W tym badaniu pokazano protokół wideo krok po kroku resekcji wierzchołkowej. Resekcja wierzchołkowa jest ostatnio wyróżnionym podejściem chirurgicznym w badaniach nad regeneracją serca u ssaków. Badanie to może promować zastosowanie resekcji wierzchołkowej jako standardowej metodologii w badaniach nad mechanizmem leżącym u podstaw regeneracji serca.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Mysi model resekcji wierzchołkowej do badania wczesnej regeneracji serca ssaków
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Choroby układu krążenia nękają cały świat z powodu intensywnych zmian stylu życia. Regeneracja serca jest bardzo obiecująca, jeśli chodzi o naprawę i odbudowę kardiomiocytów utraconych w wyniku urazów i chorób. W przeciwieństwie do silnej regeneracji serca niektórych niższych kręgowców, serca dorosłych ssaków zazwyczaj wykazują minimalną zdolność do regeneracji i naprawy serca. Jednak ostatnie badania wzbudziły znaczne zainteresowanie naukowe, stwierdzając, że między 1. a 7. dniem po urodzeniu (P1 do P7) serce nowonarodzonego myszy zachowuje znaczny potencjał regeneracyjny po resekcji wierzchołkowej (tj. Amputacji chirurgicznej i odsłonięciu wierzchołka lewej komory). Jedną z głównych kontrowersji związanych z tym odkryciem może być różnorodność procedur związanych z chirurgią stosowanych w wysiłkach na rzecz powtórzenia lub rozszerzenia tego ważnego odkrycia. Instrukcje te dynamicznie prezentują materiały i metodologię resekcji wierzchołkowej w modelu mysim. Najważniejsze etapy tej operacji przetrwania gryzoni obejmują hipotermię, znieczulenie, torakotomię, chirurgiczną amputację wierzchołka komory serca oraz zszycie i powrót do zdrowia myszy. Opisane podejście może poszerzyć zastosowanie mysiego modelu resekcji wierzchołkowej do badań sercowo-naczyniowych.
Wprowadzenie
Przedłużona długość życia ludzkiego prowadzi do różnych chorób związanych ze starzeniem się i stylem życia, w tym niewydolności serca, która jest główną przyczyną śmiertelności. Jednak bez zastąpienia utraconych lub dysfunkcyjnych komórek mięśnia sercowego, obecne terapie mogą tylko przejściowo poprawić czynność serca1, 2. Dlatego konieczne jest odkrycie i opracowanie innowacyjnych strategii regeneracji i naprawy serca. Serce dorosłego ssaka ma ograniczony potencjał regeneracyjny. Badania przeprowadzone na niższych kręgowcach, takich jak urodele i ryby teleostowe, dostarczyły bezprecedensowych informacji na temat mechanizmów molekularnych i komórkowych leżących u podstaw regeneracji serca3, 4. Niedawno pojawił się mysi model regeneracji serca u noworodków, który może umożliwić identyfikację i scharakteryzowanie bardziej ewolucyjnie zachowanych zdarzeń patofizjologicznych wymaganych do regeneracji ludzkiego serca5.
Resekcja wierzchołkowa odnosi się do chirurgicznego usunięcia wierzchołka lewej komory. Ta procedura jest ograniczona do myszy w wieku od 1 do 7 dni (P1 do P7) ze względu na jej wysoką śmiertelność u starszych myszy6. Oczekuje się, że proces regeneracji serca u nowonarodzonych myszy po resekcji wierzchołkowej będzie następujący: (I) szybkie i skuteczne tworzenie krwiaka w celu uszczelnienia wierzchołka i zapobieżenia wykrwawieniu; (II) regeneracja kardiomiocytów i przywrócenie funkcji skurczowej5, 7. Niedawne prace wywołały debatę na temat znaczenia i skuteczności tego modelu8-11. Dlatego ważne jest, aby przedstawić resekcję wierzchołkową w sposób jasny i szczegółowy. W tym celu niniejszy protokół obrazowo i szczegółowo opisuje film pokazujący, jak przeprowadziłem resekcję wierzchołkową w oparciu o poprzedni protokół6.
Zrozumienie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw regeneracji serca ma kluczowe znaczenie w leczeniu chorób serca charakteryzujących się utratą i/lub uszkodzeniem kardiomiocytów, takich jak niewydolność serca1, 2. Biorąc pod uwagę obecny i obiecujący postęp w resekcji wierzchołkowej w badaniach nad regeneracją serca, badanie to może promować stosowanie tej techniki i jej zastosowań w badaniach nad regeneracją serca.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty na myszach zostały zatwierdzone przez Program Opieki i Użytkowania Zwierząt w Narodowym Instytucie Zdrowia (NIH) z numerem protokołu H0083R3. NHLBI IACUC zatwierdziło protokół bez środków przeciwbólowych.
