Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ortotopowy przeszczep kończyn tylnych u myszy

12K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53483

⸱

12 lutego 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) Laboratory, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Visceral, Transplant and Thoracic Surgery, Innsbruck Medical University, 3Center for Vascularized Composite Allotransplantation, Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Chang Gung Memorial Hospital and School of Medicine, 4Department of General, Visceral and Transplant Surgery, Charite Berlin

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten nowatorski model do ortotopowego przeszczepu kończyn tylnych u myszy, wykorzystujący technikę mankietu bez szwów do zespolenia supermikronaczyniowego, stanowi potężne narzędzie do mechanistycznych badań immunologicznych in vivo związanych z unaczynioną allotransplantacją kompozytową (VCA).

Streszczenie

Systemy modeli zwierzęcych in vivo, a w szczególności modele mysie, przekształciły się w potężne i wszechstronne narzędzia naukowe niezbędne do prowadzenia podstawowych i translacyjnych badań w dziedzinie medycyny transplantacyjnej. Dostępna jest szeroka gama odczynników, w tym przeciwciała mono- i poliklonalne zarówno do zastosowań diagnostycznych, jak i interwencyjnych. Ponadto ogromna liczba genotypowanych, wsobnych, transgenicznych i nokautujących szczepów pozwala na szczegółowe badanie indywidualnego wkładu składników humoralnych i komórkowych w złożone wzajemne oddziaływanie odpowiedzi immunologicznej i sprawia, że mysz jest złotym standardem w badaniach immunologicznych.

Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) wyznacza nową dziedzinę transplantacji przy użyciu alloprzeszczepów w celu zastąpienia "podobnego podobnym" u pacjentów cierpiących na urazową lub wrodzoną utratę tkanki. Ten chirurgiczny protokół metodologiczny pokazuje zastosowanie techniki mankietu bez szwów do zespolenia supermikronaczyniowego w ortotopowym modelu przeszczepu kończyn tylnych myszy. Model ten pozwala w szczególności na porównanie ustalonych paradygmatów przeszczepiania narządów litych z nową formą przeszczepów składającą się z różnych składników tkankowych. Wyjątkowo, model ten pozwala na przeszczepienie żywotnego unaczynionego przedziału i niszy szpiku kostnego, które mogą wywierać korzystny wpływ na równowagę akceptacji i odrzucenia układu odpornościowego. Technika ta stanowi narzędzie do badania rozpoznawania alloantygenów oraz odrzucania i akceptacji przeszczepu allogenicznego, a także umożliwia prowadzenie badań nad funkcjonalną regeneracją nerwów w celu dalszego rozwoju tej nowej dziedziny transplantacji.

Wprowadzenie

Późne lata dziewięćdziesiąte zwiastowały pionierskie dni transplantacji rekonstrukcyjnej, z pierwszym udanym przeszczepem ręki przeprowadzonym we Francji w 1998 roku. Od tego czasu zastosowanie VCA do rekonstrukcji wyniszczających ubytków tkanek jest z powodzeniem stosowane u szerokiego spektrum pacjentów. Do tej pory na świecie liczy się 76 biorców 112 kończyn górnych, a także 31 twarzy 1-3. Ponadto wykonano kilka innych rodzajów VCA, takich jak ściana brzucha 4, krtań 5, tchawica 6, unaczynione stawy 7, a nawet penis 8. Co więcej, niedawno odnotowano przypadki urodzenia żywego dziecka po przeszczepieniu macicy 9. To rosnące doświadczenie świata wskazuje na to, w jaki sposób przeszczep rekonstrukcyjny stał się ważną opcją terapeutyczną dla pacjentów cierpiących na poważne funkcjonalne ubytki tkanki, których nie można naprawić za pomocą konwencjonalnej chirurgii i leczenia rekonstrukcyjnego i odtwórczego.

Podczas gdy pomysł zastąpienia "podobnego podobnym" wywołał entuzjazm kliniczny, początkowy sceptycyzm nadal przeważa w odniesieniu do skutków ubocznych konwencjonalnej immunosupresji w wysokich dawkach, wymaganych do utrzymania alloprzeszczepów i ich funkcji 10,11. Jednak, jak wykazano w przełomowej pracy Lee i wsp., te kompozytowe przeszczepy są mniej podatne na odrzucenie niż ich poszczególne składniki, a ponadto niektóre składniki tkanki, takie jak unaczyniony przedział kostny, podsyciły optymizm, ponieważ mogą wywierać unikalne efekty immunologiczne na równowagę akceptacji i odrzucenia immunologicznego 12.

