Artykuł metodologiczny

Podwójne wytwarzanie emulsji przy użyciu współosiowego urządzenia do ustawiania ostrości przepływu z polidimetylosiloksanu (PDMS)

DOI:

10.3791/53516

⸱

25 grudnia 2015

 ,  , 
1Department of Pharmaceutical Chemistry, University of California, San Francisco, 2Joint UCSF/UCB Bioengineering Graduate Group, University of California, San Francisco, 3Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California, San Francisco, 4California Institute for Quantitative Biosciences, University of California, San Francisco

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroprzepływowe wytwarzanie podwójnych emulsji zazwyczaj obejmuje urządzenia o wzorzystej zwilżalności lub specjalnie wykonane elementy szklane. W tym miejscu opisujemy wytwarzanie i testowanie generatora podwójnej emulsji z polidimetylosiloksanu (PDMS), który nie wymaga obróbki powierzchni ani skomplikowanych procesów produkcyjnych i jest w stanie wytwarzać podwójne emulsje do 14 μm.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podwójne emulsje są przydatne w wielu zastosowaniach biologicznych i przemysłowych, w których ważne jest, aby mieć wodny płyn nośny. W artykule przedstawiono urządzenie mikroprzepływowe z polidimetylosiloksanu (PDMS) zdolne do generowania podwójnych emulsji woda/olej/woda przy użyciu współosiowej geometrii ogniskowania przepływu, którą można wytworzyć w całości przy użyciu miękkiej litografii. Podobnie jak w przypadku urządzeń emulsyjnych wykorzystujących szklane kapilary, podwójne emulsje mogą być formowane w kanałach o jednolitej zwilżalności i wymiarach znacznie mniejszych niż rozmiary kanałów. Trójwymiarową geometrię ogniskowania przepływu uzyskuje się poprzez odlewanie pary płyt PDMS za pomocą dwuwarstwowej miękkiej litografii, a następnie łączenie płyt ze sobą w konfiguracji muszli. Uzupełniające funkcje blokujące uformowane w płytach PDMS umożliwiają dokładną rejestrację cech na każdej z powierzchni płyty. Testy urządzeń wykazały tworzenie podwójnych emulsji o średnicy od 14 μm do 50 μm przy użyciu dużych kanałów, które są odporne na zanieczyszczenia i zatykanie.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podwójne emulsje składają się z kropelek oddzielonych od fazy nośnej pośrednią, niemieszającą się warstwą płynu, i są szczególnie interesujące ze względu na ich potencjalne zastosowania w zastosowaniach przemysłowych, farmaceutycznych i biologicznych1. W niektórych przypadkach zdolność do hermetyzacji związków o wysokiej wartości w rdzeniu podwójnej emulsji umożliwia ochronę i uwalnianie materiału w kontrolowany sposób. Na przykład leki mogą być kapsułkowane w warunkach rozpuszczalności, które nie są odpowiednie dla zewnętrznego płynu nośnego2. Dodatkowo pośrednia warstwa oleju może być używana jako szablon kapsułki do kapsułkowania i dostarczania leków, kosmetyków i składników odżywczych3. W biologii podwójne emulsje są również przydatne w wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych, ponieważ pozwalają na przeprowadzenie ogromnej liczby eksperymentów sub-nanolitrowych, a następnie wykrycie i posortowanie za pomocą urządzenia do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS)4,5.

