniu).

Te ograniczenia można przezwyciężyć za pomocą konstrukcji DNA, gdzie przestrzenna i czasowa kontrola ekspresji jest określana przez określone elementy promotora. Gdy konstrukty oparte na DNA są używane w kontekście systemu Gal4-UAS, obserwuje się znaczną poprawę poziomów ekspresji transgenów26,27. W tym dwudzielnym systemie ekspresji elementy promotora specyficzne dla typu komórki napędzają ekspresję aktywatora transkrypcji Gal4, podczas gdy geny reporterowe są klonowane poniżej sekwencji aktywującej wiązanie Gal4 (UAS). Łącząc reportery UAS z odpowiednimi sterownikami Gal4, ekspresja może być ograniczona do określonych typów komórek, omijając potrzebę klonowania genów reporterowych za różnymi promotorami za każdym razem, gdy pożądany jest określony wzorzec ekspresji. Co więcej, ekspresja wielu genów reporterowych UAS może być sterowana przez pojedynczy aktywator Gal4. System Gal4-UAS zapewnia zatem wszechstronne i elastyczne podejście genetyczne do znakowania subkomórkowego.

Mikroskopy konfokalne i szerokokątne są najdoskonalszymi narzędziami większości laboratoriów. Systemy szerokokątne zazwyczaj wykorzystują lampę łukową jako źródło światła i wykrywają emitowane światło za pomocą czułej kamery, która jest umieszczona na końcu ścieżki światła. Ta metoda obrazowania jest zwykle ograniczona do cienkich próbek, ponieważ nieostre światło przesłania ostre informacje w grubszych próbkach. Mikroskopy konfokalne różnią się od systemów szerokokątnych tym, że są zbudowane tak, aby faworyzować sygnały pochodzące z płaszczyzny ogniskowej nad tymi, które pochodzą z nieostrości (tj. "sekcja optyczna")28. Aby uzyskać przekrój optyczny, na ścieżce emisji umieszcza się otworek w pozycji sprzężonej z punktowym źródłem światła. Jako źródła światła stosuje się lasery, a sygnały są wykrywane za pomocą fotopowielaczy (PMT). W praktyce wiązka laserowa jest przesuwana po próbce punkt po punkcie, a emisja fluorescencji w każdym punkcie (pikselu) jest wykrywana przez PMT.

Tutaj obrazujemy dokładnie te same struktury subkomórkowe w żywych zarodkach danio pręgowanego, używając zarówno mikroskopii szerokokątnej, jak i konfokalnej, aby zapewnić bezpośrednie porównanie obu modalności mikroskopii. Podstawowym celem takich porównań jest przedstawienie wskazówek dotyczących wyboru najbardziej odpowiedniej techniki mikroskopowej dla konkretnego pytania.

Korzystając z opisanych tutaj metod, demonstrujemy genetyczne znakowanie mitochondriów i centrosomów oparte na Gal4-UAS. Organelle te są obrazowane w różnych typach komórek układu nerwowego oraz w komórkach mięśniowych za pomocą mikroskopii szerokokątnej i konfokalnej, aby wykazać przydatność każdej metody obrazowania. Opisane tutaj metody można łatwo dostosować do badania innych organelli i struktur subkomórkowych w żywym zarodku danio pręgowanego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie doświadczenia na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z lokalnymi przepisami rządu Górnej Bawarii (Monachium, Niemcy).

1. Markowanie organelli i innych struktur subkomórkowych

UWAGA: Opisano tutaj genetyczne konstrukty reporterowe, które fluorescencyjnie znakują centrosomy, mitochondria i błony komórkowe.

  1. Zastosować konwencjonalne metody klonowania29 w celu wytworzenia białek fuzyjnych, które fluorescencyjnie znakują centrosomy i mitochondria. Sekwencję kodującą centrynę 4 (cetn4) ryby danio-pręgowanego sklonować w tej samej ramce odczytu z białkiem fluorescencyjnym2 (FP), takim jak żółte białko fluorescencyjne, aby otrzymać cetn4-YFP. Sekwencję kierującą do mitochondriów podjednostki VIII cytochromu c oksydazy sklonować w tej samej ramce odczytu z białkiem FP, takim jak cyjanowe białko fluorescencyjne, aby otrzymać mitoCFP9-11.
  2. Aby ograniczyć ekspresję białek fuzyjnych (cetn4-YFP lub mitoCFP) do konkretnych komórek zarodka danio-pręgowanego (np. neuronów lub komórek mięśniowych), zastosować dwuczęściowy system ekspresyjny Gal4-UAS26,27. Najpierw wytworzyć konstrukt reporterowy UAS. Wykorzystując konwencjonalne metody, sklonować białko fuzyjne w wektorze ekspresyjnym UAS, poniżej kasety UAS wiążącej Gal4 (warianty obejmują od 1x do 14x UAS, patrz: Dyskusja)26,27,30 i minimalnego promotora (promotor bazalny E1b z genu βaktyny karpia), a następnie wytworzyć UAS:cetn4-YFP oraz UAS:mitoCFP.
    UWAGA: W celu przygotowania konstruktów reporterowych UAS do wytworzenia stabilnych linii transgenicznych konieczne jest sklonowanie dodatkowych elementów (patrz 3 poniżej)
  3. Aby zwizualizować kontekst komórkowy, w którym znakowane są centrosomy lub mitochondria, wytworzyć konstrukt reporterowy UAS, w którym błony komórkowe są znakowane białkami FP. Pierwsze dwadzieścia aminokwasów Gap43 ryby danio-pręgowanego (zawierających miejsca palmitoilacji) sklonować w tej samej ramce odczytu z białkiem FP, aby skierować to białko FP do błony komórkowej (memFP)31,32.
  4. Pozyskać konstrukty sterujące (driver) lub linie transgeniczne, w których elementy promotora specyficzne dla typu komórek sterują ekspresją aktywatora transkrypcyjnego Gal4-VP1627, Gal4FF33 lub KalTA430.
  5. Połączyć konstrukty reporterowe UAS z odpowiednim konstruktem sterującym, aby ograniczyć ekspresję do pożądanego typu komórek (np. w neuronach lub komórkach mięśniowych). W tym celu współwstrzyknąć konstrukt sterujący Gal4 i konstrukty reporterowe UAS w stadium jednego komórki zapłodnionych jaj (szczegółowe instrukcje znajdują się w punkcie 2 poniżej), aby uzyskać ryby z ekspresją przejściową. Alternatywnie, wytworzyć stabilną linię transgeniczną reportera UAS (szczegółowe instrukcje w punkcie 3 poniżej) i skrzyżować ją ze stabilną linią transgeniczną sterującą Gal4, aby uzyskać potomstwo posiadające oba transgeny.
    UWAGA: Możliwe jest również wstrzyknięcie konstruktu/ów reporterowych UAS do zapłodnionych jaj pochodzących ze stabilnej linii transgenicznej sterującej Gal4 lub wstrzyknięcie konstruktu sterującego Gal4 do zapłodnionych jaj pochodzących ze stabilnej linii transgenicznej reportera UAS.
  6. Aby współwyrazić wiele różnych białek fuzyjnych przy użyciu systemu Gal4-UAS, zastosować sterownik Gal4 i reportery UAS w jednej z następujących konfiguracji: A. Wiele oddzielnych konstruktów reporterowych UAS (np. UAS:mitoCFP i UAS:memYFP współwstrzyknięte z konstruktem sterującym Gal4)10, B. Wiele kaset UAS w jednym reporterze (np. UAS:cetn4-YFP, UAS:memCerulean)12, C. Dwukierunkowy reporter UAS (np. UAS:memYFP,mitoCFP)2,10,24 (Rysunek 1).

