Pomiar i analiza produkcji kwasu zewnątrzkomórkowego w celu określenia szybkości glikolitycznej

Podsumowanie

Glikoliza jest definiującym markerem metabolicznym w wielu systemach biologicznych. Monitorowanie glikolizy poprzez pomiar zewnątrzkomórkowego strumienia H⁺ jest powszechne, ale wymaga korekty, aby była ilościowa i jednoznaczna. W tym miejscu pokazujemy, jak zbierać i korygować dane dotyczące strumienia zewnątrzkomórkowego, aby odróżnić oddechowe i glikolityczne źródła zakwaszenia zewnątrzkomórkowego.

Streszczenie

Zewnątrzkomórkowy pomiar zużycia tlenu i produkcji kwasu to prosty i skuteczny sposób monitorowania tempa oddychania i glikolizy¹. Zarówno reakcje mitochondrialne (oddychanie), jak i niemitochondrialne (inne reakcje redoks) zużywają tlen, ale reakcje te można łatwo odróżnić po chemicznym hamowaniu oddychania mitochondrialnego. Jednak podczas gdy zużycie tlenu w mitochondriach jest jednoznacznym i bezpośrednim pomiarem częstości oddechów², to samo nie dotyczy produkcji kwasu zewnątrzkomórkowego i jego związku z częstością glikolityczną ^3-6. Kwas zewnątrzkomórkowy wytwarzany przez komórki pochodzi zarówno z mleczanu, wytwarzanego w procesie glikolizy beztlenowej, jak i_CO2, wytwarzanego w cyklu kwasu cytrynowego podczas oddychania. W przypadku glikolizy źródłem zakwaszenia glikolitycznego jest konwersja glukozy do mleczanu ^{+ H+} i eksport produktów do podłoża testowego. W przypadku oddychania źródłem zakwaszenia dróg oddechowych jest eksport CO_{2 ,} uwodnienie do H₂CO₃ i dysocjacja do HCO₃^- + H⁺. Proporcje zakwaszenia glikolitycznego i oddechowego zależą od warunków doświadczalnych, w tym od typu komórki i dostarczonego substratu (substratów), i mogą wahać się od prawie 100% zakwaszenia glikolitycznego do prawie 100% zakwaszenia dróg oddechowych ⁶. W tym miejscu pokazujemy metody gromadzenia danych i obliczeń potrzebne do określenia wkładu układu oddechowego i glikolitycznego w całkowite zakwaszenie zewnątrzkomórkowe przez całe komórki w hodowli przy użyciu komórek mioblastów C2C12 jako modelu.

Wprowadzenie

Ogólnym celem tej metody jest dokładne zmierzenie szybkości glikolitycznej komórek za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego. Ilościowy pomiar szybkości glikolitycznej za pomocą zakwaszenia zewnątrzkomórkowego jest pożądanym punktem końcowym wielu eksperymentów. Jednak całkowita szybkość zakwaszenia zewnątrzkomórkowego jest sumą dwóch składników: zakwaszenia oddechowego w postaci CO₂ (który nawadnia się do H₂CO₃ następnie dysocjuje do HCO₃- + H⁺) oraz zakwaszenia glikolitycznego w postaci mleczanu - + H⁺.

Udział CO₂ w całkowitym zakwaszeniu zewnątrzkomórkowym był do niedawna uważany za znikomy w używanej tutaj platformie pomiarowej, analizatorze XF24 ⁷. Jednak w wielu innych systemach jest jasne, że CO₂ może być głównym czynnikiem przyczyniającym się do pozakomórkowego zakwaszenia^4-5. Wiele prac potwierdza ten wkład, ale nie próbuje się bezpośredniego oznaczania ilościowego kwasu ^3,8,9 pochodzącego z CO₂. Niedawno wykazaliśmy ilościowo, że produkcja CO₂ jest znaczącym źródłem pozakomórkowego zakwaszenia w tym układzie ⁶. Co więcej, chociaż istnieje wiele szlaków metabolicznych, które generują CO₂ z katabolizmu glukozy, te realizowane przez dehydrogenazy matrycowe w cyklu kwasu cytrynowego są przytłaczającymi czynnikami, a wszystkie inne źródła generują ilości CO₂, które mieszczą się w granicach błędu eksperymentalnego ⁶.

Bez uwzględnienia produkcji CO₂, zakwaszenie zewnątrzkomórkowe jest zatem niejednoznacznym wskaźnikiem szybkości glikolitycznej i nie może być stosowane ilościowo. Nasza poprzednia publikacja zwraca uwagę na kilka przypadków, w których oddechowy CO₂ stanowi większość całkowitego sygnału zakwaszenia, nawet w komórkach ogólnie uważanych za wykorzystujące głównie glikolizę⁶. Dodatkowo, udział CO₂ w oddychaniu całkowitego zakwaszenia różni się znacznie w trakcie wspólnych eksperymentów profilowania metabolicznego, co pokazuje, że prawidłowe porównanie szybkości glikolitycznej podczas różnych części eksperymentu wymaga korekty o CO₂ .

