Strategia walidacji roli bramkowania plazmodowego za pośrednictwem kalozy w odpowiedzi tropikalnej

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje metody badania przesiewowego genów kontrolujących przepuszczalność plazmodalną, a tym samym gradient auksyny podczas odpowiedzi tropikalnej. Obejmuje to pomiar stopnia odpowiedzi tropikalnej u hipokotylu Arabidopsis thaliana i sprawdzenie przepuszczalności plazmodalnej przez obciążenie kwasem 8-hydroksypireno-1,3,6-trisulfonowym (HPTS) i wreszcie ocenę poziomu kalozy.

Streszczenie

Roślinny hormon auksyna odgrywa ważną rolę w wielu procesach wzrostu i rozwoju, w tym w tropikalnych reakcjach na światło i grawitację. Ustalenie gradientu auksyny jest kluczowym zdarzeniem prowadzącym do fototropizmu i grawitropizmu. Wcześniej wykazano, że polarny transport auksyny (PAT) ustanawia gradient auksyny w różnych domenach komórkowych roślin. Jednak Han i in. wykazali niedawno, że dla prawidłowego tworzenia gradientu auksyny, plazmodesmalna łączność symplazmatyczna za pośrednictwem modzeli między sąsiednimi komórkami jest również czynnikiem krytycznym. W tym manuskrypcie omówiono strategię wyjaśnienia roli poszczególnych genów, które mogą wpływać na fototropizm i grawitropizm poprzez zmianę łączności symplazmatycznej poprzez modulację syntezy plazmodalnej kalozy. Pierwszym krokiem jest badanie przesiewowe nieprawidłowych reakcji tropikalnych z 3-dniowych etiolowanych siewek mutantów lub linii nadekspresji genu wraz z typem dzikim. To wstępne badanie przesiewowe może prowadzić do identyfikacji szeregu genów funkcjonujących w PAT lub kontrolujących łączność symplazmatyczną. Drugie badanie przesiewowe polega na sortowaniu kandydatów, którzy wykazują zmienione reakcje tropiczne poprzez wpływ na łączność symplazmatyczną. Aby zająć się takimi kandydatami, zbadano ruch znacznika symplazmatycznego i osadzanie się plazmodesmalnej kalozy. Strategia ta byłaby przydatna do zbadania nowych genów kandydujących, które mogą bezpośrednio lub pośrednio regulować łączność symplazmatyczną podczas reakcji tropikalnych i innych procesów rozwojowych.

Wprowadzenie

Rośliny, jako osiadłe organizmy żywe, rozwinęły wysoce wyrafinowaną sieć sygnalizacji międzykomórkowej, aby reagować na różne bodźce środowiskowe. Reakcje tropikalne są jednym ze zjawisk, za pomocą których rośliny reagują na bodźce środowiskowe. Rośliny wykazują dwie główne reakcje tropikalne, fototropizm i grawitropizm. Rośliny fotosyntetyczne zginają się w kierunku źródła światła za pomocą fototropizmu, aby zebrać maksymalną energię. Podobnie grawitropizm sprawia, że rośliny rosną w kierunku środka ciężkości. Podstawowym mechanizmem prowadzącym do takich reakcji tropikalnych jest asymetryczne tworzenie gradientu fitohormonu auksyny¹. Akt lokalnego tworzenia gradientu auksyny jest dobrze scharakteryzowany; Geny, które są zaangażowane w ten mechanizm, stanowią mapę drogową dla działania hormonów^2-8. Specyficzne położenie nośników wypływu auksyny, takich jak PIN-FORMED (PIN) i glikoproteiny P, wykonuje ruch auksyny z cytoplazmy do ściany komórkowej komórek dawcy^9,10. Ponadto, dzięki aktywnej aktywności symportowej H⁺/IAA nośników napływu auksyny, takich jak białka z rodziny AUX1 / LAX, auksyna jest ostatecznie dostarczana do sąsiednich komórek odbiorczych^2,11,12. Ten kierunkowy ruch auksyny jest znany jako polarny transport auksyny (PAT). PAT prowadzi do zróżnicowanej dystrybucji auksyny na różnych etapach rozwoju i w odpowiedzi na różne bodźce środowiskowe^13,14. Co więcej, zakłócenie lokalizacji lub ekspresji któregokolwiek z tych nośników napływu lub wypływu auksyny prowadzi do poważnych zmian w PAT, co powoduje zakłócenie gradientu auksyny, prowadząc do wad rozwojowych. Ostatnio Han i wsp. stwierdzono, że regulacja plazmodesmalna jest również niezbędna do utrzymania gradientu auksyny¹⁵. Do tej pory zidentyfikowano ponad 30 białek plazmodesmalnych¹⁶. Wśród tych białek AtGSL8 został opisany jako kluczowy enzym do syntezy kalozy w plazmodesmacie (PD), a zatem odgrywa istotną rolę w utrzymaniu limitu wykluczenia wielkości PD (SEL). Stłumiona ekspresja AtGSL8 spowodowała zniekształcony wzór gradientu auksyny prowadzący do braku odpowiedzi tropikalnej, w przeciwieństwie do siewek typu dzikiego¹⁵.