Nasza grupa była pionierem kilku mikrochirurgicznych modeli zwierzęcych do przeszczepów narządów litych, a także unaczynionej allotransplantacji kompozytowej 13-19. W tym miejscu opisujemy nowatorski zabieg chirurgiczny wykorzystujący technikę mankietu bez szwów do wykonania super zespolenia mikronaczyniowego w ortotopowym modelu przeszczepu kończyn tylnych myszy. Ten model przeszczepu stanowi użyteczne narzędzie do badania mechanizmów akceptacji i odrzucania immunologicznego, a także roli poszczególnych składników tkanki, takich jak unaczyniony przedział szpiku kostnego, w kierunku indukcji tolerancji w immunologicznie wszechstronnym środowisku gatunków myszy. Dodatkowo, ortotopowe umiejscowienie kończyny otwiera możliwości regeneracji nerwów i badań funkcjonalnych, które są niezwykle ważne dla ustalenia VCA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych Narodowego Instytutu Zdrowia (NIH) i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa (JHUACUC). Poszczególne procedury zostały wykonane zgodnie z zatwierdzonym protokołem ACUC MO13M108.

1. Operacja dawcy

  1. Przed zabiegiem należy podać środek przeciwbólowy w odpowiednim punkcie czasowym dla każdego preparatu farmakologicznego. Zgodnie z zatwierdzonym protokołem pielęgnacji i stosowania dla zwierząt, należy podać podskórnie 0,1 mg/kg masy ciała buprenorfiny na 1 godzinę przed nacięciem skóry.
  2. Uspokoić dawcę izofluranem podawanym przez komorę podłączoną do parownika izofluranu w stężeniu 4%; utrzymywać sedację i znieczulenie na poziomie 2% przez stożek nosowy. Wykonaj odbicie wycofania szczypania palców u stóp, aby monitorować głębokość znieczulenia przed rozpoczęciem zabiegu.
  3. Nosić maski, jednorazowe fartuchy izolacyjne i rękawiczki.
  4. Ogolić obszar operacyjny, w szczególności kończynę tylną i pachwinę, i przygotować 10% Powidon - Jod.
  5. Użyj sterylnej serwety polowej, narzędzi sterylizowanych w autoklawie i mikroskopu o dużym powiększeniu (40X).
  6. Wykonaj nacięcie skóry pachwiny za pomocą nożyczek proksymalnie do połowy uda i obwodowo połącz nacięcie, aby oddzielić tylną kończynę od reszty ciała myszy.
  7. Zidentyfikuj i wypreparuj tętnicę udową, żyłę i nerw. Oddziel wszystkie trzy struktury za pomocą kleszczy i mikronożyczek.
  8. Po wypreparowaniu szypułki naczyniowej podziel naczynia na poziomie więzadła pachwinowego za pomocą mikronożyczek.
  9. Następnie kontynuuj dzielenie poszczególnych grup mięśni brzusznych (gracilis i przyśrodkowe uda) oraz grzbietowych 20 proksymalnie na poziomie połowy uda, aby oddzielić przeszczep od zwierzęcia dawcy za pomocą nożyczek.
  10. Przeciąć kość udową i przeciąć w środku trzonu kości udowej za pomocą nożyczek.
  11. Poddać zwierzę eutanazji przez przedawkowanie izofluranu, a następnie zwichnięcie szyjki macicy. Potwierdź ustanie bicia serca i oddychania.
  12. Przepłukać kończynę 2 ml zimnego (4 °C) soli fizjologicznej w postaci heparyny (30 I.E.) za pomocą igły płuczącej o sile 33 G umieszczonej na strzykawce (patrz Tabela Materiałów).
  13. Umieść jeden mankiet poliimidowy odpowiednio na żyle udowej i tętnicy.
  14. Zawiń szczepionkę w mokrą bawełnianą gazę, umieść na szalce Petriego i przechowuj w temperaturze 4 °C do momentu włożenia.