1. Hipotermia Anestezjologiczna u nowonarodzonych myszy
- Przed zabiegiem wysterylizuj gąbki i sprzęt chirurgiczny w autoklawie. Przygotuj wszystkie materiały chirurgiczne i włącz sterylizator z gorącymi kulkami 15-20 minut wcześniej, aby osiągnąć temperaturę od 240°C do 270°C.
- Przenieś wszystkie szczenięta C57BL/6 (w wieku P1) od karmiącej matki do czystej klatki dla myszy ze świeżą ściółką i materiałami do gniazdowania. Gdy szczenięta zostaną zabrane na salę operacyjną, należy niezwłocznie wykonać operację wierzchołkową, aby zminimalizować czas spędzony z dala od matki i zmniejszyć ryzyko kanibalizacji matki.
- Połóż gąbki na podłożu lodowym, a następnie umieść jedno szczenię na gąbce na ~ 3 minuty, aby uzyskać znieczulenie hipotermią. Potwierdź znieczulenie, obserwując bezdech i akinezję oraz szczypiąc tylną stopę. Często sprawdzaj stan noworodków, ponieważ zbyt krótki czas nie sprawi, że szczenię stanie się kinetyczne i bezdechowe, a zbyt długi czas znieczulenia może obniżyć wskaźnik przeżycia12.
2. Torakotomia
- Przenieś szczeniaka z lodowego łóżka na stół chirurgiczny i użyj taśmy, aby unieruchomić jego ręce, nogi i ogon w pozycji leżącej.
- Zdezynfekuj klatkę piersiową za pomocą betadyny i delikatnie wyczyść ją za pomocą wacika nasączonego 70% alkoholem.
- Wykonaj poprzeczne nacięcie skóry wzdłuż czwartego obszaru międzyżebrowego jamy klatki piersiowej za pomocą nożyczek sprężynowych Vannas, a następnie tępo wypreparuj czwarte mięśnie międzyżebrowe, aby ułatwić dostęp do serca.
UWAGA: Wskaźniki przeżycia poprawiają się, gdy utrata krwi jest zminimalizowana podczas procesu chirurgicznego.
3. Chirurgiczna amputacja wierzchołka komory serca
- Ręcznie delikatnie uciskaj brzuch, aby uwydatnić wierzchołek serca. Wchłoń krew wokół obszaru operacyjnego za pomocą sterylnych aplikatorów z bawełnianą końcówką, aby uzyskać wyraźną wizualizację. W przypadku pozorowanych noworodków kontrolnych przejdź bezpośrednio do Kroku 4 (Szycie i odzyskiwanie myszy).
- Pod lampą powiększającą i za pomocą nożyczek do irydektomii delikatnie wykonać fragmentaryczną resekcję lewej komory (LV) aż do odsłonięcia komory LV. Należy uważać, aby zminimalizować wycięte części LV. Konieczne jest około 15% resekcji, aby uzyskać optymalną ekspozycję komory LV.
- Upewnij się, że serce wraca do jamy klatki piersiowej po odsłonięciu komory LV.
4. Zakładanie szwów i odzyskiwanie myszy
- Zszyj żebra i mięśnie razem, aby uszczelnić jamę klatki piersiowej za pomocą sterylnych szwów Proline 6-0, a następnie ostrożnie zamknij miejsce nacięcia skóry za pomocą kleju do skóry.
- Ogrzej noworodka pod lampą grzewczą przez ~ 3 minuty w celu regeneracji, a następnie oczyść ślady krwi i kleju za pomocą wacika do przygotowania 70% alkoholu przed ponownym wprowadzeniem go do rodzeństwa. Postaraj się wykonać całą procedurę chirurgiczną w ciągu 10 minut, ponieważ zminimalizowanie czasu spędzonego z dala od matki poprawia przeżywalność młodego po resekcji wierzchołkowej.
- Po każdym zabiegu umieść narzędzia chirurgiczne w kontakcie ze kulkami sterylizatora z gorącymi kulkami na około 20 sekund w celu całkowitej sterylizacji. Poczekaj, aż narzędzia chirurgiczne ostygną do RT przed każdym zabiegiem.