Schemat regulacji genu pokazujący układ UAS z genami A i B w celu kontroli ekspresji.
Rycina 1. Strategie koekspresji białek fuzyjnych z wykorzystaniem systemu Gal4-UAS.
Koekspresję wielu białek fuzyjnych można osiągnąć poprzez zastosowanie kaset reporterowych UAS w różnych konfiguracjach: (A) wielu oddzielnych konstruktów sterowanych przez UAS, (B) wielu kaset UAS w obrębie jednego konstruktu lub (C) dwukierunkowej kasety UAS w obrębie jednego konstruktu. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

2. Uzyskanie ryb wykazujących ekspresję przejściową

UWAGA: Niniejszy materiał jest adaptacją wcześniej opublikowanych protokołów34,35Podstawowy zestaw do mikroiniekcji powinien składać się ze stereomikroskopu o powiększeniu do 12x, mikromanipulatora z uchwytem do mikropipety oraz źródła ciśnienia powietrza. Przygotuj punkty 2.1-2.5 z wyprzedzeniem:

  1. Aby przygotować komory do mikroiniekcji jaj, należy sporządzić 1,5% (w/v) roztwór agarozy w wodzie. Dodać proszek agarozy do wody i podgrzewać w mikrofalówce aż do całkowitego rozpuszczenia agarozy. Wypełnić płytkę Petriego (100 x 15 mm) tym roztworem.
    1. Pozostawić roztwór agarozy do schłodzenia do około 45 oC, a następnie umieścić plastikową formę do mikroiniekcji (40 mm x 66 mm, z sześcioma wypustkami o długości 50 mm, szerokości 1,5 mm i głębokości 1 mm, rozmieszczonymi w odstępach 3 mm) na powierzchni roztopionej agarozy, dbając o to, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza na styku faz.
    2. Po zastygnięciu agarozy przechowywać w temperaturze 4 oC przez noc (O/N). Ostrożnie usunąć formę za pomocą szpatułki. Przygotować wiele komór do mikroiniekcji jednocześnie, przechowywać w temperaturze 4 oC i używać wielokrotnie przez kilka tygodni.
  2. Użyć wyciągacza kapilar szklanych do wykonania kapilar iniekcyjnych z długim trzonkiem36.
    UWAGA: Konkretne ustawienia służące do wykonania kapilar iniekcyjnych powinny zostać określone empirycznie. Kapilary iniekcyjne można wyciągnąć z wyprzedzeniem i przechowywać przed użyciem.
  3. Zmierzyć stężenie plazmidowego DNA (konstrukty sterownika Gal4 i reportera UAS) do mikroiniekcji za pomocą spektrofotometru zgodnie z instrukcją producenta. Zmierzyć stosunek absorbancji przy 260 nm i 280 nm (A260/280). Rozcieńczyć DNA do końcowego stężenia 100 ng/µl w wodzie wolnej od nukleaz.
    UWAGA: Stosunek A260/280 na poziomie ~1,8 oznacza czyste DNA. W celu oczyszczenia plazmidowego DNA przeznaczonego do iniekcji można rozważyć użycie komercyjnego zestawu (opartego na matrycy wiążącej z krzemionki). DNA plazmidowe powinno być wysokiej jakości, aby zapobiec toksyczności.
  4. Przygotować 10 µl mieszaniny iniekcyjnej, łącząc DNA (od 0,5 do 2,5 µl zapasu o stężeniu 100 ng/µl dla uzyskania końcowego stężenia od 5 do 20 ng/μl), roztwór Danieau (0,33 µl zapasu 30x), czerwień fenolową (0,25 µl, opcjonalnie) oraz wodę wolną od nukleaz do uzyskania całkowitej objętości 10 μl.
    UWAGA: Empirycznie określić stężenie DNA, które zapewnia odpowiednią ekspresję. Plazmidy sterownika Gal4 i reportera UAS muszą być wstrzykiwane jednocześnie. Brak ekspresji wystąpi w przypadku wstrzyknięcia tylko sterownika Gal4 lub tylko plazmidu reportera UAS do zapłodnionych jaj typu dzikiego. Jeśli jednak zapłodnione jaja pochodzą z linii sterownika Gal4, wystarczy wstrzyknąć jeden lub kilka plazmidów reportera UAS. I odwrotnie, przy mikroiniekcji do linii reportera UAS, należy wstrzyknąć tylko plazmid sterownika Gal4. Należy również pamiętać, że choć czerwień fenolowa znacznie ułatwia wizualizację iniekcji, sama w sobie jest związkiem fluorescencyjnym. W związku z tym czerwień fenolowa może utrudniać wizualizację białek fluorescencyjnych (FP), jeśli obrazowanie jest planowane przed 24 godziną po zapłodnieniu (hpf), ponieważ do tego czasu może nie zostać wystarczająco rozcieńczona.
  5. Wieczorem przed planowanymi iniekcjami przygotować kilka par (zazwyczaj od 5 do 10) samców i samic danio pręgowanego do rozrodu. Użyć zbiorników hodowlanych z wkładką o kratkowanym dnie i wyjmowanym przegrodą do oddzielenia samca od samicy.
    UWAGA: Samce i samice danio pręgowanego można zazwyczaj rozróżnić po kształcie ciała. Samce mają tendencję do bycia smuklejszymi, podczas gdy samice wykazują brzuch wystający brzusznie. Samce mają dodatkowo żółto-czerwoną kolorystykę w brzusznej części brzucha.
  6. Bezpośrednio przed iniekcjami DNA usunąć przegrody, aby umożliwić kopulację samca i samicy. Około 15 do 30 minut po usunięciu przegrody sprawdzić obecność jaj na dnie zbiornika. Przenieść dorosłe ryby za pomocą siatki do nowego zbiornika hodowlanego.
  7. Wylać wodę z nowo złożonymi zapłodnionymi jajami ze zbiornika hodowlanego do sita (np., plastikowego sitka do herbaty). Przemyć jaja w sicie za pomocą butelki z rozpylaczem zawierającej roztwór Danieau. Odwrócić sito nad płytką Petriego i użyć butelki z rozpylaczem z roztworem Danieau, aby zebrać wszystkie jaja (zazwyczaj od 50 do 200 jaj na parę dorosłych ryb).
  8. Używając pipety microloader, napełnić wyciągniętą kapilarę iniekcyjną mieszaniną iniekcyjną DNA. Zamocować kapilarę iniekcyjną w uchwycie mikromanipulatora i pod kontrolą stereomikroskopu przyciąć końcówkę pęsetą, aby stworzyć mikropipetę, która może przebić chorion i cytoplazmę komórki, dostarczając jednocześnie odpowiednią objętość DNA.
    UWAGA: Stopień przycięcia końcówki kapilary iniekcyjnej należy określić empirycznie; najlepiej ocenić go podczas wstrzykiwania do jaj.
  9. Aby określić objętość DNA do iniekcji, wpuścić kroplę roztworu iniekcyjnego do oleju mineralnego. Zmierzyć promień (r) kropli za pomocą mikrometru kalibracyjnego i obliczyć jej objętość (4/3 π r3). Modulować objętość, regulując ciśnienie wstrzykiwania i/lub czas trwania każdego impulsu iniekcyjnego.
  10. Za pomocą plastikowej pipety przenieść wszystkie zebrane jaja (zazwyczaj 50-200, z punktu 2.7 powyżej) do rowków komory do mikroiniekcji. Pod kontrolą stereomikroskopu użyć pęsety, aby zorientować jaja tak, aby cytoplazma komórki (przezroczysta) i żółtko (gęste, nieprzezroczyste) były łatwo identyfikowalne.
  11. Pod kontrolą stereomikroskopu wstrzyknąć DNA do cytoplazmy komórki zapłodnionego jaja, dbając o to, aby wstrzyknięta objętość (1 do 2 nl) odpowiadała około 10% objętości komórki.
    UWAGA: Czerwień fenolowa w roztworze DNA ułatwia wizualizację wstrzykniętej objętości.
  12. Po iniekcji poluzować jaja z rowków formy iniekcyjnej, przepłukując je butelką z rozpylaczem zawierającą roztwór Danieau. Następnie przenieść jaja do nowej płytki Petriego za pomocą plastikowej pipety transferowej i inkubować w temperaturze 28,5 oC.
  13. Zachować nieiniekcyjne jaja jako kontrolę, aby określić, czy iniekcje przyczyniają się do wysokiej śmiertelności, wynikającej albo z uszkodzeń fizycznych powstałych podczas przebijania mikropipetą, albo z mieszanki DNA.
    UWAGA: Wysoka śmiertelność po iniekcjach może wynikać z licznych czynników, w tym zbyt wysokiego stężenia DNA, zbyt dużych objętości iniekcyjnych i/lub zanieczyszczeń w plazmidach. Aby zapobiec toksyczności wynikającej z niskiej jakości preparatów DNA, można użyć komercyjnych zestawów (opartych na matrycy wiążącej z krzemionki).
  14. W regularnych odstępach czasu po iniekcjach użyć stereomikroskopu, aby wyselekcjonować i odrzucić jaja niezapłodnione oraz zarodki martwe lub zdeformowane.
    UWAGA: Jaja, które kilka godzin po zapłodnieniu wydają się być w stadium jednej komórki, uznać za niezapłodnione. Zdeformowane zarodki identyfikować po rażących wadach anatomicznych, takich jak zaburzona oś ciała przednio-tylna. Amorficzny materiał wewnątrz chorionu sugeruje, że zarodek nie przeszedł przez stadia rozwojowe i obumarł. Aby upewnić się, czy zarodki poddane mikroiniekcji przechodzą prawidłowy przebieg rozwoju, należy skonsultować się z atlasami anatomicznymi37.
  15. Przenieść zarodki za pomocą plastikowej pipety transferowej do roztworu Danieau zawierającego 1x 1-fenylo-2-tiomocznik (1xPTU) między 10 a 24 hpf, aby zapobiec powstawaniu pigmentu. Przechowywać zarodki w roztworze Danieau z PTU przez cały czas trwania eksperymentu.
    UWAGA: Oprócz melanoforów, problematyczne dla obrazowania mogą być irydofory na powierzchni skóry. Chociaż PTU nie hamuje powstawania irydoforów, istnieją linie mutantów z mniejszą liczbą irydoforów, takie jak roy orbison (roy), które można wykorzystać38.
  16. Po wykluciu się zarobków (zazwyczaj w drugim lub trzecim dniu po zapłodnieniu, 2 lub 3 dpf), usunąć choriony i wymienić roztwór Danieau z PTU.
    NOTE: Kroki te są ważne dla zapewnienia jakości medium dla zarobków oraz żywotności zdrowych zarobków.

