Artykuł metodologiczny

Obrazowanie struktur subkomórkowych w żywym zarodku danio pręgowanego

DOI:

10.3791/53456

⸱

2 kwietnia 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Neuronal Cell Biology, Technische Universität München, 2Cell Biology, Department of Biology, Faculty of Science, Utrecht University, 3Faculty of Biology, Ludwig-Maximilians-Universität-München, 4Adolf-Butenandt-Institute, Biochemistry, Ludwig-Maximilians-Universität-München, 5German Center for Neurodegenerative Diseases, 6Laboratory of Brain Development and Repair, The Rockefeller University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie dynamicznego zachowania organelli i innych struktur subkomórkowych in vivo może rzucić światło na ich funkcję w warunkach fizjologicznych i chorobowych. W tym artykule przedstawiono metody genetycznego znakowania dwóch organelli, centrosomów i mitochondriów oraz obrazowania ich dynamiki w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą mikroskopii szerokokątnej i konfokalnej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie in vivo zapewnia bezprecedensowy dostęp do dynamicznego zachowania struktur komórkowych i subkomórkowych w ich naturalnym kontekście. Przeprowadzanie takich eksperymentów obrazowych u wyższych kręgowców, takich jak ssaki, zazwyczaj wymaga chirurgicznego dostępu do badanego systemu. Dostępność optyczna embrionalnych i larwalnych danio pręgowanego pozwala na obejście takich inwazyjnych procedur i umożliwia obrazowanie w nienaruszonym organizmie. Rzeczywiście, danio pręgowany jest obecnie dobrze ugruntowanym modelem do wizualizacji dynamicznych zachowań komórkowych przy użyciu mikroskopii in vivo w szerokim zakresie kontekstów rozwojowych, od proliferacji po migrację i różnicowanie. Nowszym osiągnięciem jest coraz częstsze wykorzystanie danio pręgowanego do badania zdarzeń subkomórkowych, w tym transportu mitochondrialnego i dynamiki centrosomów. Względna łatwość, z jaką te subkomórkowe struktury mogą być genetycznie znakowane przez białka fluorescencyjne i zastosowanie technik mikroskopii świetlnej do ich obrazowania, przekształca danio pręgowanego w model biologii komórki in vivo. Tutaj opisujemy metody generowania konstruktów genetycznych, które fluorescencyjnie znakują organelle, podkreślając mitochondria i centrosomy jako konkretne przykłady. Używamy dwuczęściowego systemu Gal4-UAS w wielu konfiguracjach, aby ograniczyć ekspresję do określonych typów komórek i zapewnić protokoły do generowania przejściowo eksprymujących i stabilnych ryb transgenicznych. Na koniec podajemy wskazówki dotyczące wyboru metod mikroskopii świetlnej, które są najbardziej odpowiednie do obrazowania dynamiki subkomórkowej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie in vivo zapewnia bezpośrednią wizualizację zachowań komórek w najbardziej fizjologicznym kontekście. Przezroczystość zarodków danio pręgowanego, ich szybki i zewnętrzny rozwój oraz bogaty wachlarz narzędzi genetycznych, które umożliwiają znakowanie fluorescencyjne, przyczyniły się do coraz powszechniejszego stosowania mikroskopii in vivo w celu wyjaśnienia dynamiki kluczowych zdarzeń rozwojowych. Na przykład badania obrazowe rozwoju układu nerwowego u danio pręgowanego znacznie poszerzyły naszą wiedzę na temat zachowania neuronalnych komórek progenitorowych i losu ich potomstwa, w tym ich późniejszej migracji, różnicowania i integracji obwodów.

Scena jest teraz gotowa do zbadania dynamiki subkomórkowej leżącej u podstaw tych zachowań komórkowych. Danio pręgowany jest już wykorzystywany jako narzędzia w biologii komórki in vivo. Obecnie możliwe jest uwidocznienie mitochondriów9-11, centrosomów2,8,12-14, Golgiego15, cytoszkieletu mikrotubuli4 i aktyny16, endosomów17 i składników kompleksu błony wierzchołkowej1,18, wśród innych struktur subkomórkowych w zarodkach danio pręgowanego in vivo. Jak dotąd wiele z tego, co wiadomo o funkcji tych organelli, pochodzi z badania ich zachowania w hodowanych komórkach. Podczas gdy badania in vitro przyniosły ogromny wgląd w biologię komórki, komórki w hodowli nie reprezentują w pełni złożoności sytuacji in vivo, a zatem niekoniecznie odzwierciedlają funkcję i dynamikę organelli subkomórkowych in vivo. Zarodki danio pręgowanego stanowią realną alternatywę in vivo dla badania dynamiki subkomórkowej.

Jako kręgowce, danio pręgowany posiada wiele układów narządów (np. siatkówkę nerwową), które są homologiczne do tych występujących u gatunków ssaków. Ponadto zarodki danio pręgowanego są coraz częściej wykorzystywane do modelowania chorób człowieka19,20, w tym związanych z funkcją centrosomalną (np. małogłowie21 i wrodzona ślepota Lebera22) oraz funkcją mitochondriów (np. choroba Parkinsona23, tauopapatie10,24 i zespół Bartha25). Obrazowanie in vivo na poziomie komórkowym i subkomórkowym w tych przypadkach pozwoli lepiej zrozumieć biologię komórki leżącą u podstaw tych stanów patologicznych.

Ogólnym celem opisanych tutaj metod jest dostarczenie kompleksowego przewodnika do badania organelli i innych struktur subkomórkowych w zarodkach danio pręgowanego za pomocą mikroskopii świetlnej in vivo. Opisano cały przepływ pracy związany z wizualizacją i śledzeniem struktur subkomórkowych in vivo - od podejść do znakowania genetycznego, przez generowanie przejściowo eksprymujących i stabilnych ryb transgenicznych, a na końcu do obrazowania za pomocą mikroskopii szerokokątnej i konfokalnej. Podczas gdy każda z tych procedur jest stosowana przez liczne laboratoria danio pręgowanego, opisane protokoły są zoptymalizowane i usprawnione pod kątem badania dynamiki struktur subkomórkowych. Warto wspomnieć o dwóch konkretnych aspektach opisanej tu pracy: Po pierwsze, zastosowanie systemu ekspresji Gal4-UAS w wielu konfiguracjach do genetycznego znakowania organelli w określonych typach komórek. Po drugie, bezpośrednie porównanie mikroskopii szerokokątnej i konfokalnej z obrazowaniem struktur subkomórkowych in vivo.

Obecne strategie genetycznego znakowania organelli i innych struktur subkomórkowych u ryb danio pręgowanych wykorzystują mRNA1,4,8 z czapeczką lub konstrukty oparte na DNA, gdzie elementy promotora bezpośrednio sterują ekspresją białek fuzyjnych9,14,15. Transkrybowane in vitro ograniczone RNA powoduje szybką i szeroką ekspresję, która nie jest jednak specyficzna dla tkanki. Ponadto poziomy ekspresji zmniejszają się z czasem, gdy zakryte RNA jest rozcieńczane lub degradowane. W związku z tym zastosowanie konstruktów opartych na RNA do badania dynamiki organelli na późniejszych etapach rozwoju jest ograniczone (zwykle do 3 dni po zapłodnieniu).

Te ograniczenia można przezwyciężyć za pomocą konstrukcji DNA, gdzie przestrzenna i czasowa kontrola ekspresji jest określana przez określone elementy promotora. Gdy konstrukty oparte na DNA są używane w kontekście systemu Gal4-UAS, obserwuje się znaczną poprawę poziomów ekspresji transgenów26,27. W tym dwudzielnym systemie ekspresji elementy promotora specyficzne dla typu komórki napędzają ekspresję aktywatora transkrypcji Gal4, podczas gdy geny reporterowe są klonowane poniżej sekwencji aktywującej wiązanie Gal4 (UAS). Łącząc reportery UAS z odpowiednimi sterownikami Gal4, ekspresja może być ograniczona do określonych typów komórek, omijając potrzebę klonowania genów reporterowych za różnymi promotorami za każdym razem, gdy pożądany jest określony wzorzec ekspresji. Co więcej, ekspresja wielu genów reporterowych UAS może być sterowana przez pojedynczy aktywator Gal4. System Gal4-UAS zapewnia zatem wszechstronne i elastyczne podejście genetyczne do znakowania subkomórkowego.

