Immunofenotypowanie krwi pełnej jest niezbędne do monitorowania ludzkiego układu odpornościowego. Jednak liczba wymaganych odczynników i niestabilność określonych fluorochromów w wstępnie zmieszanych koktajlach wymaga codziennego przygotowywania odczynników. Tutaj pokazujemy, że półautomatyczne przygotowanie koktajlu przeciwciał barwiących pomaga ustalić wiarygodne immunofenotypowanie poprzez zminimalizowanie zmienności w dozowaniu odczynników.
Artykuł metodologiczny
Półautomatyczne podejście do przygotowywania koktajli przeciwciał do analizy immunofenotypowej ludzkiej krwi obwodowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Immunofenotypowanie krwi obwodowej za pomocą cytometrii przepływowej określa zmiany w częstotliwości i statusie aktywacji leukocytów obwodowych podczas choroby i leczenia. Ma ona potencjał do przewidywania skuteczności terapeutycznej i identyfikowania nowych celów terapeutycznych. Barwienie krwi pełnej wykorzystuje niemanipulowaną krew, co minimalizuje artefakty, które mogą wystąpić podczas przygotowywania próbki. Jednak barwienie krwi pełnej musi być również wykonane na świeżo pobranej krwi, aby zapewnić integralność próbki. Dodatkowo najlepiej jest przygotować koktajle przeciwciał tego samego dnia, aby uniknąć potencjalnej niestabilności barwników tandemowych i zapobiec interakcji odczynników między barwnikami fioletu brylantowego. Dlatego barwienie krwi pełnej wymaga starannej standaryzacji w celu kontroli zmienności wewnątrz- i międzyeksperymentalnej.
Tutaj informujemy o wdrożeniu automatycznego urządzenia do obsługi płynów wyposażonego w dwuwymiarowy (2D) czytnik kodów kreskowych do standardowego procesu wytwarzania koktajli przeciwciał do cytometrii przepływowej. Przeciwciała przeniesiono do probówek z kodami kreskowymi 2D ułożonych w formacie 96 dołków, a ich zawartość skompilowano w bazie danych. Osoba zajmująca się obsługą płynów może następnie zlokalizować źródłowe fiolki z przeciwciałami, odwołując się do nazw przeciwciał w bazie danych. Nasza metoda wyeliminowała żmudną koordynację pozycjonowania probówek z przeciwciałami. Zapewniło to wszechstronność, umożliwiając użytkownikowi łatwą zmianę dowolnej liczby szczegółów w procesie dozowania przeciwciał, takich jak określone przeciwciało do użycia, objętość i miejsce docelowe, poprzez modyfikację bazy danych bez przepisywania skryptów w metodzie oprogramowania dla każdego testu.
Eksperyment potwierdzający słuszność koncepcji osiągnął wyjątkową precyzję między i wewnątrz testu, zademonstrowaną przez powtórzone przygotowanie testu cytometrii przepływowej z 11 kolorami i 17 przeciwciałami. Metodologie te zwiększyły ogólną przepustowość testów cytometrii przepływowej i ułatwiły codzienne przygotowywanie złożonych koktajli przeciwciał wymaganych do szczegółowej charakterystyki fenotypowej świeżo pobranej antykoagulowanej krwi obwodowej.
Wprowadzenie
Immunofenotypowanie ludzkiej krwi obwodowej określa ilościowe i jakościowe zmiany w podzbiorach komórek odpornościowych1. Zapewnia wgląd w mechanizmy działania i oporności, pomaga w odkrywaniu biomarkerów predykcyjnych i ułatwia opracowywanie immunoterapii skojarzonych. Dlatego walidacja i standaryzacja immunofenotypowania jest obszarem dużego zainteresowania badaczy akademickich, laboratoriów klinicznych i przemysłu.
Chociaż immunofenotypowanie krwi obwodowej metodą cytometrii przepływowej jest obecnie stosowane do klinicznego leczenia nowotworów hematologicznych2,3 i zakażenia ludzkim wirusem niedoboru odporności (HIV)4,5, wiarygodne immunofenotypowanie krwi obwodowej do immunoterapii wymaga szczególnych rozważań w walidacji i standaryzacji, ponieważ wymaga szerszego pokrycia podzbiorów komórek odpornościowych i receptorów aktywujących/hamujących1,6-8. Skuteczne immunofenotypowanie wymaga starannej standaryzacji w celu zminimalizowania zmienności między eksperymentami związanych z konfiguracją instrumentu i procedurą barwienia komórek9,10. Podczas gdy standaryzacja ustawień przyrządów do cytometrii przepływowej jest dobrze ugruntowana, aby rozwiązać pierwszy problem9,11,12, pozostaje niejasne, jak zminimalizować zmienność związaną z barwieniem komórek bez ograniczania zasięgu podzbiorów komórek odpornościowych i ich statusu aktywacji.
Wraz ze wzrostem liczby wykrywanych antygenów, rośnie również możliwość wystąpienia błędów i zmienności z powodu nieoptymalnego dozowania odczynników i zanieczyszczenia krzyżowego. Metody analizy fenoptypowej antykoagulowanej krwi pełnej zostały opracowane pod koniec lat 80-tych XX wieku do stosowania w klinicznych testach laboratoryjnych. Te same metody służą potrzebom laboratorium badawczego w zakresie przygotowania próbek. Co ważne, koktajle przeciwciał stosowane w laboratorium klinicznym są zazwyczaj mniej złożone i dostępne w postaci wstępnie zbalansowanej i wstępnie zmieszanej przez producenta. Wymagane jest tylko jednorazowe przeniesienie wstępnie zmieszanego koktajlu przeciwciał. W warunkach badawczych typowe są koktajle przeciwciał składające się z 10-16 przeciwciał. Każdy koktajl musi zostać zatwierdzony pod względem stabilności przez laboratorium lub przygotowany na świeżo przed każdym badaniem. Przygotowanie wielu koktajli przeciwciał dla próbki może wiązać się z pipetowaniem 50-80 pojedynczych przeciwciał, co jest zadaniem zarówno żmudnym, jak i podatnym na błędy.
Automatyzacja przygotowywania koktajli ma kilka zalet w porównaniu z ręcznym przygotowywaniem koktajli, takich jak mniej błędów, zwiększona dokładność pipetowania, a być może nawet zmniejszone marnotrawstwo odczynników. W tym miejscu informujemy o udanym wprowadzeniu zautomatyzowanego urządzenia do obsługi cieczy wyposażonego w dwuwymiarowy (2D) czytnik kodów kreskowych do procesu barwienia komórek immunofenotypowania w celu zminimalizowania zmienności związanej z przygotowaniem próbki.
Protokół
Pobieranie i używanie krwi obwodowej w tym protokole zostało zatwierdzone przez Providence Health & Services Institutional Review Board. Wszyscy ludzie wyrazili pisemną świadomą zgodę.
Uwaga: Przestrzegaj uniwersalnych środków ostrożności. Cała ludzka krew powinna być traktowana tak, jakby była zakaźna i traktowana zgodnie z praktykami bezpieczeństwa biologicznego na poziomie 2.
Uwaga: Immunofenotypowanie z obwodową krwią pełną odbywa się poprzez inkubację antykoagulowanej krwi pełnej z fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami monoklonalnymi w celu wykrycia antygenów powierzchniowych komórek, a następnie hipotoniczną lizę w celu usunięcia czerwonych krwinek. Komórki są myte, a próbka jest analizowana za pomocą cytometru przepływowego. Opisana metoda skupia się na przygotowaniu koktajli przeciwciał za pomocą automatycznego urządzenia do obsługi płynów wyposażonego w czytnik kodów kreskowych 2D. Po pierwsze, "Koktajl podstawowy", który identyfikuje podzbiory komórek odpornościowych, i "Koktajl aktywacyjny", który monitoruje indukowalne antygeny, są przygotowywane oddzielnie (Tabela 1). Następnie oba koktajle są mieszane, aby stworzyć "Mistrzowski Koktajl Przeciwciał". Zobacz rysunek 1, aby zapoznać się z przepływem pracy.
1. Próbka
- Pobrać krew obwodową przez nakłucie żyły w probówce do pobierania krwi z antykoagulacją heparyny sodu, delikatnie odwrócić kilka razy, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie, a następnie przytrzymać w temperaturze pokojowej. Odrzucić próbkę, jeśli jest zakrzepnięta lub zhemolizowana13.
2. Przygotowanie sprzętu laboratoryjnego
- Oznacz probówki z kodami kreskowymi 2D etykietami czytelnymi dla człowieka (nazwa przeciwciała, sprzedawca, numer katalogowy i numer partii).
- Przenieść całą zawartość fiolek z przeciwciałami od sprzedawcy (wymienionych w Tabeli 1) do odpowiednich probówek z kodami kreskowymi 2D.
Uwaga: Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie wprowadzać pęcherzyków, ponieważ bąbelki fałszywie uruchamiają wykrywanie poziomu cieczy (LLS), co powoduje nieoptymalny transfer odczynnika.