Projektowanie podwójnych emulsji o pożądanych właściwościach użytkowych wymaga precyzyjnej kontroli wielkości, składu i jednorodności podwójnej emulsji. Chociaż procesy emulgowania masowego, takie jak emulgacja membranowa, są stosowane w przemyśle, powstałe emulsje są wysoce polidyspersyjne, wykazując szeroką gamę właściwości funkcjonalnych1. Dziedzina mikrofluidyki kropelkowej jest naturalnie dostosowana do wytwarzania emulsji monodyspersyjnych o starannie kontrolowanym składzie6. Wytwarzanie podwójnej emulsji mikroprzepływowej osiągnięto dzięki dwóm głównym strategiom: sekwencyjnemu wytwarzaniu kropli i skupianiu przepływu kapilarnego w szkle. Podwójne emulsje mogą być generowane w planarnych urządzeniach PDMS przy użyciu dwuetapowego procesu wytwarzania kropli. Po pierwsze, emulsje wodne w oleju są tworzone przy użyciu obszaru wytwarzania kropli woda w oleju urządzenia z hydrofobowymi ściankami kanałów. Następnie emulsję można spłynąć lub ponownie wstrzyknąć do obszaru wytwarzania kropli o hydrofilowych ściankach odpowiednich do wytwarzania oleju w kropli wody4. Jednak hydrofilowa obróbka powierzchni PMDS wymaga dodatkowego etapu produkcji i często jest tymczasowa7. Najbardziej kontrolowaną i powtarzalną metodą tworzenia podwójnych emulsji jest współosiowe ogniskowanie przepływu, technika zapoczątkowana przy użyciu mikrofluidyki szklanej kapilarnej, w której koncentryczny strumień zawierający trzy fazy jest przecinany przez mały otwór w celu wytworzenia monodyspersyjnych kropel8. Technika ta pozwala na wytwarzanie kropelek znacznie mniejszych niż wymiary kanału, przy czym dokładny rozmiar i skład podwójnej emulsji jest funkcją natężenia przepływu każdej fazy. Duża różnica między wielkością kropli a rozmiarem kanału oraz ochronny przepływ osłony zewnętrznej zapobiegają kontaktowi kropel ze ściankami kanału, dzięki czemu obróbka powierzchni jest zbędna. Jednak takie szklane urządzenia wymagają niestandardowego wykonania stożkowych końcówek kapilarnych, wraz ze starannym montażem i uszczelnieniem. Poprzedni badacze używali miękkiej litografii 3D do generowania podwójnych emulsji przy użyciu fizyki ogniskowania przepływu, ale urządzenia te wytwarzały emulsje o średnicach > 150 μm 9,10, czyli mniej więcej o rząd wielkości większych niż obiekty zwykle sortowane za pomocą FACS. Atrakcyjną alternatywą byłaby solidna funkcjonalność i wytwarzanie małych kropelek szklanego kapilarnego współosiowego ogniskowania przepływu w połączeniu z łatwością produkcji miękkiej litografii PDMS.

W tym artykule opisujemy podwójny generator emulsji, który wykorzystuje współosiowe ogniskowanie przepływu do produkcji emulsji o ≤ 50 μm i jest zbudowany w całości przy użyciu miękkiej litografii 3D11. Nasze urządzenie wykorzystuje podejście typu clamshell do wytwarzania urządzeń, które zawierają mały kanał ścinający (rysunek 1) w celu przybliżenia procesów tworzenia emulsji w ciągnionej szklanej dyszy kapilarnej. Co ważniejsze, urządzenia te nie wymagają specjalnej obróbki powierzchni, a całkowicie polimerowa konstrukcja zapewnia łatwą i powtarzalną produkcję, skalowalną do dużej liczby zduplikowanych urządzeń. W tym miejscu przedstawiamy projekt, produkcję i testowanie generatora podwójnej emulsji. Wykazano, że podwójne wytwarzanie emulsji jest wytrzymałe i powtarzalne aż do kropel o średnicy 14 μm. Połączenie funkcjonalności z łatwością produkcji sprawia, że urządzenie to jest atrakcyjną opcją do opracowywania nowych zastosowań podwójnej emulsji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Produkcja główna SU8