Aby zmierzyć szybkość glikolityczną komórek za pomocą szybkości zakwaszenia zewnątrzkomórkowego, konieczne jest przeliczenie zmian pH na zmiany w całkowitym generowanym H⁺ i odjęcie pozakomórkowego zakwaszenia spowodowanego przez CO₂ uwalniane podczas działania cyklu kwasu cytrynowego. W tym miejscu opisujemy prostą metodę pomiaru szybkości produkcji protonów zewnątrzkomórkowych (na podstawie zewnątrzkomórkowych zmian pH i skalibrowanej mocy buforowej pożywki testowej) i produkcji CO₂ (na podstawie zewnątrzkomórkowych zmian w stężeniu_O2) oraz pokazujemy, jak obliczyć szybkość glikolityczną za pomocą tych pomiarów.

Ta metoda wzmacnia użyteczność pomiaru zakwaszenia zewnątrzkomórkowego, używając jej do prawidłowego obliczania szybkości glikolitu, zgodnie z definicją produkcji mleczanu. Bez korekty na CO₂ w układach oddechowych (lub bezpośredniego pomiaru mleczanu) niemożliwe jest określenie, czy i w jakim stopniu całkowity wskaźnik zakwaszenia odzwierciedla wskaźnik glikolityczny, co zakłóca interpretację eksperymentów, które wykorzystują całkowite zakwaszenie zewnątrzkomórkowe jako bezpośredni pomiar produkcji mleczanu.

OBLICZENIA

CO₂ i mleczan są, w ramach błędu eksperymentalnego, jedynymi dwoma czynnikami przyczyniającymi się do produkcji kwasu zewnątrzkomórkowego, na podstawie eksperymentów z komórkami mioblastów⁶. Dlatego szybkość całkowitego zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (PPR, szybkość produkcji protonów) można zdefiniować jako:

PPR_tot = PPR_resp +_{PPR glyc} Równanie 1

gdzie tot = całkowity; resp = oddechowy; glyc = glikolityczny. Glikolityczny PPR jest zatem:

PPR_glyc = PPR_tot - PPR_resp Równanie 2

Tutaj,

PPR_tot = ECAR_tot/BP Równanie 3

gdzie ECAR = stopień zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (mpH/min), a BP = moc buforowa (mpH/pmol H⁺ w 7 μl), podczas gdy

PPR_resp = (10^pH-pK₁/(1+10^pH-pK₁))(max H⁺/O₂)(OCR_tot – OCR_rot/myx) Równanie 4

gdzie K₁ = łączna stała równowagi uwodnienia i dysocjacji CO₂ do HCO₃^- + H⁺; max H⁺/O₂ = zakwaszenie pochodzące z CO₂ dla określonej przemiany metabolicznej, takiej jak całkowite utlenienie glukozy⁶; OCR = wskaźnik zużycia tlenu (pmol O₂/min), a OCR_rot/myx = OCR niemitochondrialny.

Równanie 4 izoluje mitochondrialny OCR, odejmując dowolny niemitochondrialny OCR (zdefiniowany jako OCR, który jest odporny na mitochondrialne trucizny oddechowe rotenonu i myksotiazolu) i uwzględnia maksymalną ilość H⁺ generowaną na O₂ zużyte dla każdego substratu (max H⁺/O₂) (patrz ⁶), a także proporcję CO₂ powodującą powstanie H⁺ w temperaturze doświadczalnej i pH (10^pH-pK₁/(1+10^pH-pK₁). Aby uzyskać pełne utlenienie glukozy, mitochondrialny wskaźnik zużycia tlenu (OCR) jest dokładnie równy szybkości produkcji CO₂ . W ograniczonej objętości testu pomiaru strumienia zewnątrzkomórkowego CO₂ wytwarzany przez oddychanie pozostaje uwięziony w pożywce testowej. Większość uwięzionego CO₂ jest uwodniona do H₂CO_{3 ,} który następnie dysocjuje do HCO₃^- + H⁺. Niewielka frakcja pozostaje rozpuszczona, ale nie uwodniona, a inna mała frakcja jest uwodniona, ale nie zdysocjowana, zgodnie z termodynamiczną stałą równowagi uwodnienia CO₂ i dysocjacji do HCO₃^- + H⁺ w temperaturze doświadczalnej (37 °C) i pH (~7,4).

