Strategia walidacji roli bramkowania plazmodowego za pośrednictwem kalozy w odpowiedzi tropikalnej

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje metody badania przesiewowego genów kontrolujących przepuszczalność plazmodalną, a tym samym gradient auksyny podczas odpowiedzi tropikalnej. Obejmuje to pomiar stopnia odpowiedzi tropikalnej u hipokotylu Arabidopsis thaliana i sprawdzenie przepuszczalności plazmodalnej przez obciążenie kwasem 8-hydroksypireno-1,3,6-trisulfonowym (HPTS) i wreszcie ocenę poziomu kalozy.

Streszczenie

Roślinny hormon auksyna odgrywa ważną rolę w wielu procesach wzrostu i rozwoju, w tym w tropikalnych reakcjach na światło i grawitację. Ustalenie gradientu auksyny jest kluczowym zdarzeniem prowadzącym do fototropizmu i grawitropizmu. Wcześniej wykazano, że polarny transport auksyny (PAT) ustanawia gradient auksyny w różnych domenach komórkowych roślin. Jednak Han i in. wykazali niedawno, że dla prawidłowego tworzenia gradientu auksyny, plazmodesmalna łączność symplazmatyczna za pośrednictwem modzeli między sąsiednimi komórkami jest również czynnikiem krytycznym. W tym manuskrypcie omówiono strategię wyjaśnienia roli poszczególnych genów, które mogą wpływać na fototropizm i grawitropizm poprzez zmianę łączności symplazmatycznej poprzez modulację syntezy plazmodalnej kalozy. Pierwszym krokiem jest badanie przesiewowe nieprawidłowych reakcji tropikalnych z 3-dniowych etiolowanych siewek mutantów lub linii nadekspresji genu wraz z typem dzikim. To wstępne badanie przesiewowe może prowadzić do identyfikacji szeregu genów funkcjonujących w PAT lub kontrolujących łączność symplazmatyczną. Drugie badanie przesiewowe polega na sortowaniu kandydatów, którzy wykazują zmienione reakcje tropiczne poprzez wpływ na łączność symplazmatyczną. Aby zająć się takimi kandydatami, zbadano ruch znacznika symplazmatycznego i osadzanie się plazmodesmalnej kalozy. Strategia ta byłaby przydatna do zbadania nowych genów kandydujących, które mogą bezpośrednio lub pośrednio regulować łączność symplazmatyczną podczas reakcji tropikalnych i innych procesów rozwojowych.

Wprowadzenie

Rośliny, jako osiadłe organizmy żywe, rozwinęły wysoce wyrafinowaną sieć sygnalizacji międzykomórkowej, aby reagować na różne bodźce środowiskowe. Reakcje tropikalne są jednym ze zjawisk, za pomocą których rośliny reagują na bodźce środowiskowe. Rośliny wykazują dwie główne reakcje tropikalne, fototropizm i grawitropizm. Rośliny fotosyntetyczne zginają się w kierunku źródła światła za pomocą fototropizmu, aby zebrać maksymalną energię. Podobnie grawitropizm sprawia, że rośliny rosną w kierunku środka ciężkości. Podstawowym mechanizmem prowadzącym do takich reakcji tropikalnych jest asymetryczne tworzenie gradientu fitohormonu auksyny¹. Akt lokalnego tworzenia gradientu auksyny jest dobrze scharakteryzowany; Geny, które są zaangażowane w ten mechanizm, stanowią mapę drogową dla działania hormonów^2-8. Specyficzne położenie nośników wypływu auksyny, takich jak PIN-FORMED (PIN) i glikoproteiny P, wykonuje ruch auksyny z cytoplazmy do ściany komórkowej komórek dawcy^9,10. Ponadto, dzięki aktywnej aktywności symportowej H⁺/IAA nośników napływu auksyny, takich jak białka z rodziny AUX1 / LAX, auksyna jest ostatecznie dostarczana do sąsiednich komórek odbiorczych^2,11,12. Ten kierunkowy ruch auksyny jest znany jako polarny transport auksyny (PAT). PAT prowadzi do zróżnicowanej dystrybucji auksyny na różnych etapach rozwoju i w odpowiedzi na różne bodźce środowiskowe^13,14. Co więcej, zakłócenie lokalizacji lub ekspresji któregokolwiek z tych nośników napływu lub wypływu auksyny prowadzi do poważnych zmian w PAT, co powoduje zakłócenie gradientu auksyny, prowadząc do wad rozwojowych. Ostatnio Han i wsp. stwierdzono, że regulacja plazmodesmalna jest również niezbędna do utrzymania gradientu auksyny¹⁵. Do tej pory zidentyfikowano ponad 30 białek plazmodesmalnych¹⁶. Wśród tych białek AtGSL8 został opisany jako kluczowy enzym do syntezy kalozy w plazmodesmacie (PD), a zatem odgrywa istotną rolę w utrzymaniu limitu wykluczenia wielkości PD (SEL). Stłumiona ekspresja AtGSL8 spowodowała zniekształcony wzór gradientu auksyny prowadzący do braku odpowiedzi tropikalnej, w przeciwieństwie do siewek typu dzikiego¹⁵.

