Artykuł metodologiczny

Model urazu kompresyjnego rdzenia kręgowego u noworodków myszy

DOI:

10.3791/53498

⸱

27 marca 2016

 ,  , 
1Department of Neurosurgery, Oslo University Hospital, 2Norwegian Center for Stem Cell Research, Oslo University Hospital, 3Laboratory of Neural Development and Optical Recording (NDEVOR), Department of Physiology, Institute of Basic Medical Sciences, University of Oslo

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł opisuje metodę generowania powtarzalnego uszkodzenia kompresyjnego rdzenia kręgowego (SCI) u noworodka myszy. Model ten stanowi korzystną platformę do badania mechanizmów plastyczności adaptacyjnej, które leżą u podstaw spontanicznej odbudowy funkcjonalnej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uraz rdzenia kręgowego (SCI) zazwyczaj powoduje wyniszczające deficyty neurologiczne, szczególnie poprzez uszkodzenie włókien schodzących z mózgu do rdzenia kręgowego. Główny obszar badań koncentruje się obecnie na mechanizmach plastyczności adaptacyjnej, które leżą u podstaw spontanicznego lub indukowanego powrotu do sprawności funkcjonalnej po SCI. Spontaniczna regeneracja funkcjonalna jest większa we wczesnym okresie życia, co rodzi interesujące pytania o to, jak plastyczność adaptacyjna zmienia się wraz z rozwojem rdzenia kręgowego. Aby ułatwić badanie tej dynamiki, opracowaliśmy model SCI u noworodków myszy. Model ten ma znaczenie dla dziecięcego SCI, który jest zbyt słabo badany. Ponieważ plastyczność neuronalna u osoby dorosłej obejmuje niektóre z tych samych mechanizmów, co plastyczność neuronalna we wczesnym okresie życia1, model ten może potencjalnie mieć pewne znaczenie również dla dorosłego SCI. Tutaj opisujemy całą procedurę generowania powtarzalnego uszkodzenia ucisku rdzenia kręgowego (SCC) u noworodka myszy już w 1. dniu po urodzeniu (P). SCC uzyskuje się poprzez wykonanie laminektomii na danym poziomie kręgosłupa (tutaj opisanym na poziomie klatki piersiowej 9-11), a następnie użycie zmodyfikowanego miniklipsa tętniaka Yasargil w celu szybkiego kompresji i odbarczenia rdzenia kręgowego. Jak opisano wcześniej, uszkodzone noworodki myszy mogą być testowane pod kątem deficytów behawioralnych lub poświęcane do analizy fizjologicznej ex vivo połączeń synaptycznych przy użyciu elektrofizjologicznych i wysokoprzepustowych technik zapisu optycznego1. Wcześniejsze i trwające badania z wykorzystaniem oceny behawioralnej i fizjologicznej wykazały dramatyczne, ostre upośledzenie motoryki kończyn tylnych, po którym następuje całkowite odzyskanie funkcji w ciągu 2 tygodni oraz pierwsze dowody na zmiany w obwodach funkcjonalnych na poziomie zidentyfikowanych zstępujących połączeń synaptycznych1.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatniej dekady, coraz więcej dowodów uzyskanych z różnych modeli urazów rdzenia kręgowego (SCI) pokazało, że sieci rdzeniowe mogą się spontanicznie reorganizować, przyczyniając się do powrotu do sprawności1-9. W konsekwencji plastyczność adaptacyjna stała się ważnym tematem w badaniach nad SCI. Wykazano, że plastyczność obejmuje odrastanie oszczędzonych aksonów, kiełkowanie nowych pobocznych aksonów i tworzenie nowych połączeń synaptycznych. Duża część tej wiedzy została uzyskana z badań behawioralnych lub anatomicznych na dorosłych zwierzętach. Istotnym ograniczeniem badań rdzenia kręgowego u dorosłych jest trudność w wykonaniu wysokoprzepustowej oceny fizjologicznej, która jest łatwiejsza w przypadku preparatów noworodkowych1. Jedną z głównych różnic jest to, że preparaty ex vivo w całości z pnia mózgu i rdzenia kręgowego u dorosłych mają niską żywotność. Innym jest to, że dorosła tkanka rdzenia kręgowego jest bardziej nieprzezroczysta dla światła, ponieważ jest grubsza i mielinowa. Chociaż ostatnie postępy w obrazowaniu in vivo (patrz na przykład 10-12) mogą częściowo przezwyciężyć te problemy, możliwość wykonania wysokoprzepustowego obrazowania na dowolnej żądanej głębokości grzbietowo-brzusznej w wielu miejscach wzdłuż danego preparatu pnia mózgu i rdzenia kręgowego jest obecnie możliwa tylko u noworodków. Niedojrzały stan mielinizacji aksonów w rdzeniu kręgowym noworodka ułatwia wysokoprzepustowy zapis optyczny ex vivo, umożliwiając w ten sposób dynamiczną ocenę funkcjonalnych połączeń synaptycznych13-17. W połączeniu z genetycznie kodowanymi reporterami wapnia oraz narzędziami do stymulacji optogenetycznej i farmakologii, podejścia optyczne mogą przyczynić się do głębszego zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw plastyczności adaptacyjnej.

Szacuje się, że od 1 do 10% wszystkich urazów rdzenia kręgowego dotyka niemowląt i dzieciw wieku 18-22 lat. W przeciwieństwie do dorosłego SCI, patogeneza i potencjał spontanicznego powrotu do zdrowia w SCI u dzieci są mniej zbadane. Wykorzystanie modelu SCI u noworodków może zatem dostarczyć więcej informacji na temat SCI u dzieci i przyczynić się do lepszego zrozumienia zaangażowanych mechanizmów patogenetycznych i rekonwalescencji. Co więcej, uważa się, że plastyczność post-SCI wspierająca regenerację funkcjonalną w dorosłym rdzeniu kręgowym obejmuje przynajmniej częściowo te same mechanizmy, które rządzą rozwojem ośrodkowego układu nerwowego, takie jak wzrost aksonów, rozgałęzianie się i tworzenie nowych synaps23-26. W związku z tym zastosowanie modelu SCI u noworodków może dostarczyć ważnych informacji na temat mechanizmów, które działają również w dorosłym rdzeniu kręgowym lub które potencjalnie mogą zostać przywrócone w dorosłym rdzeniu kręgowym (na przykład poprzez wszczepienie komórek lub tkanek płodu lub tkanek zbudowanych de novo z pluripotencjalnych komórek macierzystych) w celu ułatwienia powrotu do zdrowia.