2. Operacja odbiorcy

  1. Usunięcie kończyny tylnej
    1. Przed zabiegiem należy podać środek przeciwbólowy w odpowiednim punkcie czasowym dla każdego preparatu farmakologicznego. Zgodnie z zatwierdzonym protokołem opieki i stosowania zwierząt, należy zastosować 0,1 mg/kg masy ciała buprenorfiny SC na 1 godzinę przed nacięciem skóry.
    2. Uspokoić dawcę izofluranem podawanym przez komorę podłączoną do parownika izofluranu w stężeniu 4%; utrzymywać sedację i znieczulenie na poziomie 2% przez stożek nosowy. Wykonaj odbicie wycofania szczypania palców u stóp, aby monitorować głębokość znieczulenia przed rozpoczęciem zabiegu.
    3. Użyj maści weterynaryjnej na oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
    4. Ogolić obszar operacyjny, w szczególności kończynę tylną i pachwinę, a następnie przygotować się z 10% Powidonem - jodem.
    5. Wykonaj nacięcie skóry pachwiny za pomocą nożyczek proksymalnie do połowy uda i obwodowo połącz nacięcie, aby oddzielić tylną kończynę od reszty ciała myszy.
    6. Zidentyfikuj i wypreparuj tętnicę udową, żyłę i nerw oraz oddziel wszystkie trzy struktury za pomocą kleszczy i mikronożyczek.
    7. Po wypreparowaniu szypułki naczyniowej zaciśnij naczynia udowe na poziomie więzadła pachwinowego.
    8. Przeciąć naczynia dystalnie na poziomie powierzchownej tętnicy nadbrzusza.
    9. Następnie kontynuuj dzielenie poszczególnych grup mięśni brzusznych (gracilis i przyśrodkowych ud) oraz grzbietowych 20 proksymalnie na poziomie połowy uda, aby oddzielić rodzimą tylną kończynę od zwierząt biorców za pomocą nożyczek.
    10. Przeciąć kość udową w środku trzonu kości udowej za pomocą nożyczek.
    11. Kauteryzuj wcześniej przecięte mięśnie ud, aby zapobiec krwawieniu z miejsca rozwarstwienia, a tym samym utracie krwi biorcy.
  2. Implantacji
    1. Zminimalizuj utratę płynów, przepłukując pole operacyjne ciepłą solą fizjologiczną (37 °C) i wstrzykując 0,3 ml ciepłej soli fizjologicznej przed i po operacji.
    2. Umieścić przeszczep w sposób, który odzwierciedla dokładne położenie anatomiczne rodzimej kończyny tylnej, wyrównując kość udową biorcy i przeszczep, a następnie połączyć je za pomocą igły rdzeniowej 20 G jako pręta śródszpikowego.
    3. Połączyć brzuszne i grzbietowe grupy mięśni za pomocą wchłanialnego materiału do szycia (6-0 Polysorb).
    4. Połączyć naczynia udowe za pomocą techniki mankietu bez szwu; szczegółowo naciągnąć naczynie po stronie biorczej na mankiety wcześniej zamontowane na końcach naczynia przeszczepu. Użyj nylonowego szwu 10-0 i wykonaj opaskę obwodową, aby przymocować naczynie biorcze do mankietu.
    5. Następnie zwolnij zaciski. Na tym etapie sprawdź wzrokowo rotację mankietu i optymalne ustawienie, aby zapobiec nieprawidłowemu obracaniu się i załamywaniu naczyń.
    6. Wykonaj skrupulatną hemostazę za pomocą elektrokoagulacji, ze szczególnym uwzględnieniem interfejsu biorcy mięśnia i końców kostnych.
    7. Zamknij skórę za pomocą niewchłanialnych szwów nylonowych (6-0 Ethilon).
    8. Ustal warunki normotermiczne, pozwalając zwierzęciu dojść do siebie w klatce pod lampą grzewczą. Kontynuuj regularne monitorowanie przez co najmniej 4 godziny przed powrotem do obiektu mieszkalnego.
    9. Zapewnij znieczulenie pooperacyjne z buprenorfiną w dawce 0,1 mg/kg podskórnie co 6-8 godzin przez 3 dni.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przeprowadzenie unaczynionego alloprzeszczepu złożonego w modelu mysim z wykorzystaniem techniki bezszwowego mankietu pozwala na osiągnięcie doskonałego i długotrwałego przeżycia przeszczepu oraz zwierzęcia, co pokazano na Rysunku 1. Co więcej, stanowi to niezawodną metodę uzyskiwania powtarzalnych wyników stopniowego odrzucania alloprzeszczepu w unaczynionej allotransplantacji złożonej, co dokumentują obrazy przedstawione na Rysunku 2. Histologia H&E...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Allotransplantacja unaczyniona, taka jak przeszczep kończyny górnej i twarzy w celu rekonstrukcji wyniszczających ubytków tkanki, rozwinęła się jako ważna opcja leczenia dla pacjentów, którzy nie są przystosowani do konwencjonalnych procedur rekonstrukcyjnych. Postęp techniczny w dziedzinie mikrochirurgii rekonstrukcyjnej, a także ogromne doświadczenie w stosowaniu silnych terapii immunosupresyjnych i immunomodulujących w transplantacji narządów litych, umożliwiają obecnie długoterminowe przeżycie przeszczepu allogeniczn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnego interesu finansowego.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Armię, Marynarkę Wojenną, NIH, Siły Powietrzne, VA i Sprawy Zdrowia, aby wesprzeć wysiłki AFIRM II, na podstawie Nagrody nr W81XWH-13-2-0053. U.S. Army Medical Research Acquisition Activity, 820 Chandler Street, Fort Detrick MD 21702-5014 jest biurem przyznającym i zarządzającym akwizycją. Opinie, interpretacje, wnioski i zalecenia są opiniami autora i niekoniecznie są zatwierdzone przez Departament Obrony.

