Artykuł metodologiczny

Szybka metoda przygotowania chromosomów do opadania na powietrzu odpowiednia dla RYB w roślinach

DOI:

10.3791/53470

⸱

16 grudnia 2015

 ,  , 
1Leibniz Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research (IPK), 2School of Biological and Chemical Sciences, Queen Mary University of London

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano protokół przygotowania wysokiej jakości rozsiewów mitotycznych chromosomów roślinnych metodą szybkiego upuszczania na sucho, odpowiednią do wykrywania FISH pojedynczych i wysokokopijnych sond DNA.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przygotowanie rozkładów chromosomów jest warunkiem wstępnym pomyślnego przeprowadzenia fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH). Przygotowanie wysokiej jakości rozsiewów chromosomów roślinnych jest trudne ze względu na sztywną ścianę komórkową. Jedną z zatwierdzonych metod przygotowania chromosomów roślinnych jest tak zwany preparat kropelkowy, znany również jako technika rozprowadzania kropel lub suszenia powietrzem. W tym miejscu przedstawiamy protokół szybkiego przygotowania mitotycznych rozsiewów chromosomowych odpowiednich do wykrywania FISH sond DNA z pojedynczymi i wysokimi kopiami. Metoda ta jest ulepszonym wariantem metody air-dry drop wykonywanej przy wilgotności względnej 50%-55%. Protokół ten obejmuje zredukowaną liczbę etapów mycia, dzięki czemu jego stosowanie jest łatwe, wydajne i powtarzalne. Oczywistymi korzyściami płynącymi z tego podejścia są dobrze rozprzestrzenione, nieuszkodzone i liczne chromosomy metafazowe, które stanowią doskonały warunek wstępny dla udanej analizy FISH. Korzystając z tego protokołu, uzyskaliśmy wysokiej jakości rozsiewy chromosomów i powtarzalne wyniki FISH dla Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum i Secale cereale.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) jest skutecznym narzędziem do fizycznego mapowania pojedynczych i wysokich kopii sekwencji na poziomie chromosomalnym. Warunkiem wstępnym jest przygotowanie wysokiej jakości rozkładów chromosomowych. Nie ma ogólnego protokołu przygotowania chromosomów, który byłby równie odpowiedni dla komórek zwierzęcych i roślinnych. Przygotowanie chromosomów roślinnych jest szczególnie trudne ze względu na sztywną ścianę komórkową i różną konsystencję cytoplazmy u różnych gatunków. Jedną z korzystnych metod przygotowania chromosomów roślinnych jest tak zwana technika kroplowa, znana również jako technika rozprowadzania kropel i technika suszenia powietrzem 1,2. Metoda ta została po raz pierwszy wprowadzona w 1958 roku przez Rothfelsa i Siminovitcha dla komórek ssaków hodowanych in vitro 3. Później Martin i wsp. 4 oraz Kato i wsp. 5 zaadaptowali tę metodę do roślin.

Niedawno opracowano metodę o nazwie 'SteamDrop', która wykorzystywała parę wodną do przygotowania nienakładających się na siebie chromosomów 6. Chociaż pozytywny wpływ wysokiej wilgotności zaobserwowano już wcześniej 7, "SteamDrop" zapewnia kontrolowany przebieg pracy z wysokiej jakości preparatami chromosomowymi 6. Leczenie parą wodną powoduje rozciąganie chromosomów, prawdopodobnie związane z jakimiś modyfikacjami białek chromosomowych. Jakość uzyskanych rozprzestrzeniania się metafaz jest bardzo wysoka, chociaż utrzymanie wystarczającej liczby kompletnych rozprzestrzeniania się metafaz dla kolejnych eksperymentów FISH wymaga specjalistycznej wiedzy technicznej.