Nowonarodzona mysz stanowi zatem platformę dla integracyjnego, wielometodologicznego podejścia do badania adaptacyjnej plastyczności po urazie rdzenia kręgowego, w której można łatwo zastosować kombinację metod behawioralnych, fizjologicznych, anatomicznych, molekularnych i genetycznych. Ustanowienie ustandaryzowanych modeli urazów noworodków jest ważnym krokiem we wdrażaniu takich badań.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten eksperymentalny protokół został zatwierdzony przez Krajowy Urząd ds. Badań nad Zwierzętami w Norwegii (Forsøksdyrutvalget, lokalny numer zatwierdzenia eksperymentalnego 12.4591) zgodnie z przepisami Unii Europejskiej dotyczącymi opieki nad zwierzętami (Federacja Europejskiego Stowarzyszenia Nauk o Zwierzętach Laboratoryjnych). Starano się zminimalizować liczbę wykorzystywanych zwierząt i ich cierpienie. W artykule opisano procedurę zastosowaną na pourodzeniowych (P) myszach ICR (Imprinting Control Region) typu dzikiego (Jackson, USA) w dniu 1 (Jackson, USA), ale to samo podejście można również zastosować na późniejszych etapach.

1. Konstruowanie systemu znieczulenia gazowego dla noworodków myszy (Rysunek 1)

  1. Zbuduj maskę na nos z końcówki strzykawki. Podłącz go do 3-drogowego kranu z plastikową rurką (Rysunek 1 - czerwona rurka i Rysunek 2A1).
  2. Wywierć mały otwór z boku maski na nos i podłącz go do plastikowej rurki, aby usunąć nadmiar gazu z maski. Zakończyć rurkę albo przy pompie próżniowej ustawionej na lekkie podciśnienie, albo w okapie wyciągowym (Rysunek 1 - jasnozielona rurka).
  3. Wykonać komorę anestezjoterapeutyczną z plastikowej szalki Petriego o wymiarach 150 mm x 25 mm (ryc. 2A2).
    1. Z jednej strony zrób otwór wystarczająco duży, aby pomieścić głowę myszy i maskę na nos.
    2. Po przeciwnej stronie wykonaj dwa mniejsze otwory, przez które można włożyć plastikowe rurki do i z maski na nos (Rysunek 1 - odpowiednio czerwona i jasnozielona rurka).
    3. Zrób trzeci otwór w górnej części pokrywy i przymocuj do niego trzecią plastikową rurkę, która kończy się na pompie próżniowej (Rysunek 1 - ciemnozielona rurka). Celem tej trzeciej rurki jest zapewnienie, że nadmiar gazu, który nie został wychwycony przez wylot z maski na nos, zostanie usunięty.
  4. Zbuduj komorę do spania, robiąc otwór w dnie dowolnego naczynia laboratoryjnego, które jest wystarczająco duże, aby pomieścić mysz i ma gładką i równą krawędź (otwór naczynia musi leżeć równo ze stołem, aby zapobiec wyciekowi gazu). Podłącz otwór w komorze do 3-drogowego kranu z plastikową rurką (Rysunek 1 - brązowa rurka). Umieść komorę spania pod wyciągiem.
  5. Podłącz 3-kierunkowy kran do rurki wylotowej parownika (Rysunek 1 - żółta rurka i Rysunek 2A3).
  6. Podłącz wlot parownika do źródła tlenu (Rysunek 1 - niebieska rurka).

2. Modyfikacja mini-klipsa do tymczasowego tętniaka Yasargil w celu stworzenia narzędzia do kompresji (Rysunek 2 i Tabela 1)

  1. Przymocuj klips mocno do stojaka za pomocą clamp. Używając lupy lornetkowej do kontroli wizualnej, spiłuj zewnętrzną powierzchnię końcówki każdego ostrza klipsa do końcowej grubości około 150 μm za pomocą kamienia do ostrzenia zamontowanego na wiertle (Rysunek 2B i C).
  2. Wykonaj korek do klipsa, przecinając krótki odcinek rurki kapilarnej z polietylenu (Tabela 1) pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą mikronoża (Tabela 1) i umieść go na jednym z ostrzy (Rysunek 2A4 oraz Rysunki 2B i C). Zapobiega to całkowitemu zamknięciu klipsa i tworzy ustandaryzowane wymiary kompresji. Gdy klips jest zamknięty, odległość między ostrzami wynosi około 230 μm. Zrób nowy korek dla każdego eksperymentu, ponieważ materiał polietylenowy może się ściskać podczas użytkowania, co zmieni przestrzeń między ostrzami.
    Uwaga: Napięcie sprężyny klipsa zmniejsza się z czasem, tak że po około 80 ściśnięciach klips nie zamyka się już całkowicie do korka i wymaga wymiany.

3. Przygotowanie przed operacją

  1. Umieść mysz w komorze uśpienia (Rysunek 1) i rozpocznij znieczulenie 4% izofluranem (Rysunek 2A5) odparowanym w czystym tlenie, używając parownika (Rysunek 2A3 i Tabela 1).
  2. Przetestuj odruch wycofania myszy, delikatnie ściskając pajęczynę skóry między palcami cienkimi plastikowymi kleszkami. Rób to ostrożnie, ponieważ nowonarodzone myszy łatwo się zraniły. Zbyt mocne szczypanie powoduje natychmiastowe siniaki. Wykonanie tego testu na początku sedacji wyzwala odruch i zapewnia dobre wskazanie ilości niezbędnej siły.
  3. Po zniesieniu odruchu wyjmij mysz z komory usypiania i umieść ją w pozycji leżącej na stole operacyjnym z pyskiem włożonym do maski na nos, która zapewnia ciągły dopływ 4% izofluranu zmieszanego z czystym tlenem (ryc. 1). Upewnij się, że wkładka rozgrzewająca jest włączona i ustawiona na 37-38 °C, ponieważ hipotermia podczas operacji może być śmiertelna.
  4. Aby uzyskać całkowitą analgezję, należy wstrzyknąć podskórnie 50 μl znieczulenia miejscowego Bupiwakainy (2,5 mg/ml, ryc. 2A6) w miejscu operacji (w opisanych tutaj eksperymentach jest to na poziomie klatki piersiowej (T)9-T11). Do wykonania wstrzyknięcia należy użyć strzykawki insulinowej (300 μl, 30 G, Rysunek 2A7 i Tabela 1).
  5. Zmniejszyć stężenie izofluranu dostarczanego do maski na nos do 1-2%.