Zatem pełne równanie do obliczania PPR_g poprzez odejmowanie PPR_resp od PPR_{tot tot to:}

PPR_glyc = ECAR_tot/BP – (10^pH-pK₁/(1+10^pH-pK₁))(max H⁺/O₂)(OCR_tot – OCR_rot/myx) Równanie 5

W ten sposób, tempo oddychania i glikolizy, jak również związane z nimi tempo produkcji ATP, można ilościowo określić na podstawie prostych pomiarów (zużycie tlenu, zakwaszenie zewnątrzkomórkowe, pojemność buforowa) i importu lub obliczenia innych wymaganych wartości (H⁺/O₂, P/O i stała równowagi K₁) ⁶. Opisany tutaj eksperyment rozszerza standardowe techniki korzystania z analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego, takie jak Seahorse XF24 ^10,11; w przypadku innych formatów pomiaru strumienia zewnątrzkomórkowego (np. XF^e96 lub XFp) wszystkie poniższe objętości powinny być odpowiednio przeskalowane.

Moc buforowa pożywki testowej może być mierzona poprzez konstrukcję standardowej krzywej, albo bezpośrednio na platformie strumienia zewnątrzkomórkowego, albo oddzielnie za pomocą skalibrowanej sondy pH. W tym miejscu podano trzy opcje pomiaru buforowania za pomocą pożywki do oznaczania strumienia zewnątrzkomórkowego, w tym użycie wszystkich portów iniekcyjnych analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego z dołkami na próbki bezkomórkowe lub użycie tylko ostatniego portu iniekcyjnego w studzienkach zawierających komórki (sekcja 1) lub przy użyciu zewnętrznego pomiaru pH (sekcja 2). Zobacz załączony arkusz kalkulacyjny, aby zapoznać się z pełnymi obliczeniami przykładowych danych.

Aby zmierzyć moc buforowania za pomocą możliwości wykrywania pH przez instrument do pomiaru strumienia zewnątrzkomórkowego, najbezpieczniej jest używać studni bezkomórkowych, aby zminimalizować zmienność sygnału. Jednak w ramach błędu nie ma statystycznej różnicy między studzienkami bezkomórkowymi a studzienkami zawierającymi komórki podczas wykonywania tego pomiaru (dane nie pokazane). UWAGA: Wariant opisany w kroku 1.7 ma tę zaletę, że uwzględnia wszelkie potencjalne zmiany w buforowaniu spowodowane dodanymi związkami lub obecnością komórek, z wadą w postaci głośniejszego sygnału. Jednakże, jak stwierdzono powyżej, nie stwierdzono istotnych różnic w obliczonej mocy buforowej między konstrukcją bezkomórkową przedstawioną w tabeli 1 a konstrukcją po eksperymencie przedstawioną w tabeli 2 w warunkach eksperymentalnych opisanych tutaj.

Dodatkowo, w małych zakresach ΔpH (<0,4 jednostek; eksperymentalnie najlepiej ograniczone do 0,2 jednostki), liniowe nachylenie uzyskane przez wykreślenie Δ mpH/pmol H⁺ odpowiednio przybliża logarytmiczną zależność między ΔpH a [H⁺]. Nachylenie tej krzywej wzorcowej reprezentuje zatem moc buforową badanego podłoża testowego w pH/nmol H⁺ w 7 μl lub mpH/pmol H⁺ w 7 μl. Zalecamy zwiększenie mocy buforowania pożywki lub zmniejszenie gęstości komórek w przypadku próbek, które przekraczają zmianę o 0,2 jednostki pH w czasie pomiaru. Czas pomiaru może również ulec skróceniu, ale może to skrócić szybkość zakwaszenia w stanie ustalonym i wprowadzić błąd do obliczenia dawki.

Protokół

1. Pomiar mocy buforującej w analizatorze przepływu zewnątrzkomórkowego: dwie warianty

UWAGA: opisane tutaj obliczenia i metody zostały opracowane przy użyciu urządzenia Extracellular Flux Analyzer. W przypadku innych instrumentów objętość pomiarowa musi zostać odpowiednio przeskalowana.

1. Przygotuj 0,1 M standardowy roztwór HCl w wodzie, używając stężonego HCl (patrz Materiały i Sprzęt), zgodnie z instrukcjami producenta.
   Uwaga: Przykładowe obliczenia dotyczące przygotowania dawek HCl do użycia we wszystkich czterech portach wtryskowych przedstawiono w Tabeli 1:

Tabela 1. Kolejne iniekcje HCl do studzienki w teście przepływu zewnątrzkomórkowego.