Uwaga: Upewnij się, że każda fiolka z przeciwciałami ma wystarczającą ilość przeciwciał do przeprowadzenia biegu. - Odczytaj kod kreskowy 2D dla każdej probówki za pomocą czytnika kodów kreskowych 2D.
- Utwórz arkusz kalkulacyjny zawierający nazwy przeciwciał (AB) i odczyty kodów kreskowych (BC) za pomocą oprogramowania do obsługi arkuszy kalkulacyjnych i zapisz go w pliku z wartościami rozdzielanymi przecinkami (csv) jako "AB_BC.csv" (Tabela 2).
Uwaga: Upewnij się, że sformatowałeś komórki jako "Tekst", a nie "Liczba", aby zachować pierwsze "0" dla numerów kodów kreskowych, jeśli takie istnieją (np. 0163562544). Dodaj "x, 0000000000" na końcu, aby określić koniec danych. - Przykręć metalowe płytki LLS do ramy pokładu w automatycznej maszynie do obsługi cieczy, aby umożliwić LLS.
3. Programowanie dla automatycznego urządzenia do obsługi cieczy
Uwaga: W oprogramowaniu dla automatycznego urządzenia do obsługi płynów zostaną zaprogramowane dwie metody: a) metoda tworzenia "Koktajlu Bazowego" i "Koktajlu Aktywacji" w 3.1), oraz b) metoda tworzenia "Koktajlu Głównego Przeciwciała" poprzez połączenie "Koktajlu Bazowego" i "Koktajlu Aktywacji" w 3.2) (Rysunek 1).
- Stwórz metodę przygotowania "Koktajlu bazowego" i "Koktajlu aktywacyjnego" (Rysunek 2).
- Korzystając z oprogramowania arkusza kalkulacyjnego, utwórz arkusz kalkulacyjny zawierający informacje o nazwach przeciwciał (AB_NAME), lokalizacji probówki docelowej (WELL-BASE lub WELL-ACT) i objętości (VOL) w μl dla "Koktajlu bazowego" z końcówkami P50 (BASE_CT_P50: Tabela 3) lub P200 (BASE_CT_P200: Tabela 4) i "Koktajlu aktywacyjnego" z końcówkami P50 (ACT_CT_P50: Tabela 5) lub końcówki P200 (ACT_CT_P200: Tabela 6). Zapisz je jako pliki csv. W przypadku lokalizacji "WELL-BASE" i "WELL-ACT" należy zapoznać się z liczbami na rysunku 3.
Uwaga: VOL = miano x (# barwienia + 2) μl. Miana w tabeli 1 są specyficzne dla partii. Operator powinien określić miano dla każdego przeciwciała zgodnie z opisem w innych 14. - Kliknij ikonę, aby uruchomić oprogramowanie dla automatycznego urządzenia do obsługi płynów na komputerze w celu utworzenia metody przygotowania "Koktajlu bazowego" i "Koktajlu aktywacyjnego".
Uwaga: Poniższe kroki 3.1.3-3.1.7 definiują sprzęt laboratoryjny: stojak na probówki z probówkami z kodami kreskowymi 2D (Rysunek 4). Pomiary są podane jako odniesienie. Badacze powinni określić i dostosować dla każdego instrumentu. - Na pasku narzędzi w sekcji "Projekt" wybierz "Edytor typów oprogramowania laboratoryjnego". Kliknij prawym przyciskiem myszy obiekt na płaskiej płytce 96-dołkowej, wybierz "Kopiuj" i wpisz "Matrix_OneML_TubeRack" w wyskakującym okienku.
- Kliknij dwukrotnie obiekt "Matrix_OneML_TubeRack", aby otworzyć okno dialogowe. Podświetl "Informacje podstawowe", ustaw 12.775 cm (X) i 8.546 cm (Y) dla "Rozpiętość" i 4.625 cm dla "Wysokość". (Rysunek 4A).
- Następnie zaznacz "Informacje o ruchu". Ustaw Przesunięcie chwytaka 0 (X), 0 (Y) i 0,3 (Z), Ściśnięcie chwytaka -0,1 cm, Odciśnięcie chwytaka 2,6 cm, Ograniczenie prędkości 75%, a następnie zaznacz opcję "Użyj czujnika chwytaka" (Rysunek 4B).
- Następnie zaznacz "Well_1". Ustaw w następujący sposób: "Dobrze przesunięty"; 1,5 cm (X) i 1,13 cm (Y), "Well Count"; 12 (x) i 8 (y), "odstępy między studniami"; 0,9 (X) i 0,9 (Y), "Maksymalna głośność"; 1 500 μl, Format"; Zwykły, "Colum 2 Offset"; 0 i "Głośność domyślna"; 0 (Rysunek 4C).
- Na koniec naciśnij przycisk "Edytuj..." po prawej stronie "Konfiguracji studni" (Rysunek 4C). W wyskakującym okienku ustaw w następujący sposób: "Kształt"; okrągły, "górny promień"; 0,37 cm, "Dolny promień"; 0,37 cm i "Wysokość"; 3,9 cm. Zaznacz "Dolna sekcja" i ustaw "Kształt"; stożek, "promień"; 0,37 cm i "Wysokość"; 0,4 cm (Rysunek 4D).
Uwaga: Następujące kroki 3.1.8-3.1.11 zdefiniują sprzęt laboratoryjny: stojak na probówki z probówkami do mikrofuge. Pomiary są podane jako odniesienie. Badacze powinni określić i dostosować dla każdego instrumentu. - Na pasku narzędzi w sekcji "Projekt" wybierz "Edytor typów oprogramowania laboratoryjnego". Kliknij prawym przyciskiem myszy obiekt dla 24-pozycyjnego stojaka, wybierz "Kopiuj" i wpisz "SmallTuberack_microfugetubes".
- Kliknij dwukrotnie obiekt "SmallTuberack_microfugetubes", aby otworzyć okno dialogowe. Podświetl "Informacje podstawowe", ustaw 12,75 cm (X) i 8,5 cm (Y) dla "Rozpiętość" i 3,95 cm dla "Wysokość".
- Następnie zaznacz "Well_1". Ustaw w następujący sposób: "Dobrze przesunięty"; 1,621 cm (X) i 1,181 cm (Y), "Well Count"; 6 (x) i 4 (y), "odstępy między studzienkami"; 1.9 (X) i 1.9 (Y), "Objętość maksymalna"; 1 000 μl, Format"; Zwykły, "Colum 2 Offset"; 0 i "Głośność domyślna"; 0.
- Na koniec naciśnij przycisk "Edytuj..." po prawej stronie "Konfiguracji studni". W wyskakującym okienku ustaw w następujący sposób: "Kształt"; okrągły, "górny promień"; 0,3345 cm, "Dolny promień"; 0,274 cm i "wysokość"; 3,6728 cm. Zaznacz "Dolna sekcja" i ustaw "Kształt"; Półkula i "promień"; 0.1575 cm.
Uwaga: Poniższe kroki 3.1.12-3.1.35 wyjaśnią, jak zaprogramować "nową metodę" do przygotowania "koktajlu bazowego" i "koktajlu aktywacyjnego" (rysunek 2). - Kliknij ikonę "Nowa metoda" i otwórz.
- Przeciągnij ikonę "JEŻELI" między ikoną "Rozpoczęcie" i "Zakończ" w nowej metodzie (Rysunek 2). Kliknij i podświetl ikonę "JEŻELI". Wpisz następujące informacje w polu Warunek: CreateObject("World.EngineObject").simulating
Uwaga: Uniemożliwi to oprogramowaniu sprawdzanie błędów i umożliwi działanie tej metody. Bez tego kroku oprogramowanie będzie ostrzegać o brakujących informacjach w zbiorze danych, ponieważ odczyty kodów kreskowych są dostępne tylko po kroku "VisionMate: Odczyt kodów kreskowych" opisanym w 3.1.20). Ponieważ ten krok wyłącza etap weryfikacji w oprogramowaniu, operator musi potwierdzić, że na pokładzie znajduje się wystarczająca ilość końcówek i odczynnika, aby wykonać tę metodę. - Wstaw ikonę "Instrument Setup" między ikonę "Then" a pierwszą ikoną "End" pod ikoną "IF" (Rysunek 2).
Uwaga: W przypadku wszystkich poniższych kroków przeciągnij ikony między ikoną "Inaczej" a drugą ikoną "Koniec" pod ikoną "JEŻELI", tak aby kroki były zamknięte w "Inaczej". - Przeciągnij ikonę "Instrument Setup" pod ikonę "Else" w metodzie (Rysunek 2).
- Kliknij ikonę "Ustawienia instrumentu" w metodzie, aby otworzyć okno. Skonfiguruj sprzęt laboratoryjny, przeciągając ikony dla dysz z filtrem P50 LLS, końcówek z filtrem P200 LLS, końcówek P1000, "Matrix_OneML_TubeRack", dwóch "SmallTuberack_microfugetubes" i zbiornika do odpowiedniej lokalizacji pokładu z listy ikon.
- Otwórz okno dialogowe "Matrix_OneML_TubeRack" i nazwij go jako "AB_BOX". Otwórz okno dialogowe "SmallTuberack_microfugetubes" i nazwij jeden z nich jako "BASE_CT" dla koktajli podstawowych, a drugi jako "ACT_CT" dla koktajli aktywacyjnych (Rysunek 5).