4. Laminektomia grzbietowa

  1. Wykonaj operację pod kontrolą mikroskopową.
  2. Po oczyszczeniu obszaru operacyjnego glukonianem chlorheksydyny (Tabela 1 #19) przez co najmniej 30 sekund, wykonaj poprzeczne nacięcie skóry o średnicy 1-2 mm w T9-T11 za pomocą mikronoża (Ryc. 2A8).
    Uwaga: U nowonarodzonych myszy ICR rostralna część żołądka, widoczna, gdy zawiera mleko, jest skierowana w stronę poziomów kręgów T12-T13 (ryc. 3). Kolejnym punktem orientacyjnym jest rostralna część podskórnego agregatu tkanki tłuszczowej klatki piersiowej, która kończy się około T8-9. Ten punkt orientacyjny jest widoczny dopiero po nacięciu skóry.
  3. Za pomocą kleszczy (ryc. 2A9 i A10) poszerzyć otwór skóry w kierunku poprzecznym do 8-9 mm, delikatnie pociągając skórę w kierunku rostralnym i doogonowym (skóra łatwo się rozrywa, tworząc gładką i prostą ranę). Zapewnia to wystarczający dostęp boczny do kręgosłupa.
  4. Wycofaj krawędzie nacięcia skóry z leżących poniżej struktur, wkładając sterylne kawałki hemostatycznej gąbki żelatynowej (ryc. 2A11 i tabela 1) podskórnie rostralne i doogonowe do nacięcia. Powiększa to otwór i zapobiega cofaniu się skóry i zasłanianiu obszaru podczas zabiegu. Hemostatyczną gąbkę żelatynową nie trzeba przed użyciem moczyć w soli fizjologicznej.
  5. Aby odsłonić kręgosłup, należy wypreparować mięśnie przykręgosłupowe za pomocą cienkich nożyczek (ryc. 2A12 i tabela 1). Przeciąć przyczepy mięśni do kręgosłupa i odsłonić blaszkę (ryc. 4A). Należy również pamiętać, że na tym etapie wyrostek rdzeniowy jest słabo rozwinięty.
  6. Zidentyfikuj linię środkową i przetnij poprzecznie między dwiema blaszkami (która na tym etapie jest chrzęstna) cienkimi nożyczkami (ryc. 4B). Ostrożnie umieść jedno ostrze cienkich kleszczyków między blaszką a oponą twardą (ryc. 4C), chwyć blaszkę kleszczami i ostrożnie podnieś ją, aż kawałek oderwie się, pozostawiając oponę twardą nienaruszoną (ryc. 4D). Powtórz to 2-3 razy, aby uzyskać laminektomię o długości 1-2 segmentów.
  7. Używając cienkich kleszczy jako rongeurów, usuń części stawów międzywyrostkowych obustronnie, aby uzyskać wystarczająco dużo miejsca, aby umieścić klips w kanale kręgowym. Oczyść obszar operacyjny i zatamuj krwawienie małymi kawałkami hemostatycznej gąbki żelatynowej.

5. Uraz kompresyjny rdzenia kręgowego

  1. Otwórz zmodyfikowany mini-klips tętniaka w uchwycie zacisku (ryc. 2A13 i ryc. 2B) i umieść ostrza po obu stronach rdzenia kręgowego w przestrzeniach między stawami fasetowymi a rdzeniem. Upewnij się, że ostrza są włożone wystarczająco głęboko, aby wpłynąć na brzuszną część rdzenia kręgowego. Jeśli nie jest to możliwe, usuń więcej połączeń międzywyrostkowych.
  2. Szybko zwolnij mini-klips, przytrzymując go na miejscu za pomocą uchwytu klipsa, aby zapobiec jego przesuwaniu się. Utrzymuj kompresję przez 15 sekund.
  3. Szybko otwórz mini-klips i wyjmij go. Aby uzyskać symetryczną kompresję, odwróć orientację mini-klipsa i używając łatwo widocznego śladu pozostawionego przez obrzęk krwotoczny z pierwszego ucisku jako wskazówki, zmień położenie klipsa w odwrotnej orientacji na drugą 15-sekundową kompresję (wcześniejsze eksperymenty wykazały, że generuje to symetryczne deficyty histologiczne i fizjologiczne, podczas gdy pojedyncze uciskinie 1). Opona twarda nie powinna zostać uszkodzona przez kompresję.
  4. Oczyść obszar i utrzymuj hemostazę za pomocą kawałków hemostatycznej gąbki żelatynowej.
  5. Usuń kawałki hemostatycznej gąbki żelatynowej, które zostały umieszczone pod krawędziami nacięcia skóry na początku zabiegu i zamknij nacięcie skóry sterylnym szwem 6,0 i uchwytem na igłę (ryc. 2A14 i 15).
  6. Wstrzyknąć podskórnie 0,75 mg/kg masy ciała buprenorfiny (ryc. 2A16) rozcieńczonej w sterylnym PBS za pomocą strzykawki insulinowej (300 μl, 30 G).

6. Opieka pooperacyjna

  1. Wyjmij mysz z maski na nos i umieść ją w komorze o kontrolowanej temperaturze ustawionej na 30 °C, aż znieczulenie ustąpi, a mysz stanie się czujna (zwykle wystarcza 1-3 godziny).
  2. Wstrzyknąć diazepam (ryc. 2B17) dootrzewnowo matce (8 g/kg masy ciała). Powoduje to odrętwienie, które zmniejsza ryzyko kanibalizmu podczas pierwszej nocy, kiedy ryzyko to jest najwyższe.
  3. Umieść obsługiwaną mysz z powrotem w śmieciu.
  4. Jeśli miot jest duży (>12 młodych), należy usunąć część nieoperowanych młodych, najlepiej większe zwierzęta, jeśli różnią się wielkością, aby zmniejszyć konkurencję o mleko. Opieka matczyna nad operowanymi młodymi jest najlepsza w linii ICR, jeśli wielkość miotu wynosi około 9 młodych.
  5. W celu leczenia bólu buprenorfinę (0,75 mg/kg masy ciała) podaje się podskórnie raz na dobę w pierwszych dniach po operacji, za pomocą strzykawki insulinowej (300 μl, 30 G). Odpowiednia objętość do wstrzyknięcia podskórnego to 30-50 μl. U nowonarodzonych myszy wokalizacja i pobudzenie są dobrymi wskaźnikami bólu.
  6. Wykonuj codzienne badanie rannych myszy za pomocą arkusza wyników, aby ocenić odżywianie, masę ciała, odwodnienie, ból, gojenie się ran, zatrzymywanie moczu i stan infekcji. Zgodnie z uzyskanym punktem, należy zapewnić specjalną opiekę, taką jak wstrzyknięcia sterylnego roztworu żywieniowego dla dzieci (Tabela 1 #18) w przypadku nieprawidłowego odżywiania. Arkusz wyników określa również kryteria humanitarnego punktu końcowego. Matka, która nie odrzuca rannych szczeniąt, jest najlepszym opiekunem.
  7. W nietypowym przypadku dysfunkcji pęcherza moczowego należy wykonywać masaż pęcherza dwa razy dziennie, aż do przywrócenia funkcji. Odbywa się to poprzez umieszczenie myszy w pozycji leżącej w jednej ręce i delikatne masowanie dolnej części brzucha w kierunku rostro-ogonowym za pomocą opuszka palca.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uraz uciskowy rdzenia kręgowego i utrata funkcji