2. Przygotuj rozcieńczenia wzorca HCl w medium do analizy zgodnie z Tabelą 1 dla liczby powtórzeń technicznych wykonywanych na jednej płytce, dodając jedno dodatkowe w celu zniwelowania błędów pipetowania; np. dla czterech powtórzeń technicznych wstrzyknięcia do portu A, przygotuj roztwór zapasu (1,1 µl x 5) 0,1 M HCl w (48,9 µl x 5) medium do analizy.
3. Rozdziel 50 µl do każdego Portu A w kasecie sondy pomiarowej. Powtórz tę procedurę dla pozostałych portów B, C i D.
4. Przeprowadź analizę przepływu zewnątrzkomórkowego¹⁰ ze standardowym cyklem kalibracji, a następnie dwa cykle [2 min mieszania, 1 min oczekiwania i 5 min pomiaru] dla każdego z czterech dodatków do portów (patrz Rysunek 2).
   1. Zaprogramuj powyższy eksperyment w oprogramowaniu urządzenia zgodnie z instrukcjami programistycznymi. Włóż przygotowaną kasetę do urządzenia i przeprowadź kalibrację zgodnie z instrukcjami oprogramowania.
   2. Po wyświetleniu komunikatu w programie, wyjmij płytkę zawierającą kalibrant i włóż do urządzenia płytkę z medium do analizy w każdej studzience; kontynuuj program.
5. Wykorzystując średnią z 8-10 punktów danych uzyskanych w stanie stacjonarnym (zazwyczaj ostatnie 8-10 punktów) sprzed i po każdym dodatku do portu, oblicz (skumulowaną) różnicę pH (∆pH) wywołaną przez każde wstrzyknięcie wzorca kwasu.
6. Nanieś ∆pH w funkcji nmol H⁺ zawartych w objętości 7 µl uwięzionej przez sondę pomiarową. Nachylenie linii prostej to moc buforowa (BP) wyrażona w mpH/pmol H⁺.
7. Alternatywnie do kroków 1.2-1.3, przeprowadź pomiary ∆pH po analizie, w której Porty A, B i C służyły do przeprowadzenia eksperymentu, a następnie wykonaj wstrzyknięcie HCl do Portu D. Zgodnie z Tabelą 2, cztery powtórzenia techniczne są wykorzystywane do wygenerowania każdego punktu 5-punktowej krzywej wzorcowej w 20 studzienkach eksperymentalnych (z wyłączeniem czterech studzienek do korekcji temperatury w tle) płytki do analizy przepływu zewnątrzkomórkowego.

Tabela 2. Pojedyncze wstrzyknięcie HCl do studzienki testu przepływu zewnątrzkomórkowego.

2. Pomiar pojemności buforowej przy użyciu zewnętrznego pH-metru

UWAGA: Aby zmierzyć pojemność buforową pożywki za pomocą zewnętrznej sondy pH, należy skalibrować sondę w temperaturze 37 °C i utrzymać tę temperaturę dla wszystkich odczynników podczas eksperymentu.

1. Przygotować 0,1 M roztwór standardowy HCl w wodzie, korzystając z koncentratu HCl zgodnie z instrukcjami producenta.
2. Podgrzać sondę pH, wzorce pH, medium analityczne, którego moc buforową należy zmierzyć, oraz 0,1 M HCl do 37 °C w kąpieli wodnej.
3. Zkalibrować sondę pH w temperaturze 37 °C zgodnie z instrukcjami producenta. Przez cały czas trwania analizy utrzymywać wszystkie odczynniki w temperaturze 37 °C, korzystając z płyty grzejnej lub kąpieli wodnej.
4. Odlać 10 ml medium analitycznego do małego zlewka lub probówki stożkowej. Monitorować pH w sposób ciągły za pomocą zanurzonej sondy pH.
5. Dodawać 0,1 M HCl do medium analitycznego w aliquotach 10-20 µl.
   1. Zapewnić wymieszanie roztworu, korzystając z mieszadła magnetycznego lub ręcznie obracając naczyniem po każdym dodaniu kwasu.
   2. Odczekać kilka sekund do ustabilizowania się pomiaru pH, a następnie zapisać wartość pH po każdym dodaniu.
   3. Zgodnie z przedstawionymi w Tabeli 3 danymi, wykonać wystarczającą liczbę dodatków, aby zapewnić dokładne obliczenie nachylenia krzywej oraz pokryć zakres pH przewidywany podczas eksperymentu.

Tabela 3. Pomiar mocy buforowej za pomocą pH-metru. Dane przedstawiają typowy eksperyment z sześcioma dodatkami 20 µl 0,1 M HCl.

6. Nanieś ∆pH w funkcji nmol dodanego H⁺ na 7 µl, otrzymując linię o nachyleniu reprezentującym pojemność buforową (Rysunek 1).

Rycina 1. Wyznaczanie mocy buforowej. Krzywa wzorcowa HCl zmierzona zgodnie z Tabelą 1, Tabelą 2 lub (tutaj) zgodnie z Tabelą 3. Nachylenie dopasowania liniowego wskazuje moc buforową (pH/nmol H⁺ w 7 µl). Każdy punkt reprezentuje średnią ± SEM dla n = 9 powtórzeń technicznych.