Autorzy chcieliby podziękować Jessice Izzi, D.V.M., Caroline Garrett, D.V.M. i Julie Watson, D.V.M. za ich doskonałe wsparcie weterynaryjne podczas tego badania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szew, szew nylonowy 6-0MWI31849
6-0 PolysorbMWI72667
10-0 NylonAero SurgicalTK-107038
, rozmiar 25Vention Medical141-0023
rurka poliimidowa, rozmiar 27Vention Medical141-0015
Zaciski mikronaczyniowe (pojedyncze)Synovis00396
Zaciski mikronaczyniowe (podwójne)Synovis00414
MikronożyczkiSynovisSAS-18
MikrokleszczeSynovisFRS-15 RM-8
MikrorozszerzaczeSynovisFRS-15 RM-8D.1
MikroigłownikSynovisC-14
Aplikator Micro-ClampSynovisCAF-4
Igła do mikropłukaniaHamilton10MM, 30°, 33G
Lactated Ringers SolutionFisher Scientific NC9968051
BuprenorfinaWymagany numer DEA; Pozyskiwany z apteki szpitalnej.
Enrofloksacyna; BaytrilBayer Health Care186599
HeparynaPozyskiwana z apteki szpitalnej
, szew , rurkapoliamidowa

Bibliografia

  1. Khalifian, S., et al. Facial transplantation: the first 9 years. Lancet. , (2014).
  2. Petruzzo, P., Dubernard, J. M. The International Registry on Hand and Composite Tissue allotransplantation. Clin. Transpl. , 247-253 (2011).
  3. Shores, J. T., Brandacher, G., Lee, W. A. Hand and Upper Extremity Transplantation: An Update of Outcomes in the Worldwide Experience. Plast. Reconstr. Surg. , (2014).
  4. Levi, D. M., et al. Transplantation of the abdominal wall. Lancet. 361, 2173-2176 (2003).
  5. Strome, M., et al. Laryngeal transplantation and 40-month follow-up. N.Engl.J. Med. 344, 1676-1679 (2001).
  6. Rose, K. G., Sesterhenn, K., Wustrow, F. Tracheal allotransplantation in man. Lancet. 1, 433(1979).
  7. Hofmann, G. O., et al. Allogeneic vascularized transplantation of human femoral diaphyses and total knee joints--first clinical experiences. Transplant. Proc. 30, 2754-2761 (1998).
  8. Hu, W., et al. A preliminary report of penile transplantation. Eur. Urol. 50, 851-853 (2006).
  9. Brannstrom, M., et al. Livebirth after uterus transplantation. Lancet. , (2014).
  10. Sarhane, K. A., et al. Diagnosing skin rejection in vascularized composite allotransplantation: advances and challenges. Clin. Transplant. 28, 277-285 (2014).
  11. Schneeberger, S., Khalifian, S., Brandacher, G. Immunosuppression and monitoring of rejection in hand transplantation. Tech. Hand Up. Extrem. Surg. 17, 208-214 (2013).
  12. Lee, W. P., et al. Relative antigenicity of components of a vascularized limb allograft. Plast. Reconstr. Surg. 87, 401-411 (1991).
  13. Sucher, R., et al. Hemiface allotransplantation in the mouse. Plast. Reconstr. Surg. 129, 867-870 (2012).
  14. Ibrahim, Z., et al. A modified heterotopic swine hind limb transplant model for translational vascularized composite allotransplantation (VCA) research. J Vis Exp. , (2013).
  15. Oberhuber, R., et al. Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique. J Vis Exp. , (2014).
  16. Sucher, R., et al. Mouse hind limb transplantation: a new composite tissue allotransplantation model using nonsuture supermicrosurgery. Transplantation. 90, 1374-1380 (2010).
  17. Maglione, M., et al. A novel technique for heterotopic vascularized pancreas transplantation in mice to assess ischemia reperfusion injury and graft pancreatitis. Surgery. 141, 682-689 (2007).
  18. Sucher, R., et al. Orthotopic hind-limb transplantation in rats. J Vis Exp. , (2010).
  19. Zou, Y., Brandacher, G., Margreiter, R., Steurer, W. Cervical heterotopic arterialized liver transplantation in the mouse. J. Surg. Res. 93, 97-100 (2000).
  20. Zhang, F., et al. Development of a mouse limb transplantation model. Microsurgery. 19, 209-213 (1999).
  21. Schneeberger, S., et al. Upper-extremity transplantation using a cell-based protocol to minimize immunosuppression. Ann. Surg. 257, 345-351 (2013).