Jak opisano wcześniej, optymalizując procedury przedoperacyjne, chirurgiczne i pooperacyjne, można uzyskać powtarzalny model kompresji SCI u noworodkówmyszy 1. Zatyczka z polietylenu umieszczona na jednym ostrzu klipsa (rys. 2B i C) zapobiega całkowitemu zamknięciu klipsa i utrzymuje stałą odległość między ostrzami na poziomie około 230 μm. Odwrócenie orientacji klipsa pomiędzy dwoma kompresjami powoduje symetryczne uszkodzenie, oceniane na podstawie następstw histologicznych (ryc. 5A i 1). Natychmiast po usunięciu miniklipsa ściśnięta tkanka rdzenia kręgowego ciemnieje z powodu krwotocznego stłuczenia i obrzęku. Obserwacja seryjnych odcinków uszkodzonego rdzenia kręgowego wybarwionych na obecność eozyny i hematoksyliny już dzień po urazie ujawnia stopniowe pogarszanie się stanu tkanki w miarę zbliżania się do epicentrum zmiany (ryc. 5A). Obecność jam śródrdzeniowych lub krwi w zmianie nie jest niczym niezwykłym.

Ocena behawioralna, na przykład poprzez śledzenie trajektorii kończyn tylnych w warunkach nieobciążających kilka godzin po operacji, pokazuje dramatyczne upośledzenie motoryki kończyn tylnych u myszy z urazami SCC w porównaniu do myszy kontrolnych pozorowanych, u których wykonywana jest tylko laminektomia (Rysunek 5B i 1). Ten test można powtarzać, dopóki mysz nie będzie w stanie wykonać innych testów behawioralnych, które wymagają udźwignięcia własnego ciężaru1.

Śmiertelność i rekonwalescencja po operacji

Śródoperacyjna śmiertelność jest głównie spowodowana bezdechem i zatrzymaniem akcji serca spowodowanym wysokim stężeniem izofluranu potrzebnym do uzyskania wystarczającego znieczulenia. Wprowadzenie miejscowo znieczulającego bupiwakainy do protokołu chirurgicznego pozwala na zmniejszenie stężenia izofluranu, a tym samym znacznie zmniejsza śmiertelność. W niedawnej serii eksperymentalnej obejmującej ponad 20 zwierząt, śmiertelność śródoperacyjna była zerowa. Natomiast na przeżycie pooperacyjne wpływa głównie akceptacja operowanych myszy przez ich matkę. Znacząca poprawa nastąpiła, gdy lęk i agresywność zostały zmniejszone po podaniu pojedynczego wstrzyknięcia Diazepamu (tj. 8 g/kg masy ciała) matce przed powrotem operowanych myszy do miotu1. Akceptację i powrót do zdrowia po operacji operowanych myszy można monitorować dzięki obecności mleka w żołądku. Żołądek myszy P1-P7, która wypiła mleko, jest wyraźnie biały i widoczny przez skórę brzucha (ryc. 3). Porównanie żywienia u myszy operowanych, kontrolnych pozorowanych i nieoperowanych jest przydatne do oceny stanu odżywienia myszy rannych. Ocena wzrostu myszy operowanych i nieoperowanych pokazuje, że pomimo niewielkiej utraty masy ciała w pierwszej dobie po operacji, krzywa wzrostu operowanych myszy szybko się normalizuje (ryc. 6). Śmiertelność związana z dysfunkcją lub infekcją pęcherza moczowego nigdy nie została zaobserwowana nawet u myszy badanych przez 7 tygodni.

Liczba na rys. 2 nazwa Producent/Dostawca Numer referencyjny # Odnośnik komentarz 1 Plastikowa strzykawka (30 lub 50 ml) cyfra arabska Plastikowa szalka Petriego (150 x 25 mm) 3 Waporyzator Fortec isofluran Cyprane http://www.mssmedical.co.uk/products/new-vaporisers/ Używamy starego urządzenia poza produkcją, sprawdź link do nowszego urządzenia 4a Yasargil tymczasowy tętniak mini-klips Æsculap powiedział: FE681K http://www.aesculapusa.com/assets/base/doc/DOC697_Rev_C-Yasargil_Aneurysm_Clip.pdf 4b Rurka kapilarna z polietylenu o małym otworze ID 0,58 mm, średnica zewnętrzna 0,96 mm Smiths Medical 800/100/200 http://www.smiths-medical.com/industrialproducts/8/39/ 5 Izofluran (Forene) Abbott GmbH & Co. KG http://www.life-sciences-europe.com/product/forene-abbott-gmbh-wiesbaden-group-narcotic-germany-west-2001-1858.html 6 Marcain (Bupivacain) Szczepionka AstraZeneca http://www.astrazeneca.co.uk/medicines01/neuroscience/Product/marcaine 7 Strzykawka insulinowa 0,3 ml 30 G x 8mm Firma VWR 80086-442 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4646138 8 Ultra Fine Micro Knife 5 mm krawędź tnąca Narzędzia naukowe Numer katalogowy: 10315-12 http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp=
Kat&suchkatalog=0019900000&reloadmenu=1 9 Bardzo cienkie kleszcze Graefe — końcówka 0,5 mm Narzędzia naukowe Rozdział 1153-10 http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp=
Kat&suchkatalog=0055700000&reloadmenu=1 Nie jest to konieczne, często zęby są za duże 10 Kleszcze SuperGrip Proste Narzędzia naukowe Numer katalogowy: 00632-11 http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp=
Kat&suchkatalog=0053500000&reloadmenu=1 Niezbędne są dwa kleszcze 11 Spongostan Special 70 x 50 x 1 mm Ferrosan (Żelazozan) 12 Nożyczki sprężynowe Vannas — ostrza 2 mm proste Narzędzia naukowe Numer katalogowy: 15000-03 http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp=
Kat&suchkatalog=0012800000&reloadmenu=1 13 Vario Clip Kleszcze do nakładania Aesculap powiedział: FE502T http://www.aesculapusa.com/assets/base/doc/DOC697_Rev_C-Yasargil_Aneurysm_Clip.pdf 14 Vicryl 6-0 (Ethicon) Johnson i Johnson Zobacz materiał J105G 15 Mikro uchwyt na igły Dietricha Numer katalogowy 11-510-20 http://trimed-ltd.com/Products/Suture-Instruments/Micro-Needle-Holders-With-Tungsten-Carbide-Inserts/Ref-11-29.html 16 Temgesic (buprenorfina) Schering-Pług 17 Stesolid (diazepam) Actavis Znany również jako Valium Rozdział 18 Sieć Pedamix Fresenius Kabi http://www.helsebiblioteket.no/retningslinjer/pediatri/mage-tarm-lever-ernæring/parenteral-ernæring Rozdział 19 Klorhexidinsprit (glukonian chlorheksydyny) Fresenius Kabi D08A C02 http://www.felleskatalogen.no/medisin/klorhexidinsprit-fresenius-kabi-klorhexidinsprit-farget-fresenius-kabi-fresenius-kabi-560639

Tabela 1. Lista narzędzi i sprzętu do generowania urazu uciskowego rdzenia kręgowego sterowanego klipsem u noworodka myszy.