  1. Zaprojektuj struktury mikroprzepływowe do produkcji dwuwarstwowej za pomocą oprogramowania AutoCAD i zleć wydrukowanie projektów dostawcy na folii obwodów drukowanych o rozdzielczości 10 μm. Szczegóły konstrukcji urządzenia podano w załączonym piśmiennictwie11, a geometrie kanałów przedstawiono na rysunku 1. Warstwy powinny zawierać znaczniki wyrównania, aby ułatwić kolokację elementów z każdej warstwy produkcyjnej12.
  2. Umieść wstępnie oczyszczoną płytkę silikonową o średnicy 3 cali na powlekarce wirowej i włącz próżnię, aby przymocować ją do uchwytu. Nałóż 1 ml SU8-3035 na środek wafla i wiruj przez 20 sekund przy 500 obr./min, a następnie 30 sekund przy 2 000 obr./min, uzyskując grubość warstwy 50 μm.
  3. Wyjmij wafel i piecz na płycie grzejnej o temperaturze 135 °C przez 30 minut. Poczekaj, aż wafel ostygnie do temperatury RT, zanim przejdziesz do następnego kroku.
  4. Wystaw powlekaną płytkę na maskę 1. warstwy (Rysunek 2A) pod skolimowaną diodą LED 190 mW, 365 nm przez 90 sekund. Po ekspozycji umieść wafel na płycie grzejnej o temperaturze 135 °C na 1 minutę, a następnie ostudź do temperatury pokojowej przed przejściem do następnego kroku.
  5. Umieść wafel na powlekarce wirowej i włącz próżnię, aby przymocować go do uchwytu. Nałóż 1 ml SU8-2050 na środek wafla i wiruj przez 20 sekund przy 500 obr./min, a następnie 30 sekund przy 1,375 obr./min, uzyskując warstwę o dodatkowej grubości 135 μm.
  6. Wyjmij wafel i piecz na płycie grzejnej o temperaturze 135 °C przez 30 minut, a następnie ostudź do temperatury RT przed przejściem do następnego kroku.
  7. Dopasuj maskę 2. warstwy (Rysunek 2B) do geometrii przedstawionej w 1.3 i wystawij powlekaną płytkę na działanie skolimowanej diody LED o mocy 190 mW, 365 nm przez 3 minuty. Po ekspozycji umieść na płycie grzejnej o temperaturze 135 °C na 1 minutę, a następnie ostudź do temperatury RT przed przejściem do następnego kroku.
  8. Opracuj maski, zanurzając się w mieszanej kąpieli octanu eteru monometylowego glikolu propylenowego na 30 minut. Umyj wafel w izopropanolu i piecz na płycie grzejnej o temperaturze 135 °C przez 1 minutę. Umieść wywołany wzorzec na szalce Petriego o średnicy 100 mm do formowania PDMS.

2. Produkcja urządzeń PDMS

  1. Przygotuj PDMS 10:1, łącząc 50 g bazy silikonowej z 5 g utwardzacza w plastikowym kubku. Wymieszaj zawartość za pomocą narzędzia obrotowego wyposażonego w patyczek do mieszania. Odgazowywać mieszaninę wewnątrz eksykatora przez 30 minut lub do momentu usunięcia wszystkich pęcherzyków powietrza.
  2. Wlać PDMS do uzyskania grubości 3 mm na urządzenie główne i umieścić z powrotem w eksykatorze w celu dalszego odgazowania. Po usunięciu wszystkich pęcherzyków piecz urządzenie w temperaturze 60 °C przez 2 godziny.
  3. Wytnij urządzenie z formy za pomocą skalpela i umieść na czystej powierzchni wzorzystą stroną do góry. Przetnij formę PDMS na pół za pomocą żyletki, aby oddzielić Mistrza 1 od Mistrza 2 (Rysunek 3a). Na elemencie zawierającym geometrię do obsługi płynów 50 μm nadrukowaną przez Master 1 przebić wloty i wyloty płynów za pomocą stempla biopsyjnego o średnicy 0,75 mm.
  4. Plazma uzdatnia urządzenia przy plazmie 1 mbarO2 przez 60 sekund w myjce plazmowej o mocy 300 W. Zwilż powierzchnię niewykrawanego kawałka PDMS kroplą wody DI, aby tymczasowo opóźnić wiązanie PdMS-PDMS i służyć jako smar. Podczas oglądania przez mikroskop stereoskopowy umieść Master 1 na powierzchni Master 2 i przesuwaj powierzchnie względnie, aż zostanie osiągnięta blokada mechaniczna, gdy wpuszczone ramki i wystające ramki na rysunku 3A łączą się.
  5. Umieść urządzenie w piekarniku o temperaturze 60 °C i piecz zmontowane urządzenie (Rysunek 3B) przez dwa dni w temperaturze 60 °C, aby odparować wodę i całkowicie związać.

3. Przygotowanie odczynników

  1. Napełnić strzykawkę o pojemności 1 ml wodą destylowaną dla fazy wewnętrznej.
  2. Napełnić strzykawkę o pojemności 1 ml olejem fluorowanym HFE 7500 z 1 % wag. biokompatybilnego środka powierzchniowo czynnego13 dla fazy środkowej.
  3. Napełnić strzykawkę o pojemności 10 ml 10% glikolem polietylenowym (PEG) w roztworze wodnym zawierającym 1 % wag. Tween 20 i 1% wag. dodecylosiarczanu sodu dla fazy ciągłej.