W tym manuskrypcie przedstawiono metody badania nowych genów kandydujących, które są zaangażowane w regulację PD. AtGSL8 został wykorzystany jako białko modelowe do przetestowania tych metod, ponieważ jest kluczowym enzymem przyczyniającym się do biosyntezy kalozy PD. Ze względu na śmiertelność mutantów nokautujących gsl8 ¹⁷, zastosowano linie RNAi indukowane deksametazonem (dex) zgodnie z wcześniej opublikowanym raportem¹⁵. Przedstawiona tutaj strategia może być dostosowana do badań przesiewowych genów, które są zaangażowane w odpowiedź hipokotylowo-tropową kontrolowaną przez PD SEL.

Protokół

1. Przesiewanie mutantów z zaburzoną reakcją fototropową i gravitropową

1. Przygotuj pożywkę Murashige i Skoog (MS) 1x o pH 5,7 z dodatkiem 0,8% agaru na jeden dzień przed eksperymentem.
   1. Do kolby stożkowej o pojemności 2 L wlać 800 ml wody podwójnie destylowanej i mieszać za pomocą mieszadła magnetycznego.
   2. Do kolby stożkowej należy dodać 4,4 g soli MS.
   3. Dodać 0,5 g kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES) i mieszać do całkowitego rozpuszczenia wszystkich soli.
   4. Dostosować pH pożywki do wartości 5,7 za pomocą 1 M KOH.
   5. Przenieść pożywkę do cylindra miarowego i doprowadzić objętość końcową do 1 l za pomocą ddH2O.₂O.
   6. Przelej pożywkę z powrotem do kolby stożkowej o pojemności 2 L i dodaj 8 g agaru roślinnego.
   7. Szczelnie owiń wlot kolby stożkowej folią aluminiową.
   8. Autoklawować pożywkę MS oraz wodę ddH₂O przez 15 min w temperaturze 121 °C, 15 psi, a po autoklawowaniu przechowywać pożywkę w 60 °C inkubator i ddH2O₂O w temperaturze pokojowej.
   9. Po schłodzeniu do 60 °Cwlej pożywkę do naczyń o wymiarach 125 x 125 x 20 mm³ kwadratowe płytki na dygestorium z laminarnym przepływem powietrza (po 50 ml w każdej płytce).
   10. Pozostawić agar do zestalenia w temperaturze pokojowej przez około 1 godzinę, utrzymując płytki częściowo otwarte. Jeśli płytki nie zostaną użyte natychmiast, należy je szczelnie zamknąć folią spożywczą i przechowywać w 4 °C w lodówce.
2. Zdezynfekuj powierzchnię nasion przy użyciu 1,1% podchlorynu sodu, a następnie rozmieść nasiona na płytkach z agarem MS 1x przygotowanych w sekcji 1.1.
   Uwaga: Tutaj, Arabidopsis thaliana {Col-0 nasiona, dsGSL8 (Col-0)}¹⁵ stosuje się do badania odpowiedzi tropistycznej, barwienia kalozy oraz ładowania HPTS. Arabidopsis thaliana {Col-0 oraz dsGSL8 (Col-0) nasiona mutantów EMS (niepublikowane) są wykorzystywane do badania odpowiedzi tropowej w Rysunek 2.
   1. Autoklawować 300 ml ddH₂O w butelce.
   2. Dodaj około stu nasion dla każdego tła, tj. linia mutantowa/nadekspresyjna oraz typ dziki (Col-0) nasiona do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml.
   3. Wyjmij płytki z agarem MS 1x z 4 °C do lodówki, a następnie osuszamy je w pozycji częściowo otwartej w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
   4. Przeprowadź sterylizację powierzchniową nasion, dodając 1 ml 0,2-krotnego roztworu wybielacza (1,1% podchlorynu sodu), a następnie inkubuj probówki do mikrocentryfugi na wytrząsarce przy 250 obr./min przez 5 min.
   5. Pozostawić nasiona do czasu, aż opadną na dno pod wpływem grawitacji, a następnie usunąć roztwór podchlorynu za pomocą mikropipety.