W tym manuskrypcie przedstawiono metody badania nowych genów kandydujących, które są zaangażowane w regulację PD. AtGSL8 został wykorzystany jako białko modelowe do przetestowania tych metod, ponieważ jest kluczowym enzymem przyczyniającym się do biosyntezy kalozy PD. Ze względu na śmiertelność mutantów nokautujących gsl8 ¹⁷, zastosowano linie RNAi indukowane deksametazonem (dex) zgodnie z wcześniej opublikowanym raportem¹⁵. Przedstawiona tutaj strategia może być dostosowana do badań przesiewowych genów, które są zaangażowane w odpowiedź hipokotylowo-tropową kontrolowaną przez PD SEL.

Protokół

1. Badania przesiewowe mutantów ze zmienionymi reakcjami fototropowymi i grawitropowymi

1. Przygotuj 1x Pożywkę Murashige i Skoog (MS) o pH 5,7 z 0,8% agarem na jeden dzień przed eksperymentem.
   1. Dodać 800 ml podwójnie destylowanej wody do kolby stożkowej o pojemności 2 l i wymieszać za pomocą pręta magnetycznego.
   2. Dodać 4,4 g soli MS do kolby stożkowej.
   3. Dodać 0,5 g kwasu 2-(N-Morfolino)etanosulfonowego (MES) i mieszać, aż wszystkie sole całkowicie się rozpuszczą.
   4. Dostosować pH pożywki do 5,7 za pomocą 1 M KOH.
   5. Przenieść pożywkę do cylindra masowego i doprowadzić końcową objętość do 1 l za pomocą ddH₂O.
   6. Wlać pożywkę z powrotem do stożkowej kolby o pojemności 2 l i dodać 8 g agaru roślinnego.
   7. Owinąć szczelnie ujście kolby stożkowej folią aluminiową.
   8. Pożywkę MS i ddH₂O należy sterylizować w autoklawie przez 15 minut w temperaturze 121 °C, 15 psi, a po autoklawowaniu przechowywać pożywkę w inkubatorze o temperaturze 60 °C, a ddH₂O w temperaturze pokojowej.
   9. Po schłodzeniu do temperatury 60 °C wlać pożywkę do³ kwadratowych płytek o wymiarach 125 x 125 x 20 mm na ławce laminarnej (po 50 ml na każdą płytkę).
   10. Pozwól agarowi zestalić się w temperaturze pokojowej przez około 1 godzinę, trzymając płytki częściowo otwarte. Jeśli płytki nie zostaną natychmiast zużyte, należy je owinąć folią spożywczą i przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C.
2. Wysterylizuj powierzchniowo nasiona 1,1% podchlorynem sodu i umieść nasiona na 1x płytkach agarowych MS, które zostały przygotowane w sekcji 1.1.
   Uwaga: W tym przypadku nasiona Arabidopsis thaliana {Col-0, dsGSL8 (Col-0)}¹⁵ są używane do odpowiedzi tropikalnej, barwienia kalozy i ładowania HPTS. Nasiona Arabidopsis thaliana {Col-0 i dsGSL8 (Col-0) zmutowane EMS} (niepublikowane) są używane do odpowiedzi tropikalnej na rycinie 2.
   1. Autoklaw 300 ml ddH₂O w butelce.
   2. Dodać około stu nasion dla każdego tła, tj. linii mutacji/nadekspresji i nasion typu dzikiego (Col-0), do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
   3. Wyjmij 1x płytki agarowe MS z lodówki o temperaturze 4 °C i wysusz je na ławce z przepływem laminarnym w pozycji częściowo otwartej.
   4. Wysterylizuj powierzchniowo nasiona, dodając 1 ml 0,2x roztworu wybielacza (1,1% podchlorynu sodu) i trzymaj probówki do mikrowirówek na wytrząsarce z prędkością 250 obr./min przez 5 minut.
   5. Pozwól nasionom opaść na dno grawitacyjnie, a następnie usuń roztwór wybielacza za pomocą mikropipety.