Mikroskopy konfokalne i szerokokątne są najdoskonalszymi narzędziami większości laboratoriów. Systemy szerokokątne zazwyczaj wykorzystują lampę łukową jako źródło światła i wykrywają emitowane światło za pomocą czułej kamery, która jest umieszczona na końcu ścieżki światła. Ta metoda obrazowania jest zwykle ograniczona do cienkich próbek, ponieważ nieostre światło przesłania ostre informacje w grubszych próbkach. Mikroskopy konfokalne różnią się od systemów szerokokątnych tym, że są zbudowane tak, aby faworyzować sygnały pochodzące z płaszczyzny ogniskowej nad tymi, które pochodzą z nieostrości (tj. "sekcja optyczna")28. Aby uzyskać przekrój optyczny, na ścieżce emisji umieszcza się otworek w pozycji sprzężonej z punktowym źródłem światła. Jako źródła światła stosuje się lasery, a sygnały są wykrywane za pomocą fotopowielaczy (PMT). W praktyce wiązka laserowa jest przesuwana po próbce punkt po punkcie, a emisja fluorescencji w każdym punkcie (pikselu) jest wykrywana przez PMT.

Tutaj obrazujemy dokładnie te same struktury subkomórkowe w żywych zarodkach danio pręgowanego, używając zarówno mikroskopii szerokokątnej, jak i konfokalnej, aby zapewnić bezpośrednie porównanie obu modalności mikroskopii. Podstawowym celem takich porównań jest przedstawienie wskazówek dotyczących wyboru najbardziej odpowiedniej techniki mikroskopowej dla konkretnego pytania.

Korzystając z opisanych tutaj metod, demonstrujemy genetyczne znakowanie mitochondriów i centrosomów oparte na Gal4-UAS. Organelle te są obrazowane w różnych typach komórek układu nerwowego oraz w komórkach mięśniowych za pomocą mikroskopii szerokokątnej i konfokalnej, aby wykazać przydatność każdej metody obrazowania. Opisane tutaj metody można łatwo dostosować do badania innych organelli i struktur subkomórkowych w żywym zarodku danio pręgowanego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z lokalnymi przepisami rządu Górnej Bawarii (Monachium, Niemcy).

1. Znakowanie organelli i innych struktur subkomórkowych

UWAGA: Tutaj opisane są genetyczne konstrukcje reporterowe, które fluorescencyjnie oznaczają centrosomy, mitochondria i błony komórkowe.

  1. Użyj konwencjonalnych metod klonowania29 w celu wygenerowania białek fuzyjnych, które fluorescencyjnie znakują centrosomy i mitochondria. Sklonuj sekwencję kodującą danio pręgowanego centrin4 (cetn4) w ramce za pomocą białka fluorescencyjnego2 (FP), takiego jak żółte białko fluorescencyjne, aby wytworzyć cetn4-YFP. Sklonuj mitochondrialną sekwencję celującą podjednostki VIII oksydazy cytochromu c w ramce za pomocą FP, takiego jak białko fluorescencyjne cyjanu, aby wygenerować mitoCFP9-11.
  2. Aby ograniczyć ekspresję białek fuzyjnych (cetn4-YFP lub mitoCFP) do określonych komórek zarodka danio pręgowanego (np. neuronów lub komórek mięśniowych), należy zastosować dwudzielny system ekspresji Gal4-UAS26,27. Najpierw wygeneruj konstrukcję reportera UAS. Użyj konwencjonalnych metod do sklonowania białka fuzyjnego w wektorze ekspresyjnym UAS, poniżej kasety UAS wiążącej Gal4 (warianty od 1x do 14x UAS, patrz Dyskusja)26,27,30 i minimalnego promotora (podstawowy promotor E1b z genu βaktyny karpia) i wygeneruj UAS:cetn4-YFP i UAS:mitoCFP.
    nuta: Aby przygotować konstrukty reporterowe UAS do generowania stabilnych linii transgenicznych, należy sklonować dodatkowe elementy (patrz 3 poniżej)
  3. Aby zobrazować kontekst komórkowy, w którym znakowane są centrosomy lub mitochondria, wygeneruj konstrukty reporterowe UAS, w których błony komórkowe są znakowane przez FP. Sklonuj pierwsze dwadzieścia aminokwasów danio pręgowanego Gap43 (zawierających miejsca palmitoilacji) w ramce za pomocą FP, aby skierować ten FP do błony komórkowej (memFP)31,32.
  4. Uzyskać konstrukty sterujące lub linie transgeniczne, w których specyficzne dla typu komórki elementy promotorowe sterują ekspresją aktywatora transkrypcyjnego Gal4-VP1627, Gal4FF33 lub KalTA430.
  5. Połącz konstrukcje reporterowe UAS z odpowiednią konstrukcją sterownika, aby ograniczyć ekspresję do pożądanego typu komórki będącej przedmiotem zainteresowania (np. w neuronach lub komórkach mięśniowych). Aby to zrobić, należy jednocześnie wstrzyknąć sterownik Gal4 i konstrukty reportera UAS na etapie jednokomórkowym zapłodnionych jaj (szczegółowe instrukcje znajdują się w 2 poniżej), aby wygenerować ryby o przejściowej ekspresji. Alternatywnie, wygeneruj stabilną linię transgeniczną reportera UAS (szczegółowe instrukcje patrz 3 poniżej) i skrzyżuj się ze stabilną linią transgeniczną Gal4, aby wygenerować potomstwo z obydwoma transgenami.
    nuta: Możliwe jest również wstrzyknięcie konstruktuatu/konstruktów reporterowych UAS do zapłodnionych jaj z linii transgenicznej stabilnej kierowcy Gal4 lub konstruktu sterownika Gal4 do zapłodnionych jaj z linii transgenicznej stabilnej reporterowej UAS.
  6. Aby uzyskać jednoczesną ekspresję wielu odrębnych białek fuzyjnych przy użyciu systemu Gal4-UAS, należy użyć sterownika Gal4 i reportera/ów UAS w jednej z następujących konfiguracji: A. Wiele oddzielnych konstrukcji reportera UAS (np. UAS:mitoCFP i UAS:memYFP wstrzyknięte jednocześnie z konstruktem sterownika Gal4)10, B. Wiele kaset UAS na jednym reporterze (np. UAS:cetn4-YFP, UAS:memCerulean)12 C. Dwukierunkowy rejestrator UAS (np. UAS: memYFP,mitoCFP)2,10,24 (Rysunek 1).

figure-protocol-1
Rysunek 1. Strategie koekspresji białek fuzyjnych przy użyciu systemu Gal4-UAS.
Jednoczesną ekspresję wielu białek fuzyjnych można osiągnąć przy użyciu kaset reporterowych UAS w różnych konfiguracjach: (A) wiele oddzielnych konstrukcji sterowanych przez UAS, (B) wiele kaset UAS na jednej konstrukcji lub (C) dwukierunkowa kaseta UAS na jednej konstrukcji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Generuj ryby o przejściowym wyrażaniu

UWAGA: Poniższy tekst jest adaptacją wcześniej opublikowanych protokołów34,35. Podstawowy zestaw do wstrzykiwań powinien obejmować mikroskop stereoskopowy o zakresie powiększenia do 12x, mikromanipulator z uchwytem na mikropipety i źródło ciśnienia powietrza. Przygotuj 2.1-2.5 z wyprzedzeniem:

  1. Aby przygotować komory do mikroiniekcji jaj, należy przygotować roztwór 1,5 % (w/v) agarozy w wodzie. Dodaj proszek agarozy do wody i kuchenki mikrofalowej, aż agaroza całkowicie się rozpuści. Napełnij szalkę Petriego (100 x 15 mm) tym roztworem.
    1. Pozostawić roztwór agarozy do ostygnięcia do około 45 oC przed umieszczeniem plastikowej formy do mikroiniekcji (40 mm x 66 mm, z 6 x 50 mm długimi grzbietami o szerokości 1,5 mm, głębokości 1 mm i oddalonymi od siebie o 3 mm) na powierzchni stopionej agarozy, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków na granicy faz.
    2. Po zastygnięciu agarozy przechowywać w temperaturze 4 oC O/N. Ostrożnie wyjmij formę za pomocą szpatułki. Przygotować wiele komór do mikroiniekcji na raz, przechowywać w temperaturze 4 oC i stosować wielokrotnie przez kilka tygodni.
  2. Za pomocą ściągacza do mikropipet wygeneruj szklane kapilary iniekcyjne z długim trzpieniem36,
    nuta: Konkretne ustawienia używane do generowania naczyń włosowatych iniekcyjnych należy określić empirycznie. Kapilary iniekcyjne można wyciągnąć z wyprzedzeniem i przechowywać przed użyciem.
  3. Zmierzyć stężenie plazmidowego DNA (sterownik Gal4 i konstrukty reporterowe UAS) do mikroiniekcji za pomocą spektrofotometru zgodnie z instrukcją producenta. Zmierzyć stosunek absorbancji przy 260 nm i 280 nm (A260/280). Rozcieńczyć DNA do końcowego stężenia 100 ng/μl w wodzie wolnej od nukleaz.
    nuta: Stosunek A260/280 wynoszący ~1,8 oznacza czyste DNA. Rozważ użycie komercyjnego zestawu (opartego na matrycy wiążącej na bazie krzemionki) do oczyszczenia plazmidowego DNA, które ma być użyte do wstrzyknięcia. Plazmidowe DNA powinno być wysokiej jakości, aby zapobiec toksyczności.
  4. Przygotować 10 μl mieszanki iniekcyjnej, łącząc DNA (0,5 do 2,5 μl 100 ng/μl podstawy, aby uzyskać końcowe stężenie 5 do 20 ng/μl), roztwór Danieau (0,33 μl 30x podstawy), czerwień fenolową (0,25 μl, opcjonalnie) i wodę wolną od nukleaz do całkowitej objętości 10 μl.
    nuta: Empirycznie określ stężenie DNA, które daje odpowiednią ekspresję. Plazmidy kierowcy Gal4 i reportera UAS muszą być wstrzykiwane jednocześnie. Żadna ekspresja nie nastąpi, gdy tylko kierowca Gal4 lub plazmid reporterowy UAS zostanie wstrzyknięty do zapłodnionych jaj typu dzikiego. Jeśli jednak zapłodnione jaja pochodzą z linii napędowej Gal4, wystarczy wstrzyknąć jeden lub kilka plazmidów reporterowych UAS. I odwrotnie, w przypadku mikroiniekcji do linii reporterowej UAS, należy wstrzyknąć tylko plazmid sterownika Gal4. Wreszcie, podczas gdy czerwień fenolowa może znacznie pomóc w wizualizacji zastrzyków, sam w sobie jest również związkiem fluorescencyjnym. W związku z tym czerwień fenolowa może zaciemniać wizualizację FP, jeśli obrazowanie jest planowane przed 24 godzinami po zapłodnieniu (hpf), ponieważ do tego czasu może nie być wystarczająco rozcieńczona.
  5. Wieczorem przed planowanymi zastrzykami ustaw kilka par (zwykle od 5 do 10) samców i samic danio pręgowanego do hodowli. Używaj zbiorników hodowlanych z wkładką zawierającą siatkowe dno i wyjmowaną przegrodę, aby oddzielić samce i samice ryb.
    nuta: Samce i samice danio pręgowanego można ogólnie odróżnić po kształcie ciała. Samce są zwykle smukłe, podczas gdy samice mają tendencję do wykazywania brzusznie wystającego brzucha. Samce dodatkowo mają żółtawo-czerwone zabarwienie na brzusznej części brzucha.
  6. Bezpośrednio przed wstrzyknięciem DNA usuń przegrody, aby umożliwić samcowi i samicy kojarzenie się. Około 15 do 30 minut po wyjęciu przegrody sprawdź, czy na dnie zbiornika nie ma jaj. Przenieś dorosłe ryby za pomocą sieci rybackiej do nowego zbiornika hodowlanego.
  7. Wylej wodę zawierającą nowo złożone zapłodnione jaja ze zbiornika hodowlanego na sito (np. plastikowe sitko do herbaty). Umyj jajka na sicie za pomocą butelki z rozpylaczem zawierającej roztwór Danieau. Odwróć sito na szalce Petriego i użyj butelki z rozpylaczem z roztworem Danieau, aby odzyskać wszystkie jaja (zwykle od 50 do 200 jaj na parę hodowlaną dorosłych ryb).
  8. Za pomocą pipety z mikroładowarką napełnij z powrotem wyciągniętą kapilę iniekcyjną mieszanką do wstrzykiwań DNA. Zamontuj kapilę iniekcyjną w uchwycie mikromanipulatora i przytnij końcówkę, pod wizualną kontrolą mikroskopu stereoskopowego, za pomocą kleszczy, aby stworzyć mikropipetę, która może przeniknąć przez kosmówkę i cytoplazmę komórki, będąc jednocześnie w stanie dostarczyć odpowiednią objętość DNA.
    nuta: Stopień, w jakim końcówka kapilary iniekcyjnej jest przycięta, powinien być określony empirycznie i może być najlepiej oceniony podczas wstrzykiwania komórek jajowych.
  9. Aby określić objętość DNA do wstrzyknięcia, należy wlać kroplę roztworu do wstrzykiwań do oleju mineralnego. Zmierzyć promień (r) kropli za pomocą mikrometru kalibracyjnego i obliczyć jej objętość (4/3 π r3). Moduluj objętość, dostosowując ciśnienie wtrysku i/lub czas trwania każdego impulsu wtrysku.
  10. Za pomocą plastikowej pipety przenieś wszystkie zebrane jaja (zwykle 50-200, od 2,7 powyżej) do rowów komory mikroiniekcyjnej. Pod wizualną kontrolą mikroskopu stereoskopowego użyj kleszczy, aby zorientować jaja tak, aby można było łatwo zidentyfikować cytoplazmę komórki (przezroczystą) i żółtko (gęste, nieprzezroczyste).
  11. Pod kontrolą wzrokową mikroskopu stereoskopowego wstrzyknąć DNA do cytoplazmy komórki zapłodnionej komórki jajowej, uważając, aby wstrzyknięta objętość (1 do 2 nl) odpowiadała około 10% objętości komórki.
    nuta: Czerwień fenolowa w roztworze DNA pomaga w wizualizacji wstrzykniętej objętości.
  12. Po wstrzyknięciu należy poluzować jaja z rowów formy wtryskowej, przepłukując je butelką z rozpylaczem zawierającą roztwór Danieau. Następnie przenieść jaja na świeżą szalkę Petriego za pomocą plastikowej pipety transferowej i przechowywać w inkubatorze o temperaturze 28,5 oC.
  13. Utrzymuj niewstrzyknięte jaja jako kontrolę, aby określić, czy zastrzyki przyczyniają się do wysokiej śmiertelności, czy to w wyniku uszkodzeń fizycznych odniesionych podczas penetracji mikropipet, czy mieszanki DNA.
    nuta: Wysoka śmiertelność po wstrzyknięciach może wynikać z wielu czynników, w tym zbyt wysokiego stężenia DNA lub objętości wstrzyknięć i/lub plazmidów z zanieczyszczeniami. Aby zapobiec toksyczności spowodowanej preparatami DNA niskiej jakości, można stosować komercyjne zestawy (oparte na matrycy wiążącej na bazie krzemionki).
  14. W regularnych odstępach czasu po wstrzyknięciu należy użyć mikroskopu stereoskopowego do badania przesiewowego w poszukiwaniu niezapłodnionych jaj oraz martwych lub zniekształconych zarodków i wyrzucić je.
    nuta: Jaja, które wydają się być w stadium jednokomórkowym kilka godzin po zapłodnieniu, należy uznać za niezapłodnione. Identyfikuj zniekształcone zarodki na podstawie poważnych wad anatomicznych, takich jak upośledzona przednia i tylna oś ciała. Amorficzny materiał w kosmówce sugeruje, że zarodek nie przeszedł przez etapy rozwojowe i zmarł. Aby upewnić się, czy zarodki, którym poddano mikroiniekcję, przechodzą normalny przebieg rozwoju, należy zapoznać się z atlasami anatomicznymi37.
  15. Przenieść zarodki za pomocą plastikowej pipety transferowej do roztworu Danieau zawierającego 1x 1-fenyl 2-tiomocznik (1xPTU) między 10 a 24 hpf, aby zapobiec tworzeniu się pigmentu. Utrzymywać zarodki w roztworze Danieau zawierającym PTU przez cały czas trwania eksperymentu.
    nuta: Oprócz melanoforów, irydofory na powierzchni skóry mogą być problematyczne dla obrazowania. Podczas gdy PTU nie hamuje tworzenia irydoforów, istnieją zmutowane linie ze zmniejszoną liczbą irydoforów, takie jak roy orbison (roy) i mogą być używane38.
  16. Po wykluciu się zarodków (zwykle w drugiej lub trzeciej dobie po zapłodnieniu, 2 lub 3 dpf) należy wyrzucić kosmówkę i wymienić roztwór Danieau zawierający PTU.
    nuta: Etapy te są ważne dla zapewnienia jakości podłoża zarodkowego i żywotności zdrowych zarodków.