Schemat aparatu anestezjologicznego z parownikiem izofluranowym, komorą do spania, maską gazową, pompą próżniową.
Rysunek 1. Schemat konfiguracji znieczulenia. Ten schemat przedstawia zestaw anestezjologiczny przeznaczony dla myszy noworodkowej, z komorą do spania do wstępnego znieczulenia i maską na nos do ciągłego znieczulenia podczas operacji.

Konfiguracja sprzętu chirurgicznego do mikrochirurgii; obejmuje autoklaw, kleszcze, mikroskopy; Diagram z etykietą.
Rysunek 2. Główne narzędzia i klips kompresyjny. (A) Narzędzia używane podczas zabiegu. Numery odpowiadają adnotacji użytej w tabeli 1. (B i C) Mini-klips do tymczasowego tętniaka Yasargil z końcówką każdego ostrza ręcznie przyciętą do grubości około 150 μm. Na jednym z ostrzy umieszcza się korek wykonany z plastra rurki polietylenowej (Tabela 1), aby zapobiec całkowitemu zamknięciu klipsa. Podziałka: 2 mm. Aplikacja: aplikator klipsowy (#12 w A); St: korek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Młode gryzonie, żołądek widocznie wypełniony mlekiem, oznaczony T12-13, schemat badania anatomicznego.
Rysunek 3. Punkt orientacyjny w przedoperacyjnej ocenie poziomu kręgosłupa u noworodków myszy ICR. (A) Widok boczny myszy P1 ICR z białym mlekiem w żołądku. Rostralna część żołądka odpowiada poziomowi kręgosłupa T12-T13. (B) Mysz P1 ICR w narkozie w pozycji leżącej. Chociaż trudniej to sobie wyobrazić niż w (A), żołądek wypełniony mlekiem jest rozpoznawalny. Rostralna część żołądka wskazuje na poziom kręgosłupa T12-T13. Podziałka: 0,5 cm.

Zabieg chirurgiczny przedstawiający usunięcie blaszki w chirurgii kręgosłupa, oznaczony schemat.
Rysunek 4. Laminektomia grzbietowa. (A) Rozwarstwienie mięśni przykręgosłupowych. Należy pamiętać, że w tym wieku wyrostek rdzeniowy jest słabo rozwinięty. (B) Poprzeczne przecięcie blaszki cienkimi nożyczkami. (C) Wprowadzenie jednego ostrza cienkiego kleszcza pomiędzy blaszką a oponą twardą. Punkt wejścia jest pokazany przez grot strzałki. (D) Usunięcie blaszki. Podziałka: 2 mm.

Histologia rdzenia kręgowego, progresja zmiany, wykres śledzenia chodu psa, widoki boczne i brzuszne.
Rysunek 5. Wyniki histologiczne i behawioralne po urazie kompresyjnym rdzenia kręgowego w P1. (A) Barwienie eozyną i hematoksyliną w odcinkach rdzenia kręgowego od zranionej myszy (1 dzień po urazie) w różnej odległości od epicentrum urazu. (B) Reprezentatywne ślady trajektorii kończyn przednich i tylnych obserwowane 6 godzin po urazie lub po pozorowanej laminektomii kontrolnej. Ślady na górze reprezentują trajektorie oglądane z boku zwierzęcia. Ślady na dole reprezentują trajektorie widziane od strony brzusznej zwierzęcia. Patrz także 1. Podziałka skali: 250 μm. DH: róg grzbietowy; L, po lewej; R: prawo; SCC: kompresja rdzenia kręgowego; VH: róg brzuszny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wykres porównawczy wagi poporodowej, grupy kontrolne i SCC, analiza wykresu słupkowego.
Rysunek 6. Porównawcze krzywe wzrostu. Histogram przedstawiający przyrost masy ciała myszy nieoperowanych i uszkodzonych przez SCC od 1. dnia po urodzeniu do 9. dnia po urodzeniu.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule opisano procedury postępowania w przypadku urazu SCC generowanego przez klips u myszy P1. Te same procedury można również wykonać na późniejszych etapach. Urazy kompresyjne przeprowadzono z powodzeniem w P5, P7, P9 i P12 (Züchner i wsp., rękopis w przygotowaniu). Na wszystkich etapach poporodowych znieczulenie ogólne uzyskuje się za pomocą izofluranu odparowanego w czystym tlenie, ale wynik znieczulenia zależy w dużej mierze od wieku. W początkowych próbach P1-P4, przed wprowadzeniem znieczulenia miejscowego do protokołu, trudno było uzyskać głęboką i przedłużoną sedację ze względu na wąskie okno dawka-efekt między niewystarczającą sedacją a przedawkowaniem. Ponadto podniesiono obawy związane z neurotoksycznym działaniem izofluranu u nowonarodzonych zwierząt27-30. Połączenie izofluranu i miejscowo znieczulającego bupiwakainy powoduje głębsze i bardziej stabilne znieczulenie, umożliwiając jednocześnie zmniejszenie dawki izofluranu o współczynnik 2-3. Opisano różne rodzaje znieczulenia u noworodków gryzoni, w tym krioanezjologię31,32, ale jedną z potencjalnych niedogodności krioanestezjologii jest jej działanie neuroprotekcyjne (ocenione przez 33,34), co może skomplikować generowanie skutecznego i powtarzalnego urazu. Uważa się, że znieczulenie oparte na barbituranach ma niższą skuteczność u nowonarodzonych myszy ze względu na niższy poziom albuminy w surowicy i tkanki tłuszczowej niż u dorosłych35,36.

Chociaż jest to dość inwazyjne i traumatyczne, po ustaleniu procedury śmiertelność podczas operacji jest niska. Istnieją jednak krytyczne etapy podczas zabiegu, które wymagają szczególnej uwagi, aby poprawić powrót do zdrowia i przeżycie operowanych myszy. Ważną kwestią jest wybór szczeniąt, które będą miały największe szanse na przeżycie operacji. Gdy miot jest duży, stan odżywienia poszczególnych szczeniąt jest różny. Oprócz nieuniknionego krwawienia, które występuje podczas operacji, operowane szczenięta spędzają godziny z dala od matki i często nie piją mleka przed następnym rankiem. Dlatego korzystne jest wybieranie szczeniąt, które mają już pewną ilość mleka w żołądku. Jest to łatwo widoczne przez skórę brzucha od P0 do P7.