   6. Dodać 1 ml świeżego ddH₂O (autoklawizowanego) do nasion i dobrze wymieszać, kilkakrotnie odwracając probówkę mikrowirówkową. Pozwól nasionom ponownie osiąść, a następnie usuń wodę.
   7. Powtórz krok 1.2.6 5-6 razy.
   8. Dodaj podwójną ilość wody do objętości nasion, które pozostały po ostatecznym umyciu.
   9. Wysterylizowane nasiona należy rozsiać na półsuszonej płytce agarowej 1x MS za pomocą końcówki mikropipety o pojemności 1 ml zawierającej 200 μl nasion (w tym wody).
      1. Zachowaj około 0,1 cm odległości między dwoma nasionami i co najmniej 1,8 cm między dwoma rzędami nasion. Ułóż nasiona w pięciu poziomych rzędach na kwadratową płytkę (125 x 125 x 20 mm³). Poczekaj, aż woda lekko wyschnie przed umieszczeniem pokrywki na talerzu.
   10. Uszczelnij płytki taśmą chirurgiczną, ułóż wszystkie płytki pionowo i owiń folią aluminiową.
   11. Przenieś owinięte talerze do ciemnego pudełka (bez dostępu do światła). Następnie przechowuj ciemne pudełko w pomieszczeniu/lodówce o temperaturze 4 °C przez 3 dni.
   12. Począwszy od tego kroku, utrzymuj niezmieniony kierunek płyt. Po 3 dniach leczenia zimnem należy przechowywać ciemne pudełko w pomieszczeniu do hodowli roślin w temperaturze 22 °C przez następne 3 dni. Po 3 dniach sprawdź stan kiełkowania nasion w zielonym świetle w ciemnym pomieszczeniu.
       UWAGA: Zwykle 3-dniowe siewki etiolowane Col-0 mogą dorastać do 1,6 cm długości.
3. Przeanalizuj zmienioną odpowiedź fototropową i grawitropową w mutantach lub liniach nadekspresji określonego genu. Wybierz tylko podobnej wielkości i pionowo rosnące proste sadzonki pod zielonym światłem w ciemnym pomieszczeniu. Przenieś wybrane sadzonki na świeżą płytkę agarową 1x MS za pomocą końcówki wysterylizowanej wykałaczki.
   1. Delikatnie wybierz sadzonki z najniższej części ich hipokotylu, nie dotykając żadnych innych części. Upewnij się, że wszystkie sadzonki mają tę samą orientację liścienia/haczyka, a po przeniesieniu, że orientacja haczyków do sadzonek pozostaje taka sama. Użyj co najmniej 20 sadzonek z każdego tła w każdym rzędzie i co najmniej dwóch płytek dla każdego punktu czasowego do dalszej analizy.
      Uwaga: Na każdej płycie można porównać cztery różne tła (4 rzędy).
      Opcjonalnie: Używając indukowalnych przez deksametazon (dex) RNAi/linii nadekspresji, przenieś powyższe sadzonki na płytkę 1x MS wraz z płytką +dex MS (płytka zawierająca 1x MS, 0,8% pożywki agarowej uzupełnionej 20 μM dex) przez 3 godziny i trzymaj płytki pionowo w ciemnym pudełku.
   2. Aby sprawdzić odpowiedź fototropową, przenieś powyższe płytki pionowo do czarnej skrzynki z otwartą tylko jedną stroną. Przenieś czarne pudełko zawierające płytki do komory wzrostu roślin z jednostronnym białym światłem. Aby zapewnić jednostronne światło, umieść krawędź płyty w kierunku źródła światła (nie przedniej strony). Zapoznaj się z konfiguracją na rysunku 1.
   3. Podobnie, aby sprawdzić odpowiedź grawitropową, trzymaj płytki z przeniesionymi sadzonkami pionowo i przykryj folią aluminiową. Następnie zmień orientację płytki w pionie na 90° i trzymaj ją wewnątrz czarnej skrzynki zakrytej ze wszystkich stron. Zapoznaj się z konfiguracją na rysunku 1.