4. Przygotowanie systemu

  1. Umieść chip mikroprzepływowy na stoliku mikroskopu odwróconego sprzężonego z kamerą cyfrową zdolną do < czasów otwarcia migawki 100 μs.
  2. Zamontuj wszystkie strzykawki na pompkach strzykawkowych i przymocuj igły 27 G. Przymocuj ~ 30 cm odcinki rurki PE-2 do igieł i włóż luźne końce do odpowiednich wybitych otworów w urządzeniu.
  3. Włóż PE-2 o długości 10 cm do portu wyjściowego urządzenia, a drugi koniec umieść w pojemniku na odpady.
  4. Zalać urządzenie, uruchamiając pompy strzykawkowe z dużą prędkością (2 000 μl/min), aż płyn w segmentach przewodów dotrze do portów wlotowych urządzenia.

5. Wytwarzanie emulsji

  1. Ustaw ostroskop na obszarze, w którym znajduje się otwór 50 μm x 50 μm i dolny kanał wyjściowy.
  2. Ustawić pompy strzykawkowe tak, aby dostarczały płyn do podwójnego generatora emulsji przy natężeniu przepływu 250 μl/h dla fazy wewnętrznej, 100 μl/h dla fazy środkowej i 700 μl/h dla fazy ciągłej i odczekać 10 minut na wyrównanie.
  3. Utrzymuj natężenie przepływu fazy wewnętrznej i środkowej na poziomie odpowiednio 250 μl/h i 100 μl/h. Ustawić natężenie przepływu fazy zewnętrznej na 1 050 μl/h. Odczekaj 3-5 minut, aż podwójne wytwarzanie emulsji ustabilizuje się w tych warunkach przepływu.
  4. Rejestruj 5-sekundowe obrazy wideo z częstotliwością odświeżania 30 Hz do przetwarzania w trybie offline za pomocą ręcznej analizy obrazu.
  5. Powtórzyć czynności opisane w ppkt 5.3 i 5.4 z natężeniami przepływu podanymi w tabeli 1. Natężenie przepływu w fazie wewnętrznej i środkowej jest utrzymywane na stałym poziomie, a natężenie przepływu w fazie nośnej zmienia się poprzez regulację ustawienia pompy strzykawkowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Generator podwójnej emulsji składa się ze współosiowego urządzenia do ogniskowania przepływu, stworzonego przy użyciu produkcji 3D PDMS (Rysunek 1A). Geometria umożliwia formowanie trójfazowego współosiowego strumienia w kwadratową kryzę o wymiarach 50 μm x 50 μm, co pozwala na tworzenie podwójnych emulsji woda/olej/woda (rysunek 1B, rysunek 1C). Wewnętrzna faza wodna i środkowa faza olejowa są połączone na złączu o wymiarach kanału 10 μm...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisana tutaj geometria generująca podwójną emulsję została zaprojektowana tak, aby naśladować fizykę szklanych urządzeń kapilarnych8. W nich wyrównane cylindryczne szklane kapilary są używane do tworzenia trójfazowego współosiowego strumienia, który jest ścinany w jednolite podwójne kropelki emulsji. Funkcja naszego urządzenia 3D PDMS zależy od centralnego wyrównania małych elementów utworzonych za pomocą produkcji o wysokości 50 μm z kanałami fazy nośnej o całkowitej wysokości 320 μm. Istnieje znaczne ryzyko...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została wsparta przez Research Award od California Institute for Quantitative Biosciences (QB3), Bridging the Gap Award od Rogers Family Foundation, UCSF/Sandler Foundation Program for Breakthrough Biomedical Research, grant od BASF oraz NSF poprzez Faculty Early Career Development (CAREER) Program (DBI-1253293).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
FotomaskiCadArt Servcies
3-calowe wafle silikonowe, typ P, klasa dziewiczaWafle uniwersyteckie447
SU-8 3035MicrochemY311074
SU-8 2050MicrochemY111072
Sylgard 184 zestaw elastomerów silikonowychKrayden4019862
strzykawki 1 mlBD
strzykawki 10 mlBD309604
27 igieł gaugueBD305109
PE 2 rurki polietylenoweScientific Commodities, Inc.B31695-PE/2
Novec 7500Fisher Scientific98-0212-2928-5Powszechnie znany jako HFE 7500
Biokompatybilny środek powierzchniowo czynnyRan Biotechnologies008-FluoroSurfaktant
35 000 MW PEGSigma Aldrich1546660
Tween 20Sigma AldrichP1369
Dodecylosiarczan Sigma AldrichL3771
Test 309628