- Po zakończeniu operacji dla wszystkich szczeniąt w miocie, wymieszaj szczenięta z pościelą i odchodami matki przed powrotem do gniazda matki.
UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, myszy ICR / CD-1 są lepszymi matkami zastępczymi niż C57BL / 6, ale nawet wśród matek karmiących o tym samym pochodzeniu genetycznym instynkty wychowawcze różnią się. Jeśli zmiana matki karmiącej jest konieczna w celu zmniejszenia śmiertelności w wyniku kanibalizacji matki, należy przenieść młode P0 do matki karmiącej, a następnie wykonać resekcję wierzchołkową w P1. Operację pozorowaną lub resekcję wierzchołkową należy wykonywać tylko w jednym miocie młodych, ponieważ mieszanie szczeniąt pozorowanych i chirurgicznych może zmniejszyć przeżywalność chirurgicznej grupy szczeniąt6.
5. Analiza pooperacyjna
- Jednego dnia po zabiegu monitoruj młode, upewnij się, że nie ma różnicy między grupą pozorowaną a chirurgiczną i policz liczbę szczeniąt, aby zmierzyć wskaźnik przeżycia. Jeśli operacje są wykonywane prawidłowo, wskaźniki przeżycia powinny być podobne i większe niż 60% zarówno w grupie pozorowanej, jak i chirurgicznej.
- Izolacja i fiksacja serca.
- Eutanazja szczeniąt w 1 i 2 dniu po operacji poprzez dekapitację i 21 dzień po operacji za pomocą CO2 z gwarancją śmierci przez zwichnięcie szyjki macicy, a następnie oczyść klatkę piersiową za pomocą preparatu nasącego 70% alkoholem.
- Naciąć linię środkową skóry i mięśnia klatki piersiowej, a następnie otwórz klatkę piersiową.
- Wyciąć całe serca z jamy klatki piersiowej i utrwalić całe serce każdej próbki w 5 ml 4% paraformaldehydu O/N w temperaturze pokojowej.
- Następnego dnia przenieś próbki do 70% etanolu. Próbki można przechowywać do tygodnia przed zatopieniem parafiny.
- Przeciąć skrawki parafiny o grubości 5 μm przez całą komorę i wykonać standardowe barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) oraz trichromem Massona w celu zbadania odpowiedzi regeneracyjnej5, 7. W szczególności barwnik H&E służy do badania wymiany mięśni, a barwnik trichromowy Massona służy do badania reakcji zwłóknieniowych5.
- Wybierz obszar zainteresowania i ustaw ręcznie co najmniej trzy ogniska na próbkę za pomocą skanera do slajdów. Zobrazuj i przeanalizuj szkiełka barwiące w powiększeniu 40× zgodnie z instrukcjami producenta z domyślnymi parametrami.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Szczenięta myszy uśmiercano 1, 2 i 21 dni po resekcji koniuszka, a ich serca pobierano do barwienia H&E oraz barwienia trichromem Massona. Niebieski kolor w barwieniu trichromem Massona wskazuje na odkładanie się macierzy zewnątrzkomórkowej osierdzia5. Przy udanej resekcji koniuszka, jeden dzień po zabiegu, w celu zamknięcia LV skutecznie tworzy się skrzep krwi, co pokazano na Rysunku 1A. Obserwuje się stopniową resorpcję skrzepu krwi oraz wczesne włóknienie serca, a następnie zastąpienie ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Regeneracja serca wykazuje potencjał w leczeniu i profilaktyce niewydolności serca1, 2. Modele zwierzęce są niezbędne i odgrywają kluczową rolę w zrozumieniu, w jaki sposób zachodzi regeneracja serca3-6. Wiele i ryb regeneruje tkankę serca w odpowiedzi na uraz, co zapewnia wgląd w nasze zrozumienie chorób sercowo-naczyniowych u ludzi13, 14. Jednak z punktu widzenia ewolucji patofizjologia powinna być bardziej zachowana między modelem mysim a człowiekiem. Regeneracja serca w modelach zwier...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Opłaty za publikację tego artykułu zostały ufundowane przez dar od Fine Science Tools dla dr Jian Hou.