   4. Po upływie podanych punktów czasowych (zwykle 1,5 godziny, 3 godziny, 6 godziny i 12 godzin) zeskanuj płyty za pomocą skanera i zapisz zdjęcia w formacie JPEG.
   5. Zmierz kąt gięcia sadzonek za pomocą oprogramowania ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/index.html) (Rysunek 2).
      1. Uruchom program ImageJ, klikając dwukrotnie (Rysunek 2A).
         Uwaga: Główne narzędzia, które zostały użyte do pomiaru kąta, pokazano na rysunku 2B.
      2. Kliknij opcję "plik", a następnie podopcję "otwórz" na pasku narzędzi ImageJ i otwórz zdjęcia zapisane w formacie pliku JPEG, aby zmierzyć tropikalny kąt zgięcia (Rysunek 2C).
      3. Kliknij narzędzie powiększające, aby powiększyć lub pomniejszyć obraz, klikając odpowiednio lewym lub prawym przyciskiem myszy, jak pokazano na rysunku 2B.
      4. Kliknij narzędzie do przewijania, aby przeciągnąć i ustawić obraz (Rysunek 2D). Następnie kliknij narzędzie kąta, aby zmierzyć kąt zgięcia (Rysunek 2E).
         1. Kliknij dwukrotnie lewym przyciskiem myszy na oryginalny punkt kierunku wzrostu hipokotylu "a", przeciągnij myszą do punktu inicjacji zginania "b" (rysunek 2F) i kliknij lewym przyciskiem, aby narysować pierwszą linię (rysunek 2G).
         2. Przeciągnij mysz z punktu b do punktu końcowego gięcia "c" i kliknij lewym przyciskiem, aby narysować drugą linię (Rysunek 2H) i utworzyć stałą A. Uwaga: Rzeczywisty kąt gięcia wynosi B, co jest równe 180°-A. (Rysunek 2F).
         3. Zmierz i zapisz A, naciskając "M" na klawiaturze. Plik wynikowy otworzy się osobno, jak pokazano na rysunku 2I. Zmierz i zapisz wszystkie sadzonki jedna po drugiej. Na przykład najpierw zmierz kąt zgięcia dla wszystkich hipokotyli z Col-0, a następnie dla zmutowanych linii.
   6. Przenieś zestaw danych z ImageJ do pliku arkusza kalkulacyjnego, aby uzyskać średnią kątów gięcia każdego tła.
   7. W przypadku analizy ilościowej należy utworzyć wykres słupkowy z wynikami testów statystycznych, w tym słupkami błędów standardowych i wartościami prawdopodobieństwa (patrz rysunek 2).
      1. Oblicz rzeczywiste zginanie B i zaprojektuj formułę za pomocą arkusza kalkulacyjnego, tj. B = 180°-A. Uwaga: A to wartość, która została uzyskana z analizy ImageJ.
      2. Zmierz średni kąt gięcia B dla każdego tła za pomocą narzędzi arkusza kalkulacyjnego (Rysunek 2J).
      3. Przeanalizuj odchylenie standardowe między powtórzeniami dla każdego pomiaru za pomocą narzędzia "formuły" arkusza kalkulacyjnego (Rysunek 2J).
      4. Zbadaj istotność wyników, stosując test t do średniego kąta gięcia i wartości odchylenia standardowego obliczonych w sposób opisany powyżej.
      5. Narysuj diagram słupkowy, korzystając z powyższych wartości, aby graficznie przedstawić ilościową różnicę w kącie gięcia między dwoma różnymi tłami za pomocą narzędzia "wstaw" arkusza kalkulacyjnego (Rysunek 2K).
         Uwaga: Zmutowane/nadmiernie ekspresyjne linie silnych genów kandydujących wykazywałyby wyraźne różnice w stosunku do typu dzikiego, takie jak brak zginania, szybkie zginanie lub powolne zginanie.