3. Generowanie stabilnych linii transgenicznych

UWAGA: Stabilne linie transgeniczne można efektywnie generować przy użyciu systemu transposonów Tol2. Wektor transposonu Tol2 zawierający interesujący transgen jest wstrzykiwany wspólnie z mRNA kodującym enzym transpozazę do zapłodnionych jaj w stadium jednego komórki. Białko transpozazy pochodzące z wstrzykniętego mRNA katalizuje wycięcie kasety transgenu z wektora transposonu i jego integrację z genomem39.

  1. Klonuj kasetę raportującą transgenu (np. UAS:mitoCFP) pomiędzy odwrócone powtórzenia końcowe Tol2 w jednym z wektorów Tol2 obecnie stosowanych w społeczności badaczy danio pręgowanego, zgodnie z opisem40.
    UWAGA: Wektory Tol2 zawierające kasetę selekcyjną, w której elementy promotora napędzają ekspresję białek fluorescencyjnych (FP) w układach narządowych niezwiązanych z obszarem zainteresowania (np. w sercu41 lub soczewce42), są przydatne do przesiewania transgenicznych linii raportujących UAS w przypadku braku transaktywacji Gal4.
  2. Używając komercyjnego zestawu (opartego na matrycy wiążącej na bazie krzemionki), oczyść plazmidowy DNA przeznaczony do iniekcji. Upewnij się, że plazmidowy DNA jest wysokiej jakości, aby zapobiec toksyczności.
  3. Przeprowadź transkrypcję mRNA kodującego transpozazę Tol2, używając odpowiedniego wektora transkrypcyjnego, takiego jak PCS-TP43. W skrócie: zlinearyzuj PCS-TP, a następnie użyj komercyjnego zestawu do generowania mRNA z czapką, postępując zgodnie z protokołem producenta. Należy zadbać o uniknięcie kontaminacji RNazami (np. stosować końcówki do pipet i probówki wolne od RNaz). RNA rozdziel na alikwoty o stężeniu 100 ng/µl do jednorazowego użycia i przechowuj w temperaturze -80 oC.
  4. W dniu przeprowadzania iniekcji odmroź na lodzie alikwot mRNA transpozazy. Wymieszaj wektor DNA transpozonu (2 µl stężenia 100 ng/µl) i mRNA transpozazy (2 µl stężenia 100 ng/µl) w stosunku 1:1, a następnie dodaj 6 µl wody wolnej od RNaz, aby uzyskać całkowitą objętość 10 µl.
    UWAGA: Rekomendowane stężenie dla każdego składnika wynosi 20 ng/µl, jednak optymalne stężenie należy ustalić empirycznie. Do rozcieńczania używaj wody wolnej od RNaz. Podczas pracy z mieszaniną iniekcyjną DNA-RNA stosuj rękawiczki i utrzymuj ją na lodzie przez cały czas trwania iniekcji, aby zapobiec degradacji mRNA.
  5. Kierując się szczegółowymi instrukcjami zawartymi w powyższej sekcji 2, wstrzyknij mieszaninę DNA-RNA do zapłodnionych jaj w stadium jednokomórkowym. Pod kontrolą wizualną stereomikroskopu celuj w cytoplazmę komórki w stadium jednokomórkowym, aby uzyskać najwyższą wydajność transgenezy. Inkubuj wstrzyknięte embriony w temperaturze 28,5 oC do momentu rozpoczęcia przesiewania pod kątem ekspresji transgenu.
    UWAGA: W celu sprawdzenia wydajności transpozazy Tol2 można przeprowadzić reakcję PCR, zgodnie z wcześniejszym opisem44.
  6. Przesiewaj embriony w szalce Petriego pod kątem transgenezy, używając okularów fluorescencyjnego mikroskopu dissectingowego.
    UWAGA: Użyj odpowiednich zestawów filtrów mikroskopu, aby zwizualizować ekspresję FP kasety selekcyjnej (tj. fluorescencję w sercu lub soczewce) w 2. lub 3. dniu po zapłodnieniu (dpf). Zidentyfikuj potencjalne embriony transgeniczne na podstawie ekspresji (w sercu lub soczewce) i hoduj te embriony do wieku dorosłego (pokolenie F0 ) zgodnie ze standardowymi protokołami45. Alternatywnie, zidentyfikuj potencjalne embriony transgeniczne za pomocą PCR, jak opisano w 46.
  7. Gdy ryby raportujące UAS z pokolenia F0 osiągną wiek 2,5–3 miesięcy, skrzyżuj je (szczegóły w punkcie 2.5) z nietransgenicznymi rybami typu dzikiego, aby uzyskać jaja do stworzenia pokolenia F1. Alternatywnie skrzyżuj ryby raportujące UAS F0 z linią napędową Gal4, aby utworzyć pokolenie F1. W tym drugim przypadku transgen napędzany przez UAS może być bezpośrednio monitorowany w embrionach uzyskanych z tego krzyżowania.
  8. Użyj fluorescencyjnego mikroskopu dissectingowego, aby przesiewać embriony F1 pod kątem ekspresji transgenu lub kasety selekcyjnej.
    UWAGA: Potwierdzenie ekspresji oznacza, że transgen został przekazany przez linię zarodkową. Transgeneza w stadium F0 jest nie mendlowska. Liczba embrionów wykazujących ekspresję transgenu może się różnić – od niewielkiej liczby do zdecydowanej większości w poszczególnych miotach. Integracja transpozonu u różnych ryb F0 może być bardzo zróżnicowana, co skutkuje różnymi wzorcami ekspresji. Dlatego ryby F1 pochodzące od różnych osobników założycielskich F0 należy utrzymywać jako oddzielne podlinie. Integracje transpozonu u ryb F1 są stabilne i są przekazywane kolejnym pokoleniom zgodnie z prawami Mendla.
  9. Utrzymuj każdą rybę F0 w oddzielnych zbiornikach, aby umożliwić ponowną identyfikację nosicieli transgenu.