   6. Dodać 1 ml świeżej wody ddH2O₂Dodaj wodę (autoklawowaną) do nasion i wymieszaj dokładnie, kilkakrotnie odwracając probówkę do mikrocentryfugi. Pozostaw nasiona do ponownego osadzenia, a następnie odlej wodę.
   7. Powtórz krok 1.2.6 od 5 do 6 razy.
   8. Dodać ilość wody dwukrotnie większą niż objętość nasion pozostałych po końcowym płukaniu.
   9. Nanieś sterylne nasiona w formie kropek na pół-wyschniętą płytkę z agarem MS 1x, używając końcówki mikropipety o objętości 1 ml zawierającej 200 µl nasion (wliczając wodę).
      1. Zachowaj odległość około 0,1 cm między dwiema nasionami oraz minimum 1,8 cm między dwoma rzędami nasion. Umieść nasiona w pięciu poziomych rzędach na płytce kwadratowej (125 x 125 x 20 mm).³). Pozostaw wodę do lekkiego wyschnięcia przed nałożeniem pokrywki na płytkę.
   10. Zaszczelnij płytki taśmą chirurgiczną, ułóż wszystkie płytki pionowo w stosie i owiń folią aluminiową.
   11. Przenieś owinięte płytki do ciemnej skrzynki (bez dostępu do światła). Następnie umieść skrzynkę w 4 °C w temperaturze pokojowej/w lodówce przez 3 dni.
   12. Od tego momentu nie zmieniać orientacji płytek. Po 3 dniach traktowania zimnem pozostawić ciemną skrzynkę w pomieszczeniu do hodowli roślin w temperaturze 22 °C przez kolejne 3 dni. Po upływie 3 dni należy sprawdzić status kiełkowania nasion pod zielonym światłem w ciemni.
       UWAGA: Zazwyczaj 3-dniowe Col-0 etylowane siewki mogą osiągnąć długość do 1,6 cm.
3. Analiza zmienionej odpowiedzi fototropicznej i gravitropicznej u mutantów lub linii z nadekspresją specyficznego genu. Wybrać jedynie siewki o podobnej wielkości, rosnące pionowo i prosto, poddane działaniu zielonego światła w ciemni. Przenieść wybrane siewki na świeżą płytkę z agarem MS 1x, używając końcówki sterylizowanego wykałaczką.
   1. Ostrożnie wyjmij siewki, chwytając je za najniższą część podlistka, tak aby nie dotykać żadnych innych części rośliny. Upewnij się, że wszystkie siewki mają taką samą orientację liści zakątkowych/zakrzywienia podlistka i że po przeniesieniu orientacja zakrzywień siewek pozostanie niezmieniona. W każdym rzędzie należy użyć co najmniej 20 siewek każdego genotypu, a dla każdego punktu czasowego co najmniej dwóch płytek do dalszych analiz.
      Uwaga: Na każdej płytce można porównać cztery różne tła (4 rzędy).
      Opcjonalnie: w przypadku stosowania linii z RNAi/nadekspresją indukowaną deksametazonem (dex), należy przenieść powyższe siewki na płytkę z pożywką 1x MS oraz na płytkę MS +dex (płytkę zawierającą pożywkę 1x MS z 0,8% agarem, wzbogaconą o 20 µM (dex) przez 3 h, utrzymując płytki w pozycji pionowej w ciemnej komorze.
   2. Aby sprawdzić odpowiedź fototropową, przenieś powyższe płytki pionowo do czarnego pudełka z otwartą tylko jedną ścianą. Przenieś czarne pudełko z płytkami do komory wzrostu roślin z jednostronnym białym światłem. Aby zapewnić jednostronne oświetlenie, umieść krawędź płytki w stronę źródła światła (nie stroną przednią). Należy odnieść się do konfiguracji w Rycina 1.
   3. Analogicznie, aby sprawdzić odpowiedź grawitropową, należy utrzymać płytki z przeniesionymi siewkami w pozycji pionowej i owinąć je folią aluminiową. Następnie należy zmienić orientację płytek w pionie na 90° i pozostawić go wewnątrz czarnej skrzynki, osłoniętej z każdej strony. Należy odnieść się do konfiguracji w Rysunek 1.