- Przeciągnij ikonę "Transfer" do metody (Rysunek 2), aby dodać krok do przenoszenia buforu ze zbiornika do probówek do mikrofuge dla "Koktajlu bazowego" i "Koktajlu aktywacyjnego". Objętość transferu = 25 μl x (# barwienia +2) dla "Koktajlu bazowego" i = 25 μl x (# barwienia +2) dla "Koktajlu aktywacyjnego".
- Dodaj kroki, aby przesunąć "Matrix_OneML_TubeRack" na czytnik kodów kreskowych 2D. Przeciągnij ikonę "VisionMate Move" do metody (Rysunek 2) i określ przejście z początkowej pozycji pokładu do pozycji czytnika kodów kreskowych na pokładzie.
- Przeciągnij ikonę "VisionMate: Odczyt kodów kreskowych" do metody (Rysunek 2). Otwórz okno dialogowe i wybierz "VisionMate" jako urządzenie i nazwij zestaw danych jako "BC_Read".
- Przeciągnij przycisk "Wstrzymaj użytkownika" (Rysunek 2), wybierz opcję "Wstrzymaj cały system i wyświetl ten komunikat" i wpisz komentarz w polu, aby przypomnieć użytkownikom o potwierdzeniu, że wszystkie kody kreskowe zostały odczytane przed przejściem do następnego kroku.
Uwaga: Następujące kroki 3.1.22-3.1.26 połączą lokalizacje studzienek i nazwy przeciwciał za pomocą informacji z kodów kreskowych. Umożliwi to zautomatyzowanemu obchodzeniu się z płynami znalezienie lokalizacji konkretnego przeciwciała na podstawie nazwy przeciwciała "AB". - Przeciągnij ikonę "Krok raportowania" do metody (Rysunek 2).
- Utwórz plik tekstowy za pomocą programu tekstowego i zapisz go jako "BC_Readout" w folderze dokumentów na komputerze.
- Otwórz okno dialogowe "Krok raportowania", wybierz "Plik tekstowy" dla stylu raportu i wybierz plik "BC_Readout" za pomocą browsersing.
Uwaga: Wynikowy plik "BC_Readout" będzie zawierał informacje o wszystkich urządzeniach laboratoryjnych na pokładzie, z wyjątkiem końcówek skonfigurowanych w 3.1.16, w tym informacje dotyczące odczytów kodów kreskowych dla probówek z kodami kreskowymi 2D i lokalizacji studzienek w "Matrix_OneML_TubeRack". - Dodaj krok "Utwórz zestaw danych", aby połączyć kod kreskowy i informacje o studni. Przeciągnij ikonę "Utwórz zestaw danych" do metody (Rysunek 2), kliknij ją, aby otworzyć okno dialogowe, wybierz "Odczyt z pliku" i wybierz "AB_BC.csv" (Tabela 2 utworzona w 2.4), zaznacz "Rozdzielany przecinkami" i "Plik ma wiersz nagłówka".
Uwaga: W oknie Podgląd pliku powinny być widoczne nazwy przeciwciał (AB) i odczyty kodów kreskowych (BC). - W tym samym oknie dialogowym "Utwórz zestaw danych" w wersji 3.1.25 wybierz "VM1" dla lokalizacji sprzętu laboratoryjnego i "0" dla głębokości stosu, wybierz "Dopasuj identyfikator próbki" i użyj pola "BC", aby dopasować do zestawu danych "BC_Read". Wybierz "AB" i "BC" dla "Zestawy danych do utworzenia" (Rysunek 6).
- Przeciągnij ikonę "VisionMate Move" do metody (Rysunek 2) i określ przejście z pozycji czytnika kodów kreskowych "VM1" z powrotem do początkowej pozycji pokładu na pokładzie.
Uwaga: Poniższe kroki 3.1.28-3.1.33 określą krok transferu dla "Koktajlu bazowego". - Przeciągnij ikonę "Lista robocza" (Rysunek 2) i przejdź do pliku listy roboczej "Base_CT_P50" (Tabela 3) utworzonego w 3.1.1. Zaznacz "Zapętl całą listę roboczą".
- Przeciągnij ikonę "Transfer" bezpośrednio pod ikonę "Lista robocza" (Rysunek 2).
- Kliknij ikonę "Przelej", aby otworzyć pole specyfikacji. Wybierz tylko jedną z sond, końcówki filtrowane przez P50 LLS, wybierz "rozładuj je" po zakończeniu transferu i zaznacz "Zmień końcówki między transferami". Dodaj źródło, klikając "Kliknij tutaj, aby dodać źródło", wybierz "Matrix_OneML_TubeRack" jako oprogramowanie laboratoryjne i wybierz lokalizację na pokładzie według nazwy "AB_BOX".
- W polu specyfikacji dla "Transferu" "Powiększ" na schemacie 96 dołków, klikając prawym przyciskiem myszy i wybierz "AB" natychmiast po "Użyj zestawu danych" i wybierz, gdzie jego wartości "są równe" i "= AB_NAME". Wybierz wybraną technikę transferu.
Uwaga: Zdecydowanie zaleca się stosowanie LLS, aby uniknąć wytrącania się zanieczyszczeń w pobliżu dna. - W polu specyfikacji dla "Transferu" wybierz miejsce docelowe, klikając "Kliknij tutaj, aby dodać miejsce docelowe", kliknij prawym przyciskiem myszy, aby powiększyć i wybierz "SmallTuberack_microfugetubes" jako sprzęt laboratoryjny, objętość jako "=VOL" i lokalizację na pokładzie według nazwy "BASE_CT". Po pomniejszeniu kliknij ponownie prawym przyciskiem myszy, zaznacz "Określ zaznaczenie jako tekst" i zaznacz "Określ cele za pomocą poniższego wyrażenia:" i wpisz "=WELL_BASE" jako zmienną dla pozycji pokładu docelowego.
- Powtórz 3.1.29-3.1.32 podobnie dla "Koktajlu bazowego" z końcówkami P200, wybierając plik csv "Base_CT_P200" (Tabela 4), a następnie wybierz końcówki z filtrem P200 LLS, a także odpowiednią technikę pipetowania dla końcówek z filtrem P200 LLS.
Uwaga: Poniższe kroki 3.1.34 i 3.1.35 definiują krok transferu dla "Koktajlu aktywacyjnego". - Powtórz 3.1.29-3.1.32 podobnie dla "Koktajlu aktywacyjnego" z końcówkami P50, wybierając plik csv "ACT_CT_P50" (Tabela 5) i wybierając "ACT_CT" jako miejsce docelowe. Kliknij prawym przyciskiem myszy miejsce docelowe i zaznacz "Określ zaznaczenie jako tekst". Zaznacz "Określ cele za pomocą poniższego wyrażenia:" i wpisz "=WELL_ACT" jako zmienną dla pozycji docelowej.
- Powtórz 3.1.34 podobnie dla "Koktajlu aktywacyjnego" z końcówkami P200, wybierając plik csv "ACT_CT_P200" (Tabela 6) i filtrowane końcówki P200 LLS.
Uwaga: Metodę przygotowania "Koktajlu bazowego" i "Koktajlu aktywacyjnego" można zamknąć po zapisaniu.
- Korzystając z oprogramowania arkusza kalkulacyjnego, utwórz arkusz kalkulacyjny zawierający informacje o nazwach przeciwciał (AB_NAME), lokalizacji probówki docelowej (WELL-BASE lub WELL-ACT) i objętości (VOL) w μl dla "Koktajlu bazowego" z końcówkami P50 (BASE_CT_P50: Tabela 3) lub P200 (BASE_CT_P200: Tabela 4) i "Koktajlu aktywacyjnego" z końcówkami P50 (ACT_CT_P50: Tabela 5) lub końcówki P200 (ACT_CT_P200: Tabela 6). Zapisz je jako pliki csv. W przypadku lokalizacji "WELL-BASE" i "WELL-ACT" należy zapoznać się z liczbami na rysunku 3.
- Stwórz nową metodę wytwarzania "Mistrzowskiego koktajlu przeciwciał", łącząc "Koktajl bazowy" i "Koktajl aktywacyjny" w 5 ml probówkach z polistyrenu o okrągłym dnie (Rysunek 7).
Uwaga: Poniższe kroki 3.2.1-3.2.6 definiują sprzęt laboratoryjny: stojak na probówki z probówkami z polistyrenu o okrągłym dnie o pojemności 5 ml. Numery mają charakter poglądowy. Badacze powinni określić i dostosować się do instrumentu.- Na pasku narzędzi w sekcji "Projekt" wybierz "Edytor typów oprogramowania laboratoryjnego". Kliknij prawym przyciskiem myszy obiekt dla 24-pozycyjnego stojaka, wybierz "Kopiuj" i wpisz "BiocisionCoolRack_XT" w wyskakującym okienku.
- Kliknij dwukrotnie obiekt "BiocisionCoolRack_XT", aby otworzyć okno dialogowe.