3. Generuj stabilne linie transgeniczne

UWAGA: Stabilne linie transgeniczne mogą być efektywnie generowane za pomocą systemu transpozonów Tol2. Wektor transpozonu Tol2 zawierający interesujący nas transgen jest wstrzykiwany wraz z mRNA kodującym enzym transpozazy do zapłodnionych jaj na etapie jednokomórkowym. Białko transpozazy pochodzące z wstrzykniętego mRNA katalizuje wycięcie kasety transgenu z wektora transpozonu i jej integrację z genomem39.

  1. Sklonuj transgeniczną kasetę reporterową (np. UAS:mitoCFP) między powtórzeniami odwróconego terminala Tol2 w jednym z wektorów Tol2 obecnie używanych w społeczności danio pręgowanego, jak opisano40,
    nuta: Wektory Tol2 zawierające wybieralną kasetę, w której elementy promotorowe sterują ekspresją FP w układach narządów niezwiązanych z obszarem zainteresowania (np. serce41 lub soczewka42) są przydatne do badań przesiewowych linii transgenicznych reportera UAS przy braku transaktywacji Gal4.
  2. Za pomocą komercyjnego zestawu (opartego na matrycy wiążącej na bazie krzemionki) oczyść plazmidowe DNA, które ma być użyte do wstrzyknięcia. Upewnij się, że plazmidowe DNA jest wysokiej jakości, aby zapobiec toksyczności.
  3. Transkrybuj mRNA kodujące transpozazę Tol2 przy użyciu odpowiedniego wektora transkrypcyjnego, takiego jak PCS-TP43. Krótko mówiąc, zlinearyzuj PCS-TP i użyj komercyjnego zestawu do generowania ograniczonego mRNA i postępuj zgodnie z protokołem producenta. Należy uważać, aby uniknąć zanieczyszczenia RNazami (np. należy używać końcówek i probówek do pipet niezawierających RNAzy). Podwielokrotnić RNA w stężeniu 100 ng/μl do jednorazowego użytku i przechowywać w temperaturze -80 oC.
  4. Rano w dniu wstrzyknięć rozmrozić na lodzie porcję mRNA transpozazy. Wymieszaj transpozonowy wektor DNA (2 μl ze 100 ng/μl) i mRNA transpozazy (2 μl ze 100 ng/μl) w stosunku 1:1 i dodaj 6 μl wody wolnej od RNAse, aby uzyskać całkowitą objętość do 10 μl.
    nuta: Dla każdego z nich zalecane jest stężenie 20 ng/μl, ale optymalne stężenie należy określić empirycznie. Do rozcieńczenia należy użyć wody wolnej od RNAzy. Podczas obchodzenia się z mieszanką iniekcyjną DNA-RNA należy używać rękawiczek i trzymać ją na lodzie przez cały okres wstrzyknięć, aby zapobiec degradacji mRNA.
  5. Korzystając ze szczegółowych instrukcji w sekcji 2 powyżej, wstrzyknij mieszankę iniekcyjną DNA-RNA do zapłodnionych jaj na etapie jednokomórkowym. Pod kontrolą wzrokową mikroskopu stereoskopowego celuj w cytoplazmę komórki w stadium jednokomórkowym, aby uzyskać najwyższe wskaźniki wydajności transgenezy. Utrzymuj wstrzyknięte zarodki w temperaturze 28,5 oC do czasu, gdy będą gotowe do badania przesiewowego pod kątem ekspresji transgenu.
    nuta: PCR można przeprowadzić w celu sprawdzenia skuteczności transpozazy Tol2, jak opisano wcześniej44.
  6. Badania przesiewowe zarodków na szalce Petriego w celu transgenezy za pomocą okularów fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego.
    nuta: Użyj odpowiednich zestawów filtrów mikroskopu, aby zobrazować ekspresję FP wybieralnej kasety (tj. fluorescencję w sercu lub soczewce) przy 2 lub 3 dpf. Zidentyfikuj potencjalne transgeniczne zarodki na podstawie ekspresji (w sercu lub soczewce) i wyhoduj te zarodki do dorosłości (pokolenie F0) przy użyciu standardowych protokołów45. Alternatywnie, zidentyfikuj potencjalne transgeniczne zarodki za pomocą PCR, jak opisano w 46.
  7. Gdy ryby reportera UAS F0 osiągną wiek 2,5 - 3 miesięcy, skrzyżuj je (szczegóły w 2.5) z nietransgenicznymi rybami dzikiego typu w celu uzyskania ikry i ustanowienia pokolenia F1. Alternatywnie, skrzyżuj rybę reportera F0 UAS z linią kierowcy Gal4, aby ustalić generację F1. W tym drugim przypadku transgen napędzany przez UAS może być bezpośrednio monitorowany w zarodkach uzyskanych z krzyżówki.
  8. Użyj fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego do badania przesiewowego zarodków F1 pod kątem ekspresji transgenu lub kasety selekcyjnej.
    nuta: Kiedy ekspresja zostanie potwierdzona, można powiedzieć, że transgen jest przenoszony przez linię zarodkową. Transgeneza jest nie-mendlowska w stadium F0. Liczba zarodków wykazujących ekspresję transgenu może wahać się od niewielkiej liczby do zdecydowanej większości w poszczególnych lęgach. Integracja transpozonów u różnych ryb F0 może się znacznie różnić, co skutkuje różnymi wzorcami ekspresji. Dlatego utrzymuj ryby F1 z różnych założycieli F0 jako oddzielne podlinie. Integracje transpozonów u ryb F1 są stabilne i są przekazywane kolejnym pokoleniom w sposób mendlowski.
  9. Utrzymuj każdą rybę F0 w oddzielnych zbiornikach, aby ponownie zidentyfikować nosicieli transgenu.

4. Przygotowanie zarodków do obrazowania pod mikroskopem pionowym

UWAGA: Opisane tutaj procedury zostały zoptymalizowane pod kątem obrazowania na mikroskopach pionowych z obiektywami o dużej odległości roboczej z stożkiem zanurzającym w wodzie.

  1. Użyj fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego, aby przebadać zarodki pod kątem ekspresji transgenu.
    nuta: Ekspresja transgenu reporterowego UAS będzie zależeć od konkretnej użytej linii sterującej Gal4. Wybierz zarodki do eksperymentów obrazowych w oparciu o pożądany wzorzec ekspresji.
  2. Przenieść wybrane zarodki za pomocą plastikowej pipety na oddzielną szalkę Petriego zawierającą bufor Danieau z 1x PTU i 1x Trikainą.
    nuta: Gdy znakowanie jest rzadkie (tylko kilka komórek w układzie narządów), należy umieścić zarodki w agarozie (patrz 4.3-4.7 poniżej) i przeprowadzić badanie przesiewowe pod kątem ekspresji transgenu za pomocą mikroskopu szerokokątnego z obiektywami o dużym powiększeniu (patrz 5.1 poniżej). Trikaina znieczula ryby i powinna być skuteczna w ciągu kilku sekund. Jeśli ryby nie są unieruchomione, jest prawdopodobne, że Trikaine uległa degradacji. Możliwe przyczyny tej degradacji to słabe przechowywanie trikainy, która jest wrażliwa na światło47.
  3. Przygotuj agarozę do osadzenia ryby, rozpuszczając niskotopliwy proszek agarozy w buforze Danieau do końcowego stężenia 0,7%. Porcję (1 ml) i przechowywać w bloku grzewczym w temperaturze 40 °C do momentu przygotowania do użycia.
    nuta: Wyższe stężenia agarozy (do 1,5%) można również stosować do zatapiania ryb.
  4. Dodać 50 μl 20x bulionu Trikainy i 20 μl 50x roztworu podstawowego PTU do 1 ml podwielokrotności niskotopliwej agarozy i dobrze wymieszać, stukając w bok probówki. Włóż rurkę z powrotem do bloku grzewczego. Za pomocą plastikowej pipety transferowej delikatnie odpipetuj kilka (1-10) znieczulonych zarodków do agarozy, przenosząc jak najmniej płynu, aby uniknąć rozcieńczenia agarozy.
  5. Za pomocą plastikowej pipety przenieś wszystkie zarodki z niewielką ilością agarozy na szalkę Petriego ze szklanym dnem.
  6. Pracując stosunkowo szybko, użyj kleszczy, aby ustawić zarodki w pożądanej orientacji, w zależności od struktury, która ma być zobrazowana.
    nuta: Ustaw zarodki na boku, jeśli ma być obrazowana siatkówka lub neurony czuciowe Rohon-Beard (RB).
  7. Pozwól agarozie zestalić się przez co najmniej 15 minut. Dodać bufor Danieau zawierający 1xPTU i 1xTrikainę, aby przykryć zarodki zanurzone w agarozie. Umieścić szalkę zawierającą zarodki zatopione w agarozie w inkubatorze w temperaturze 28,5 °C, aż będzie gotowa do obrazowania.