   4. Po upływie określonych punktów czasowych (zazwyczaj 1,5 h, 3 h, 6 h i 12 h) należy przeskanować płytki skanerem i zapisać obrazy w formacie JPEG.
   5. Pomiar kąta wygięcia siewek przy użyciu oprogramowania ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/index.html) (Rycina 2).
      1. Uruchom program ImageJ, klikając dwukrotnie (Rysunek 2A).
         Uwaga: Główne narzędzia wykorzystane do pomiaru kąta przedstawiono w Rycina 2B.
      2. W pasku narzędzi programu ImageJ kliknij opcję „file”, a następnie podopcję „open” i otwórz zdjęcia zapisane w formacie JPEG, aby zmierzyć kąt wygięcia tropycznego (Rycina 2C).
      3. Kliknij narzędzie lupy, aby przybliżyć lub oddalić obraz, klikając odpowiednio lewy lub prawy przycisk myszy, tak jak pokazano w Rycina 2B.
      4. Kliknij narzędzie przewijania, aby przeciągnąć i ustawić obraz (Rysunek 2DNastępnie należy kliknąć narzędzie do pomiaru kątów, aby zmierzyć kąt zgięcia (Rycina 2E).
         1. Kliknij dwukrotnie lewym przyciskiem myszy w punkcie „a”, wyznaczającym pierwotny kierunek wzrostu podkotylowca, a następnie przeciągnij kursor do punktu „b”, będącego punktem rozpoczęcia wygięcia (Rysunek 2F), a następnie kliknij lewym przyciskiem myszy, aby narysować pierwszą linię (Rycina 2G).
         2. Przeciągnij myszą od punktu b do końcowego punktu zgięcia „c” i kliknij lewy przycisk, aby narysować drugą linię (Rysunek 2H) i utworzyć utrwaloną A. Uwaga: rzeczywisty kąt zgięcia wynosi B, które jest równe 180°-A. (Rysunek 2F).
         3. Zmierzyć i zapisać A poprzez naciśnięcie klawisza „M” na klawiaturze. Plik z wynikami otworzy się w osobnym oknie, jak pokazano w Rysunek 2IPomiarem i zarejestruj wszystkie siewki jedna po drugiej. Na przykład, najpierw zmierz kąt wygięcia dla wszystkich podsadzek z Col-0 a następnie dla linii mutantów.
   6. Przenieś zbiór danych z programu ImageJ do pliku arkusza kalkulacyjnego, aby obliczyć średnie kąty zgięcia dla każdego tła.
   7. Do analizy ilościowej przygotuj wykres słupkowy z wynikami testów statystycznych, zawierający słupki błędu standardowego i wartości prawdopodobieństwa (Patrz Rysunek 2).
      1. Oblicz rzeczywiste wygięcie B oraz zaprojektuj formułę przy użyciu arkusza kalkulacyjnego, t. j. B = 180°-A. Uwaga: A to wartość uzyskana z analizy w programie ImageJ.
      2. Zmierz średni kąt zgięcia B dla każdego tła przy użyciu narzędzi arkusza kalkulacyjnego (Rysunek 2J).
      3. Przeanalizuj odchylenie standardowe między powtórzeniami dla każdego pomiaru, korzystając z narzędzia „formuły” w arkuszu kalkulacyjnym (Rysunek 2J).
      4. Przetestuj istotność wyników, stosując test t dla średniego kąta zgięcia oraz wartości odchylenia standardowego obliczonych zgodnie z powyższymi opisami.
      5. Narysuj wykres słupkowy, wykorzystując powyższe wartości, aby graficznie przedstawić ilościową różnicę w kącie zgięcia pomiędzy dwoma różnymi tłem, używając narzędzia „wstaw” arkusza kalkulacyjnego (Rycina 2K).
         Uwaga: Linie z mutacją lub nadekspresją silnych genów kandydackich wykazywałyby wyraźne różnice w stosunku do typu dzikiego, takie jak brak zginania, szybkie zginanie lub powolne zginanie.