2. Linie roślin z wadliwymi reakcjami zwrotnikowymi spowodowanymi zmianami w PD SEL ze zmienionym poziomem PD kalozy

1. Przeprowadzić test obciążenia hipokotylem za pomocą obciążenia barwnikiem kwasu 8-hydroksypireno-1,3,6-trisulfonowego (HPTS) na wierzchu siewek blokami agarozy HPTS i porównać ruch barwnika między liniami mutacji/nadekspresji a Col-0.
   1. Przygotować bloki agarozy HPTS do testu obciążenia hipokotylowego.
      1. Pobrać 10 ml ddH₂O do kolby stożkowej o pojemności 50 ml i dodać 0,1 g agarozy, aby przygotować 1% żel agarozowy. Gotuj agarozę w kuchence mikrofalowej przez 1-2 minuty z przerywanym potrząsaniem i pozwól jej ostygnąć przez 5 minut.
      2. Dodać 50 mg HPTS do 10 ml 1% roztworu agarozy i dobrze wymieszać, aż roztwór zmieni kolor na zielony.
      3. Wlej powyższą mieszaninę na szalkę Petriego o średnicy 10 mm i pozostaw do zestalenia się na 15 minut.
      4. Pokrój zestaloną agarozę HPTS ostrym ostrzem preparacyjnym, aby uzyskać małe bloki agarozy (0,5 x 2 cm²).
   2. Przygotuj próbki roślin do testu obciążenia barwnikiem HPTS.
      1. Ustawić platformę do testu obciążenia barwnikiem HPTS; umieścić szkiełko podstawowe mikroskopu (24 x 50 mm²) na nowej płytce z podłożem MS, jak pokazano na rysunku 3A.
      2. Wytnij 3-dniowe etiolowane siewki od podstawy haczyka za pomocą ostrych nożyczek chirurgicznych.
      3. Natychmiast przenieść powyższe siewki (minimum 5 sadzonek z każdego tła) na powierzchnię mikroskopijnego szkła nakrywkowego w taki sposób, aby tylko 0,5 cm hipokotylu z miejsca wycięcia pozostało na szkiełku nakrywkowym, a reszta hipokotylu dotykała podłoża, jak pokazano na rysunku 3B.
      4. Umieść blok agarozy HPTS na wierzchu hipokotylu (z wyciętym hakiem) na 5 minut w taki sposób, aby wycięty obszar dotykał bloku agarozy HPTS.
      5. Po 5 minutach załadunku usunąć blok agarozy z powierzchni hipokotylu, przenieść hipokotyle na 10 mm szalkę Petriego zawierającą ddH₂O i myć hipokotyle w ddH₂O przez 15 minut, ciągle wstrząsając.
   3. Przygotuj próbki do mikroskopii konfokalnej.
      1. Wybierz co najmniej 5 sadzonek z każdego tła do obserwacji pod konfokalnym laserowym mikroskopem skaningowym.
      2. W kanale laserowym ustaw długość fali na 488 nm dla wzbudzenia właściwego i od 500 do 550 nm dla emisji pasmowo-przepustowej.
      3. Przenieś sadzonki w 2 zestawach (jeden Col-0 + jeden mutant) do nowego szkiełka mikroskopowego po umyciu ddH₂O. Dodaj 100-150 μl podwójnie destylowanej wody do szkiełka i przykryj szkiełkiem przykrywkowym. Przesuń szkiełko do stolika mikroskopu konfokalnego.
      4. Skoncentruj obszar hipokotylu (za pomocą soczewki obiektywowej 20X lub 40X) za pomocą oświetlenia jasnego pola (białe światło). Następnie zeskanuj szkiełka pod kątem fluorescencji.