- Podświetl "Informacje podstawowe", ustaw 12.78 cm (X) i 8.57 cm (Y) dla "Rozpiętość" i 7.93 cm dla "Wysokości".
- Podświetl "Well_1". Ustaw w następujący sposób: "Dobrze przesunięty"; 1,55 cm (X) i 1,33 cm (Y), "Well Count"; 6 (x) i 4 (y), "odstępy między studzienkami"; 1,95 (X) i 1,97 (Y), "Maksymalna głośność"; 2 000 μl, Format"; Zwykły, "Colum 2 Offset"; 0 i "Głośność domyślna"; 0.
- Otwórz "Konfigurację studni", aby edytować. Ustaw w następujący sposób: "Kształt"; okrągły, "górny promień"; 0,5375 cm, "Dolny promień"; 0,48 cm i "wysokość"; 7,07 cm. Zaznacz "Dolna sekcja" i ustaw "Kształt"; Półkula i "promień"; 0,45 cm.
Uwaga: Poniższe kroki 3.2.6-3.2.7 definiują kroki transferu i są używane w kroku 3.2.14. - Utwórz plik csv "AB_MACT" (Tabela 7) do przygotowania koktajlu przeciwciał z następującymi nagłówkami: a) "SRC_BASE"; nazwa urządzenia laboratoryjnego dla "Koktajlu bazowego", b) "WELL_BASE"; lokalizacje studni w sprzęcie laboratoryjnym dla "Koktajlu bazowego", c) "VOL_BASE"; objętość transferowa dla "Koktajlu bazowego" w μl, d) "SRC_ACT"; nazwa oprogramowania laboratoryjnego dla "Koktajlu Aktywacji", e) "WELL_ACT"; lokalizacje studni w sprzęcie laboratoryjnym dla "Koktajlu aktywacyjnego", f) "VOL_ACT"; objętość transferu dla "Koktajlu aktywacyjnego" w μl, g) "DEST_MACT"; informacje o pozycji pokładu dla "Master Antibody Cocktail" oraz h) "WELL_MACT"; informacje o położeniu studni w stojaku na probówki dla "Master Antibody Cocktail".
- Proszę wypełnić informacje pod nagłówkami utworzonymi w ppkt 3.2.6) (Tabela 7) w następujący sposób: a) użyć "BASE_CT" pod SRC_BASE, b) dobrze wymienić informacje o lokalizacji "WELL_BASE", jak pokazano na rysunku 3A, c) podać całkowitą objętość przeciwciał (25 μl buforu + suma wszystkich mian przeciwciał zasadowych dla barwienia pojedynczego) pod "VOL_BASE", d) użyć "ACT_CT" pod SRC_ACT, e) dobrze wymienić informacje o lokalizacji dla "WELL_BASE", jak pokazano na rysunku 3B, f) podać całkowitą objętość przeciwciał (25 μl buforu + suma wszystkich mian przeciwciał aktywacyjnych dla pojedynczego barwienia) pod "VOL_ACT". Przenieść 25 μl buforu dla T-Cell FM3. Patrz Tabela 1 dla testów 1-3, g) użyj "SPL_TUBES_1" (patrz 3.2.10) dla "DEST_MACT" i h) wyświetl informacje o lokalizacji studni dla "WELL_MACT", jak pokazano na rysunku 8.
Uwaga: Następujące kroki 3.2.8-3.2.15 zaprogramują metodę wytwarzania "Mistrzowskiego Koktajlu Przeciwciał" - Otwórz nową metodę (Rysunek 7).
- Przeciągnij ikonę "Instrument Setup" (Ustawienia instrumentu) do nowej metody (Rysunek 7).
- W polu specyfikacji "Konfiguracja instrumentu" przeciągnij ikony końcówek P1000, dwie "SmallTuberack_microfugetubes" i "BiocisionCoolRack_XT" na schemat pokładu. Otwórz okno dialogowe dla dwóch "SmallTuberack_microfugetubes" i nazw odpowiednio "BASE_CT" i "ACT_CT", jak określono w 3.1.17. Otwórz okno dialogowe dla "BiocisionCoolRack_XT" i nazwij "SPL_TUBES_1", jak określono w 3.2.7 (Rysunek 9).
- Dodaj nową "Grupę", przeciągając ikonę "Grupa" do metody (Rysunek 7).
- Przeciągnij ikonę "Przenieś z pliku" bezpośrednio pod ikonę "Grupa", aby przenieść "Koktajl bazowy" w celu przygotowania "Koktajlu Mistrza Przeciwciał" (Rysunek 7).
- W polu specyfikacji "Przenieś z pliku" wybierz używane końcówki P1000, wybierz "rozładuj je" po zakończeniu transferu i zaznacz "Zmień końcówki między transferami".
- W polu specyfikacji "Transfer z pliku" wybierz plik "AB_MACT" (Tabela 7), przeglądając, zaznacz "Plik ma wiersz nagłówka". Wybierz "SRC_BASE" dla pozycji źródłowego sprzętu laboratoryjnego i "WELL_BASE" dla informacji o odwiercie w źródłowym oprogramowaniu laboratoryjnym, wybierz "DEST_MACT" dla docelowego sprzętu laboratoryjnego i "WELL_MACT" dla informacji o studzience w docelowym oprogramowaniu laboratoryjnym i wybierz "VOL_BASE" dla informacji o objętości (Rysunek 10). Wybierz odpowiednią technikę transferu dla końcówek P1000.
Uwaga: LLS może nie być konieczny do tego procesu. - Dodaj kolejny "Przenieś z pliku", przeciągając go bezpośrednio pod "Grupę", aby przenieść "Koktajl aktywacyjny", który ma zostać zmieszany z "Koktajlem podstawowym" w celu przygotowania "Głównego koktajlu przeciwciał" (Rysunek 7). Podobnie ustaw krok transferu, jak w 3.2.13 i 3.2.14. Wyjątki są następujące: a) Wybierz "SRC_ACT" dla pozycji źródłowego oprogramowania laboratoryjnego, b) "WELL_ACT" dla informacji o odwiercie w źródłowym oprogramowaniu laboratoryjnym i c) "VOL_ACT" dla informacji o objętości.
4. Procedura operacyjna
- Najpierw kliknij dwukrotnie ikonę oprogramowania, aby uruchomić czytnik kodów kreskowych 2D na komputerze.
- Następnie kliknij dwukrotnie ikonę oprogramowania, aby uruchomić automatyczną obsługę płynów na komputerze.
- W sekcji "Instrument" wybierz "Home All Axes", aby zalać strzykawki automatycznego urządzenia do obsługi cieczy. Upewnij się, że wszystkie strzykawki nie zawierają widocznych pęcherzyków powietrza.
Uwaga: "Home All Axes" da również instrumentowi punkt odniesienia, z którego będzie mógł wykonywać kolejne ruchy. - Otwórz metodę przygotowania "Koktajlu bazowego" i "Koktajlu aktywacyjnego" (Rysunek 2) w oprogramowaniu automatycznego urządzenia do obsługi cieczy.
- Umieść probówki do mikrofuge w "SmallTuberack_microfugetubes" dla "BASE_CT" i "ACT_CT" zgodnie z numerem "Koktajlu bazowego" i "Koktajlu aktywacyjnego", które mają zostać wykonane (Rysunek 3). Następnie umieść je na pokładzie zgodnie z "Konfiguracją instrumentów" (Rysunek 5).
- Umieść zbiornik z buforem na pokładzie zgodnie z "Ustawieniami instrumentu".
- Odkręć probówki z kodami kreskowymi 2D zawierające przeciwciała za pomocą 8-kanałowego odkręcacza z nakrętką. Trzymaj nakrętki w dokładnej kolejności na tacce na nakrętki, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego. Umieść "Matrix_OneML_TubeRack" na pokładzie zgodnie z "Ustawieniami instrumentów" (Rysunek 5).
- Umieść końcówki z filtrem P50 LLS, końcówki z filtrem P200 LLS i końcówki P1000 na pokładzie zgodnie z "Konfiguracją instrumentu" (Rysunek 5).
- Uruchom metodę, klikając zieloną ikonę startową w kształcie trójkąta. Zgodnie z monitem w wyskakującym okienku upewnij się, że wszystkie elementy na pokładzie są zgodne z "Konfiguracją instrumentu" zdefiniowaną w metodzie. Nie umieszczaj na pokładzie żadnych przedmiotów, które nie są wymienione w "Ustawieniach instrumentu", ponieważ może to zmiażdżyć kapsułę i/lub chwytak. Naciśnij "OK", aby kontynuować.
- Po przeniesieniu "Matrix_OneML_TubeRack" do czytnika kodów kreskowych 2D i odczytaniu kodów kreskowych, kolejne wyskakujące okienko zapyta, czy wszystkie kody kreskowe zostały odczytane. Kontynuuj, naciskając "OK" po potwierdzeniu.
- Po zakończeniu przenoszenia przez automatyczną ładowarkę do cieczy, ponownie zamknąć probówki z kodami kreskowymi 2D za pomocą 8-kanałowego odkręcacza z nakrętką i umieścić je z powrotem w temperaturze 4 °C.