7. Po ustaleniu mocy buforowej za pomocą Metody 1 lub 2 powyżej, przelicz sygnał ECAR (mpH/min) na PPR (pmol H⁺/min/µg białka), dzieląc ECAR przez moc buforową (BP) (mpH/pmol H⁺) i skalując wynik do zawartości białka w każdej studzience:
   PPR_tot (pmol H⁺/min/μg białka) = ECAR (mpH/min)/BP (mpH/pmol H⁺ w 7 μl)/białko na studzienkę (μg)     Równanie 6
8. Alternatywnie, wykorzystaj te same eksperymenty w Metodach 1 lub 2, aby obliczyć wartość pojemności buforowej (BC), której oprogramowanie urządzenia używa do automatycznego obliczania PPR podczas gromadzenia danych.
   UWAGA: Instrukcja obsługi urządzenia¹² (strona 107) zawiera szczegółowe informacje na temat obliczania i stosowania pojemności buforowej, gdzie BC opisano jako:
   BC (mol/L) = mole H⁺/(ΔpH x objętość buforu (L))     Równanie 7
   UWAGA: Pojemność buforową zdefiniowaną w Równaniu 7 można obliczyć w urządzeniu lub za pomocą zewnętrznych testów sondy pH opisanych powyżej. Przelicznik między mocą buforową a pojemnością buforową jest prosty (patrz. załączony arkusz kalkulacyjny):
   BC = 1 x 10^-9/BP ((mpH/pmol H⁺ w 7 µl) / 7  µl)     Równanie 8
   UWAGA: Jeśli pojemność buforowa jest znana przed wykonaniem testu, można ją wprowadzić bezpośrednio do oprogramowania urządzenia podczas konfiguracji eksperymentu.
9. Zastosuj tę procedurę i powyższe obliczenia do większości konwencjonalnych układów buforowych, zgodnie z opisem w poprzedniej publikacji ⁶.
   UWAGA: Tabela 4 zawiera zestawienie mocy buforowej i pojemności buforowej kilku konwencjonalnych pożywek.

Tabela 4. Moc i pojemność buforowa wybranych mediów.

3. Wykonanie analizy przepływu zewnątrzkomórkowego z użyciem komórek mioblastów C2C12

UWAGA: W kroku 3.4.3 nie zaobserwowano różnic w produkcji kwasu pochodzącego z CO₂ zależnie od obecności anhydrazy węglanowej w hodowli C2C12, co sugeruje, że jej obecność nie jest wymagana do pełnej konwersji CO₂ do HCO₃^- + H⁺. Zaleca się jednak empiryczne przetestowanie tego w różnych układach doświadczalnych przed pominięciem anhydrazy węglanowej.

1. Hodować mioblasty mysie C2C12 ¹³ w temperaturze 37 °C w atmosferze 95% powietrza/5% CO₂ w modyfikowanej przez Dulbecco pożywce Eagle (DMEM) z dodatkiem 11,1 mM glukozy, 2 mM glutaminy, 10% v/v płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 100 U/ml penicyliny i 100 µg/ml streptomycyny.
2. Na 24 h przed analizą wysiać komórki w 100 µl tej samej pożywki hodowlanej w zagęszczeniu 20 000 komórek/dołek w polistyrenowej 24-dołkowej płytce do analizy strumienia zewnątrzkomórkowego (patrz Materiały i Metody) bez dodatkowej powłoki.
3. Rozcieńczyć oligomycynę, FCCP oraz rotenon z myksotiazolem, a także HCl (opcjonalnie) do 10-krotnego stężenia końcowego w pożywce analitycznej Krebs Ringer Phosphate HEPES (KRPH) (2 mM HEPES, 136 mM NaCl, 2 mM NaH₂PO₄, 3,7 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 1,5 mM CaCl₂, 0,1% w/v albuminy surowicy bydlęcej wolnej od kwasów tłuszczowych, pH 7,4 w 37 °C).
4. Przygotowanie komórek
   1. Na 30 min przed analizą trzykrotnie przemyć przylegające komórki, delikatnie odsysając pożywkę z dołka, a następnie powoli dodając 500 µl KRPH.
   2. Po trzecim etapie płukania inkubować komórki w temperaturze 37 °C w powietrzu (nie w 5% CO₂, co zmieniłoby pH tej pożywki wolnej od wodorowęglanów).
   3. Na początku analizy zastąpić KRPH w dołkach 500 µl świeżego KRPH zawierającego 500 U/ml anhydrazy węglanowej oraz albo glukozę (10 mM), albo samą pożywkę, bez dodatkowego substratu.
5. Załadowanie kartridża sensora
   1. Do portów kartridża sensora strumienia zewnątrzkomórkowego pipetować 50 µl alikwotów każdego 10-krotnego związku przygotowanego w kroku 3.3 w następujący sposób (podano stężenia końcowe w dołku analitycznym): Port A: 2 µg/ml oligomycyny, Port B: 0,5 µM FCCP, Port C: 1 µM rotenonu, 1 µM myksotiazolu, Port D: HCl (w przypadku przeprowadzania kalibracji kwasowej w trakcie analizy, zgodnie z powyższym opisem i Tabelą 2).
      UWAGA: w celu całkowitego zahamowania łańcucha oddechowego opisanego w tej procedurze, 1 µM myksotiazolu można stosować zamiennie z 1 µM antymycyną A.
6. Analiza strumienia zewnątrzkomórkowego:
   1. Przeprowadzić standardową analizę strumienia zewnątrzkomórkowego w celu określenia kontroli oddechowej zgodnie z opisem w ¹⁰.