Podziękowania
Autorzy dziękują doktorom Jamesowi Hawkinsowi, Zu-Xi Yu i Xuan Qu z Narodowego Instytutu Serca, Płuc i Krwi (NHLBI) za pomoc w chirurgii na myszach oraz przygotowaniu i barwieniu skrawków parafiny. Autorzy są wdzięczni Radzie Redakcyjnej NIH Fellows za pomoc redakcyjną.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Uchwyty do igieł Olsen-Hegar z nożyczkami, 1,5 mm | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| Nożyczki sprężynowe Vannas - 2 mm Krawędź tnąca | Narzędzia do nauki | 15000-03 | Nożyczki do irydektomii |
| Sterylizator gorących koralików | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Kleszczyki do tęczówki, proste, ząbkowane | Fine Science Tools | 11064-07 | |
| Kleszcze do tęczówki, Zakrzywione, ząbkowane | narzędzia naukowe | 11065-07 | |
| Nożyczki shea - zakrzywione / - / 12 cm | Narzędzia naukowe | 14105-12 | |
| Kleszcze do wiązania szwów z okrągłymi uchwytami, proste | narzędzia do nauki | 18025-12 | |
| Nożyczki sprężynowe Vannas z okrągłym uchwytem | Narzędzia do nauki | 15400-12 | |
| hemostacie | 13007-12 | ||
| Lampa powiększająca | Luxolamp Corp | IM120 | |
| Lampa grzewcza | Brandt Equipment llc | 51152/3 | |
| 6-0 Nici prolenowe | Ethicon | 8889H | |
| Klej do skóry-Klej tkankowy Vetbond | 3M | 1469 | |
| Sterylne aplikatory z bawełnianą końcówką | Dynarex | 4305 | |
| WEBCOL Podkładka alkoholowa | Covidien | 6818 | Medium 2 PLY, 200/PUDEŁKO, nasycona 70% alkoholem izopropylowym |
| Gąbki uniwersalne Curity | Covidien | 9024 | Włóknina 4 PLY, 4 "x4" (10,2 cm i razy; 10,2 cm) |
| Arkusz ochraniacza na stół | KIMTECH SCIENCE | 7546 | 18 "x 19,5" (45,72 cm x 49,53 cm) x 50 |
| 0,9% Chlorek sodu, 250 ml | Hospira Inc. | NDC 0409-6138-22 | |
| Waciki w roztworze betadyny | Purdue Products L.P. | NDC 67618-153-03 | |
| Autoklaw | TOMY Biologia cyfrowa | SX-700 | WYSOKOCIŚNIENIOWY STERYLIZATOR PAROWY |
| Skaner slajdów | HAMAMATSU | NanoZoomer 2.0-RS |
Bibliografia
- Lin, Z., Pu, W. T. Strategies for cardiac regeneration and repair. Sci Transl Med. 6, 231-239 (2014).
- Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. Mending broken hearts: cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 14, 529-541 (2013).
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R. Turning back the cardiac regenerative clock: lessons from the neonate. Trends Cardiovasc Med. 22, 128-133 (2012).
- Porrello, E. R., Olson, E. N. A neonatal blueprint for cardiac regeneration. Stem Cell Res. 13, 556-570 (2014).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331, 1078-1080 (2011).
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nat Protoc. 9, 305-311 (2014).
- Allen, T. C. Armed Forces Institute of Pathology. Hematoxylin and eosin. Laboratory methods in Histotechnology. Prophet, E. B., Mills, B., Arrington, J. B., Sobin, L. H. , American Registry of Pathology. Washington DC. 53-58 (1992).
- Andersen, D. C., Ganesalingam, S., Jensen, C. H., Sheikh, S. P. Do neonatal mouse hearts regenerate following heart apex resection? Stem cell reports. 2, 406-413 (2014).
- Kotlikoff, M. I., Hesse, M., Fleischmann, B. K. Comment on 'Do neonatal mouse hearts regenerate following heart apex resection?'. Stem cell reports. 3, 2(2014).
- Sadek, H. A., et al. Multi-investigator letter on reproducibility of neonatal heart regeneration following apical resection. Stem cell reports. 3, 1(2014).
- Andersen, D. C., Jensen, C. H., Sheikh, S. P., et al. Response to Sadek et al. and Kotlikoff et al. Stem cell reports. 3, 3-4 (2014).
- Phifer, C. B., Terry, L. M. Use of hypothermia for general anesthesia in preweanling rodents. Physiol Behav. 38, 887-890 (1986).
- Laflamme, M. A., Murry, C. E. Regenerating the heart. Nat Biotechnol. 23, 845-856 (2005).
- Laflamme, M. A., Murry, C. E. Heart regeneration. Nature. , 326-335 (2011).
- Jesty, S. A., et al. c-kit+ precursors support postinfarction myogenesis in the neonatal, but not adult, heart. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 13380-13385 (2012).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138, 1663-1674 (2011).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