- Energicznie wiruj wszystkie probówki do mikrofug przez 20 sekund i włóż je z powrotem do stojaków na probówki.
Uwaga: Niewystarczające wirowanie może spowodować nieoptymalne zabarwienie komórek. - Zamknij metodę przygotowania "Koktajlu bazowego" i "Koktajlu aktywacyjnego". Następnie otwórz metodę przygotowania "Mistrzowskiego koktajlu przeciwciał".
- Ustaw wstępnie oznakowane rurki z polistyrenu o pojemności 5 ml z okrągłym dnem na "BiocisionCoolRack_XT" (Rysunek 8) i umieść je na pokładzie. Na etykietach należy wskazać, jakie "Koktajl Baza" i "Koktajl Aktywacyjny" są mieszane, a także odpowiedni identyfikator pacjenta.
- Umieść na pokładzie stojaki na probówki na końcówki "Base Cocktail", "Activation Cocktail" i P1000 (Rysunek 9). Uruchom metodę (Rysunek 7). Zgodnie z monitem wyświetlanym w wyskakującym okienku upewnij się, że elementy na pokładzie są zgodne z konfiguracją instrumentalną w metodzie (Rysunek 9). Naciśnij "OK", aby kontynuować.
- Po zakończeniu powyższego procesu ręcznie dodaj 50 μl próbek krwi do każdej 5 ml probówki z polistyrenu o okrągłym dnie, która zawiera koktajl przeciwciał.
- Wirować probówki z próbkami w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Uważaj, aby nie rozlewać krwi po bokach probówek, ponieważ spowoduje to niespójne barwienie. Ostrożnie usuń wszelkie smugi krwi za pomocą wacików zwilżonych buforem do płukania.
- Dodać ręcznie 1 ml buforu do lizy RBC i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
- Dodać 2 ml buforu przepływowego do przemywania (0,1% azydku sodu, 1% BSA, 10 U/ml heparyny w 1x HBSS) i wirować przez 5 minut przy 400 x g. Wyrzucić supernatant do komory bezpieczeństwa biologicznego klasy II. Powtórz ten proces prania. Ponownie zawiesić poplamione komórki w 0,5 ml buforu do przemywania przepływowego.
- Ustaw cytometr przepływowy, który jest wyposażony w lasery do mąki i odpowiednie filtry, a następnie uruchom próbki za pomocą 5 ml okrągłodennych rurek polistyrenowych. Do zbierania danych należy stosować standardowe metody kalibracji cytometru i kompensacji fluorescencji12,15. Zebrać wszystkie parametry wymienione w "FLUOROFOR" w tabeli 1.
Uwaga: w każdym cyklu należy stosować odpowiednie materiały kontrolne, aby zapewnić właściwą wydajność testu. - Po uruchomieniu próbek wyeksportuj uzyskane dane jako pliki fcs.
- Analizuj dane za pomocą odpowiedniego oprogramowania. Zidentyfikuj podzbiory limfocytów T za pomocą strategii bramkowania opisanej przez Human Immunology Project1.
Wyniki
Celem immunofenotypowania krwi pełnej jest uzyskanie informacji ilościowych (wyznaczenie podgrup komórek odpornościowych) oraz jakościowych (wykrycie stanu aktywacji) na temat komórek odpornościowych. Nieznacznie zmodyfikowaliśmy panel do immunofenotypowania limfocytów T zaproponowany przez Human Immunology Project1, aby poprawić ogólną wydajność naszej metody (Tabela 1). Nasz panel limfocytów T ma na celu identyfikację limfocytów T naiwnych, pamięci centralnej (CM), pamięci efektorowej (EM) oraz limfocytów T efektorowych. W skrócie, dublety różnicujemy na podstawie parametrów FCS-A i FCS-H. Następnie wyznaczamy bramkę dla limfocytów na podstawie rozpraszania bocznego oraz poziomów CD45. Limfocyty T są następnie identyfikowane na podstawie ekspresji CD3. Limfocyty T CD3+ są różnicowane na limfocyty T γδ oraz limfocyty T αβ. Limfocyty T αβ są dalej dzielone na limfocyty T CD4+ i CD8+. Następnie analizuje się podgrupy limfocytów T CD4+ i CD8+ na podstawie ekspresji CD45RA i CCR7: limfocyty T CM CD45RA-CCR7+, naiwne CD45RA+CCR7+, efektorowe CD45RA+CCR7- oraz limfocyty T EM CD45RA-CCR7-1. Dodatkowo monitorujemy ekspresję markerów aktywacji, takich jak CD38, HLA-DR, ICOS, PD-1, GITR, 4-1BB, CD69, NKG2D i OX40, aby uzyskać informacje jakościowe.
Aby zademonstrować precyzję tej metody, próbki krwi obwodowej od 4 zdrowych dawców barwiono 5 razy w ciągu jednego dnia. Rycina 11 przedstawia zależność między procentowym udziałem subpopulacji limfocytów T w bramkowanych limfocytach a procentowym współczynnikiem zmienności (%CV). Szczegółowy podział procentowych subpopulacji limfocytów T w bramkowanych limfocytach oraz %CV dla każdego podzbioru przedstawiono w Tabeli 8. Dla uproszczenia w Rycynie 11 i Tabeli 8 nie uwzględniono danych z testów 2 i 3. Sugerowano, aby kryterium akceptacji dla testów fenotypowych biomarkerów do celów badawczych wynosiło mniej niż 25% CV między seriami (precyzja międzyanalizowa)10. Wszystkie pomiary spełniły to kryterium, z wyjątkiem komórek ICOS+ γδ T (26,64-46,39%, Tabela 8) oraz komórek ICOS+ CD8 T (14,64-58,39%, Tabela 8). Wartości te przedstawiono w celach demonstracyjnych. Nie wykorzystujemy tych pomiarów, ponieważ ICOS odgrywa główną rolę przede wszystkim w aktywacji limfocytów T CD416. Tendencję do wyższego %CV w populacjach stanowiących niski odsetek całkowitej populacji zaobserwowano również w innych badaniach7. W przypadku, gdy badacze są zainteresowani monitorowaniem rzadkich zdarzeń, liczbę analizowanych komórek należy zwiększyć, aby zniwelować większą impreczyjność17. Wspólnie nasze dane wykazują pomyślne wdrożenie automatyzacji w przygotowaniu próbek do immunofenotypowania krwi obwodowej.
Rycina 1. Schemat immunofenotypowania z wykorzystaniem pełnej krwi obwodowej. Przedstawiono krok po kroku przebieg analizy immunofenotypowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 2. Przegląd metody przygotowania „Base Cocktail” oraz „Activation Cocktail”. Przedstawiono kroki metody przygotowania „Base Cocktail” i „Activation Cocktail” w oprogramowaniu dla automatycznego systemu pipetującego. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.
Rysunek 3. Układ statywu do probówek z BACE_CT i ACT_CT. (A) przedstawia układ statywu do probówek „BACE_CT”. (B) przedstawia układ statywu do probówek „ACT_CT”. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 4. Definiowanie sprzętu laboratoryjnego dla statywu z probówkami z kodami kreskowymi 2D. Proces definiowania statywu z probówkami z kodami kreskowymi 2D krok po kroku. Aby wyświetlić większą wersję tej ryciny, kliknij tutaj.
Rysunek 5. Konfiguracja instrumentu dla metody przygotowania „Base Cocktail” i „Activation Cocktail”. Przedstawiono układ pokładu dla metody przygotowania „Base Cocktail” i „Activation Cocktail”. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 6. Konfiguracja dla funkcji „Create Data Set”. Przedstawiono szczegółowe ustawienia dla funkcji „Create Data Set”. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.
Rycina 7. Przegląd metody przygotowania „Głównego Koktajlu Przeciwciał”. Przedstawiono kroki metody przygotowania „Głównego Koktajlu Przeciwciał” w oprogramowaniu automatycznego robota do pipetowania. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.