2. Przesiewanie linii roślin z wadliwymi reakcjami tropistycznymi wynikającymi ze zmian w PD SEL przy zmiennym poziomie kalozy PD

1. Wykonaj test ładowania hipokotylu poprzez ładowanie barwnika kwasu 8-hydroksypyrenu-1,3,6-trisulfonowego (HPTS) na szczyt siewek za pomocą bloków agarozy z HPTS i porównaj ruch barwnika pomiędzy liniami mutantów/nadekspresyjnymi a Col-0.
   1. Przygotuj bloki agarozy z HPTS do testu ładowania hipokotylu.
      1. Do kolby stożkowej o pojemności 50 ml nalej 10 ml ddH₂O i dodaj 0,1 g agarozy, aby przygotować 1% żel agarozowy. Gotuj agarozę w kuchence mikrofalowej przez 1-2 min, okresowo wstrząsając, a następnie pozostaw do ochłonięcia na 5 min.
      2. Dodaj 50 mg HPTS do 10 ml 1% roztworu agarozy i dokładnie wymieszaj, aż roztwór stanie się zielony.
      3. Wlej powyższą mieszaninę do szalki Petriego o średnicy 10 mm i pozostaw do zastygnięcia na 15 min.
      4. Przetnij zastygłą agarozę z HPTS ostrym skalpelem, aby utworzyć małe bloki agarozy (0,5 x 2 cm²).
   2. Przygotuj próbki roślin do testu ładowania barwnika HPTS.
      1. Przygotuj stanowisko do testu ładowania barwnika HPTS; umieść szkiełko nakrywki (24 x 50 mm²) na nowej płytce z podłożem MS, jak pokazano na Rysunku 3A.
      2. Odetnij 3-dniowe etiolizowane siewki u podstawy zakrzywienia (haka) za pomocą ostrych nożyczek chirurgicznych.
      3. Niezwłocznie przenieś powyższe siewki (minimum 5 siewek z każdego tła genetycznego) na powierzchnię szkiełka nakrywki w taki sposób, aby na szkiełku pozostało jedynie 0,5 cm hipokotylu od miejsca odcięcia, a reszta hipokotylu dotykała podłoża, jak pokazano na Rysunku 3B.
      4. Umieść blok agarozy z HPTS na szczycie hipokotylu (z odciętym zakrzywieniem) na 5 min w taki sposób, aby odcięty obszar stykał się z blokiem agarozy z HPTS.
      5. Po 5 min ładowania usuń blok agarozy z powierzchni hipokotylu, przenieś hipokotyle do szalki Petriego o średnicy 10 mm zawierającej ddH₂O i płucz hipokotyle w ddH₂O przez 15 min przy ciągłym wstrząsaniu.
   3. Przygotuj próbki do mikroskopii konfokalnej.
      1. Wybierz minimum 5 siewek z każdego tła genetycznego do obserwacji pod konfokalnym skaningowym mikroskopem laserowym.
      2. W kanale laserowym ustaw długość fali na 488 nm dla specyficznego wzbudzenia i od 500 do 550 nm dla emisji pasmowej.
      3. Przenieś siewki w 2 zestawach (jeden Col-0 + jeden mutant) na nowe szkiełko mikroskopowe po wypłukaniu w ddH₂O. Dodaj 100-150 µl wody dwukrotnie destylowanej na szkiełko i przykryj szkiełkiem nakrywką. Przesuń szkiełko na stolik mikroskopu konfokalnego.
      4. Ustaw ostrość w obszarze hipokotylu (używając obiektywu 20X lub 40X) przy użyciu oświetlenia w ciemnym polu (światło białe). Następnie przeskanuj szkiełka pod kątem fluorescencji.