UWAGA: Dla każdego etapu eksperymentu określ pożądane czasy mieszania, oczekiwania i pomiaru, a także liczbę cykli w każdym etapie.

UWAGA: Dane w Tabeli 5 zostały zebrane podczas dwóch cykli pomiarowych obejmujących 2 min mieszania, 1 min oczekiwania i 5 min pomiaru dla każdego segmentu, przy czym trzy cykle pomiarowe odbyły się po dodaniu przez Port D różnych ilości HCl (w celu kalibracji pojemności buforowej, jak w Tabeli 2).

Tabela 5. Konfiguracja testu przepływu zewnątrzkomórkowego.

4. Pomiar końcowego stężenia mleczanu

UWAGA: Aby zwalidować opisany tutaj test pośredni w innym systemie, końcowe stężenie mleczanu po zakończeniu eksperymentu z przepływem zewnątrzkomórkowym można wyznaczyć bezpośrednio w konwencjonalnej płytce 96-dołkowej poprzez pomiar prędkości początkowej (przez 2 min) redukcji NAD⁺ → NADH katalizowanej przez dehydrogenazę mleczanową, co zostało szczegółowo opisane w naszej poprzedniej publikacji⁶. Dla danych przedstawionych w Reprezentatywnych Wynikach końcowe stężenie mleczanu w dołkach testowych zawierających glukozę wynosiło ~40 μM.

1. Przygotować 2x pożywkę hydrazynową: 1 M Tris, 20 mM EDTA, 400 mM hydrazyny, pH 9,8 przy 22 °C). Bezpośrednio przed rozpoczęciem analizy dodać NAD⁺ do stężenia 4 mM oraz dehydrogenazę mleczanową (LDH) do aktywności 40 U/ml. Końcowy skład pożywki analitycznej (1x): 500 mM Tris, 10 mM EDTA, 200 mM hydrazyny, 2 mM NAD⁺, 20 U/ml LDH.
2. Niezwłocznie po zakończeniu pomiaru strumieni zewnątrzkomórkowych (extracellular flux assay), pobrać 100 μl pożywki analitycznej z każdej studni płytki do pomiaru strumieni zewnątrzkomórkowych i przenieść do studni nieprzezroczystej (czarnej) płytki 96-dołkowej.
3. Do każdej studni z próbką dodać 100 µl 2x pożywki hydrazynowej.
4. Natychmiast umieścić płytkę w czytniku mikropłytek i rozpocząć monitorowanie fluorescencji NADH przy pobudzeniu 340 nm/emisji 460 nm.
5. Rejestrować prędkość początkową przez około 2 min.
6. Przeprowadzić analogiczny eksperyment w celu sporządzenia krzywej wzorcowej poprzez wykreślenie prędkości początkowej w funkcji stężenia mleczanu dla dodanych stężeń mleczanu od 0 do 50 μM.
7. Obliczyć stężenie mleczanu w każdej studni eksperymentalnej, korzystając z krzywej wzorcowej.

5. Pomiar zawartości białka

1. Usunąć pozostałe podłoże assay z każdej studzienki płytki assay.
2. Przemyć studzienki trzykrotnie 250 µl KRPH bez BSA, uważając, aby zminimalizować odrywanie komórek od powierzchni dna studzienki.
3. Dodać 25 µl buforu do lizy RIPA (150 mM NaCl, 50 mM Tris, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1% v/v Triton X-100, 0,5% w/v deoksycholan sodu, 0,1% v/v SDS, pH 7,4 w 22 °C) do każdej studzienki płytki assay.
4. Inkubować płytkę na lodzie przez 30 min.
5. Mieszać płytkę na wstrząsarce do płytek z prędkością 1 200 rpm przez 5 min.
6. Zmierzyć stężenie białka standardowymi metodami, np. za pomocą testu BCA, upewniając się, że skład buforu do lizy jest kompatybilny z metodą pomiaru. Zawartość białka w doświadczeniu przedstawionym na Rysunku 2 wynosiła ~4 µg/studzienkę.

