Ten protokół opisuje technikę oceny zmian w unaczynieniu matki podczas ciąży u myszy. Za pomocą metod stereologicznych ocenia się ilościowo przebudowę dziesiętnych tętnic spiralnych, a wyniki potwierdza się jakościowo za pomocą immunohistochemii.
Artykuł metodologiczny
Ocena przebudowy naczyń krwionośnych matki w czasie ciąży w macicy myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Łożysko pośredniczy w wymianie czynników takich jak gazy i składniki odżywcze między matką a płodem i ma specyficzne zapotrzebowanie na dopływ krwi z krążenia matki. Unaczynienie macicy matki musi dostosować się do tego tymczasowego zapotrzebowania, a powodzenie tego procesu przebudowy tętnic ma wpływ na wzrost płodu. Komórki matczynego układu odpornościowego, zwłaszcza komórki NK (natural killer), odgrywają kluczową rolę w tym procesie. W tym miejscu opisujemy metodę oceny stopnia przebudowy tętnic spiralnych matki podczas ciąży myszy. Skanowane są skrawki tkanek barwione hematoksyliną i eozyną, a następnie analizowana jest wielkość naczyń. Jako uzupełniającą metodę walidacji przedstawiamy również jakościową ocenę powodzenia procesu przebudowy poprzez immunohistochemiczne wykrywanie aktyny mięśni gładkich (SMA), która normalnie znika z ośrodka naczyniowego tętniczego w połowie ciąży. Razem metody te umożliwiają określenie ważnego parametru fenotypu ciąży. Wyniki te można połączyć z innymi punktami końcowymi ciąży myszy, aby zapewnić wgląd w mechanizmy leżące u podstaw powikłań związanych z ciążą.
Wprowadzenie
Wymiana składników odżywczych, gazów i produktów przemiany materii podczas ciąży eutheriańskiej odbywa się za pośrednictwem łożyska. W żeńskich drogach rodnych tętnice maciczne są głównymi kanałami krwi do macicy. Po implantacji rozgałęziają się one w wyspecjalizowane naczynia zwane tętnicami spiralnymi, które wiją się przez decidua basalis w kierunku jednostki płodowo-łożyskowej. Średnica i elastyczność tych spiralnych tętnic, które są otoczone leukocytami, w szczególności komórkami NK macicy (uNK), decydują o objętości i prędkości krwi dostępnej dla łożyska1,2. Prawidłowe zmiany hemodynamiczne w wyniku przebudowy tętnic spiralnych mają kluczowe znaczenie dla powodzenia ciąży.
Chociaż mechanizmy leżące u podstaw różnią się szczegółowo między ciążą ludzką a mysią, końcowym wynikiem procesu przebudowy u obu gatunków jest rozszerzone, wysokoprzewodzące unaczynienie, które traci warstwę mięśni gładkich. U myszy interferon pochodzący z komórek uNK (IFN-)γ jest niezbędny do wywołania tych zmian około połowy ciąży3-5. Myszy, które nie mają komórek NK lub składników szlaku sygnałowego IFN-γ, nie przechodzą tych zmian, co wiąże się ze zmniejszonym wzrostem płodu6,7, co podkreśla znaczenie odpowiedniego dopływu krwi do jednostki płodowo-łożyskowej. We wczesnej ciąży u ludzi śródmiąższowa i wewnątrznaczyniowa inwazja trofoblastu pozakosmkowego oraz ich interakcja z komórkami uNK są ważne dla wywoływania zmian naczyniowych i promowania wzrostu płodu8-10. Komórki uNK mogą koordynować inwazję ludzkiego trofoblastu poprzez chemokiny11 i cytokiny, takie jak makrofagi granulocytów - czynnik stymulujący tworzenie kolonii (GM-CSF)12. Płytka inwazja trofoblastu wiąże się ze zmniejszoną przebudową tętnic i powikłaniami ciąży, takimi jak stan przedrzucawkowy9.