4. Przygotowanie embrionów do obrazowania za pomocą mikroskopu pionowego

UWAGA: Opisane tutaj procedury zostały zoptymalizowane pod kątem obrazowania na mikroskopach pionowych z obiektywami wodnymi o dużej odległości roboczej.

  1. Użyj fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego, aby przesiewać zarodki pod kątem ekspresji transgenu.
    UWAGA: Ekspresja transgenu reporterowego UAS będzie zależeć od zastosowanej konkretnej linii sterującej Gal4. Wybierz zarodki do eksperymentów obrazowania na podstawie pożądanego wzorca ekspresji.
  2. Przenieś wybrane zarodki za pomocą plastikowej pipety do oddzielnej szalki Petriego zawierającej bufor Danieau z 1x PTU i 1x Tricaine.
    UWAGA: Gdy znakowanie jest rzadkie (tylko kilka komórek w systemie narządowym), zamknij zarodki w agarozie (patrz punkty 4.3-4.7 poniżej) i przesiewaj pod kątem ekspresji transgenu za pomocą mikroskopu szerokopolowego z obiektywami o dużym powiększeniu (patrz punkt 5.1 poniżej). Tricaine znieczula ryby i powinien zadziałać w ciągu kilku sekund. Jeśli ryby nie zostaną unieruchomione, prawdopodobnie Tricaine uległ degradacji. Możliwymi przyczynami tej degradacji jest niewłaściwe przechowywanie Tricaine, który jest wrażliwy na światło47.
  3. Przygotuj agarozę do zatapiania ryb, rozpuszczając proszek agarozy niskotopliwej w buforze Danieau do końcowego stężenia 0,7%. Podziel na aliquoty (1 ml) i przechowuj w bloku grzewczym w temperaturze 40 °C do momentu użycia.
    UWAGA: Do zatapiania ryb można użyć również wyższych stężeń agarozy (do 1,5%).
  4. Do 1 ml aliquoty agarozy niskotopliwej dodaj 50 μl 20-krotnego roztworu zapasu Tricaine oraz 20 μl 50-krotnego roztworu zapasu PTU i dobrze wymieszaj, stukując w bok probówki. Włóż probówkę z powrotem do bloku grzewczego. Używając plastikowej pipety transferowej, delikatnie przenieś kilka (1-10) znieczulonych zarodków do agarozy, przenosząc jak najmniejszą ilość płynu, aby uniknąć rozcieńczenia agarozy.
  5. Za pomocą plastikowej pipety przenieś wszystkie zarodki wraz z niewielką ilością agarozy do szalki Petriego z szklanym dnem.
  6. Pracując stosunkowo szybko, użyj pęsety, aby ustawić zarodki w pożądanej orientacji, w zależności od struktury przeznaczonej do obrazowania.
    UWAGA: Ustaw zarodki bokiem, jeśli obrazowaniu ma podlegać siatkówka lub sensoryczne neurony Rohona-Bearda (RB).
  7. Pozostaw agarozę do zastygnięcia na co najmniej 15 min. Dodaj bufor Danieau zawierający 1xPTU i 1xTricaine, aby przykryć zarodki zatopione w agarozie. Umieść szalkę z zarodkami w agarozie w inkubatorze w temperaturze 28,5 oC do czasu rozpoczęcia obrazowania.

5. Obrazowanie struktur komórkowych i subkomórkowych przy użyciu mikroskopii szerokopolowej lub konfokalnej

UWAGA: Mikroskopia szerokopolowa oraz punktowa mikroskopia konfokalna to najczęściej stosowane metody obrazowania fluorescencyjnie znakowanych zarodków danio przebrzuchłego. Tabela 1 podsumowuje główne zalety i wady obu systemów. W obu rodzajach mikroskopii zarodki są montowane w agarozie zgodnie z opisem w punkcie 4 powyżej i utrzymywane w temperaturze 28,5 oC przez cały czas trwania eksperymentu obrazowania, przy użyciu komory grzewczej na stoliku mikroskopu. Ważne jest, aby naczynie z zarodkami zatopionymi w agarozie wyrównało temperaturę do 28,5 oC przed rozpoczęciem obrazowania, ponieważ wahania temperatury powodują dryft w wymiarze z. Podczas przeprowadzania długoterminowych eksperymentów obrazowania (trwających kilka godzin), należy umieścić pokrywę z pleksiglasu nad szalką Petriego, aby ograniczyć odparowywanie buforu.

Szerokie poleKonfokalny z punktowym skanowaniem
KosztStosunkowo taniDrogi (ok. 5x więcej)
FotoblaknięcieNiskieWysokie. Próbka jest narażona na światło laserowe powyżej i poniżej płaszczyzny ogniskowania.
FototoksycznośćNiskaWysoka (patrz wyżej: Fotoblaknięcie)
Szybkość akwizycjiSzybkaWolna
Rozdzielczość w xyPrawo AbbegoPrawo Abbego (można poprawić o ok. 40% stosując bardzo mały otwór pinhole; jednak w większości ustawień ma to niewielkie zastosowanie praktyczne)
Przekrój optycznySłabyTak (można regulować wielkością otworu pinhole)
Penetracja tkankiOgraniczona do struktur powierzchownych (np. komórek Rohona-Bearda lub włókien mięśniowych)Ograniczona do < 100 mm od powierzchni embrionu

Tabela 1. Ogólne porównanie mikroskopii szerokopolowej i konfokalnej z aktywnym skanowaniem punktowym