5. Obrazowanie struktur komórkowych i subkomórkowych za pomocą mikroskopii szerokokątnej lub konfokalnej

UWAGA: Mikroskopia szerokokątna i mikroskopia konfokalna ze skaningiem punktowym są najczęściej używanymi metodami obrazowania fluorescencyjnie znakowanych zarodków danio pręgowanego. Tabela 1 podsumowuje główne zalety i wady obu systemów. W przypadku obu form mikroskopii zarodki są umieszczane w agarozie, jak opisano w punkcie 4 powyżej, i utrzymywane w temperaturze 28,5 oC przez cały czas trwania eksperymentu obrazowego za pomocą komory grzewczej na stoliku mikroskopu. Co ważne, szalka z zarodkami zatopionymi w agarozie może osiągnąć równowagę do 28,5 oC przed rozpoczęciem obrazowania, ponieważ wahania temperatury powodują dryf w wymiarze z. Podczas przeprowadzania długotrwałych eksperymentów obrazowych (trwających kilka godzin) należy nałożyć osłonę z pleksiglasu na szalkę Petriego, aby zmniejszyć parowanie buforu.

Szerokie pole widzeniaKonfokalne skanowanie punktowe
kosztStosunkowo niedrogiDrogie (ok. 5x więcej)
Wybielanie fotograficzneniskiwysoki. Próbka jest wystawiona na działanie światła laserowego powyżej i poniżej płaszczyzny ogniskowej.
FototoksycznośćniskiWysoki (patrz Foto-wybielanie powyżej)
Szybkość akwizycjiszybkipowolny
Rozdzielczość w xyPrawo AbbegoPrawo Abbego (można je poprawić o ok. 40% za pomocą bardzo małego otworka, jednak w większości ustawień ma to niewielkie zastosowanie praktyczne)
Przekrój optycznybiednyTak (można dostosować za pomocą rozmiaru otworka)
Przenikanie do tkanekOgraniczone do struktur powierzchownych (np. komórek Rohon-Beard lub włókien mięśniowych)Ograniczone do < 100 mm od powierzchni zarodka

Tabela 1. Ogólne porównanie mikroskopii konfokalnej szerokokątnej i punktowej skaningowej