      5. Zrób zdjęcia dla co najmniej 10 zestawów i porównaj dwa tła, sprawdzając zakres ruchu barwnika od punktu ładowania.
         Uwaga: Zmutowane/nadekspresyjne linie ze zmienionym ruchem symetrycznym będą wykazywać różne wzorce obciążenia barwnikiem w porównaniu z dzikim typem Col-0.
2. Przeanalizuj poziom kalozy w zmutowanych/nadekspresyjnych liniach wykazujących zmienioną odpowiedź fototropową i grawitropową oraz wykazujących wyraźny ruch barwnika HPTS w porównaniu z Col-0.
   1. Przygotuj barwnik barwiący anilinę z niebieskim kalozy.
      1. Przygotować 1 M glicyny o pH 9,5 i 0,1% (W/V) błękitu anilinowego w autoklalawowanym ddH₂O.
      2. Sporządzić bufor barwiący, mieszając 0,1% błękitu anilinowego i 1 M glicyny w proporcjach objętościowych 2:3. Na przykład na 50 ml buforu barwiącego weź 20 ml 0,1% błękitu anilinowego i 30 ml 1 M glicyny. Uwaga: Przygotuj bufor do barwienia na co najmniej 48 godzin przed użyciem i przechowuj go w ciemności.
   2. Sadzonki wygięte lub niezgięte bejcować specyficznym dla modzeli niebieskim barwnikiem anilinowym.
      1. Aby zahamować syntezę kalozy de novo podczas procesu barwienia, należy dodać końcową objętość 1,5 mM 2-deoksy-D-glukozy (DDG) do 50 ml buforu barwiącego.
      2. Weź 3-dniowe etiolowane sadzonki do barwienia kalozy (z reakcją tropikalną lub bez).
      3. Wytnij sadzonki z obszaru haczyka za pomocą cienkich nożyczek chirurgicznych.
      4. Przenieś sadzonki na małą szalkę Petriego zawierającą 2 ml buforu barwiącego za pomocą końcówki wykałaczki.
      5. Inkubować sadzonki z buforem barwiącym w ciemności przez 2 godziny z ciągłym wytrząsaniem przy 30 obr./min.
      6. Po zabarwieniu umyj sadzonki ddH₂O przez 2 minuty, aby usunąć nadmiar bufora barwiącego.
      7. Wybierz co najmniej 5 sadzonek dla każdego tła rośliny do obserwacji pod konfokalnym laserowym mikroskopem skaningowym.
   3. Przygotuj próbki do mikroskopii konfokalnej:
      1. Przenieś sadzonki w zestawie (jeden Col-0 + jeden mutant) w celu oczyszczenia szkiełek mikroskopowych po umyciu ddH₂O.
      2. Dodać 100-150 μl ddH₂O i przykryć szkiełkiem podstawowym. Przesuń szkiełko do stolika mikroskopu konfokalnego.
      3. W kanale laserowym ustaw długość fali na 405 nm dla wzbudzenia właściwego i emisję od 500 do 550 nm dla obrazowania fluorescencji błękitu anilinowego.
      4. Ustaw ostrość obszaru hipokotylu, najpierw za pomocą soczewek obiektywowych 10X, a później 20X lub 40X, wykorzystując oświetlenie w jasnym polu (światło białe).
      5. Następnie włącz filtrowane światło, zeskanuj slajdy pod kątem fluorescencji i zapisz obrazy.