  1. Mikroskopia szerokopolowa
    UWAGA: Poniżej przedstawiono wytyczne dotyczące obrazowania embrionów zebrafish przy użyciu prostego mikroskopu szerokopolowego z obiektywami typu water-dipping-cone o dużej odległości roboczej. Mikroskop jest wyposażony w chłodzoną kamerę CCD oraz zestawy filtrów do wizualizacji różnych fluoroforów, zamontowane na automatycznym kole filtrowym w celu szybkiej akwizycji wielu kanałów. Akwizycja obrazu jest sterowana przez μManager, otwartoźródłowy pakiet oprogramowania do mikroskopii48. Podano konkretny przykład obrazowania mitochondriów w neuronach sensorycznych RB. Komórki RB są znakowane genetycznie za pomocą YFP celowanego w błonę, a ich mitochondria są znakowane CFP (patrz 1.1 powyżej).
    1. Zamocuj embriony bokiem w agarozie o niskiej temperaturze topnienia, zgodnie z opisem w punkcie 4 powyżej.
    2. Przed rozpoczęciem obrazowania pozwól naczyniu z zamocowanymi rybami wyrównać temperaturę do 28,5 oC w komorze grzewczej na stole mikroskopu.
    3. Użyj obiektywu water-dipping-cone o niskim powiększeniu i spójrz przez okulary mikroskopu, aby wybrać obszar na powierzchni embrionu do obrazowania.
      UWAGA: Jeśli używana jest stabilna transgeniczna linia reporterowa MitoFish, Tg(UAS-E1b:mYFP,mitoCFP)mde6, w połączeniu z linią sterującą taką jak HuC:Gal4, większość neuronów RB jest znakowana i pojawia się jako gęsta sieć rozgałęzień neurytów na powierzchni embrionu. Jeśli do uzyskania rzadkiego znakowania stosuje się mikroiniekcję konstruktów DNA (np. Sensory:Gal4-VP16 z UAS:mitoCFP i UAS:MA-YFP), przeskanuj embriony, aby zidentyfikować komórki podwójnie znakowane.
    4. Otwórz oprogramowanie mikroskopu (μManager 1.4) i kliknij „Illumination” w sekcji „Configuration settings”, aby zdefiniować odpowiednie zestawy filtrów dla interesującej długości fali (YFP lub CFP w obecnym przykładzie). W sekcji „Camera settings” wprowadź czas ekspozycji wymagany do uzyskania odpowiedniego obrazu.
      UWAGA: „Illumination Settings” są wstępnie ustawione przez użytkownika podczas instalacji oprogramowania i ładowane przy otwieraniu μManager. Jeśli oprogramowanie nie jest skonfigurowane do sterowania kołem filtrowym, ręcznie przesuń koło filtrów w wieżyczce do odpowiedniej pozycji.
    5. Zmień obiektyw na water-dipping-cone o dużej odległości roboczej z powiększeniem od 40x do 100x. Wybierz obiektyw o najwyższej aperturze numerycznej (NA) i skorygowany chromatycznie (apochromat).
    6. Kliknij „Live”, aby wybrać pole widzenia: w przypadku neuronu RB obrazuj transport mitochondrialny w aksonie początkowym, wychodzącym z ciała komórki, lub w rozgałęzieniu peryferyjnym.
      UWAGA: Rozgałęzienia peryferyjne neuronów RB w ogonowym fałdzie płetwy embrionu zapewniają idealną możliwość obrazowania dużego, płaskiego pola widzenia, które można zatem uchwycić na jednej klatce za pomocą mikroskopu szerokopolowego. Dlatego ważne jest, aby zamocować embrion tak płasko jak to możliwe na boku, tak aby ogonowy fałd płetwy był równoległy do dna szalki Petriego.
    7. Po wybraniu pola widzenia kliknij przycisk „rectangular selection” w menu ImageJ, zdefiniuj obszar zainteresowania (ROI) i kliknij „ROI” w oknie µManager. Po wybraniu ROI do obrazowania kliknij „Stop” i „Save”, aby wykonać obraz w kanale YFP i zarejestrować lokalną morfologię neurytu/neurytów.
    8. Aby obrazować transport mitochondrialny, kliknij przycisk „Multi-D Acq.”. Otwórz dodatkowe okno („Multi-dimensional Acquisition”) i wybierz liczbę punktów czasowych oraz odstęp między nimi. Stosuj szybkość klatek 0,3-1 Hz. Przeprowadź rejestrację przez co najmniej 10 min, aby zebrać jak najwięcej punktów danych.
    9. W oknie „Multi-dimensional Acquisition” kliknij „Channels”, dodaj i zdefiniuj długość fali do obrazowania (CFP dla mitochondriów w tym przykładzie) oraz czas ekspozycji. Utrzymuj czas ekspozycji poniżej 400 msec przy obrazowaniu transportu mitochondrialnego.
    10. Kliknij opcję „Save Images” w oknie „Multi-dimensional Acquisition”, aby automatycznie zapisywać pliki w określonym folderze wskazanym w „Directory root”. Kliknij „Acquire” w prawym górnym rogu, aby rozpocząć obrazowanie time-lapse.
    11. Ręcznie koryguj ostrość podczas rejestracji time-lapse, aby zniwelować ewentualny dryft w wymiarze z.
      UWAGA: Stosując te parametry, transport mitochondrialny w neuronach RB można obrazować przez okres do 4 hr.
  2. Mikroskopia konfokalna
    UWAGA: Poniżej przedstawiono wytyczne dotyczące obrazowania za pomocą prostego mikroskopu konfokalnego Olympus FV1000 i obiektywów typu water-dipping-cone o dużej odległości roboczej. Mikroskop jest wyposażony w wiele linii laserowych i kilka detektorów (konwencjonalne PMT oraz czulsze detektory fosforku galu i arsenu), co umożliwia obrazowanie wielokanałowe. Odniesienia dotyczą konkretnie oprogramowania Olympus Fluoview. Jednak opisane tutaj parametry obrazowania powinny być łatwo przenaszalne na inne systemy konfokalne.
    1. Zamocuj embriony w agarozie o niskiej temperaturze topnienia w orientacji odpowiedniej dla obrazowanego organu/struktury, zgodnie z opisem w punkcie 4 powyżej.
    2. Przed rozpoczęciem obrazowania pozwól naczyniu z zamocowanymi rybami wyrównać temperaturę do 28,5 oC w komorze grzewczej na stole mikroskopu.
    3. Użyj obiektywów water-dipping-cone o dużej odległości roboczej dla mikroskopów konfokalnych w konfiguracji prostej. Wybierz obiektywy o najwyższej możliwej NA, aby zmaksymalizować ilość zbieranych sygnałów fluorescencyjnych i uzyskać najlepszą rozdzielczość. Podczas zbierania obrazów z wielu kanałów wybierz obiektywy skorygowane chromatycznie (apochromaty).
    4. Otwórz oprogramowanie mikroskopu i kliknij „Trans Lamp” lub „Epi Lamp”, aby użyć odpowiednio światła przechodzącego lub fluorescencyjnego w celu zidentyfikowania obszaru zainteresowania za pomocą okularów mikroskopu.
    5. Użyj oprogramowania do ustawienia następujących parametrów skanowania w celu uzyskania stosów obrazów:
      1. W oknie „Acquisition Setting” upewnij się, że obiektyw wybrany do obrazowania odpowiada obiektywowi widocznemu w menu rozwijanym dostępnych obiektywów.
        UWAGA: Ma to na celu zapewnienie, że wszelkie wstępnie obliczone parametry dla konkretnego obiektywu (np. rozdzielczość boczna i osiowa, rozmiar apertury konfokalnej itp.) są prawidłowe i mogą być niezawodnie stosowane.
      2. Wybierz odpowiednią linię/linie laserowe oraz dichroiczne filtry wzbudzenia i emisji, aby obrazować konkretne białka fluorescencyjne. Zrób to, klikając przycisk „Dye list” w oknie „Image Acquisition Control” i wybierając odpowiednie fluorofory. Alternatywnie kliknij przycisk „Light path and dyes”, aby ustawić te parametry ręcznie.
        UWAGA: Po wybraniu opcji „Dye List” oprogramowanie automatycznie wybiera odpowiednie linie laserowe, dichroiczne filtry wzbudzenia i emisji oraz odpowiednio dostosowuje rozmiar apertury konfokalnej.
      3. W oknie „Acquisition Setting” dostosuj czynnik „Zoom” i „Size aspect ratio” (tzn. 512x512, 1024x1024 itp.) skanowanego obrazu, aby uzyskać rozmiar piksela niezbędny do najlepszego rozdzielenia obrazowanych struktur. Ustaw rozmiar piksela na około połowę teoretycznej rozdzielczości obiektywu, stosując kryteria próbkowania Nyquista. Aby określić rozmiar piksela pobranego obrazu, kliknij przycisk z symbolem informacji („i”) w oknie „Image Acquisition Control”.
      4. Ustaw prędkość skanowania na najszybszą możliwą (2 μs/pixel) w oknie „Acquisition Setting”.
      5. W oknie „Image Acquisition Control” kliknij uśrednianie linii Kalmana, aby zredukować szum. Zazwyczaj wystarcza czynnik od 2 do 3.
      6. Wybierz tryb skanowania sekwencyjnego przy obrazowaniu fluoroforów o nakładających się widmach. Aby to zrobić, kliknij „Sequential” i „Line” w oknie „Image Acquisition Control”.
      7. Dostosuj moc wyjściową odpowiedniej linii/linii laserowych (zazwyczaj poniżej 5%). Konkretne wartości muszą zostać określone empirycznie.
      8. Kliknij przycisk „XY Repeat” lub „Focus x2” lub „Focus x4”, aby stale skanować wybrany obszar, dostosowując ustawienia detektora dla każdego kanału. Dostosuj „HV”, „Gain” i „Offset” dla każdego kanału, aby uzyskać obrazy o najwyższej dynamice wartości szarości.
        UWAGA: Konkretne wartości tych ustawień muszą zostać określone empirycznie. „HV” reguluje napięcie na detektorze w celu zmiany jego czułości, „Offset” reguluje sygnał wyjściowy detektora, a „Gain” mnoży sygnał wyjściowy detektora przez stały czynnik.
      9. Naciśnij Ctrl + H, aby zwizualizować pobrane obrazy za pomocą tabeli wyszukiwania (HiLo), która identyfikuje piksele niedonasycone (pojawiają się jako niebieskie) i przesycone (pojawiają się jako czerwone), czego należy zazwyczaj unikać. Ponownie oceń moc wyjściową odpowiednich linii laserowych i ustawienia detektora.
        UWAGA: Stosowanie wysokiej mocy lasera i wysokich poziomów „HV” detektora doprowadzi do silniejszego sygnału. Wyższa moc lasera spowoduje jednak zwiększone blaknięcie i fototoksyczność. Zwiększenie „HV” doprowadzi do zwiększenia szumu. Dlatego podczas ustawiania mocy lasera i „HV” należy znaleźć kompromis, aby uzyskać obrazy z akceptowalnym poziomem szumu, zapobiegając jednocześnie fotouszkodzeniom (patrz również Tabela 1).
      10. Zbierz obrazy z określonej objętości, ustawiając ostrość na górnej i dolnej granicy obszaru zainteresowania. W oknie „Acquisition Setting” kliknij przyciski „End Set” i „Start Set” okna z-stack na górnej i dolnej granicy obrazowanej objętości. Wybierz wielkość kroku stanowiącą połowę rozdzielczości z dla danego obiektywu (np. jeśli rozdzielczość z wynosi 2 µm, wybierz 1 µm). Aby określić rozdzielczość z obiektywu, kliknij przycisk z symbolem informacji („i”) w oknie „Image Acquisition Control”.
      11. Ustaw serię czasową, aby zbierać z-stacki z częstotliwością czasową odpowiednią dla dynamiki obrazowanej struktury podkomórkowej. W podoknie „TimeScan” wprowadź częstotliwość, z jaką z-stacki powinny być pobierane („Interval”), oraz liczbę razy, w których obrazy powinny zostać pobrane („Num”).
      12. Kliknij przyciski „Depth” i „Time” w oknie „Image Acquisition Control”, aby potwierdzić, że zostaną pobrane z-stack i seria czasowa. Na koniec kliknij przycisk „XYZT”, aby rozpocząć akwizycję obrazów time-lapse.
      13. Po zakończeniu akwizycji obrazów sprawdź komunikat „Series Done” na interfejsie oprogramowania. Kliknij go i zapisz obrazy w formacie „oib”, aby zarejestrować obrazy oraz powiązane z nimi metadane.
        UWAGA: Obrazy uzyskane za pomocą mikroskopu szerokopolowego i konfokalnego można wizualizować i analizować za pomocą oprogramowania takiego jak FIJI, darmowego programu do przetwarzania obrazów z domeny publicznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszej pracy bezpośrednio porównano i zestawiono zastosowanie mikroskopii szerokopolowej oraz konfokalnej do obrazowania mitochondriów i centrosomów w żywych embrionach zebrafish. W zależności od położenia komórek, w których badana jest dynamika organelli, oraz wrodzonej częstotliwości konkretnych zdarzeń subkomórkowych, zazwyczaj lepszym wyborem jest albo mikroskopia szerokopolowa, albo konfokalna. Obrazowano organelle w neuronach RB znajdujących się na powierzchni embrionu oraz w ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu demonstrujemy wszechstronność systemu ekspresji Gal4-UAS do fluorescencyjnego znakowania mitochondriów, centrosomów i błon komórkowych określonych typów komórek in vivo w zarodkach danio pręgowanego. Wiele fluorescencyjnych białek fuzyjnych, które znakują inne organelle lub struktury subkomórkowe, można znaleźć w opublikowanej literaturze i można je uzyskać z odpowiedniego laboratorium, źródeł komercyjnych lub niekomercyjnych depozytów plazmidowych (np . Addgene). Aby zaprojektować nowe fl...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