Pierwszej nocy operowane szczenię jest narażone na duże ryzyko kanibalizacji przez matkę. Podczas początkowego rozwoju tego modelu ponad połowa operowanych myszy nie miała już miejsca następnego ranka, z wyraźnymi śladami krwi w klatce. Nekrofagia, kanibalizm i dzieciobójstwo u gryzoni są badane od dziesięcioleci37-40. W tym badaniu kanibalizm był obserwowany tylko raz, ale został uznany za bardziej prawdopodobne wyjaśnienie niż nekrofagia, ponieważ szczenięta, które zostały zwrócone do klatki, były zazwyczaj w tak dobrej kondycji, że śmierć z przyczyn naturalnych w nocy wydawała się nieprawdopodobna. To skłoniło do pomysłu zastosowania odwracalnego środka farmakologicznego, takiego jak Diazepam, w celu zmniejszenia lęku i agresywności u matki (sprawdzone przez 41). Dootrzewnowe wstrzyknięcie diazepamu znacznie poprawiło sytuację, zmniejszając śmiertelność w ciągu pierwszej nocy z ponad 60% do mniej niż 20%.

Zmniejszenie wielkości miotu poprzez ubój i jak najmniejsze naruszanie ściółki po powrocie pooperacyjnym to dodatkowe elementy, które mogą przynieść korzyści operowanym zwierzętom. Jednak pozostawienie z matką tylko operowanych szczeniąt nie jest korzystne. Najlepsza równowaga operowanych/nieoperowanych szczeniąt może się różnić w zależności od linii, ale w przypadku myszy ICR i SCID-ICR pozostawienie 4-5 operowanych szczeniąt (uraz lub pozorowanie) wraz z 3-4 nieoperowanymi młodymi dało najlepsze wyniki.

Ogólnie rzecz biorąc, głównym ograniczeniem tego modelu SCI u noworodków jest to, że rdzeń kręgowy noworodka różni się pod wieloma względami od rdzenia kręgowego dorosłego, a zatem może nie zapewniać wyników eksperymentalnych, które są porównywalne z wynikami uzyskanymi z modeli SCI dla dorosłych. Różnice te obejmują ogólny rozmiar i objętość rdzenia kręgowego, liczbę komórek, niedostateczną reprezentację określonych typów komórek, takich jak oligodendrocyty, niedojrzałe odpowiedzi immunologiczne i niedojrzałe obwody neuronalne. Wnioski płynące z eksperymentów w tym modelu muszą być zatem starannie przemyślane. Z drugiej strony, model ten jest istotny dla stosunkowo mniej zbadanego scenariusza SCI u dzieci. Co więcej, wyraźna słabość w stosunku do modeli SCI u dorosłych jest również potencjalną mocną stroną, ponieważ może pozwolić na wyjaśnienie mechanizmów plastyczności, które, choć w minimalnym stopniu występują w dorosłym rdzeniu kręgowym, mogą stanowić substrat terapeutyczny, jeśli zostaną przywrócone. Można sobie wyobrazić, że przywrócenie stanu noworodkowego, a nawet embrionalnego, może być realizowane poprzez implantację mniej rozwiniętych komórek lub tkanek lub poprzez leczenie odczynnikami, które powodują powstanie dorosłej tkanki o wcześniejszych cechach rozwojowych. Wykorzystanie enzymów do eliminacji sieci okołoneuronalnych jest przykładem tego drugiego podejścia42,43.

Głównym problemem przy ustalaniu modelu zwierzęcego dla SCI jest uzyskanie ustandaryzowanego urazu. Jest to ważny aspekt, który został uwzględniony w wielu modelach SCI, np. przecięcie, hemisekcja, impaktory, ściskanie balonu, zgniatanie kleszczami, ściskanie ciężarem statycznym itp. Jeśli chodzi o urządzenia uderzające, wysiłki w tym kierunku zaowocowały modelami SCI u dorosłych gryzoni, w których można manipulować wieloma parametrami uderzenia, takimi jak prędkość, siła i czas trwania (sprawdzone przez 44). Inne podejście, wymagające mniejszej ilości sprzętu, wykorzystuje modyfikację klipsa do tętniaka Kerra-Lougheeda45,46. Te 2 podejścia są komplementarne, ponieważ impaktor naśladuje uraz spowodowany kontuzją, podczas gdy klips naśladuje uraz kompresyjny z pewnym stopniem współistniejącego niedokrwienia. Ze względu na znaczne ograniczenia rozmiaru i większą podatność nowonarodzonych myszy, wyższą śmiertelność związaną z dłuższymi operacjami, a także koszty opracowania sprzętu na mniejszą skalę, zdecydowano się na opracowanie kompresji generowanej przez klips, a nie kontuzji generowanej przez impaktor. Udało się to osiągnąć poprzez dostosowanie dostępnego na rynku miniklipsa do tętniaka do rozmiaru kręgosłupa nowonarodzonych myszy1. Dodanie korka zapewnia znormalizowaną szerokość kompresji i tak długo, jak napięcie klipsa ściska się do granicy korka, siła ściskania podczas fazy statycznej przy minimalnej szerokości powinna się nieznacznie różnić. To, co nie jest znormalizowane, to prędkość ściskania podczas fazy dynamicznej, ponieważ będzie się ona zmieniać wraz ze zmianami naprężenia klipsa w okresie jego użytkowania. Ponieważ statyczna faza kompresji trwa znacznie dłużej niż faza dynamiczna i niewiele wskazuje na to, że tkanka rdzenia kręgowego wywiera dużą siłę przeciwną przeciwko ostrzom mini-klipsa, jest prawdopodobne, że ciężkość urazu jest najbardziej zależna od fazy statycznej. To jednak pozostaje do przetestowania. Ciężkość urazu może zależeć od wielu czynników, w tym statycznej siły i czasu trwania kompresji, prędkości kompresji i dekompresji, pozycji mini-klipsa oraz liczby uciśnięć wykonanych w tym samym miejscu. W związku z tym kombinatoryczna zmienność tych parametrów może skutkować generowaniem spektrum ciężkości urazów od słabych do ciężkich. Pomimo potencjalnej zmienności, w naszym wcześniej opublikowanym badaniu1 uzyskaliśmy spójne wyniki na poziomie histologicznym, fizjologicznym i behawioralnym, więc niewiele wskazuje na to, że akceptowalna standaryzacja jest trudna do osiągnięcia. Zwracamy uwagę, że w tym badaniu zastosowaliśmy wiele metod walidacji na każdym poziomie, w tym testy behawioralne, takie jak air-stepping, jak pokazano na rysunku 5.