  1. Mikroskopia szerokokątna
    nuta: W tym miejscu przedstawiono wytyczne dotyczące obrazowania zarodków danio pręgowanego za pomocą pionowego mikroskopu szerokokątnego z obiektywami zanurzającymi się w wodzie na dużą odległość roboczą. Mikroskop jest wyposażony w chłodzoną kamerę CCD oraz zestawy filtrów do wizualizacji różnych fluoroforów zamontowane na zautomatyzowanym kole filtrów w celu szybkiej akwizycji wielu kanałów. Akwizycja obrazu jest kontrolowana przez μManager, pakiet oprogramowania do mikroskopii typu open source48. Podano konkretny przykład obrazowania mitochondriów w neuronach czuciowych RB. Komórki RB są znakowane genetycznie za pomocą YFP ukierunkowanego na błonę, a ich mitochondria są znakowane CFP (patrz 1.1 powyżej).
    1. Zamontuj zarodki na boku w niskotopliwej agarozie, jak opisano w 4 powyżej.
    2. Przed rozpoczęciem obrazowania pozostawić szalkę z zamontowaną rybą do zrównoważenia do 28,5 oC w komorze grzewczej na stoliku mikroskopu.
    3. Użyj obiektywu ze stożkiem zanurzonym w wodzie o małym powiększeniu i spójrz przez okulary mikroskopu, aby wybrać obszar na powierzchni zarodka do zobrazowania.
      nuta: Jeśli stabilna transgeniczna linia reporterowa MitoFish, Tg(UAS-E1b:mYFP,mitoCFP)mde6, jest używana w połączeniu z linią sterującą, taką jak HuC: Gal4, wówczas większość neuronów RB jest znakowana i pojawia się jako gęsta siatka altan neurytowych na powierzchni zarodka. Jeśli mikroiniekcja konstruktów DNA jest stosowana w celu uzyskania rzadkiego znakowania (np. Sensory:Gal4-VP16 z UAS:mitoCFP i UAS:MA-YFP), należy przeprowadzić badania przesiewowe zarodków w celu identyfikacji podwójnie znakowanych komórek.
    4. Otwórz oprogramowanie mikroskopu (μManager 1.4) i kliknij "Oświetlenie" w sekcji "Ustawienia konfiguracyjne", aby zdefiniować odpowiednie zestawy filtrów dla interesującej Cię długości fali (YFP lub CFP dla bieżącego przykładu). W sekcji "Ustawienia aparatu" wprowadź czas naświetlania wymagany do uzyskania odpowiedniego obrazu.
      nuta: "Ustawienia podświetlenia" są wstępnie ustawiane przez użytkownika podczas instalacji oprogramowania i są wczytywane podczas otwierania programu μManager. Jeśli oprogramowanie nie jest skonfigurowane do sterowania kołem filtrów, ręcznie przesuń koło filtra w głowicy rewolwerowej do odpowiedniej pozycji.
    5. Zmień na obiektyw ze stożkiem zanurzanym w wodzie na dużą odległość roboczą w zakresie powiększenia 40-100x. Wybierz obiektyw o największej aperturze numerycznej (NA) i korekcji chromatycznej (apochromatyczny).
    6. Kliknij "Na żywo", aby wybrać pole widzenia: W przypadku neuronu RB zobrazuj transport mitochondrialny w aksonie macierzystym, emanującym z ciała komórki lub w altanie obwodowej.
      nuta: Obwodowe altanki neuronów RB w fałdzie płetwy ogonowej zarodka stanowią idealną okazję do zobrazowania dużego pola widzenia, które jest płaskie i dlatego można je uchwycić na jednej klatce za pomocą mikroskopu szerokokątnego. Dlatego ważne jest, aby zarodek ułożyć jak najbardziej płasko na boku, tak aby fałd płetwy ogonowej był równoległy do dna szalki Petriego.
    7. Po wybraniu pola widzenia należy kliknąć na przycisk "wybór prostokątny" w menu ImageJ, zdefiniować obszar zainteresowania (ROI) i kliknąć na "ROI" w oknie μManager. Po wybraniu ROI dla obrazowania, kliknij "Zatrzymaj" i "Zapisz", aby zrobić zdjęcie kanału YFP w celu zarejestrowania lokalnej morfologii neurytu / neurytów.
    8. Aby zobrazować transport mitochondrialny, kliknij przycisk "Multi-D Acq". Obserwuj dodatkowe okno ("Akwizycja wielowymiarowa") i wybierz liczbę punktów czasowych oraz interwał między punktami czasowymi w tym oknie. Używaj częstotliwości odświeżania 0,3-1 Hz. Nagrywaj przez co najmniej 10 minut, aby zebrać jak najwięcej punktów danych.
    9. W oknie "Akwizycja wielowymiarowa" kliknij "Kanały", dodaj i zdefiniuj długość fali do obrazowania (w tym przykładzie CFP dla mitochondriów) oraz czas ekspozycji. Utrzymuj czas ekspozycji poniżej 400 ms w celu obrazowania transportu mitochondrialnego.
    10. Kliknij opcję "Zapisz obrazy" w oknie "Akwizycja wielowymiarowa", aby automatycznie zapisać pliki w określonym folderze opisanym w "Katalogu głównym". Kliknij "Pobierz" w prawym górnym rogu, aby rozpocząć obrazowanie poklatkowe.
    11. Ręcznie dostosuj ostrość podczas nagrywania poklatkowego, aby skompensować wszelkie odchylenia w wymiarze z.
      UWAGA: Korzystając z tych parametrów, transport mitochondrialny w neuronach RB może być obrazowany nawet przez 4 godziny.
  2. Mikroskopia konfokalna
    nuta: Poniżej znajdują się wskazówki dotyczące obrazowania za pomocą pionowego mikroskopu konfokalnego Olympus FV1000 i obiektywów ze stożkiem zanurzanym w wodzie na dużą odległość. Mikroskop jest wyposażony w wiele linii laserowych i kilka detektorów (konwencjonalne PMT i bardziej czułe detektory fosforku arsenku galu), które pozwalają na obrazowanie wielokanałowe. Szczególne odniesienie dotyczy oprogramowania Olympus Fluoview. Jednak opisane tutaj parametry obrazowania powinny być łatwo przenoszone do innych systemów konfokalnych.
    1. Zamontuj zarodki w niskotopliwej agarozie w orientacji odpowiedniej dla narządu/struktury, która ma być zobrazowana, jak opisano w punkcie 4 powyżej.
    2. Przed rozpoczęciem obrazowania pozostawić szalkę z zamontowaną rybą do zrównoważenia do 28,5 oC w komorze grzewczej na stoliku mikroskopu.
    3. Do mikroskopów konfokalnych w konfiguracji pionowej należy używać obiektywów stożkowych zanurzających się w wodzie o dużej odległości roboczej. Wybierz obiektywy o najwyższej możliwej NA, aby zmaksymalizować ilość sygnałów fluorescencyjnych, które można zebrać i mieć najlepszą zdolność rozdzielczą. W przypadku zbierania obrazów z wielu kanałów należy wybrać obiektywy z korekcją chromatyczną (apochromatyczne).
    4. Otwórz oprogramowanie mikroskopu i kliknij "Trans Lamp" lub "Epi Lamp", aby użyć odpowiednio światła przechodzącego lub fluorescencyjnego do identyfikacji obszaru zainteresowania za pomocą okularów mikroskopu.
    5. Użyj oprogramowania, aby skonfigurować następujące parametry skanowania w celu uzyskania stosów obrazów:
      1. W oknie "Ustawienia namierzania" sprawdź, czy cel wybrany do obrazowania jest zgodny z celem wyświetlanym w menu rozwijanym dostępnych celów.
        nuta: Ma to na celu zapewnienie, że wszystkie wstępnie obliczone parametry dla danego obiektywu (np. rozdzielczość poprzeczna i osiowa, wielkość apertury konfokalnej itp.) są prawdziwe i mogą być niezawodnie wykorzystywane.
      2. Wybierz odpowiednią linię/filtry laserowe oraz dichroiczne wzbudzenie i emisję, aby zobrazować określone białka fluorescencyjne. W tym celu należy kliknąć przycisk "Lista barwników" w oknie "Kontrola akwizycji obrazu" i wybrać odpowiedni fluorofor. Alternatywnie kliknij przycisk "Ścieżka światła i barwniki", aby ręcznie ustawić te parametry.
        nuta: Po wybraniu opcji przycisku "Lista barwników" oprogramowanie automatycznie wybiera odpowiednie linie laserowe, filtry dichroiczne wzbudzenia i emisji oraz odpowiednio dostosowuje wielkość apertury konfokalnej.
      3. W oknie "Ustawienia akwizycji" dostosuj współczynnik "Powiększenie" i "Proporcje rozmiaru" (tj. 512x512, 1024x1024 itd.) zeskanowanego obrazu, aby uzyskać rozmiar piksela niezbędny do najlepszego rozdzielenia obrazowanych struktur. Ustaw rozmiar piksela tak, aby wynosił około połowy teoretycznej rozdzielczości obiektywu, postępując zgodnie z kryteriami próbkowania Nyquista. Aby określić rozmiar w pikselach pozyskanego obrazu, kliknij przycisk z symbolem informacyjnym ("i") w oknie "Kontrola pozyskiwania obrazu".
      4. Ustaw prędkość skanowania na najwyższą możliwą (2 μs/piksel) w oknie "Ustawienia akwizycji".
      5. W oknie "Image Acquisition Control" kliknij uśrednianie linii Kalmana, aby zredukować szumy. Zwykle wystarcza współczynnik od 2 do 3.
      6. Wybierz tryb skanowania sekwencyjnego podczas obrazowania fluoroforów z nakładającymi się widmami. Aby to zrobić, kliknij "Sekwencyjny" i "Linia" w oknie "Kontrola pozyskiwania obrazu".
      7. Dostosuj moc wyjściową odpowiedniej linii laserowej (zwykle poniżej 5%). Konkretne wartości należy określić empirycznie.
      8. Kliknij przycisk "XY Repeat" lub "Focus x2" lub "Focus x4", aby w sposób ciągły skanować wybrany obszar, jednocześnie dostosowując ustawienia detektora dla każdego kanału. Dostosuj "HV", "Gain" i "Offset" dla każdego kanału, aby uzyskać obrazy o najwyższym zakresie dynamicznym wartości szarości.
        nuta: Konkretne wartości dla tych ustawień należy określić empirycznie. "HV" dostosowuje napięcie na detektorze, aby zmienić jego czułość, "Offset" dostosowuje sygnał wyjściowy detektora, a "Gain" zwielokrotnia sygnał wyjściowy detektora o stały współczynnik.
      9. Naciśnij Ctrl + H, aby wyświetlić uzyskane obrazy za pomocą tabeli przeglądowej (HiLo), która identyfikuje nienasycone (pojawiają się na niebiesko) i nadmiernie nasycone piksele (pojawiają się na czerwono), których należy generalnie unikać. Ponownie oceń moc wyjściową odpowiedniej linii/s lasera i ustawienia detektora.
        nuta: Użycie dużej mocy lasera i wysokich poziomów "HV" detektora doprowadzi do zwiększenia sygnału. Wyższa moc lasera doprowadzi jednak do zwiększonego wybielania i fototoksyczności. Zwiększenie "HV" doprowadzi do zwiększonego hałasu. W związku z tym należy znaleźć kompromis przy ustawianiu mocy lasera i "HV", aby uzyskać obrazy o akceptowalnym poziomie szumów, jednocześnie zapobiegając uszkodzeniom fotograficznym (patrz również tabela 1).
      10. Zbieraj obrazy ze zdefiniowanej objętości, ustawiając ostrość na górnej i dolnej granicy obszaru zainteresowania. W oknie "Ustawienie akwizycji" kliknij przyciski zestawu "End Set" i "Start Set" w oknie z-stack przy górnej i dolnej granicy głośności, która ma być zobrazowana. Wybierz rozmiar kroku, który jest równy połowie rozdzielczości z dla danego obiektywu (np. jeśli rozdzielczość z wynosi 2 μm, wybierz 1 μm). Aby określić rozdzielczość z obiektywu, kliknij przycisk z symbolem informacyjnym ("i") w oknie "Image Acquisition Control".
      11. Ustaw szereg czasowy, aby zbierać stosy z z częstotliwością czasową, która jest odpowiednia dla dynamiki obrazowanej struktury subkomórkowej. W oknie podrzędnym "TimeScan" wprowadź częstotliwość, z jaką powinny być pobierane stosy z ("Interwał") oraz liczbę przejęć obrazów ("Liczba").
      12. Kliknij przyciski "Głębokość" i "Czas" w oknie "Kontrola akwizycji obrazu", aby potwierdzić, że zostanie uzyskany stos z i szeregi czasowe. Na koniec kliknij przycisk "XYZT", aby rozpocząć pobieranie zdjęć poklatkowych.
      13. Po zakończeniu akwizycji obrazu obserwuj "Series Done" w interfejsie oprogramowania. Kliknij na niego i zapisz obrazy w formacie "oib", aby nagrać obrazy i powiązane z nimi metadane.
        nuta: Obrazy uzyskane za pomocą mikroskopu szerokokątnego i mikroskopu konfokalnego mogą być wizualizowane i analizowane za pomocą oprogramowania, takiego jak FIJI, bezpłatny program do przetwarzania obrazów w domenie publicznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj użycie mikroskopii szerokokątnej i konfokalnej do obrazowania mitochondriów i centrosomów w żywych zarodkach danio pręgowanego jest bezpośrednio porównywane i kontrastowane. W zależności od lokalizacji komórek, w których ma być badana dynamika organelli i nieodłącznej częstotliwości określonych zdarzeń subkomórkowych, na ogół lepszym wyborem jest mikroskopia szerokokątna lub konfokalna. Zobrazowaliśmy organelle w neuronach RB zlokalizowanych na powierzchni zarodka oraz w komórkach s...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu demonstrujemy wszechstronność systemu ekspresji Gal4-UAS do fluorescencyjnego znakowania mitochondriów, centrosomów i błon komórkowych określonych typów komórek in vivo w zarodkach danio pręgowanego. Wiele fluorescencyjnych białek fuzyjnych, które znakują inne organelle lub struktury subkomórkowe, można znaleźć w opublikowanej literaturze i można je uzyskać z odpowiedniego laboratorium, źródeł komercyjnych lub niekomercyjnych depozytów plazmidowych (np . Addgene). Aby zaprojektować nowe fl...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