      5. Wykonaj obrazy dla minimum 10 zestawów i porównaj oba tła genetyczne, sprawdzając zasięg ruchu barwnika od punktu ładowania.
         Uwaga: Linie mutantów/nadekspresyjne ze zmienionym ruchem symplastycznym wykażą inne wzorce ładowania barwnika w porównaniu do typu dzikiego Col-0.
2. Przeanalizuj poziom kalozy w liniach mutantów/nadekspresyjnych wykazujących zmienną odpowiedź fototropową i gravitropową oraz wyraźny ruch barwnika HPTS w porównaniu do Col-0.
   1. Przygotuj barwnik do barwienia kalozy błękitem anilinowym.
      1. Przygotuj 1 M glicynę, pH 9,5 oraz 0,1% (m/v) błękit anilinowy w autoklawowanej ddH₂O.
      2. Przygotuj bufor do barwienia, mieszając 0,1% błękit anilinowy i 1 M glicynę w stosunku objętościowym 2:3. Na przykład dla 50 ml buforu do barwienia pobierz 20 ml 0,1% błękitu anilinowego i 30 ml 1 M glicyny. Uwaga: Przygotuj bufor do barwienia minimum 48 h przed użyciem i przechowuj go w ciemności.
   2. Zbarw siewki wygięte lub niewygięte specyficznym dla kalozy barwnikiem błękitem anilinowym.
      1. Aby zahamować syntezę kalozy de novo podczas procesu barwienia, dodaj końcową objętość 1,5 mM 2-deoksy-D-glukozy (DDG) do 50 ml buforu do barwienia.
      2. Pobierz 3-dniowe etiolizowane siewki do barwienia kalozy (z odpowiedzią tropową lub bez niej).
      3. Odetnij siewki w obszarze zakrzywienia za pomocą cienkich nożyczek chirurgicznych.
      4. Przenieś siewki do małej szalki Petriego zawierającej 2 ml buforu do barwienia, używając końcówki wykałaczki.
      5. Inkubuj siewki w buforze do barwienia w ciemności przez 2 h przy ciągłym wstrząsaniu z prędkością 30 rpm.
      6. Po barwieniu płucz siewki w ddH₂O przez 2 min, aby usunąć nadmiar buforu do barwienia.
      7. Wybierz minimum 5 siewek dla każdego tła roślinnego do obserwacji pod konfokalnym skaningowym mikroskopem laserowym.
   3. Przygotuj próbki do mikroskopii konfokalnej:
      1. Przenieś siewki w zestawach (jeden Col-0 + jeden mutant) na czyste szkiełka mikroskopowe po wypłukaniu w ddH₂O.
      2. Dodaj 100-150 µl ddH₂O i przykryj szkiełkiem nakrywką. Przesuń szkiełko na stolik mikroskopu konfokalnego.
      3. W kanale laserowym ustaw długość fali na 405 nm dla specyficznego wzbudzenia i emisję od 500 do 550 nm dla obrazowania fluorescencji błękitu anilinowego.
      4. Ustaw ostrość w obszarze hipokotylu, najpierw obiektywem 10X, a następnie 20X lub 40X, używając oświetlenia w ciemnym polu (światło białe).
      5. Następnie włącz światło filtrowane, przeskanuj szkiełka pod kątem fluorescencji i zapisz obrazy.