W tym modelu SCI u noworodków uraz oszczędza pewną część aksonów, a tym samym zapewnia sytuację sprzyjającą wywołaniu plastyczności adaptacyjnej poprzez przemodelowanie oszczędzonych połączeń i tworzenie nowych obwodów. Co więcej, ponieważ nowonarodzona mysz dobrze nadaje się do badania wieloma metodami eksperymentalnymi, możliwe jest wykorzystanie tego modelu do badania funkcjonalnego odzyskiwania i plastyczności adaptacyjnej z podejściem integracyjnym, w tym testami behawioralnymi, śledzeniem aksonów wstecznych i następczych, immunohistochemią, elektrofizjologią i wysokoprzepustowym zapisem optycznym1. Jako przykład wykorzystaliśmy to integracyjne podejście, aby zademonstrować ponowne modelowanie sieci na poziomie określonych zstępujących danych wejściowych przy użyciu wysokoprzepustowego obrazowania wapnia w całościowych preparatach ex vivo pnia mózgu i uszkodzonego rdzenia kręgowego1. Można to jeszcze bardziej rozwinąć, wykorzystując narzędzia farmakologii neurooptogenetycznej i optogenetycznej do oceny przebudowy połączeń synaptycznych między określonymi subpopulacjami neuronów rdzeniowych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została wsparta dotacjami z Regionalnego Urzędu ds. Zdrowia Południowo-Wschodniej Norwegii (JLB, 2014119; JCG, numery projektów 2015045 i 2012065), przez Norweską Radę ds. Badań Naukowych (JCG, numer projektu 23 00 00) i Uniwersytet w Oslo.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Plastikowa strzykawka (30 lub 50  ml)
Plastikowa szalka Petriego (150 x 25  mm)
Waporyzator Fortec izofluranowyCypraneUżywamy i starego urządzenia wycofanego z produkcji, sprawdź link do nowszego urządzenia
Yasargil tymczasowy tętniak mini-clipÆ sculapFE681K
Rurka polietylenowa drobnootworowa ID 0,58  mm, OD 0,96  mmSmiths Medical800/100/200
Izofluran (Forene)Abbott GmbH & Co. KG
Marcain (Bupivacain)AstraZeneca
Insuline seyringe 0,3  ml 30  G x 8  mmVWR80086-442
Ultra cienki mikronóż 5  mm krawędź tnącaFine Science Tools10315-12
Ekstra cienkie kleszcze Graefe – 0.5  mm KońcówkaFine Science Tools1153-10Naprawdę nie jest to konieczne, często zęby są za duże
Kleszcze SuperGrip StraightFine Science Tools00632-11Potrzebne są dwa kleszcze
Spongostan Special 70 x 50 x 1  mmFerrosan
Vannas – 2  mm Ostrza Prostenarzędzia do nauki o naprawie15000-03
Vario Clip Kleszcze do nakładaniaAesculapFE502T
Vicryl 6– 0 (Ethicon)Johnson and JohnsonJ105G
Mikroigły11-510-20
Temgesic (buprenorfina)Schering-Plough
Stesolid (diazepam)ActavisZnany również jako Valium
PedamixFresenius Kabi
Klorhexidinsprit (glukonian chlorheksydyny)Fresenius KabiD08A C02
Nożyczki sprężynowe Dithricha