P.E. jest wspierany przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Research Training Group 1373 oraz Graduate School of the Technische Universität München (TUM-GS). G.P. był wspierany przez TUM-GS. L.T. jest wspierany przez stypendium EMBO (EMBO ALTF 108-2013). Prace D.P. nad danio pręgowanym były wspierane przez DFG za pośrednictwem Sonderforschungsbereich "Molekularne mechanizmy neurodegeneracji" (SFB 596); Centrum Zintegrowanych Nauk o Białkach (Monachium) oraz Siódmego Programu Ramowego Wspólnoty Europejskiej (7PR/2007-2013) na podstawie umowy o grant nr 200611 (MEMOSAD). Obecnie jest stypendystą New York Stem Cell Foundation-Druckenmiller Fellow i był stypendystą Niemieckiej Akademii Nauk Leopoldina. L.G. jest wspierany przez DFG w ramach projektu SFB 870 "Assembly and Function of Neuronal Circuits" (Montaż i funkcja obwodów neuronalnych).

Jesteśmy wdzięczni Kristinie Wullimann za utrzymanie naszego obiektu do ryb, Yvonne Hufnagel za wsparcie techniczne i Thomasowi Misgeldowi za komentarze do manuskryptu. Jesteśmy wdzięczni R. Kösterowi (Technische Universität Braunschweig) za dostarczenie wektora M1 Medusa (pSKmemmRFP:5xUAS:H2B-CFP:5xUAS:Centrin2-YFP), z którego sklonowaliśmy Centrin-YFP oraz S.C. Suzuki i T. Yoshimatsu (University of Washington) za dostarczenie kasety 14xUAS:MA-cerulean, której użyliśmy do wygenerowania konstrukcji reportera do stworzenia CentrinFish. Podziękowania kierujemy również do S.C. Suzuki i T. Yoshimatsu (University of Washington) za linię transgeniczną Otx2:Gal4, A. Sagastiego za konstrukt Sensory:Gal4-VP16 (UCLA) oraz M. Noneta (Washington University w St. Louis) za wektor pCold Heart Tol2. Dziękujemy Bettinie Schmid, Alexandrowi Hruscha i Christianowi Haassowi (Niemieckie Centrum Chorób Neurodegeneracyjnych w Monachium - DZNE) za wkład w rozwój MitoFish.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Agaroza (2-hydroksyetyloagaroza)Sigma-AldrichA4018-10GNiska temperatura żelowania Typ VII
Grzejnik blokowyEppendorfThermomixer compact
Ca(NO3)2 Hydrat azotanu wapnia, 99.996% Aldrich202967-50gAby przygotować 30x kamerę
CCDQimagingRetiga Exi Fast 1394
Kleszcze Dumont #5 z powłoką ceramicznąDumont - Fine Science Tools11252-50#5
Kleszcze Konfokalny laserowo-skaningowy mikroskop OlympusFV1000 Fluoview
Podgrzewacz do naczyńWarner Instrument CorporationDH-35Pierścień grzewczy
Sól metanosiarczanu 3-aminobenzoesanu etyluPharmaQTricaine PharmaQ-25gTricaine (znieczulający)
Fluorescencyjny mikroskop preparacyjnyLeicaM205 FA
Zestaw GeneCleanMP Biomedicals111001200
Naczynia do hodowli ze szklanym dnemMatTek CorporationP35G-0-14-Cszalka Petriego 35 mm, mikrostudzienka 14 mm, szkło nakrywkowe nr 0
Igły szklaneWorld Precision Instruments Inc. TW100F-4Do mikroiniekcji
HEPESSigmaH3375-250gDo przygotowania 30x wysokopróżniowego smaru Danieau's
Dow Corning DCC000001242 150gSmar z dwutlenku krzemu
KCl 99%Sigma-AldrichS7643-5kgDo przygotowania 30x
MgSO4.7H2O     Siarczan magnezu siedmiowodny 98+% Odczynnik A.C.S. Sigma-Aldrich230291-500gDo przygotowania 30x
Mikrowtryskiwacz Danieau Końcówki do mikroładowarek EppendorfFemtoJet
Eppendorf9300010070,5-20 ul
MikromanipulatorMaerzhaeuser WetzlarMM33 Rechts/00-42-101-0000/M3301R
Uchwyt na mikropipetyIntracelP/N 50-00XX-130-1
mMESSAGE mMACHINE SP6 Zestaw do transkrypcjiAmbionAM1340Do transkrypcji PCS-Transposase
NaCl BioXtra >99.5%Sigma-AldrichP9541-1kgDo przygotowania 30x
NanofotometrDo pomiaru stężenia DNA/RNA
Ściągacz igiełSutter InstrumentP-1000Flaming/Brown
NIR Apo 40x/0.80W NikonObiektyw stożkowy zanurzany w wodzie
N-fenylotiomocznik klasy I, ok. 98%SigmaP7629-10GPTU (zapobiega pigmentacji)
szalkiPetriego Sarstedt AG 82147292 x 16mm 
Formy plastikowe Adaptacyjne narzędzia naukoweTU-1Do mikroiniekcji
Osłona z pleksiglasu - z otworemWykonaneOtwór w osłonie z pleksiglasu powinien być o 3 mm większy niż średnica obiektywu stożka do zanurzania w wodzie
Sitko do herbaty (plastikowe)Do zbierania ikry danio pręgowanego
Regulator temperaturyWarner Instrument CorporationTC-344BPodwójna automatyczna temperatura Kontroler
Pipety transferoweSarstedt AG 86.1171Plastikowe pipety transferowe 3,5 ml
UMPlanFI 100x/1,00 WOlympusObiektyw stożkowy do zanurzania w wodzie
UMPlanFLN 20x/0,50W OlympusObiektyw ze stożkiem zanurzanym w wodzie
Mikroskop szerokokątnyOlympusBX51WI
PTU (50x Stock)Rozpuść 76 mg PTU w 50 ml wody destylowanej
Mieszaj energicznie w temperaturze pokojowej 
Przechowywać w temperaturze -20 oC w 1 ml porcji
Stosować w 1x roztwór roboczy
Trikaina (20x Stock)Rozpuść 200 mg Trikainy w 48 ml wody destylowanej
Dodaj 2 ml 1M zasady Tris (pH9)
Dostosuj do pH 7 
Przechowywać w temperaturze -20 oC w 1 ml porcji
Stosować przy 1x roztworze roboczym
Roztwór Danieau (30x Stock)1,740 mM  NaCl 
21 mM          KCl 
12 mM          MgSO4.7H2O 
18 mM          Ca (NO3)2
150 mM      Bufor HEPES 
Woda destylowana do 1 l 
Przechowywać pod adresem 4 oC 
Stosować w 0,3x roztworze roboczym
Danieau Danieau na zamówienie