P.E. jest wspierany przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Research Training Group 1373 oraz Graduate School of the Technische Universität München (TUM-GS). G.P. był wspierany przez TUM-GS. L.T. jest wspierany przez stypendium EMBO (EMBO ALTF 108-2013). Prace D.P. nad danio pręgowanym były wspierane przez DFG za pośrednictwem Sonderforschungsbereich "Molekularne mechanizmy neurodegeneracji" (SFB 596); Centrum Zintegrowanych Nauk o Białkach (Monachium) oraz Siódmego Programu Ramowego Wspólnoty Europejskiej (7PR/2007-2013) na podstawie umowy o grant nr 200611 (MEMOSAD). Obecnie jest stypendystą New York Stem Cell Foundation-Druckenmiller Fellow i był stypendystą Niemieckiej Akademii Nauk Leopoldina. L.G. jest wspierany przez DFG w ramach projektu SFB 870 "Assembly and Function of Neuronal Circuits" (Montaż i funkcja obwodów neuronalnych).

Jesteśmy wdzięczni Kristinie Wullimann za utrzymanie naszego obiektu do ryb, Yvonne Hufnagel za wsparcie techniczne i Thomasowi Misgeldowi za komentarze do manuskryptu. Jesteśmy wdzięczni R. Kösterowi (Technische Universität Braunschweig) za dostarczenie wektora M1 Medusa (pSKmemmRFP:5xUAS:H2B-CFP:5xUAS:Centrin2-YFP), z którego sklonowaliśmy Centrin-YFP oraz S.C. Suzuki i T. Yoshimatsu (University of Washington) za dostarczenie kasety 14xUAS:MA-cerulean, której użyliśmy do wygenerowania konstrukcji reportera do stworzenia CentrinFish. Podziękowania kierujemy również do S.C. Suzuki i T. Yoshimatsu (University of Washington) za linię transgeniczną Otx2:Gal4, A. Sagastiego za konstrukt Sensory:Gal4-VP16 (UCLA) oraz M. Noneta (Washington University w St. Louis) za wektor pCold Heart Tol2. Dziękujemy Bettinie Schmid, Alexandrowi Hruscha i Christianowi Haassowi (Niemieckie Centrum Chorób Neurodegeneracyjnych w Monachium - DZNE) za wkład w rozwój MitoFish.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Agaroza (2-hydroksyetyloagaroza)Sigma-AldrichA4018-10GNiska temperatura żelowania Typ VII
Grzejnik blokowyEppendorfThermomixer compact
Ca(NO3)2 Hydrat azotanu wapnia, 99.996% Aldrich202967-50gAby przygotować 30x kamerę
CCDQimagingRetiga Exi Fast 1394
Kleszcze Dumont #5 z powłoką ceramicznąDumont - Fine Science Tools11252-50#5
Kleszcze Konfokalny laserowo-skaningowy mikroskop OlympusFV1000 Fluoview
Podgrzewacz do naczyńWarner Instrument CorporationDH-35Pierścień grzewczy
Sól metanosiarczanu 3-aminobenzoesanu etyluPharmaQTricaine PharmaQ-25gTricaine (znieczulający)
Fluorescencyjny mikroskop preparacyjnyLeicaM205 FA
Zestaw GeneCleanMP Biomedicals111001200
Naczynia do hodowli ze szklanym dnemMatTek CorporationP35G-0-14-Cszalka Petriego 35 mm, mikrostudzienka 14 mm, szkło nakrywkowe nr 0
Igły szklaneWorld Precision Instruments Inc. TW100F-4Do mikroiniekcji
HEPESSigmaH3375-250gDo przygotowania 30x wysokopróżniowego smaru Danieau's
Dow Corning DCC000001242 150gSmar z dwutlenku krzemu
KCl 99%Sigma-AldrichS7643-5kgDo przygotowania 30x
MgSO4.7H2O     Siarczan magnezu siedmiowodny 98+% Odczynnik A.C.S. Sigma-Aldrich230291-500gDo przygotowania 30x
Mikrowtryskiwacz Danieau Końcówki do mikroładowarek EppendorfFemtoJet
Eppendorf9300010070,5-20 ul
MikromanipulatorMaerzhaeuser WetzlarMM33 Rechts/00-42-101-0000/M3301R
Uchwyt na mikropipetyIntracelP/N 50-00XX-130-1
mMESSAGE mMACHINE SP6 Zestaw do transkrypcjiAmbionAM1340Do transkrypcji PCS-Transposase
NaCl BioXtra >99.5%Sigma-AldrichP9541-1kgDo przygotowania 30x
NanofotometrDo pomiaru stężenia DNA/RNA
Ściągacz igiełSutter InstrumentP-1000Flaming/Brown
NIR Apo 40x/0.80W NikonObiektyw stożkowy zanurzany w wodzie
N-fenylotiomocznik klasy I, ok. 98%SigmaP7629-10GPTU (zapobiega pigmentacji)
szalkiPetriego Sarstedt AG 82147292 x 16mm 
Formy plastikowe Adaptacyjne narzędzia naukoweTU-1Do mikroiniekcji
Osłona z pleksiglasu - z otworemWykonaneOtwór w osłonie z pleksiglasu powinien być o 3 mm większy niż średnica obiektywu stożka do zanurzania w wodzie
Sitko do herbaty (plastikowe)Do zbierania ikry danio pręgowanego
Regulator temperaturyWarner Instrument CorporationTC-344BPodwójna automatyczna temperatura Kontroler
Pipety transferoweSarstedt AG 86.1171Plastikowe pipety transferowe 3,5 ml
UMPlanFI 100x/1,00 WOlympusObiektyw stożkowy do zanurzania w wodzie
UMPlanFLN 20x/0,50W OlympusObiektyw ze stożkiem zanurzanym w wodzie
Mikroskop szerokokątnyOlympusBX51WI
PTU (50x Stock)Rozpuść 76 mg PTU w 50 ml wody destylowanej
Mieszaj energicznie w temperaturze pokojowej 
Przechowywać w temperaturze -20 oC w 1 ml porcji
Stosować w 1x roztwór roboczy
Trikaina (20x Stock)Rozpuść 200 mg Trikainy w 48 ml wody destylowanej
Dodaj 2 ml 1M zasady Tris (pH9)
Dostosuj do pH 7 
Przechowywać w temperaturze -20 oC w 1 ml porcji
Stosować przy 1x roztworze roboczym
Roztwór Danieau (30x Stock)1,740 mM  NaCl 
21 mM          KCl 
12 mM          MgSO4.7H2O 
18 mM          Ca (NO3)2
150 mM      Bufor HEPES 
Woda destylowana do 1 l 
Przechowywać pod adresem 4 oC 
Stosować w 0,3x roztworze roboczym
Danieau Danieau na zamówienie