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Boulland, J. -L., Lambert, F. M., Züchner, M., Strom, S., Glover, J. C. A Neonatal Mouse Spinal Cord Injury Model for Assessing Post-Injury Adaptive Plasticity and Human Stem Cell Integration. PLoS ONE. 8 (8), (2013).
  2. Raineteau, O., Schwab, M. E. Plasticity of motor systems after incomplete spinal cord injury. Nat. Rev. Neurosci. 2 (4), 263-273 (2001).
  3. Edgerton, V. R., Tillakaratne, N. J. K., Bigbee, A. J., de Leon, R. D., Roy, R. R. Plasticity of the spinal neural circuitry after injury. Annu. Rev. Neurosci. 27, 145-167 (2004).
  4. Bareyre, F. M., et al. The injured spinal cord spontaneously forms a new intraspinal circuit in adult rats. Nat. Neurosci. 7 (3), 269-277 (2004).
  5. Cai, L. L., et al. Plasticity of functional connectivity in the adult spinal cord. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B., Biol. Sci. 361 (1473), 1635-1646 (2006).
  6. Courtine, G., Song, B., et al. Recovery of supraspinal control of stepping via indirect propriospinal relay connections after spinal cord injury. Nat. Med. 14 (1), 69-74 (2008).
  7. Courtine, G., et al. Transformation of nonfunctional spinal circuits into functional states after the loss of brain input. Nat. Neurosci. 12 (10), 1333-1342 (2009).
  8. Fenrich, K. K., Rose, P. K. Axons with highly branched terminal regions successfully regenerate across spinal midline transections in the adult cat. J. Comp. Neurol. 519 (16), 3240-3258 (2011).
  9. Fenrich, K. K., Rose, P. K. Spinal interneuron axons spontaneously regenerate after spinal cord injury in the adult feline. J. Neurosci. 29 (39), 12145-12158 (2009).
  10. Farrar, M. J., et al. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber. Nat. Methods. 9 (3), 297-302 (2012).
  11. Oshima, Y., et al. Intravital multiphoton fluorescence imaging and optical manipulation of spinal cord in mice, using a compact fiber laser system. Lasers Surg. Med. 46 (7), 563-572 (2014).
  12. Débarre, D., Olivier, N., Supatto, W., Beaurepaire, E. Mitigating phototoxicity during multiphoton microscopy of live Drosophila embryos in the 1.0-1.2 µm wavelength range. PloS One. 9 (8), e104250(2014).
  13. Kasumacic, N., Glover, J. C., Perreault, M. -C. Segmental patterns of vestibular-mediated synaptic inputs to axial and limb motoneurons in the neonatal mouse assessed by optical recording. J. Physiol. 588 (Pt 24), 4905-4925 (2010).
  14. Kasumacic, N., Glover, J. C., Perreault, M. -C. Vestibular-mediated synaptic inputs and pathways to sympathetic preganglionic neurons in the neonatal mouse. J. Physiol. 590 (Pt 22), 5809-5826 (2012).
  15. Szokol, K., Glover, J. C., Perreault, M. -C. Differential origin of reticulospinal drive to motoneurons innervating trunk and hindlimb muscles in the mouse revealed by optical recording. J. Physiol. 586 (Pt 21), 5259-5276 (2008).
  16. Szokol, K., Glover, J. C., Perreault, M. -C. Organization of functional synaptic connections between medullary reticulospinal neurons and lumbar descending commissural interneurons in the neonatal mouse. J. Neurosci. 31 (12), 4731-4742 (2011).
  17. Szokol, K., Perreault, M. -C. Imaging synaptically mediated responses produced by brainstem inputs onto identified spinal neurons in the neonatal mouse. J. Neurosci. Meth. 180 (1), 1-8 (2009).
  18. Pang, D. Spinal cord injury without radiographic abnormality in children, 2 decades later. Neurosurgery. 55 (6), 1325-1342 (2004).
  19. Lee, J. H., Sung, I. Y., Kang, J. Y., Park, S. R. Characteristics of pediatric-onset spinal cord injury. Pediatr. Int. 51 (2), 254-257 (2009).
  20. Parent, S., Mac-Thiong, J. -M., Roy-Beaudry, M., Sosa, J. F., Labelle, H. Spinal cord injury in the pediatric population: a systematic review of the literature. J. Neurotrauma. 28 (8), 1515-1524 (2011).
  21. Basu, S. Spinal injuries in children. Front Neurol. 3, 96(2012).
  22. Chien, L. -C., et al. Age, sex, and socio-economic status affect the incidence of pediatric spinal cord injury: an eleven-year national cohort study. PloS One. 7 (6), e39264(2012).
  23. Maier, I. C., Schwab, M. E. Sprouting, regeneration and circuit formation in the injured spinal cord: factors and activity. Philos. T. R. Soc. Lond. B. 361 (1473), 1611-1634 (2006).
  24. Schwab, M. E., Strittmatter, S. M. Nogo limits neural plasticity and recovery from injury. Curr. Opin. Neurobiol. 27, 53-60 (2014).
  25. Jakeman, L. B., Hoschouer, E. L., Basso, D. M. Injured mice at the gym: review, results and considerations for combining chondroitinase and locomotor exercise to enhance recovery after spinal cord injury. Brain Res. Bull. 84 (4-5), 317-326 (2011).
  26. Rhodes, K., Fawcett, J. Chondroitin sulphate proteoglycans: preventing plasticity or protecting the CNS? J. Anat. 204 (1), 33-48 (2004).
  27. Zhu, C., et al. Isoflurane anesthesia induced persistent, progressive memory impairment, caused a loss of neural stem cells, and reduced neurogenesis in young, but not adult, rodents. J. Cereb. Blood Flow Metab. 30 (5), 1017-1030 (2010).
  28. Loepke, A. W., et al. The effects of neonatal isoflurane exposure in mice on brain cell viability, adult behavior, learning, and memory. Anesth. Analg. 108 (1), 90-104 (2009).
  29. Rothstein, S., Simkins, T., Nunez, J. L. Response to neonatal anesthesia - effect of sex on anatomical and behavioral outcome. Neuroscience. 152 (4), 959-969 (2008).
  30. Rizzi, S., Carter, L. B., Ori, C., Jevtovic-Todorovic, V. Clinical anesthesia causes permanent damage to the fetal guinea pig brain. Brain Pathol. 18 (2), (2008).
  31. Janus, C., Golde, T. The effect of brief neonatal cryoanesthesia on physical development and adult cognitive function in mice. Behav. Brain Res. 259, 253-260 (2014).
  32. Nuñez, J. L., Koss, W. A., Juraska, J. M. Hippocampal anatomy and water maze performance are affected by neonatal cryoanesthesia in rats of both sexes. Horm. Behav. 37 (3), 169-178 (2000).
  33. Batchelor, P. E., et al. Systematic review and meta-analysis of therapeutic hypothermia in animal models of spinal cord injury. PloS one. 8 (8), e71317(2013).
  34. Kwon, B. K., et al. Hypothermia for spinal cord injury. The Spine Journal. 8 (6), 859-874 (2008).
  35. Benjamin, M. M. Outline of veterinary clinical pathology. , 3rd ed, (1978).
  36. Cunningham, M. G., McKay, R. D. G. A hypothermic miniaturized stereotaxic instrument for surgery in newborn rats. J. Neurosci. Methods. 47 (1-2), 105-114 (1993).
  37. Lane-Petter, W. Cannibalism in rats and mice. Proc. R. Soc. Med. 61 (12), 1295-1296 (1968).
  38. Gandelman, R., Simon, N. G. Spontaneous pup-killing by mice in response to large litters. Dev. Psychobiol. 11 (3), 235-241 (1978).
  39. Taylor, G. T. Urinary odors and size protect juvenile laboratory mice from adult male attack. Dev. Psychobiol. 15 (2), 171-186 (1982).
  40. Weber, E. M., Algers, B., Hultgren, J., Olsson, I. A. Pup mortality in laboratory mice -- infanticide or not? Acta Vet Scand. 55 (1), 83(2013).
  41. Crawley, J. N. Exploratory behavior models of anxiety in mice. Neurosci. Biobehav. Rev. 9 (1), 37-44 (1985).
  42. Kwok, J. C. F., Heller, J. P., Zhao, R. -R., Fawcett, J. W. Targeting inhibitory chondroitin sulphate proteoglycans to promote plasticity after injury. Methods Mol. Biol. 1162, 127-138 (2014).
  43. Kwok, J. C. F., Afshari, F., Garcìa-Alìas, G., Fawcett, J. W. Proteoglycans in the central nervous system: plasticity, regeneration and their stimulation with chondroitinase ABC. Restor. Neurol. Neurosci. 26 (2-3), 131-145 (2008).
  44. Young, W. Spinal cord contusion models. Prog. Brain Res. 137, 231-255 (2002).
  45. Rivlin, A. S., Tator, C. H. Regional spinal cord blood flow in rats after severe cord trauma. J. Neurosurg. 49 (6), 844-853 (1978).
  46. Rivlin, A. S., Tator, C. H. Effect of duration of acute spinal cord compression in a new acute cord injury model in the rat. Surg. Neurol. 10 (1), 38-43 (1978).
  47. Joshi, M., Fehlings, M. G. Development and characterization of a novel, graded model of clip compressive spinal cord injury in the mouse: Part 1. Clip design, behavioral outcomes, and histopathology. J. Neurotrauma. 19 (2), 175-190 (2002).
  48. Joshi, M., Fehlings, M. G. Development and characterization of a novel, graded model of clip compressive spinal cord injury in the mouse: Part 2. Quantitative neuroanatomical assessment and analysis of the relationships between axonal tracts, residual tissue, and locomotor recovery. J. Neurotrauma. 19 (2), 191-203 (2002).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Noworodkowy model mysilaminektomia grzbietowaklips do t tniak w Yasargilruchomo ko czyn tylnychplastyczno adaptacyjnaanaliza elektrofizjologicznarejestracja optycznaprocedura chirurgicznaocena behawioralna

Powiązane artykuły