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alexandre, P., Reugels, A. M., Barker, D., Blanc, E., Clarke, J. D. Neurons derive from the more apical daughter in asymmetric divisions in the zebrafish neural tube. Nat Neurosci. 13 (6), 673-679 (2010).
  2. Distel, M., Hocking, J. C., Volkmann, K., Koster, R. W. The centrosome neither persistently leads migration nor determines the site of axonogenesis in migrating neurons in vivo. J Cell Biol. 191 (4), 875-890 (2010).
  3. Godinho, L., et al. Nonapical symmetric divisions underlie horizontal cell layer formation in the developing retina in vivo. Neuron. 56 (4), 597-603 (2007).
  4. Norden, C., Young, S., Link, B. A., Harris, W. A. Actomyosin is the main driver of interkinetic nuclear migration in the retina. Cell. 138 (6), 1195-1208 (2009).
  5. Godinho, L., et al. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. 132 (22), 5069-5079 (2005).
  6. Mumm, J. S., et al. In vivo imaging reveals dendritic targeting of laminated afferents by zebrafish retinal ganglion cells. Neuron. 52 (4), 609-621 (2006).
  7. Sagasti, A., Guido, M. R., Raible, D. W., Schier, A. F. Repulsive interactions shape the morphologies and functional arrangement of zebrafish peripheral sensory arbors. Current biology : CB. 15 (9), 804-814 (2005).
  8. Zolessi, F. R., Poggi, L., Wilkinson, C. J., Chien, C. B., Harris, W. A. Polarization and orientation of retinal ganglion cells in vivo. Neural Dev. 1, 2(2006).
  9. Kim, M. J., Kang, K. H., Kim, C. H., Choi, S. Y. Real-time imaging of mitochondria in transgenic zebrafish expressing mitochondrially targeted GFP. Biotechniques. 45 (3), 331-334 (2008).
  10. Plucinska, G., et al. In vivo imaging of disease-related mitochondrial dynamics in a vertebrate model system. J Neurosci. 32 (46), 16203-16212 (2012).
  11. O'Donnell, K. C., Vargas, M. E., Sagasti, A. WldS and PGC-1alpha regulate mitochondrial transport and oxidation state after axonal injury. J Neurosci. 33 (37), 14778-14790 (2013).
  12. Engerer, P., Yoshimatsu, T., Suzuki, S. C., Godinho, L. CentrinFish permit the visualization of centrosome dynamics in a cellular context in vivo. Zebrafish. 11 (6), 586-587 (2014).
  13. Wang, K., et al. Rapid adaptive optical recovery of optimal resolution over large volumes. Nat Methods. 11 (6), 625-628 (2014).
  14. Randlett, O., Poggi, L., Zolessi, F. R., Harris, W. A. The oriented emergence of axons from retinal ganglion cells is directed by laminin contact in vivo. Neuron. 70 (2), 266-280 (2011).
  15. Tanabe, K., et al. Atypical protein kinase C regulates primary dendrite specification of cerebellar Purkinje cells by localizing Golgi apparatus. J Neurosci. 30 (50), 16983-16992 (2010).
  16. Hocking, J. C., Distel, M., Koster, R. W. Studying cellular and subcellular dynamics in the developing zebrafish nervous system. Exp Neurol. 242, 1-10 (2013).
  17. Clark, B. S., Winter, M., Cohen, A. R., Link, B. A. Generation of Rab-based transgenic lines for in vivo studies of endosome biology in zebrafish. Dev Dyn. 240 (11), 2452-2465 (2011).
  18. Paolini, A., et al. Asymmetric inheritance of the apical domain and self-renewal of retinal ganglion cell progenitors depend on Anillin function. Development. 142 (5), 832-839 (2015).
  19. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. The Journal of clinical investigation. 122 (7), 2337-2343 (2012).
  20. Steele, S. L., Prykhozhij, S. V., Berman, J. N. Zebrafish as a model system for mitochondrial biology and diseases. Translational research : the journal of laboratory and clinical medicine. 163 (2), 79-98 (2014).
  21. Novorol, C., et al. Microcephaly models in the developing zebrafish retinal neuroepithelium point to an underlying defect in metaphase progression. Open biology. 3 (10), 130065(2013).
  22. Baye, L. M., et al. The N-terminal region of centrosomal protein 290 (CEP290) restores vision in a zebrafish model of human blindness. Human molecular genetics. 20 (8), 1467-1477 (2011).
  23. Flinn, L. J., et al. TigarB causes mitochondrial dysfunction and neuronal loss in PINK1 deficiency. Annals of neurology. 74 (6), 837-847 (2013).
  24. Paquet, D., et al. A zebrafish model of tauopathy allows in vivo imaging of neuronal cell death and drug evaluation. The Journal of clinical investigation. 119 (5), 1382-1395 (2009).
  25. Khuchua, Z., Yue, Z., Batts, L., Strauss, A. W. A zebrafish model of human Barth syndrome reveals the essential role of tafazzin in cardiac development and function. Circulation research. 99 (2), 201-208 (2006).
  26. Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of development. 80 (2), 153-158 (1999).
  27. Koster, R. W., Fraser, S. E. Tracing transgene expression in living zebrafish embryos. Dev Biol. 233 (2), 329-346 (2001).
  28. Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nat Methods. 2 (12), 920-931 (2005).
  29. Sambrook, J., Russell, D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  30. Distel, M., Wullimann, M. F., Koster, R. W. Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13365-13370 (2009).
  31. Skene, J. H., Virag, I. Posttranslational membrane attachment and dynamic fatty acylation of a neuronal growth cone protein, GAP-43. J Cell Biol. 108 (2), 613-624 (1989).
  32. Zuber, M. X., Strittmatter, S. M., Fishman, M. C. A membrane-targeting signal in the amino terminus of the neuronal protein GAP-43. Nature. 341 (6240), 345-348 (1989).
  33. Asakawa, K., et al. Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1255-1260 (2008).
  34. Godinho, L. Injecting zebrafish with DNA or RNA constructs encoding fluorescent protein reporters. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (7), 871-874 (2011).
  35. Palanca, A. M., Sagasti, A. Optogenetic activation of zebrafish somatosensory neurons using ChEF-tdTomato. J Vis Exp. (71), e50184(2013).
  36. Dean, D. A., Gasiorowski, J. Z. Preparing injection pipettes on a flaming/brown pipette puller. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (3), prot5586(2011).
  37. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  38. Ren, J. Q., McCarthy, W. R., Zhang, H. W., Adolph, A. R., Li, L. Behavioral visual responses of wild-type and hypopigmented zebrafish. Vision Research. 42 (3), 293-299 (2002).
  39. Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, Suppl 1. S7(2007).
  40. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev Dyn. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  41. Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn. 228 (1), 30-40 (2003).
  42. Davidson, A. E., et al. Efficient gene delivery and gene expression in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon. Dev Biol. 263 (2), 191-202 (2003).
  43. Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Dev Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
  44. Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Efficient transposition of the Tol2 transposable element from a single-copy donor in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (50), 19827-19832 (2008).
  45. Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed, University of Oregon Press. (2007).
  46. Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies. Biotechniques. 55 (6), 314-316 (2013).
  47. Carter, K. M., Woodley, C. M., Brown, R. S. A review of tricaine methanesulfonate for anesthesia of fish. Rev Fish Biol Fisher. 21 (1), 51-59 (2011).
  48. Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using microManager. Curr Protoc Mol Biol. , 14.20(2010).
  49. Snapp, E. L. Design and Use of Fluorescent Fusion Proteins in Cell Biology. Curr Protoc Cell Biol. , 21.4(2005).
  50. Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends in cell biology. 19 (11), 649-655 (2009).
  51. Costantini, L. M., Snapp, E. L. Fluorescent proteins in cellular organelles: serious pitfalls and some solutions. DNA and cell biology. 32 (11), 622-627 (2013).
  52. Provost, E., Rhee, J., Leach, S. D. Viral 2A peptides allow expression of multiple proteins from a single ORF in transgenic zebrafish embryos. Genesis. 45 (10), 625-629 (2007).
  53. Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLoS One. 6 (4), e18556(2011).
  54. Akitake, C. M., Macurak, M., Halpern, M. E., Goll, M. G. Transgenerational analysis of transcriptional silencing in zebrafish. Dev Biol. 352 (2), 191-201 (2011).
  55. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  56. Katayama, H., Yamamoto, A., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. GFP-like proteins stably accumulate in lysosomes. Cell Struct Funct. 33 (1), 1-12 (2008).
  57. Shaner, N. C., et al. Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins. Nat Methods. 5 (6), 545-551 (2008).
  58. Marinkovic, P., et al. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (11), 4296-4301 (2012).
  59. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  60. Keller, P. J., Ahrens, M. B. Visualizing Whole-Brain Activity and Development at the Single-Cell Level Using Light-Sheet Microscopy. Neuron. 85 (3), 462-483 (2015).
  61. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
  62. Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nat Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
  63. Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy. Nat Methods. 9 (7), 755-763 (2012).
  64. Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obrazowanie subkom rkowetransport mitochondri wdynamika centrosom wsystem Gal4 UASznakowanie fluorescencyjnemikroskopia szerokopolowamikroskopia konfokalnaobrazowanie time lapsemikroskopia in vivo

Powiązane artykuły