Rysunek 8. Układ statywu z probówkami polistyrenowymi o dnie okrągłym o pojemności 5 ml. Przedstawiono układ dla statywu z probówkami „SPL_TUBES_1”. FM3 oznacza fluorescencję minus 3 (brilliant violet 421, fykoerytryna i allofikocyjanina). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 9. Konfiguracja instrumentu dla metody przygotowania „Głównego koktajlu przeciwciał” (Master Antibody Cocktail). Przedstawiono układ pokładu dla metody przygotowania „Głównego koktajlu przeciwciał” (Master Antibody Cocktail). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 10. Konfiguracja funkcji „Transfer From File”. Przedstawiono szczegółowe ustawienia dla funkcji „Transfer From File”. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 11. Niska zmienność w półautomatycznym immunofenotypowaniu krwi pełnej. Pojedyncze wartości CV dla wszystkich analizowanych populacji komórek od czterech zdrowych dawców przedstawiono jako niebieskie otwarte okręgi. Krzywa regresji zaznaczona jest niebieską linią. Czerwone linie przerywane wskazują 95% przedziały ufności, a zielone linie przerywane wskazują 95% przedziały predykcji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 12. Przykład nieoptymalnego barwienia. Barwienie przeprowadzono z odpowiednim lub niewystarczającym mieszaniem w wibratorze probówek do mikrocentryfugi z próbek „BACE_CT” i „ACT_CT”. W panelu B widoczne są dwie bramkowane populacje. Mniejsza populacja z niską intensywnością barwienia CD45 reprezentuje komórki, które nie zostały optymalnie zabarwione. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.
| GRUPA | MARKER | FLUOROFOR | Klon | MIANO (µl/barwienie) | |
| KOKTAJL PODSTAWOWY | TCELL | CD45 | FITC | 2D1 | 0.4 |
| CD3 | Alexa700 | UCHT1 | 1 | ||
| CD8 | APC-H7 | SK1 | 0.4 | ||
| CD4 | PerCP-CY5.5 | SK3 | 2 | ||
| CCR7 | PE-CF594 | 150503 | 1 | ||
| CD45RA | PE-Cy7 | L48 | 1 | ||
| TCRab | BV786 | T10B9.1A-31 | 1 | ||
| TCRgd | BV650 | B1 | 5 | ||
| KOKTAJL AKTYWACYJNY-1 | TEST1 | HLA-DR | BV421 | G46-6 | 5 |
| CD278(ICOS) | PE | DX29 | 5 | ||
| CD38 | APC | HB7 | 1 | ||
| KOKTAJL AKTYWACYJNY-2 | TEST2 | CD279(PD1) | BV421 | EH12.1 | 2.5 |
| CD357(GITR) | PE | eBioAITR | 5 | ||
| CD137(41BB) | APC | 4B4-1 | 10 | ||
| KOKTAJL AKTYWACYJNY-3 | TEST3 | CD69 | BV421 | FN50 | 1 |
| CD314(NKG2D) | PE | 1D11 | 2 | ||
| CD134(OX40) | APC | ACT35 | 5 |
Tabela 1. Lista przeciwciał dla zmodyfikowanego panelu limfocytów T.
| Przeciwciało | Numer katalogowy |
| CD45_FITC | 0163562388 |
| CD3_Alexa700 | 0163562110 |
| CD4_PerCP_CY5.5 | 0163562364 |
| CD8_APC-H7 | 0163562363 |
| CCR7_PE-CF594 | 0163562387 |
| CD45RA_PE-Cy7 | 0163562091 |
| TCRab_BV786 | 0163562069 |
| TCRgd_BV650 | 0163562108 |
| A_HLA-DR_BV421 | 0163562339 |
| A_CD278(ICOS)_PE | 0163562082 |
| A_CD38_APC | 0163562317 |
| A_CD279(PD1)_BV421 | 0163562340 |
| A_CD357(GITR)_PE | 0163562093 |
| A_CD137(41BB)_APC | 0163562315 |
| A_CD69_BV421 | 0163562341 |
| A_CD314(NKG2D)_PE | 0163562314 |
| A_CD134(OX40)_APC | 0163562316 |
Tabela 2. Nazwy przeciwciał wraz z numerami kodów 2D.
| GRUPA | DNO_STUDZIAK ÓW | NAZWA_PRZECIAŁA | OBJĘTOŚĆ |
| TCELL | 1 | CD8_APC-H7 | 7.2 |
| TCELL | 1 | CD45_FITC | 7.2 |
| TCELL | 1 | CD3_Alexa700 | 18 |
| TCELL | 1 | CCR7_PE-CF594 | 18 |
| TCELL | 1 | CD45RA_PE-Cy7 | 18 |
| TCELL | 1 | TCRab_BV786 | 18 |
Tabela 3. Plik "BASE_CT_P50": nazwy przeciwciał i informacje o objętości.
| GRUPA | DNO_STUDZIEŃKI | NAZWA_PRZECIAŁA | OB.OBJĘTOŚCI |
| TCELL | 1 | CD4_PerCP_CY5.5 | 36 |
| TCELL | 1 | TCRgd_BV650 | 90 |
Tabela 4. Plik „BASE_CT_P200”: nazwy przeciwciał i informacje o objętości.
| GRUPA | AKTYW_DOŁKA | NAZWA_PRZACIĄŁA | OBIETOŚĆ |
| TEST1 | 7 | A_HLA-DR_BV421 | 30 |
| TEST1 | 7 | A_CD278(ICOS)_PE | 30 |
| TEST1 | 7 | A_CD38_APC | 6 |
| TEST2 | 13 | A_CD279(PD1)_BV421 | 15 |
| TEST2 | 13 | A_CD357(GITR)_PE | 30 |
| TEST3 | 19 | A_CD314(NKG2D)_PE | 12 |
| TEST3 | 19 | A_CD69_BV421 | 6 |
| TEST3 | 19 | A_CD134(OX40)_APC | 30 |
Tabela 5. Plik „ACT_ CT_P50”: nazwy przeciwciał i informacje o objętości.
| GRUPA | AKTYWACJA_STUDNI | NAZWA_PRZECIWCIAŁA | TOM |
| TEST2 | 13 | A_CD137(41BB)_APC | 60 |
Tabela 6. Plik „ACT_CT _P200”: nazwy przeciwciał i informacje o objętości.
| DAWCY# | Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. PODSTAWA | KOKTAJL PODSTAWOWY | dołek Baza | TOM_ PODSTAWA | SRC_ACT | ACTI- VATION KOKTAJL | dołek ACT | VOL_ACT | DEST_MACT | dołek MACT | |
| HD001 | PODSTAWOWA_TK | limfocyt T | 1 | 36.8 | ACT_CT | FM3 | 1 | 25 | PROBÓWKI_SPL_1 | 1 | |
| HD001 | PODSTAWOWA_TK | TCELL | 1 | 36.8 | ACT_CT | TEST1 | 7 | 36 | PROBÓWKI_SPL_1 | 7 | |
| HD001 | PODSTAWOWA_TK | TCELL | 1 | 36.8 | ACT_CT | TEST2 | 13 | 42.5 | PROBÓWKI_SPL_1 | 13 | |
| HD001 | PODSTAWOWA_TK | TCELL | 1 | 36.8 | ACT_CT | TEST3 | 19 | 33 | PROBÓWKI_SPL_1 | 19 | |
| HD002 | PODSTAWOWA_TK | TCELL | 1 | 36.8 | ACT_CT | FM3 | 1 | 25 | PROBÓWKI_SPL_1 | 2 | |
| HD002 | PODSTAWOWA_TK | TCELL | 1 | 36.8 | ACT_CT | TEST1 | 7 | 36 | PROBÓWKI_SPL_1 | 8 | |
| HD002 | PODSTAWOWA_TK | limfocyty T | 1 | 36.8 | ACT_CT | TEST2 | 13 | 42.5 | PROBÓWKI_SPL_1 | 14 | |
| HD002 | PODSTAWOWA_TK | limfocyt T | 1 | 36.8 | ACT_CT | TEST3 | 19 | 33 | PROBÓWKI_SPL_1 | 20 | |
| HD003 | PODSTAWOWA_TK | TCELL | 1 | 36.8 | ACT_CT | FM3 | 1 | 25 | PROBÓWKI_SPL_1 | 3 | |
| HD003 | PODSTAWOWA_TK | TCELL | 1 | 36.8 | ACT_CT | TEST1 | 7 | 36 | PROBÓWKI_SPL_1 | 9 | |
| HD003 | PODSTAWOWA_TK | TCELL | 1 | 36.8 | ACT_CT | TEST2 | 13 | 42.5 | PROBÓWKI_SPL_1 | 15 | |
| HD003 | PODSTAWOWA_TK | TCELL | 1 | 36.8 | ACT_CT | TEST3 | 19 | 33 | PROBÓWKI_SPL_1 | 21 | |
| HD004 | PODSTAWOWA_TK | TCELL | 1 | 36.8 | ACT_CT | FM3 | 1 | 25 | PROBÓWKI_SPL_1 | 4 | |
| HD004 | PODSTAWOWA_TK | TCELL | 1 | 36.8 | ACT_CT | TEST1 | 7 | 36 | PROBÓWKI_SPL_1 | 10 | |
| HD004 | PODSTAWOWY_TK | TCELL | 1 | 36.8 | ACT_CT | TEST2 | 13 | 42.5 | PROBÓWKI_SPL_1 | 16 | |
| HD004 | PODSTAWOWA_TK | LIMFOCYTY T | 1 | 36.8 | ACT_CT | TEST3 | 19 | 33 | PROBÓWKI_SPL_1 | 22 | |
Tabela 7. Plik "AB_MACT": Informacje o źródle i celu dla "Master Antibody Cocktail".
| Numer populacji na Rys. 1 | i | ii | iii | iv | v | |
| Nazwa populacji | CD3+ | limfocyty T αβ | limfocyty T γδ | CD3+CD4+ | CD3+CD8+ | |
| % limfocytów | Zdrowy dawca nr 1 | 79.80 | 75.20 | 2.70 | 49.60 | 22.30 |
| Zdrowy dawca nr 2 | 69.40 | 61.90 | 5.85 | 44.40 | 16.20 | |
| Zdrowy dawca nr 3 | 75.80 | 69.60 | 4.75 | 42.00 | 23.50 | |
| Zdrowy dawca nr 4 | 77.20 | 73.50 | 1.98 | 52.70 | 18.90 | |
| %CV | Zdrowy dawca nr 1 | 1.42 | 1.58 | 3.70 | 2.50 | 1.56 |
| Zdrowy dawca nr 2 | 2.48 | 2.39 | 5.74 | 2.82 | 2.41 | |
| Zdrowy dawca nr 3 | 1.15 | 1.40 | 6.32 | 1.42 | 2.72 | |
| Zdrowy dawca nr 4 | 0.81 | 0.94 | 5.45 | 1.20 | 1.44 | |
| Średnia | 1.47 | 1.58 | 5.30 | 1.99 | 2.03 | |
| Odchylenie standardowe | 0.72 | 0.61 | 1.13 | 0.79 | 0.63 |
Tabela 8. Surowe dane dotyczące % limfocytów oraz % CV dla każdej subpopulacji przedstawione na Ryc. 4. Należy zauważyć, że dane dla Testów 2 i 3 nie zostały przedstawione na Ryc. 5 i w Tabeli 8 w celu uproszczenia prezentacji danych.