      6. Zmierz intensywność sygnału kalozy za pomocą oprogramowania ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/index.html) (zob. Rysunek 4).
         1. Zmień format zdjęć z mikroskopii konfokalnej z formatu binarnego Olympus Image (*.oib) na format pliku JPEG. Uwaga: Oprogramowanie ImageJ obsługuje tylko format JPEG.
         2. Uruchom program ImageJ poprzez dwukrotne kliknięcie (Rysunek 4A). Uwaga: Strzałki wskazują narzędzie prostokąta, które należy zastosować w pomiarze intensywności kalozy (Rysunek 4B).
         3. Kliknij opcję „file”, a następnie podopcję „open” na pasku narzędzi ImageJ i otwórz zdjęcia mikroskopowe zapisane w formacie JPEG, aby zmierzyć intensywność kalozy (Rysunek 4C).
         4. Kliknij ikonę prostokąta na pasku narzędzi ImageJ (Rysunek 4D).
         5. Aby przeanalizować intensywność sygnału, przeciągnij kursor po zdjęciu i zaznacz obszar do zbadania (Rysunek 4E).
         6. Zmierz i zapisz wartości liczbowe dla intensywności sygnału, naciskając klawisz „M” na klawiaturze (Rysunek 4E). Uwaga: Plik z wynikami otworzy się oddzielnie (Rysunek 4F).
         7. Zmierz i zapisz wartości intensywności po kolei dla wszystkich siewek z każdego tła roślinnego.
            Uwaga: W programie ImageJ plik wyników „Mean” wskazuje intensywność sygnału dla zaznaczonego „Area” (obszaru).
      7. Skopiuj średnie wartości z pliku wyników ImageJ i wklej je do pliku arkusza kalkulacyjnego w celu przeprowadzenia analizy ilościowej.
      8. Do analizy ilościowej przygotuj wykres słupkowy z testami statystycznymi, w tym z paskami błędów standardowych i wartościami prawdopodobieństwa (Rysunek 4).
         1. Zmierz średnią intensywność sygnału (średnia z ImageJ) dla każdego tła, używając narzędzia „formuły” w arkuszu kalkulacyjnym (Rysunek 4G).
         2. Przeanalizuj odchylenie standardowe między powtórzeniami dla każdego pomiaru, używając narzędzia „formuły” w arkuszu kalkulacyjnym (Rysunek 4G).
         3. Oblicz błąd standardowy (SE) za pomocą narzędzia „formuły” w arkuszu kalkulacyjnym.
            Uwaga: SE = s/√n, gdzie (s) to odchylenie standardowe populacji, a (n) to wielkość (liczba obserwacji) próby.
         4. Przetestuj istotność wyników, stosując test t dla średniej intensywności sygnału oraz wartości błędu standardowego obliczonych w opisany wyżej sposób.
         5. Narysuj wykres słupkowy, używając powyższych wartości, aby graficznie przedstawić ilościową różnicę w poziomie kalozy między dwoma różnymi tłami, korzystając z narzędzia „wstaw” w arkuszu kalkulacyjnym (Rysunek 4H).
            Uwaga: Linie mutantów/nadekspresyjne silnych kandydatów wykażą różne poziomy kalozy w porównaniu do typu dzikiego, takie jak brak kalozy, niewielka ilość kalozy lub hiperakumulacja kalozy w PD.