Wyniki

Rysunek 2 przedstawia surowe dane z typowego eksperymentu. Do obliczeń wykorzystano ostatnie 10 punktów pomiarowych z zapisu punkt-po-punkcie zarówno dla OCR, jak i pH (zacieniowane pionowe słupki). Początkowe obawy, że średnia wartość (pomiar w punkcie środkowym) każdego cyklu analizy nie zapewni wystarczającej rozdzielczości szybkości dla dokładnego obliczenia, szczególnie ze względu na niewielkie opóźnienie między dodaniem odczynnika a osiągnięciem stacjonarnej szybkości zakwaszania, nie potwierdziły się, ponieważ nie wydaje się to mieć istotnego wpływu na błąd obliczeniowy (nie pokazano). Alternatywnie, jeśli podczas konfiguracji eksperymentu zostanie wprowadzona prawidłowa pojemność buforowa, PPR można odczytać bezpośrednio z odczytu gromadzenia danych instrumentu, wyświetlając wynik PPR w oprogramowaniu urządzenia lub w formacie kompatybilnym z komputerem, dostępnym w ustawieniach wyjścia danych.

Rycina 2. Reprezentatywne krzywe przepływu zewnątrzkomórkowego O₂ i H⁺. Krzywe OCR i pH dla przykładowego eksperymentu z Tabeli 5, zawierającego 10 mM glukozy na początku analizy. Port D posiadał różne stężenia HCl w celu kalibracji mocy buforowej (niewykazane na tych uśrednionych krzywych). Dane z poprzedniej publikacji⁶. Każdy punkt reprezentuje średnią ± SEM dla n = 8 powtórzeń biologicznych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza danych reprezentatywnych wyników

Korzystając z arkusza kalkulacyjnego przedstawionego w Tabeli 6 i dołączonego jako załącznik, wartości danych z poszczególnych studzienek można wpisać w kolumny z żółtymi nagłówkami. Wszystkie sześć kolumn po prawej stronie jest obliczanych na podstawie tych wpisów. Przykład w Tabeli 6 przedstawia obliczenia PPR_resp oraz PPR_glyc z wykorzystaniem danych ECAR i OCR z poszczególnych studzienek dla warunków natywnych z dodatkiem glukozy lub bez, przed dodaniem oligomycyny w porcie A. Powtórzenia techniczne dla każdego preparatu biologicznego są zazwyczaj uśredniane w celu uzyskania pojedynczych wartości wyników w czterech ostatnich kolumnach, a następnie dane z różnych preparatów biologicznych są uśredniane z odpowiednią statystyką propagacji błędu w BP oraz tych czterech wartościach.

Tabela 6. Obliczanie zakwaszenia oddechowego i glikolitycznego. Kolumny zaznaczone na żółto wskazują wartości, które należy wprowadzić z obliczeń (np. BP, max H⁺/O₂) lub z zebranych danych (np. ECAR_tot, OCR). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej tabeli. | Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę jako arkusz Excel.

Wkład glikolizy i oddychania do PPR po korekcie

Rysunek 3 przedstawia graficzną prezentację danych obliczonych zgodnie z Tabelą 6 dla natywnych szybkości zakwaszania glikolitycznego i oddechowego, szybkości po dodaniu oligomycyny (Port A) oraz szybkości po dodaniu FCCP (Port B). Dane te wyraźnie pokazują, jak proporcje zakwaszania oddechowego i glikolitycznego zmieniają się w zależności od wyboru substratu (glukoza vs kontrola (ctl) bez dodatku) oraz stanu mitochondriów (funkcja natywna vs funkcja zmieniona farmakologicznie).

Rysunek 3. Szybkość produkcji protonów (PPR) z procesów glikolitycznych i oddechowych. PPR z oddychania (części niezamalowane) i glikolizy (części zamalowane) w komórkach C2C12, obliczone zgodnie z równaniem 5 z dodatkiem glukozy (trzy słupki po lewej) lub bez dodatku glukozy (trzy słupki po prawej). Dane z⁶. Wszystkie dane reprezentują średnią ± SEM dla n = 8 powtórzeń biologicznych.

Dyskusja

Zakwaszenie zewnątrzkomórkowe jest łatwym do zmierzenia wskaźnikiem tempa metabolizmu komórkowego. Aby prawidłowo określić szybkość glikolizy komórkowej (zdefiniowaną przez produkcję mleczanu), kluczowe znaczenie ma znajomość mocy buforowej pożywki testowej i przeliczenie pomiarów strumienia zewnątrzkomórkowego zużycia tlenu i zakwaszenia na tempo produkcji protonów. Wykonując te obliczenia, można odjąć zakwaszenie wynikające z CO₂ uwolnionego w cyklu kwasu cytrynowego, pozostawiając zakwaszenie wynikające z produkcji mleczanu.