Dyskusja
Immunofenotypowanie krwi obwodowej ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wglądu w indywidualne reakcje na immunoterapię. Wyzwanie polega na standaryzacji testów w celu kontrolowania zmienności między eksperymentami1,14. Jednym z głównych źródeł zmienności jest manipulacja próbkami przez człowieka. W związku z tym można sobie wyobrazić, że częściowa lub pełna automatyzacja przetwarzania próbek ułatwi radykalne zmniejszenie zmienności między eksperymentami1,14. W tym protokole informujemy o naszych udanych wysiłkach na rzecz zminimalizowania zmienności testu poprzez wprowadzenie zautomatyzowanego urządzenia do obsługi cieczy wyposażonego w czytnik kodów kreskowych 2D do barwienia próbek w immunofenotypowaniu krwi pełnej.
Pod względem projektowym nasza metoda jest wszechstronna i może monitorować inne podgrupy odpornościowe, dodając dodatkowe "koktajle bazowe" w celu ich zdefiniowania. Takie podzbiory obejmują limfocyty pomocnicze T, limfocyty regulatorowe T, limfocyty B, komórki NK, komórki dendrytyczne i monocyty (manuskrypt w przygotowaniu)18. Dostosowaliśmy zalecane przez konsorcjum panele przeciwciał poprzez wprowadzenie dodatkowych markerów1. Populacje komórek zidentyfikowano za pomocą "koktajlu bazowego" sprzężonego z fluorochromami z minimalną emisją do detektorów fioletu brylantowego 421 (BV421), fikoerytryny (PE) i allofikocyjaniny (APC), ponieważ chcieliśmy zarezerwować te kanały do wykrywania indukowalnych antygenów. Cecha ta nie tylko zapewnia najwyższą czułość monitorowania stanu aktywacji komórek odpornościowych, ale także umożliwia elastyczną akomodację nowych markerów aktywacji, ponieważ te trzy fluorochromy są najczęściej sprzężone z przeciwciałami przeciwko markerom indukowalnym. Dlatego nasza metoda nadaje się nie tylko do przygotowania koktajli do immunofenotypowania krwi pełnej, ale jest również przydatna do barwienia innych próbek, w tym komórek jednojądrzastych krwi obwodowej i komórek odzyskanych z tkanek zdezagregowanych (np. guza).
Pomyślne wprowadzenie naszej metody wymaga zwrócenia szczególnej uwagi na etapy przygotowania sprzętu laboratoryjnego oraz programowania i wykonywania metody. Przygotowanie probówek z kodami kreskowymi 2D obejmuje etykietowanie etykietami czytelnymi dla człowieka i przeniesienie przeciwciał do wyznaczonych probówek. Aby zapobiec wprowadzaniu błędów, zalecamy zrobienie tego w dwie osoby. Za każdym razem, gdy zmieniasz arkusze kalkulacyjne, badacze powinni sprawdzić, czy metoda działa poprawnie. Wybór odpowiednich metod pipetowania podczas programowania zapewnia pomyślne przenoszenie cieczy. LLS umożliwia pipetowanie bez wytrącania się zanieczyszczeń z dna probówek z przeciwciałami, do czego używamy końcówek przewodzących P50 lub P200. LLS może nie być dobrym rozwiązaniem dla końcówek P1000, ponieważ LLS jest bardziej wrażliwy na końcówki P1000 i czasami jest fałszywie wyzwalany przez obecność pęcherzyków. Wysokości w definicji sprzętu laboratoryjnego powinny być dostosowane do każdego instrumentu, ponieważ może dojść do nieoptymalnego przenoszenia cieczy, na przykład, jeśli nie ma wystarczającej przestrzeni między krawędzią końcówek a dnem rurek. Jak pokazano na rysunku 12, jeśli "Koktajl bazowy" i/lub "Koktajl aktywacyjny" nie są dobrze zawirowane, może to spowodować nieoptymalne barwienie.
Myśleliśmy o użyciu liofilizowanych odczynników do barwienia komórek jako alternatywnego podejścia do zmniejszenia zmienności związanej z dozowaniem odczynników19. Wiadomo jednak, że polimerowe koniugaty jaskrawych barwników fioletowych oddziałują ze sobą, powodując niespecyficzne sygnały. W związku z tym dodanie więcej niż dwóch koniugatów polimerowych (np. BV421 i BV650 itp.) do liofilizowanych odczynników może powodować niespecyficzną sygnalizację (np . wzrost sygnału tła BV650 w populacji BV421+ )20. Co więcej, odczynniki liofilizowane nie są elastyczne w zakresie włączania nowych barwień. Są one zazwyczaj droższe i wymagają zamówienia zbiorczego. Z tych powodów zdecydowaliśmy się na użycie zautomatyzowanej maszyny do obsługi cieczy wyposażonej w rurki z kodami kreskowymi 2D. Chociaż konfiguracja wymaga czasu i wiąże się z początkową inwestycją w zakup urządzenia, w dłuższej perspektywie takie czynniki zostaną zrekompensowane przez zwiększoną produktywność i odtwarzalność testów. W rzeczywistości kilka grup wcześniej zgłosiło udaną integrację zautomatyzowanego urządzenia do obsługi cieczy z ich przepływem pracy immunofenotypowania lub podobnych zastosowań21,22. Zautomatyzowane rozwiązania do analizy cytometrii przepływowej są również dostępne ze źródeł komercyjnych (FACS SPA III, Automated Cocktail Preparation Workstation i FlowStainer). To dodatkowo wskazuje, że istnieje duże zapotrzebowanie na zautomatyzowane przygotowywanie koktajli do immunofenotypowania.
Po opanowaniu tej techniki przewidujemy, że opracowanie w pełni zautomatyzowanego immunofenotypowania krwi pełnej jeszcze bardziej zmniejszy zmienność między eksperymentami i może sprawić, że immunofenotypowanie krwi pełnej będzie możliwe nawet w wieloośrodkowym badaniu klinicznym23. Zaczęliśmy już korzystać z asystenta mycia lyse, aby zautomatyzować etapy lizy i mycia. Przewidujemy również, że automatyczne oznaczanie objętości przeciwciał w probówkach z kodami kreskowymi 2D i śledzenie dozowania odczynników znacznie poprawi odpowiednio inwentaryzację przeciwciał i kontrolę jakości naszej metody.
Oświadczenia
YK, ILG, TLM, WLM, DPH i KSB: Brak sprzecznych interesów finansowych. ANT jest pracownikiem firmy Beckman Coulter, Inc. Publikacja tego artykułu wideo jest sponsorowana przez Beckman Coulter, Inc.