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania mitotycznych chromosomów zbóż odpowiednich do wykrywania FISH przez sondy pojedyncze i o wysokiej kopii 5,8. Metoda ta jest ulepszonym wariantem metody upuszczania na sucho opisanej przez Kato 9, wykonywanej przy wilgotności względnej 50%-55% (Rysunek 1). Protokół ten obejmuje zredukowaną liczbę etapów mycia, dzięki czemu jego stosowanie jest łatwe, wydajne i powtarzalne. Korzystając z tego protokołu, uzyskaliśmy wysokiej jakości rozsiewy chromosomowe i wyniki FISH dla Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum i Secale cereale.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie chromosomów

  1. Kiełkowanie nasion i utrwalanie wierzchołków korzeni
    1. Wykiełkować 10-20 nasion jęczmienia na dwóch warstwach wilgotnej bibuły filtracyjnej na szalce Petriego w ciemnych warunkach przez 2 dni w temperaturze 22-24 °C. Odciąć energiczne korzenie o długości 1-2 cm od nasion za pomocą żyletki.
    2. Przygotuj lodowatą wodę, umieszczając szklaną butelkę o pojemności 500 ml zawierającą zimną wodę z kranu w pokruszonej lodowatej wodzie. Napowietrz lodowatą wodę i zanurz końcówki korzeni na 20 godzin, aby zwiększyć częstotliwość komórek metafazy.
    3. Przenieś korzenie z wody do 50 ml utrwalacza etanolu: kwasu octowego (3:1), aby utrwalić je w temperaturze pokojowej przez 2 dni. Przechowywać korzenie w świeżo przygotowanym etanolu: kwasie octowym (3:1) utrwalającym w temperaturze 4 °C przez okres do roku.
  2. Mycie i obróbka enzymatyczna
    1. Umyj 10-20 korzeni 30 ml lodowatej wody z kranu przez 5 minut dwa razy za pomocą szklanej zlewki o pojemności 50 ml. Użyj mikroskopu dwuokularowego. Przenieść korzenie pojedynczo do 30 ml 0,01 M buforu cytrynianu (0,01 M kwas cytrynowy + 0,01 M cytrynian sodu, pH 4,8) za pomocą kleszczy i umyć, potrząsając szklaną zlewką przez 5 minut dwukrotnie. Umieść korzenie na bibule filtracyjnej, aby całkowicie usunąć płyn i odciąć niepożądaną tkankę niemerystematyczną za pomocą żyletki.
    2. Inkubować do 20 końcówek korzeni w 1 ml mieszaniny enzymów w temperaturze 37 °C przez około 50 minut, aby zmiękczyć tkankę roślinną (Tabela 1) w szkiełku zegarkowym. Mieszanina enzymatyczna zawiera 0,7% celulazy R10, 0,7% celulazy, 1% pektoliazy i 1% cytohelikazy rozcieńczonej w 0,01 M buforze cytrynianowym. Mieszaninę enzymów należy przechowywać w temperaturze -20 °C i użyć ponownie do pięciu razy.
    3. Usunąć enzym za pomocą pipetowania i dwukrotnie umyć końcówki korzeni na lodzie 5 ml 0,01 M buforu cytrynianowego w celu zastąpienia pozostałego enzymu.
  3. Maceracja korzeni
    1. Umyj końcówki korzeni 1 ml 96% etanolu dwukrotnie dokładnie w tym samym szkiełku zegarka. Zastąp etanol świeżo przygotowanym utrwalaczem (75% kwas octowy : 25% etanol). Użyj 10-15 μl utrwalacza na wierzchołek korzenia.
    2. Przenieś wierzchołki korzeni wraz z utrwalaczem do probówki o pojemności 2 ml i rozdrobnij merystemy korzeniowe za pomocą igły preparacyjnej lub kleszczy. Dotknij rurki 20 razy, aby ponownie zawiesić komórki i uzyskać zawiesinę komórek. Zawiesinę komórek należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do dwóch miesięcy.
  4. Upuszczanie zawiesiny komórek
    1. Umieść 2-3 warstwy nasączonej wodą chusteczki papierowej na płycie grzewczej w temperaturze 50 °C. Zanurz mikroskopijne szkiełka w lodowatej wodzie z kranu w lodówce na 30 minut. I umieść szkiełka na wilgotnej chusteczce papierowej.
    2. Odpipetować 7-10 μl zawiesiny komórek i upuścić ją z odległości 20 cm na schłodzony szkiełko umieszczone na płycie grzejnej. Odpipetować 10 μl mieszaniny kwasu octowego i etanolu w tym samym miejscu, co zawiesina komórek na szkiełku podstawowym i trzymać szkiełko na płycie grzejnej przez dodatkowe 2 minuty. Umieść szkiełko na płycie grzejnej bez mokrej chusteczki i pozostaw do wyschnięcia na 1 minutę.
  5. Kontrola jakości i przechowywanie preparatów
    1. Sprawdź szkiełka za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym, aby kontrolować jakość rozprzestrzeniania się chromosomów. Preparaty należy stosować tego samego dnia lub przechowywać zanurzając w 96% etanolu w słoiku Coplin w temperaturze -20 °C.
  6. Wstępna obróbka szkiełek przed FISH; wszystkie etapy są wykonywane w RT
    1. Umieść szkiełka w słoiku Coplin zawierającym 50 ml 2x SSC (20x SSC zawiera 3 M NaCl i 300 mM cytrynian trisodowy) na 5 minut. Za pomocą kleszczy przenieś szkiełka do słoika Coplin zawierającego 50 ml 45% kwasu octowego na 3-10 min.
    2. Przenieś szkiełka do słoika Coplin zawierającego 50 ml 2x SSC na 10 min. Przenieś szkiełka do słoika Coplin zawierającego 50 ml 4% formaldehydu (w 2x SSC) i zanurz szkiełka na 10 minut w celu utrwalenia chromosomów.
    3. Usunąć formaldehyd, spłukując szkiełka 3 razy po 4 minuty każde, w słoiku Coplin zawierającym 50 ml 2x SSC. Odwadnianie szkiełek w słoiku Coplin przez 2 minuty w seriach odpowiednio 70%, 90% i 100% etanolu oraz suchych szkiełek w pozycji pionowej.

2. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH)

  1. Dla każdego szkiełka należy przygotować roztwór hybrydyzacyjny o łącznej objętości 20 μl, używając 10 μl dejonizowanego formamidu, 5 μl 4x buforu hybrydyzacyjnego (bufor 200 μl zawiera 80 μl 20x SSC, 8 μl 1 M Tris-HCl pH 8,0, 1,6 μl 0,5 M EDTA, 11,2 μl 10 μg/ μl nasienia łososia i 99,2 μl wody wolnej od DNaz), 3 μl sondy i 2 μl wody wolnej od DNaz.
  2. Dodać 20 μl roztworu do hybrydyzacji na szkiełko podstawowe i przykryć szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 24 x 32 mm, a następnie zamknąć szkiełko nakrywkowe cementem gumowym. Denaturyzacja szkiełek za pomocą sond jednocześnie w temperaturze 80 °C przez 2 minuty na płycie grzejnej.
  3. Przenieść szkiełka do wilgotnej komory i inkubować szkiełka w temperaturze 37 °C O/N, unikając światła. Usuń szkiełka nakrywkowe, spłukując szkiełka w słoiku Coplin z 2x SSC. Umieścić szkiełka w słoiku Coplin o temperaturze 55-60 °C 2x SSC i inkubować przez 20 minut.
  4. Umieść szkiełka do 2x SSC w słoiku Coplin na 2 minuty w temperaturze RT. Odwodnić szkiełka w słoiku Coplin na 2 minuty w seriach odpowiednio 70%, 90% i 100% etanolu.
  5. Wysuszyć szkiełka na powietrzu i przeciwbarwić 1 μg/ml 4',6-diamidino-2-fenylindoliny (DAPI) w podłożu zapobiegającym blaknięciu, unikając intensywnego światła.

3. Analiza mikroskopowa i przechowywanie

  1. Przeanalizuj szkiełka za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego. Dobór filtra zależy od fluorochromu użytego do znakowania sondy. W razie potrzeby szkiełka należy przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemnych warunkach do roku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopijne preparaty z mitotycznym rozprzestrzenianiem się metafazy zostały przygotowane metodą szybkiego przygotowania chromosomów opadających na powietrzu, opisaną powyżej (Uzupełnienie Rysunku 1). Analizę FISH przeprowadzono przy użyciu zarówno sekwencji powtarzalnych, jak i jednokopijnych. Obrazy uzyskano za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego z zestawem filtrów umożliwiających wzbudzenie odpowiednich fluoroforów i uchwycono za pomocą monochromatycznej kamery CCD o wysokiej czułości. Do akwizyc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperyment z preparatyką chromosomów przeprowadzono z wykorzystaniem młodych korzeni zbóż należących do rodziny traw (Poaceae). Wszystkie analizowane gatunki mają 14 stosunkowo długich mitotycznych chromosomów metafazy (11-15 μm) w diploidalnym zestawie genomu i należą do gatunków wielkogenomowych (5,1-7,9 Gbp).