Bibliografia

  1. Alexandre, P., Reugels, A. M., Barker, D., Blanc, E., Clarke, J. D. Neurons derive from the more apical daughter in asymmetric divisions in the zebrafish neural tube. Nat Neurosci. 13 (6), 673-679 (2010).
  2. Distel, M., Hocking, J. C., Volkmann, K., Koster, R. W. The centrosome neither persistently leads migration nor determines the site of axonogenesis in migrating neurons in vivo. J Cell Biol. 191 (4), 875-890 (2010).
  3. Godinho, L., et al. Nonapical symmetric divisions underlie horizontal cell layer formation in the developing retina in vivo. Neuron. 56 (4), 597-603 (2007).
  4. Norden, C., Young, S., Link, B. A., Harris, W. A. Actomyosin is the main driver of interkinetic nuclear migration in the retina. Cell. 138 (6), 1195-1208 (2009).
  5. Godinho, L., et al. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. 132 (22), 5069-5079 (2005).
  6. Mumm, J. S., et al. In vivo imaging reveals dendritic targeting of laminated afferents by zebrafish retinal ganglion cells. Neuron. 52 (4), 609-621 (2006).
  7. Sagasti, A., Guido, M. R., Raible, D. W., Schier, A. F. Repulsive interactions shape the morphologies and functional arrangement of zebrafish peripheral sensory arbors. Current biology : CB. 15 (9), 804-814 (2005).
  8. Zolessi, F. R., Poggi, L., Wilkinson, C. J., Chien, C. B., Harris, W. A. Polarization and orientation of retinal ganglion cells in vivo. Neural Dev. 1, 2(2006).
  9. Kim, M. J., Kang, K. H., Kim, C. H., Choi, S. Y. Real-time imaging of mitochondria in transgenic zebrafish expressing mitochondrially targeted GFP. Biotechniques. 45 (3), 331-334 (2008).
  10. Plucinska, G., et al. In vivo imaging of disease-related mitochondrial dynamics in a vertebrate model system. J Neurosci. 32 (46), 16203-16212 (2012).
  11. O'Donnell, K. C., Vargas, M. E., Sagasti, A. WldS and PGC-1alpha regulate mitochondrial transport and oxidation state after axonal injury. J Neurosci. 33 (37), 14778-14790 (2013).
  12. Engerer, P., Yoshimatsu, T., Suzuki, S. C., Godinho, L. CentrinFish permit the visualization of centrosome dynamics in a cellular context in vivo. Zebrafish. 11 (6), 586-587 (2014).
  13. Wang, K., et al. Rapid adaptive optical recovery of optimal resolution over large volumes. Nat Methods. 11 (6), 625-628 (2014).
  14. Randlett, O., Poggi, L., Zolessi, F. R., Harris, W. A. The oriented emergence of axons from retinal ganglion cells is directed by laminin contact in vivo. Neuron. 70 (2), 266-280 (2011).
  15. Tanabe, K., et al. Atypical protein kinase C regulates primary dendrite specification of cerebellar Purkinje cells by localizing Golgi apparatus. J Neurosci. 30 (50), 16983-16992 (2010).
  16. Hocking, J. C., Distel, M., Koster, R. W. Studying cellular and subcellular dynamics in the developing zebrafish nervous system. Exp Neurol. 242, 1-10 (2013).
  17. Clark, B. S., Winter, M., Cohen, A. R., Link, B. A. Generation of Rab-based transgenic lines for in vivo studies of endosome biology in zebrafish. Dev Dyn. 240 (11), 2452-2465 (2011).
  18. Paolini, A., et al. Asymmetric inheritance of the apical domain and self-renewal of retinal ganglion cell progenitors depend on Anillin function. Development. 142 (5), 832-839 (2015).
  19. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. The Journal of clinical investigation. 122 (7), 2337-2343 (2012).
  20. Steele, S. L., Prykhozhij, S. V., Berman, J. N. Zebrafish as a model system for mitochondrial biology and diseases. Translational research : the journal of laboratory and clinical medicine. 163 (2), 79-98 (2014).
  21. Novorol, C., et al. Microcephaly models in the developing zebrafish retinal neuroepithelium point to an underlying defect in metaphase progression. Open biology. 3 (10), 130065(2013).
  22. Baye, L. M., et al. The N-terminal region of centrosomal protein 290 (CEP290) restores vision in a zebrafish model of human blindness. Human molecular genetics. 20 (8), 1467-1477 (2011).
  23. Flinn, L. J., et al. TigarB causes mitochondrial dysfunction and neuronal loss in PINK1 deficiency. Annals of neurology. 74 (6), 837-847 (2013).
  24. Paquet, D., et al. A zebrafish model of tauopathy allows in vivo imaging of neuronal cell death and drug evaluation. The Journal of clinical investigation. 119 (5), 1382-1395 (2009).
  25. Khuchua, Z., Yue, Z., Batts, L., Strauss, A. W. A zebrafish model of human Barth syndrome reveals the essential role of tafazzin in cardiac development and function. Circulation research. 99 (2), 201-208 (2006).
  26. Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of development. 80 (2), 153-158 (1999).
  27. Koster, R. W., Fraser, S. E. Tracing transgene expression in living zebrafish embryos. Dev Biol. 233 (2), 329-346 (2001).
  28. Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nat Methods. 2 (12), 920-931 (2005).
  29. Sambrook, J., Russell, D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  30. Distel, M., Wullimann, M. F., Koster, R. W. Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13365-13370 (2009).
  31. Skene, J. H., Virag, I. Posttranslational membrane attachment and dynamic fatty acylation of a neuronal growth cone protein, GAP-43. J Cell Biol. 108 (2), 613-624 (1989).
  32. Zuber, M. X., Strittmatter, S. M., Fishman, M. C. A membrane-targeting signal in the amino terminus of the neuronal protein GAP-43. Nature. 341 (6240), 345-348 (1989).
  33. Asakawa, K., et al. Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1255-1260 (2008).
  34. Godinho, L. Injecting zebrafish with DNA or RNA constructs encoding fluorescent protein reporters. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (7), 871-874 (2011).
  35. Palanca, A. M., Sagasti, A. Optogenetic activation of zebrafish somatosensory neurons using ChEF-tdTomato. J Vis Exp. (71), e50184(2013).
  36. Dean, D. A., Gasiorowski, J. Z. Preparing injection pipettes on a flaming/brown pipette puller. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (3), prot5586(2011).
  37. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  38. Ren, J. Q., McCarthy, W. R., Zhang, H. W., Adolph, A. R., Li, L. Behavioral visual responses of wild-type and hypopigmented zebrafish. Vision Research. 42 (3), 293-299 (2002).
  39. Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, Suppl 1. S7(2007).
  40. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev Dyn. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  41. Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn. 228 (1), 30-40 (2003).
  42. Davidson, A. E., et al. Efficient gene delivery and gene expression in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon. Dev Biol. 263 (2), 191-202 (2003).
  43. Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Dev Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
  44. Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Efficient transposition of the Tol2 transposable element from a single-copy donor in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (50), 19827-19832 (2008).
  45. Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed, University of Oregon Press. (2007).
  46. Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies. Biotechniques. 55 (6), 314-316 (2013).
  47. Carter, K. M., Woodley, C. M., Brown, R. S. A review of tricaine methanesulfonate for anesthesia of fish. Rev Fish Biol Fisher. 21 (1), 51-59 (2011).
  48. Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using microManager. Curr Protoc Mol Biol. , 14.20(2010).
  49. Snapp, E. L. Design and Use of Fluorescent Fusion Proteins in Cell Biology. Curr Protoc Cell Biol. , 21.4(2005).
  50. Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends in cell biology. 19 (11), 649-655 (2009).
  51. Costantini, L. M., Snapp, E. L. Fluorescent proteins in cellular organelles: serious pitfalls and some solutions. DNA and cell biology. 32 (11), 622-627 (2013).
  52. Provost, E., Rhee, J., Leach, S. D. Viral 2A peptides allow expression of multiple proteins from a single ORF in transgenic zebrafish embryos. Genesis. 45 (10), 625-629 (2007).
  53. Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLoS One. 6 (4), e18556(2011).
  54. Akitake, C. M., Macurak, M., Halpern, M. E., Goll, M. G. Transgenerational analysis of transcriptional silencing in zebrafish. Dev Biol. 352 (2), 191-201 (2011).
  55. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  56. Katayama, H., Yamamoto, A., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. GFP-like proteins stably accumulate in lysosomes. Cell Struct Funct. 33 (1), 1-12 (2008).
  57. Shaner, N. C., et al. Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins. Nat Methods. 5 (6), 545-551 (2008).
  58. Marinkovic, P., et al. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (11), 4296-4301 (2012).
  59. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  60. Keller, P. J., Ahrens, M. B. Visualizing Whole-Brain Activity and Development at the Single-Cell Level Using Light-Sheet Microscopy. Neuron. 85 (3), 462-483 (2015).
  61. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
  62. Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nat Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
  63. Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy. Nat Methods. 9 (7), 755-763 (2012).
  64. Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Obrazowanie subkomórkowetransport mitochondriówdynamika centrosomówsystem Gal4-UASznakowanie fluorescencyjnemikroskopia szerokopolowamikroskopia konfokalnaobrazowanie time-lapsemikroskopia in vivo
Obrazowanie struktur subkomórkowych w żywym zarodku danio pręgowanego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.