Podziękowania
Dziękujemy Hannah Puzas za pomoc w projektowaniu i konfiguracji systemu oraz Kevinowi Khovananthowi za porady techniczne. Fundusze na te prace zostały zapewnione przez The Hearst Foundations i Providence Portland Medical Foundation.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | Cytometr przepływowy | |
| NXp Span-8 Stacja robocza do automatyzacji laboratorium | Beckman Coulter | A31839 | Stacja robocza do automatyzacji laboratoryjnej |
| Wkładka, Tuba, 11 mm, Biały, do probówek do mikrofug 1,5 ml (opakowanie 25 szt.) | Beckman Coulter | 373696 | Akcesorium do 24-pozycyjnego stojaka na probówki do mikrofugowania. |
| Zestaw LLS | Beckman Coulter | 719262 | Przymocuj spód pokładu w stacji roboczej automatyzacji laboratoryjnej, aby umożliwić wykrywanie poziomu cieczy |
| 24-pozycyjny stojak na probówki | Beckman Coulter | 373661 | Stojak na probówki do przechowywania probówek do mikrofuge do koktajli przeciwciał lub krwi |
| WORKI AUTOKLAWE BIOHAZARD 12 x 24 CALE CZERWONE | LabMart | M111416 | Jednorazowe worki autoklawe do stacji |
| roboczej Automatyki LaboratoryjnejVisionMate Szybki czytnik kodów kreskowych 2D | Thermo Scientific | AB-1850 | Czytnik kodów kreskowych 2D |
| 8-kanałowy ręczny kapsor / decapper z zakrętką | Thermo Scientific | 4105MAT | Do odkręcania i zamykania probówek z kodami kreskowymi 2D |
| Probówki do mikrowirówek | Fisher Scientific | 02-681-335 | Do sporządzania koktajlu lub dostarczania próbki krwi do stacji roboczej automatyzacji laboratoryjnej |
| CoolRack XT CFT24 | biocision | BCS-534 | Do przechowywania probówek. |
| 1,0 ml Matrix ScrewTop Bursztynowe probówki w stojakach zatrzaskowych | Thermo Scientific | 3741AMB | Probówki z kodami kreskowymi 2D do przechowywania przeciwciał sprzężonych z barwnikiem fluorescencyjnym |
| Końcówki Biomek Span-8 P1000, przewodzące, wstępnie sterylne z barierą, 1,025 i mikro; l | Beckman Coulter | 987925 | Wskazówki dotyczące stacji roboczej automatyzacji laboratoryjnej |
| Końcówki Biomek Span-8 P50, przewodzące, wstępnie sterylne z barierą, 50 i mikro; l (Opakowanie 10 stojaków) | Beckman Coulter | B01091 | Wskazówki dotyczące stacji roboczej automatyzacji laboratorium |
| Końcówki Biomek Span-8 P250, przewodzące, wstępnie sterylne z barierą (opakowanie 10 stojaków) | do 394627 redlic Beckman do | roboczej automatyki laboratoryjnej | |
| BD FACS Roztwór lizujący 10x Koncentrat | BD Biosciences | 349202 | Liza RBC |
| Falcon Probówki z polistyrenu okrągłodennego | Fisher Scientific | 14-959-5 | Probówki na próbki |
| Anty-CD45 FITC | BD Biosciences | 347463 | Panel komórek T efektorowych (podstawa) |
| Anty-CD3 Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0038-42 | Panel efektorowych komórek T (podstawa) |
| Anty-CD4 PerCPCy5.5 | BD Biosciences | 341654 | Panel komórek T efektorowych (podstawa) |
| Anty-TCRgd BV650 | BD Biosciences | 564156 | Panel komórek T efektorowych (podstawa) |
| Anty-TCRab BV786 | BD Biosciences | 563825 | Panel komórek T efektorowych (baza) |
| Anty-CD8 APC-H7 | BD Biosciences | 560179 | Panel efektorowych komórek T (podstawa) |
| Anty-CCR7 PE-CF594 | BD Biosciences | 562381 | Panel komórek T efektorowych (podstawa)Panel komórek T |
| anty-CD45RA PE-Cy7 | BD Biosciences | 337167 | Panel komórek T efektorowych (podstawa) |
| Anty-HLA-DR BV421 | BD Panel | 562804 | Effectorowych komórek T (aktywacja) |
| Anty-CD278 (ICOS) PE | BD Biosciences | 557802 | Panel komórek T efektora (aktywacja) |
| Anty-CD38 APC | BD Biosciences | 340439 | Panel efektorowych komórek T (aktywacja) |
| Anty-CD279(PD1) BV421 | BD Biosciences | 562516 | Panel efektorowych komórek T (aktywacja) |
| Anty-CD357(GITR) PE | eBioscience | 12-5875-42 | Panel efektorowych komórek T (aktywacja) |
| Anty-CD137(41BB) APC | BD Biosciences | 550890 | Panel komórek T efektorowych (aktywacja) |
| Anty-CD69 BV421 | BD Biosciences | 562884 | Panel komórek T efektora (aktywacja) |
| Anty-CD314(NKG2D) PE | BD Biosciences | 557940 | Panel efektorowych komórek T (aktywacja) |
| Anty-CD134(OX40) Panel komórek T efektora APC | BioLegend | 350008 | (aktywacja) |
| BD Vacutainer Plastikowe probówki do pobierania krwi z heparyną sodu: Korek konwencjonalny | Fisher Scientific | 02-689-6 | Do pobierania krwi |
| Albumina, surowica bydlęca, frakcja V, RIA i ELISA Klasa | EMD Milipore | 126593 | Do buforu do płukania przepływu |
| Azydek sodu | Sigma-Aldrich | S8032 | Do buforu do płukania przepływu |
| Heparyna, sól sodowa | Affimetrix | 16920 | Do buforu do płukania przepływu |
| Hank' s Zrównoważony roztwór soli (HBSS), 1x, z wapniem, magnezem, bez czerwieni fenolowej | GE Healthcare Life Sciences | SH30588.02 | Do buforu przepływowego |
Bibliografia
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nat. Rev. Immunol. 12 (3), 191-200 (2012).
- Craig, F. E., Foon, K. A. Flow cytometric immunophenotyping for hematologic neoplasms. Blood. 111 (8), 3941-3967 (2008).
- Johansson, U., Bloxham, D., et al. Guidelines on the use of multicolour flow cytometry in the diagnosis of haematological neoplasms. Br. J. Haematol. 165 (4), 455-488 (2014).
- Schnizlein-Bick, C. T., Spritzler, J., et al. Evaluation of TruCount Absolute-Count Tubes for Determining CD4 and CD8 Cell Numbers in Human Immunodeficiency Virus-Positive Adults. Clin. Vaccine Immunol. 7 (3), 336-343 (2000).
- Cossarizza, A., De Biasi, S., et al. Cytometry, immunology, and HIV infection: Three decades of strong interactions. Cytometry A. 83 (8), 680-691 (2013).
- Hensley, T. R., Easter, A. B., et al. Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay. J. Vis. Exp. (67), e4302(2012).
- Streitz, M., Miloud, T., et al. Standardization of whole blood immune phenotype monitoring for clinical trials: panels and methods from the ONE study. Transplant. Res. 2 (1), 17(2013).
- Hensley-McBain, T., Heit, A., De Rosa, S. C., McElrath, M. J., Andersen-Nissen, E. Optimization of a whole blood phenotyping assay for enumeration of peripheral blood leukocyte populations in multicenter clinical trials. J. Immunol. Methods. 411, 23-36 (2014).
- Green, C. L., Brown, L., Stewart, J. J., Xu, Y., Litwin, V., Closkey, T. W. M. Recommendations for the validation of flow cytometric testing during drug development: I instrumentation. J. Immunol. Methods. 363 (2), 104-119 (2011).
- O'Hara, D. M., Xu, Y., Liang, Z., Reddy, M. P., Wu, D. Y., Litwin, V. Recommendations for the validation of flow cytometric testing during drug development: II assays. J. Immunol. Methods. 363 (2), 120-134 (2011).
- Owens, M. A., Vall, H. G., Hurley, A. A., Wormsley, S. B. Validation and quality control of immunophenotyping in clinical flow cytometry. J. Immunol. Methods. 243 (1-2), 33-50 (2000).
- Kalina, T., Flores-Montero, J., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).
- Calvelli, T., Denny, T. N., Paxton, H., Gelman, R., Kagan, J. Guideline for flow cytometric immunophenotyping: a report from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases, Division of AIDS. Cytometry A. 14 (7), 702-715 (1993).
- Biancotto, A., McCoy, J. P. Studying the human immunome: the complexity of comprehensive leukocyte immunophenotyping. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 377, 23-60 (2014).
- Perfetto, S. P., Ambrozak, D., Nguyen, R., Chattopadhyay, P., Roederer, M. Quality assurance for polychromatic flow cytometry. Nat. Protoc. 1 (3), 1522-1530 (2006).
- Yong, P. F. K., Salzer, U., Grimbacher, B. The role of costimulation in antibody deficiencies: ICOS and common variable immunodeficiency. Immunol. Rev. 229 (1), 101-113 (2009).
- Donnenberg, A. D., Donnenberg, V. S. Rare-Event Analysis in Flow Cytometry. Clin. Lab. Med. 27 (3), 627-652 (2007).
- Biancotto, A., Fuchs, J. C., Williams, A., Dagur, P. K., McCoy, J. P. High dimensional flow cytometry for comprehensive leukocyte immunophenotyping (CLIP) in translational research. J. Immunol. Methods. 363 (2), 245-261 (2011).
- Villanova, F., Di Meglio, P., et al. Integration of Lyoplate Based Flow Cytometry and Computational Analysis for Standardized Immunological Biomarker Discovery. PloS One. 8 (7), e65485(2013).
- BD biosciences. Optimizing Experiments Using BD Horizon Brilliant Polymer Conjugates. , (2014).
- Malergue, F., van Agthoven, A., Scifo, C., Egan, D., Strous, G. J. Automation of a Phospho-STAT5 Staining Procedure for Flow Cytometry for Application in Drug Discovery. J. Biomol. Screen. 20 (3), 416-421 (2015).
- Hasan, M., Beitz, B., et al. Semi-automated and standardized cytometric procedures for multi-panel and multi-parametric wholeblood immunophenotyping. Clin. Immunol. 157 (2), 261-276 (2015).
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., et al. A model for harmonizing flow cytometry in clinical trials. Nat. immunol. 11 (11), 975-978 (2010).
Przedruki i uprawnienia