Długość kiełkujących korzeni nie przekraczała 2 cm, aby uzyskać maksymalnie tkankę merystematyczną. Synchronizację dzielących się komórek osiągnięto dzięki 20-godzinnemu leczeniu lodo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Serdecznie dziękujemy DFG za wsparcie finansowe (HO 1779/21-1), a także Katrin Kumke i Dr. Veit Schubert (IPK, Gatersleben) za porady techniczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płyta grzejnaMEDAX GmbH12603
Celulaza R10DuchefaC8001
Celulaza CalBioChem219466
PectolyaseSigmaP3026
CytohelikazaSigmaC8274
Texas Red-12-dUTPInvitrogenC3176bezpośredni fluorochrom 
Fluor488-5-dUTPInvitrogenC11397fluorochrom bezpośredni 
Mikroskop fluorescencyjnyOlympus BX61BX61
Kamera CCDOrca ER, HamamatsuC10600
4',6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI) Vector LaboratoriesBarwnik fluorescencyjnyH-1200

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Geber, G., Schweizer, D. Cytochemical heterochromatin differentiation in Sinapis alba (Cruciferae) using a simple air-drying technique for producing chromosome spreads. Pl Syst Evol. 158 (2-4), 97-106 (1988).
  2. Andras, S. C., et al. A drop-spreading technique to produce cytoplasm-free mitotic preparations from plants with small chromosomes. Chromosome Res. 7 (8), 641-647 (1999).
  3. Rothfels, K. H., Siminovitch, L. An air-drying technique for flattening chromosomes in mammalian cells grown in vitro. Stain Technology. 33 (2), 73-77 (1958).
  4. Martin, R., Busch, W., Herrmann, R. G., Wanner, G. Efficient preparation of plant chromosomes for high-resolution scanning electron microscopy. Chromosome Res. 2 (5), 411-415 (1994).
  5. Kato, A., Albert, P. S., Vega, J. M., Birchler, J. A. Sensitive fluorescence in situ hybridization signal detection in maize using directly labeled probes produced by high concentration DNA polymerase nick translation. Biotech. Histochem. 81 (2-3), 71-78 (2006).
  6. Kirov, I., Divashuk, M., Van Laere, K., Soloviev, A., Khrustaleva, L. An easy 'SteamDrop' method for high quality plant chromosome preparation. Mol. Cytogenet. 7, 21(2014).
  7. Spurbeck, J. L., Zinsmeister, A. R., Meyer, K. J., Jalal, S. M. Dynamics of chromosome spreading. Am J Med Genet. 61 (4), 387-393 (1996).
  8. Ma, L., et al. Synteny between Brachypodium distachyon and Hordeum vulgare as revealed by FISH. Chromosome Res. 18 (7), 841-850 (2010).
  9. Kato, A., Lamb, J. C., Birchler, J. A. Chromosome painting using repetitive DNA sequences as probes for somatic chromosome identification in maize. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101 (37), 13554-13559 (2004).
  10. Pan, W. H., Houben, A., Schlegel, R. Highly effective cell synchronization in plant-roots by hydroxyurea and amiprophos-methyl or colchicine. Genome. 36 (2), 387-390 (1993).
  11. Kim, J. S., et al. Integrated karyotyping of sorghum by in situ hybridization of landed BACs. Genome. 45 (2), 402-412 (2002).
  12. Lapitan, N. L. V., Brown, S. E., Kennard, W., Stephens, J. L., Knudson, D. L. FISH physical mapping with barley BAC clones. Plant J. 11 (1), 149-156 (1997).
  13. Aliyeva-Schnorr, L., et al. Cytogenetic mapping with centromeric BAC contigs shows that this recombination-poor region comprises more than half of barley chromosome 3H. Plant J. 84, 385-394 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Metoda suszenia powietrznegoanaliza FISHchromosomy ro linnepreparaty mitotycznezawiesina kom rkowatrawienie enzymatyczneprzygotowanie preparat wroztw r hybrydyzacyjnymikroskopia fluorescencyjna

Powiązane artykuły