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Van Der Graaf, S., Schroën, C. G. P. H., Boom, R. M. Preparation of double emulsions by membrane emulsification - A review. J. Membrane Sci. 251 (1-2), 7-15 (2005).
  2. Laugel, C., Baillet, A. P., Youenang Piemi, M., Marty, J., Ferrier, D. Oil-water-oil multiple emulsions for prolonged delivery of hydrocortisone after topical application: comparison with simple emulsions. Int. J. Pharm. 160 (1), 109-117 (1998).
  3. Kim, S. H., Kim, J. W., Cho, J. C., Weitz, D. A. Double-emulsion drops with ultra-thin shells for capsule templates. Lab Chip. 11 (18), 3162-3166 (2011).
  4. Lim, S. W., Abate, A. R. Ultrahigh-throughput sorting of microfluidic drops with flow cytometry. Lab Chip. 13 (23), 4563-4572 (2013).
  5. Bernath, K., Hai, M., Mastrobattista, E., Griffiths, A. D., Magdassi, S., Tawfik, D. S. In vitro compartmentalization by double emulsions: sorting and gene enrichment by fluorescence activated cell sorting. Anal. Biochem. 325 (1), 151-157 (2004).
  6. Seemann, R., Brinkmann, M., Pfohl, T., Herminghaus, S. Droplet based microfluidics. Rep. Prog. Phys. 75 (1), 016601(2012).
  7. Bauer, W. A. C., Fischlechner, M., Abell, C., Huck, W. T. S. Hydrophilic PDMS microchannels for high-throughput formation of oil-in-water microdroplets and water-in-oil-in-water double emulsions. Lab Chip. 10 (14), 1814-1819 (2010).
  8. Utada, A. S., Lorenceau, E., Link, D. R., Kaplan, P. D., Stone, H. A., Weitz, D. A. Monodisperse double emulsions generated from a microcapillary device. Science. 308 (5721), 537-541 (2005).
  9. Chang, F. C., Su, Y. C. Controlled double emulsification utilizing 3D PDMS microchannels. J. Micromech. Microeng. 18 (6), 065018(2008).
  10. Romanowsky, M. B., Abate, A. R., Rotem, A., Holtze, C., Weitz, D. A. High throughput production of single core double emulsions in a parallelized microfluidic device. Lab Chip. 12 (4), 802-807 (2012).
  11. Tran, T. M., Cater, S., Abate, A. R. Coaxial flow focusing in poly(dimethylsiloxane) microfluidic devices. Biomicrofluidics. 8 (1), 016502(2014).
  12. Lithography. , Available from: https://www.memsnet.org/mems/processes/lithography.html (2015).
  13. O'Donovan, B., Eastburn, D. J., Abate, A. R. Electrode-free picoinjection of microfluidic drops. Lab Chip. 12 (20), 4029-4032 (2012).
  14. Chang, F. C., Lin, H. H., Su, Y. C. Controlled W/O/W double emulsification in 3-D PDMS micro-channels. 3rd IEEE Int. Conf. Nano/Micro Eng. Mol. Syst. NEMS, , 792-795 (2008).
  15. Romanowsky, M. B., Abate, A. R., Rotem, A., Holtze, C., Weitz, D. A. High throughput production of single core double emulsions in a parallelized microfluidic device. Lab Chip. 12 (4), 802(2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

PDMS Microfluidic DeviceCoaxial Flow FocusingSoft Lithography FabricationWater Oil Water EmulsionsMicrofluidic Chip DesignSyringe Pump SetupPlasma Bonding TechniqueDroplet Size AnalysisFlow Cytometry Compatibility

Powiązane artykuły