Wyniki

W obecnym układzie wykorzystano linie AtGSL8 z indukowalnym przez dekzametazon (dex) RNAi [dalej dsGSL8 (+dex/-dex)], ponieważ homozygotyczne mutanty z insercją T-DNA w genie gsl8 są letalne na etapie siewki¹⁸. Trzydniowe etiolowane siewki dsGSL8 oraz siewki typu dzikiego z ±dex poddano działaniu bodźców fototropicznych i gravitropicznych. Stwierdzono, że siewki dsGSL8 (+dex) wykazują defekty w fototropizmie i gravitropizmie¹⁵

Dyskusja

W tym manuskrypcie szczegółowo opisano strategię badania przesiewowego zmutowanych/nadmiernych linii ekspresji, które są wadliwe w odpowiedziach fototropowych i grawitropowych z powodu zmienionej kalozy PD, a tym samym PD SEL. Synteza i degradacja kalozy PD odbywa się głównie przez syntazy kalozy i β-1,3-glukanazy, ale regulacja tych enzymów jest kontrolowana przez wiele czynników poprzedzających. Aby wyszukać takie czynniki początkowe lub kandydatów, którzy są bezpośrednio zaangażowani w regulację PD, opracowaliśmy tę m...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
HPTS (sól trisodowa kwasu 8-hydroksypireno-1,3,6-trisulfonowego)	Sigma	H1529-1G	Barwnik fluorescencyjny jako znacznik symplazmatyczny
LE Agaroza	Dongin-Genomic	GEL001-500G	Używany do bloku agarozy HPTS
Kuchenka mikrofalowa	LG-Goldstar		Maszyna do gotowania żelu agarozowego
100 ml szklana kolba stożkowa	Dong Kwang	A0205	Służy do gotowania agarozy HPTS żelowa
szalka Petriego (35 mm x 10 mm)	SPL nauki przyrodnicze	SPL10035	Służy do wytwarzania bloków agarozowych HPTS i mycia próbek roślin
Szkiełka podstawowe i szkiełka mikroskopowe (24 mm x 50 mm)	Szkło laboratoryjne Marienfeld	101222	Służy do bloków agarozowych HPTS i przygotowywania próbek mikroskopowych
Płytki pośrednie MS 125 mm x 125 mm x 20 mm	SPL nauki przyrodnicze	SPL11125	Płytki do produkcji podłoża agarowego MS
Nożyczki	Niemcy Stal nierdzewna	HSB 942-11	Służy do wycinania obszaru hakowego próbek roślinnych
Murashige i Skoog (MS) mieszanina soli bazowej	Duchefa	P10453.01	MS pożywka zawierająca witaminy.
(N-morfolino) kwas etanosulfonowy (MES) monohydrat	Bioshop	3G30212	Do produkcji pożywek MS.
Agar	roślinny Duchefa	P1001.1000	Do zestalania pożywki MS.
Autoklaw	ALP	CL-40L
Shaker	Wise Mix	SHO-1D	Do spokojnego zmywania buforu barwiącego anilinę i barwnika HPTS.
1 ml Niebieskie końcówki	Sorenson	10040
Pipeta 1 ml	BioPette	L-1101-2
Taśma chirurgiczna	MIcropore	1530-0	Do uszczelniania płytki MS
Błękit anilinowy (błękit metylowy)	Sigma	M5528-25G	Służy do przygotowania buforu do barwienia błękitu anilinowego.
Glycine	Bioshop	GLN001	Służy do przygotowania buforu do barwienia błękitu anilinowego.
DDG	Sigma	D8375-1G	Służy do hamowania syntaz kalozy.
Mikroskop konfokalny	Olympus	FV1000MPE SIM	Aby sprawdzić barwienie błękitem anilinowym i wynik obciążenia barwnikiem HPTS.
Mieszadło	I lab	K400	Do mieszania roztworu mediów.
Folia aluminiowa	SW folia		Do owijania talerzy w ciemnym stanie.
Podchloryn sodu	Samjin Przemysł		Do nasion sterylizowanych powierzchniowo

do gotowania