  22. Azari, K., Brandacher, G. Vascularized composite allotransplantation. Curr Opin Organ Transplant. 18, 631-632 (2013).
  23. Pomahac, B., Gobble, R. M., Schneeberger, S. Facial and hand allotransplantation. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 4, (2014).
  24. Chong, A. S., Alegre, M. L., Miller, M. L., Fairchild, R. L. Lessons and limits of mouse models. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 3, a015495(2013).
  25. Lin, C. H., et al. The neck as a preferred recipient site for vascularized composite allotransplantation in the mouse. Plast. Reconstr. Surg. 133, 133e-141e (2014).
  26. Shapiro, R. I., Cerra, F. B. A model for reimplantation and transplantation of a complex organ: the rat hind limb. J. Surg. Res. 24, 501-506 (1978).
  27. Leto Barone, A. A., et al. The gracilis myocutaneous free flap in swine: an advantageous preclinical model for vascularized composite allograft transplantation research. Microsurgery. 33, 51-55 (2013).
  28. Mathes, D. W., et al. A preclinical canine model for composite tissue transplantation. J. Reconstr. Microsurg. 26, 201-207 (2010).
  29. Barth, R. N., et al. Prolonged survival of composite facial allografts in non-human primates associated with posttransplant lymphoproliferative disorder. Transplantation. 88, 1242-1250 (2009).
  30. Brandacher, G., Grahammer, J., Sucher, R., Lee, W. P. Animal models for basic and translational research in reconstructive transplantation. Birth Defects Res C Embryo Today. 96, 39-50 (2012).
  31. Foster, R. D., Liu, T. Orthotopic hindlimb transplantation in the mouse. J. Reconstr. Microsurg. 19, 49(2002).
  32. Tung, T. H., Mohanakumar, T., Mackinnon, S. E. Development of a Mouse Model for Heterotopic Limb and Composite-Tissue Transplantation. J. Reconstr. Microsurg. 17, 267-274 (2001).
  33. Zhang, F., Shi, D. Y., Kryger, Z., Moon, W. Development of a mouse limb transplantation model. Microsurgery. 19 (5), 209-213 (1999).
  34. Schneeberger, S., et al. Atypical acute rejection after hand transplantation. Am. J. Transplant. 8, 688-696 (2008).
  35. Mathes, D. W., et al. Stable mixed hematopoietic chimerism permits tolerance of vascularized composite allografts across a full major histocompatibility mismatch in swine. Transpl. Int. 27, 1086-1096 (2014).
  36. Yamada, Y., et al. Use of CTLA4Ig for induction of mixed chimerism and renal allograft tolerance in nonhuman primates. Am. J. Transplant. 14, 2704-2712 (2014).
  37. Sachs, D. H., Kawai, T., Sykes, M. Induction of tolerance through mixed chimerism. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 4, a015529(2014).
  38. Kawai, T., et al. HLA-mismatched renal transplantation without maintenance immunosuppression. N. Engl. J. Med. 358, 353-361 (2008).
  39. Kawai, T., Sachs, D. H. Tolerance induction: hematopoietic chimerism. Curr Opin Organ Transplant. 18, 402-407 (2013).
  40. Kawai, T., Sachs, D. H., Sykes, M., Cosimi, A. .B. HLA-mismatched renal transplantation without maintenance immunosuppression. N. Engl. J. Med. 368, 1850-1852 (2013).
  41. Leventhal, J., et al. Chimerism and tolerance without GVHD or engraftment syndrome in HLA-mismatched combined kidney and hematopoietic stem cell transplantation. Sci. Transl. Med. 4, 124-128 (2012).
  42. Cendales, L. C., et al. The Banff 2007 working classification of skin-containing composite tissue allograft pathology. Am. J. Transplant. 8, 1396-1400 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Model mysiunaczyniona allotransplantacja złożonatechnika mankietowa bezszwowasupermikroanastomoza naczyniowapreparowanie tętnicy i żyły udowejaplikacja mankietu polimidowegoustawienie kości udowejkoaptacja grup mięśniowychanaliza odrzucania allograftu
Ortotopowy przeszczep kończyn tylnych u myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.