      6. Zmierz intensywność sygnału kalozy za pomocą oprogramowania ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/index.html) (Patrz rysunek 4).
         1. Zmień format zdjęć z mikroskopii konfokalnej z formatu binarnego obrazu Olympus (*.oib) na format pliku JPEG. Uwaga: Oprogramowanie ImageJ obsługuje tylko format JPEG.
         2. Uruchom program ImageJ, klikając dwukrotnie (Rysunek 4A). Uwaga: Strzałki wskazują narzędzie prostokąta, które ma być używane do pomiaru intensywności kalozy (Rysunek 4B).
         3. Kliknij opcję "plik", a następnie podopcję "otwórz" na pasku narzędzi ImageJ i otwórz zdjęcia mikroskopowe, które zostały zapisane w formacie pliku JPEG, aby zmierzyć intensywność kalozy (Rysunek 4C).
         4. Kliknij prostokątną ikonę na pasku narzędzi ImageJ (Rysunek 4D).
         5. Aby przeanalizować natężenie sygnału, przeciągnij kursor na obraz i wybierz obszar do zbadania (Rysunek 4E)
         6. Zmierz i zapisz wartości liczbowe intensywności sygnału, naciskając "M" na klawiaturze (Rysunek 4E). Uwaga: Plik wynikowy otworzy się oddzielnie (Rysunek 4F).
         7. Mierz i zapisuj wartości intensywności jedna po drugiej dla wszystkich sadzonek z każdego tła rośliny.
            Uwaga: W ImageJ plik wynikowy "Średnia" wskazuje intensywność sygnału wybranego "Obszaru".
      7. Skopiuj średnie wartości z pliku wynikowego ImageJ i wklej je do pliku arkusza kalkulacyjnego w celu analizy ilościowej.
      8. Na potrzeby analizy ilościowej należy utworzyć diagram słupkowy z testami statystycznymi, w tym słupkami błędów standardowych i wartościami prawdopodobieństwa (rysunek 4).
         1. Zmierz średnie natężenie sygnału (średnia z ImageJ) dla każdego tła za pomocą narzędzia "formuły" arkusza kalkulacyjnego (Rysunek 4G).
         2. Przeanalizuj odchylenie standardowe między powtórzeniami dla każdego pomiaru za pomocą narzędzia "formuły" arkusza kalkulacyjnego (Rysunek 4G).
         3. Oblicz błąd standardowy (SE) za pomocą narzędzia "formuły" arkusza kalkulacyjnego.
            Uwaga: SE = s/√n, gdzie (s) jest odchyleniem standardowym populacji, a (n) jest wielkością (liczbą obserwacji) próby.
         4. Zbadaj istotność wyników, stosując test t do średniego natężenia sygnału i wartości błędu standardowego obliczonych w sposób opisany powyżej.
         5. Narysuj diagram słupkowy, korzystając z powyższych wartości, aby graficznie przedstawić ilościową różnicę w poziomie kalozy między dwoma różnymi tłami za pomocą narzędzia "wstaw" arkusza kalkulacyjnego (Rysunek 4H).
            Uwaga: Zmutowane/nadmiernie ekspresyjne linie silnych kandydatów będą wykazywać różne poziomy kalozy w porównaniu z typem dzikim, takie jak brak modzeli, mała kaloza lub akumulacja kalozy hiper PD.