Wiele różnych sposobów pomiaru mocy buforowej dla tej korekty ma różne zalety i wady. Pomiar zewnętrzny za pomocą sondy pH jest bardzo dokładny i powtarzalny, ale może nie odzwierciedlać niewielkich różnic w wykrywaniu pH wprowadzonych przez fluorofory zawarte na płytce testowej, dodanie związków podczas badania lub obecność samych komórek. Pomiary pH w płytce rozwiązują te problemy, ale wprowadzają również różne stopnie szumu eksperymentalnego.

Korekta CO₂ do ECAR pozwala po raz pierwszy na jednoznaczne i ilościowe obliczenie szybkości glikolitycznej i ujawnia różnice w udziale oddechowym i glikolitycznym w całkowitym ECAR w trakcie eksperymentu. Korzystając z równania 5 i pomiarów OCR, ECAR i mocy buforowej, szybkość glikolityczną można obliczyć za pomocą dostarczonego prostego arkusza kalkulacyjnego (tabela 6). W razie potrzeby szybkość tę można zweryfikować za pomocą pomiaru mleczanu post hoc ⁶. W komórkach, w których szlak pentozofosforanowy jest wysoce aktywny, zastosowanie inhibitorów szlaku, takich jak 6-aminonikotynamid, może być przydatne do wyizolowania szybkości glikolitycznej. Obliczanie udziału zarówno_CO2, ^{jak i H+} pochodzącego z mleczanu na podstawie całkowitego zmierzonego wskaźnika zakwaszenia pozakomórkowego i wskaźnika zużycia tlenu jest nieocenionym narzędziem do wykorzystania danych o strumieniu zewnątrzkomórkowym do formułowania mocnych i ilościowych stwierdzeń na temat aktywności metabolicznej.

Korzystając z opisanych tutaj procedur, w tym różnych modyfikacji pomiaru mocy buforowej i optymalizacji eksperymentu strumienia zewnątrzkomórkowego dla badanych komórek i pożądanych danych, szybkość glikolizy w nienaruszonych komórkach można określić ilościowo w szerokim zakresie warunków eksperymentalnych. Ta metoda jest ograniczona do komórek, które mogą rosnąć w przylegającej kulturze na (lub komórkach lub organellach, do których można przykleić) powierzchni polistyrenu. Jest to najbardziej wiarygodne, gdy hodowane komórki są jednorodne i zlewają się, chociaż nadal można uzyskać przydatne dane w zakresie tych warunków. Obliczenia wymagają pewnej wiedzy na temat metabolizmu komórek, ponieważ max H⁺/O₂ waha się od 0,65 do 1,0 dla pełnego utlenienia różnych substratów i więcej dla częściowego utlenienia ⁶, jednak jeśli wiadomo, że komórki utleniają glukozę, można przyjąć wartość 1,0.

Chociaż metoda ta jest istotna dla całej charakterystyki metabolicznej, może być szczególnie pomocna, gdy jest stosowana w systemach, w których przejście między metabolizmem oddechowym i glikolitycznym w celu utrzymania komórkowego zaopatrzenia ATP jest krytycznym fenotypem, w tym charakterystyką komórek macierzystych i komórek rakowych pochodzących z nowotworu. Zrozumienie zmian w kontroli metabolicznej w tych i innych kontekstach pozwoli na większy stopień wyrafinowania i dokładności w eksperymentalnym projektowaniu i analizie tych typów komórek.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pherastar FS	BMG	bez czytnika	mikropłytek
Seahorse XF-24	Seahorse Bioscience	bez instrumentu	do strumienia zewnątrzkomórkowego
Płytka testowa Seahorse XF Materiał	eksploatacyjny	Seahorse Bioscience	V7-PS
Calibrant	Seahorse Bioscience	100840-000
roztwór HCl standard	Sigma	38280
oligomycyna	Sigma	O4876	chemiczna
FCCP	Sigma	C2920	chemiczna
Rotenon	Sigma	R8875	chemiczna
Myksotiazol	Sigma	T5580	chemiczna
DMEM	Corning	10-013-CV	średni składnik
FBS	Corning	35-010-CV	średni składnik
penicylina / streptomycyna	Corning	30-002-CI	średni składnik
anhydraza węglowa	Sigma	C2624	chemiczna
96-dołkowa płytka testowa	Corning	CLS3991	materiał eksploatacyjny
NAD+	Sigma	N7004	chemiczny
LDH	Sigma	L1254	chemiczny

chemiczna