Wyniki

W obecnej konfiguracji użyto indukowanych deksametazonem (dex) linii RNAi AtGSL8 [dalej dsGSL8 (+dex/-dex)], ponieważ homozygotyczne mutanty insercji T-DNA gsl8 są siewkami śmiertelnymi¹⁸. Trzydniowe etiolowane siewki dsGSL8 i siewki typu dzikiego z ±dex poddano działaniu bodźców fototropowych i grawitropowych. Odkryliśmy, że siewki dsGSL8 (+dex) były wadliwe pod względem fototropizmu i grawitropizmu¹⁵. Rysunek 5

Dyskusja

W tym manuskrypcie szczegółowo opisano strategię badania przesiewowego zmutowanych/nadmiernych linii ekspresji, które są wadliwe w odpowiedziach fototropowych i grawitropowych z powodu zmienionej kalozy PD, a tym samym PD SEL. Synteza i degradacja kalozy PD odbywa się głównie przez syntazy kalozy i β-1,3-glukanazy, ale regulacja tych enzymów jest kontrolowana przez wiele czynników poprzedzających. Aby wyszukać takie czynniki początkowe lub kandydatów, którzy są bezpośrednio zaangażowani w regulację PD, opracowaliśmy tę m...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
HPTS (sól trisodowa kwasu 8-hydroksypireno-1,3,6-trisulfonowego)	Sigma	H1529-1G	Barwnik fluorescencyjny jako znacznik symplazmatyczny
LE Agaroza	Dongin-Genomic	GEL001-500G	Używany do bloku agarozy HPTS
Kuchenka mikrofalowa	LG-Goldstar		Maszyna do gotowania żelu agarozowego
100 ml szklana kolba stożkowa	Dong Kwang	A0205	Służy do gotowania agarozy HPTS żelowa
szalka Petriego (35 mm x 10 mm)	SPL nauki przyrodnicze	SPL10035	Służy do wytwarzania bloków agarozowych HPTS i mycia próbek roślin
Szkiełka podstawowe i szkiełka mikroskopowe (24 mm x 50 mm)	Szkło laboratoryjne Marienfeld	101222	Służy do bloków agarozowych HPTS i przygotowywania próbek mikroskopowych
Płytki pośrednie MS 125 mm x 125 mm x 20 mm	SPL nauki przyrodnicze	SPL11125	Płytki do produkcji podłoża agarowego MS
Nożyczki	Niemcy Stal nierdzewna	HSB 942-11	Służy do wycinania obszaru hakowego próbek roślinnych
Murashige i Skoog (MS) mieszanina soli bazowej	Duchefa	P10453.01	MS pożywka zawierająca witaminy.
(N-morfolino) kwas etanosulfonowy (MES) monohydrat	Bioshop	3G30212	Do produkcji pożywek MS.
Agar	roślinny Duchefa	P1001.1000	Do zestalania pożywki MS.
Autoklaw	ALP	CL-40L
Shaker	Wise Mix	SHO-1D	Do spokojnego zmywania buforu barwiącego anilinę i barwnika HPTS.
1 ml Niebieskie końcówki	Sorenson	10040
Pipeta 1 ml	BioPette	L-1101-2
Taśma chirurgiczna	MIcropore	1530-0	Do uszczelniania płytki MS
Błękit anilinowy (błękit metylowy)	Sigma	M5528-25G	Służy do przygotowania buforu do barwienia błękitu anilinowego.
Glycine	Bioshop	GLN001	Służy do przygotowania buforu do barwienia błękitu anilinowego.
DDG	Sigma	D8375-1G	Służy do hamowania syntaz kalozy.
Mikroskop konfokalny	Olympus	FV1000MPE SIM	Aby sprawdzić barwienie błękitem anilinowym i wynik obciążenia barwnikiem HPTS.
Mieszadło	I lab	K400	Do mieszania roztworu mediów.
Folia aluminiowa	SW folia		Do owijania talerzy w ciemnym stanie.
Podchloryn sodu	Samjin Przemysł		Do nasion sterylizowanych powierzchniowo