Ten protokół opiera się na pionierskiej pracy Anne Croy, która opisała ważną rolę układu odpornościowego, a w szczególności pochodzącego z NK IFN-γ dla udanej przebudowy naczyń krwionośnych poprzez immunohistochemię i eleganckie eksperymenty transferowe5,13. Tutaj opisujemy szybki i ekonomiczny sposób oceny stanu przebudowy tętnic spiralnych. Chociaż nasze laboratorium rutynowo ocenia to w połowie ciąży (dzień ciąży (gd)9,5)14, proces przebudowy odbywa się między gd8,5 a12,5 gd. 15. Pojawienie się automatycznych skanerów do slajdów znacznie ułatwiło ocenę obszarów naczyń i strumieni świetlnych na podstawie przekrojów i stwierdziliśmy, że jest to bardziej powtarzalne podejście niż pomiar średnic naczyń. Dodanie immunohistochemicznej detekcji SMA pozwala na prostą walidację wyników uzyskanych z oceny stereologicznej. Podobnie jak w przypadku wszystkich technik stereologicznych, zaleca się przeprowadzenie oceny jako zaślepionego eksperymentu przez co najmniej dwóch egzaminatorów. W tym celu można wprowadzić etap randomizacji podczas seryjnego cięcia próbek, tak aby badacze oceniający preparaty nie wiedzieli, z jakiej grupy eksperymentalnej pochodzą próbki.
Ogólnym celem tego protokołu jest dostarczenie niezawodnego narzędzia do dokładnej oceny przebudowy tętnic spiralnych u myszy o zdefiniowanych genotypach matki i ojca, w kontekście mysich modeli dla powikłań związanych z ciążą. Wyniki podkreślają zależność od komórek uNK tego procesu, który jest niezbędny do prawidłowego wzrostu płodu.
Protokół
Wszystkie procedury omówione w tym manuskrypcie są zgodne z przepisami brytyjskiego Ministerstwa Spraw Wewnętrznych i są zatwierdzone przez Panel Oceny Etycznej Cambridge.
1. Pobieranie próbek
- Ustaw krycie w określonym czasie przy użyciu 8-12 tygodniowych samic myszy C57BL/6 z dorosłymi samcami (do 2 samic na samca) po południu. Sprawdź, czy nie ma czopów dopochwowych jako oznaki kopulacji wcześnie rano w kolejnych dniach. Obecność wtyczki o poranku oznacza gd0.5.
- W dniu gd9.5 poddaj zwierzę eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy i otwórz jamę brzuszną. Należy pamiętać, że eutanazja za pomocą CO2 może powodować rozszerzenie naczyń krwionośnych.
- Użyj nici dentystycznej, aby delikatnie podwiązać tętnice maciczne (ryc. 1, przerywane strzałki). Zawiąż nić dentystyczną wokół tętnic na końcu każdego rogu macicy, proksymalnie do jajników, a także wokół szyjki macicy.
Uwaga: Nie należy pękać naczyń, ponieważ może to spowodować zapadnięcie się tętnic. - Szybko wypreparuj macicę za pomocą nożyczek preparacyjnych, wycinając całą macicę dystalnie do trzech punktów podwiązania na końcu rogów macicy i szyjki macicy.
- Umieść macicę na przygotowanym kawałku styropianu tak, aby oba rogi były ustawione wzdłuż tej samej długiej osi w przeciwnych kierunkach niż szyjka macicy. Delikatnie rozciągnij go i przypnij za pomocą 2-3 igieł o wadze 25 G.
- Zanurz polistyren w przygotowanej stożkowej tubie o pojemności 50 ml. Uzupełnij do 50 ml 10% formaliną. Fix na 5-6 godzin w temperaturze pokojowej.
- Odrzuć roztwór formaliny i zastąp go 50 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) na 5 minut.
- Wytnij dwa rogi macicy proksymalnie do punktu podwiązania na każdym końcu i proksymalnie do szyjki macicy pośrodku, odetnij nadmiar tłuszczu wokół miejsc implantacji i przemyj dwukrotnie w PBS przez 5 minut, aby usunąć ślady formaliny.
- Próbki należy przechowywać w 70% etanolu w temperaturze 4 °C (przez okres do dwóch tygodni) do czasu przetworzenia.
UWAGA: Etanol jest wysoce łatwopalny. - Należy stosować zautomatyzowany system przetwarzania z wykorzystaniem parametrów wskazanych w tabeli 1. Osadź rogi pojedynczo w parafinie, aby można je było przeciąć wzdłuż płaszczyzny prostopadłej do długiej osi macicy. Gwarantuje to, że maksymalny obszar każdego miejsca implantacji zostanie odsłonięty do analizy w środku bloku (Rysunek 2A).
OPCJONALNIE: Jest to dogodny punkt czasowy do losowania bloków w razie potrzeby. - Za pomocą mikrotomu wyciąć z bloków odcinki szeregowe o grubości 7 μm. Zabarwić jeden fragment w odstępie co 49 μm hematoksyliną i eozyną (H&E, patrz punkt 2.1). Pozostałe sekcje należy przechowywać w temperaturze pokojowej do barwienia SMA i innych dalszych zastosowań.
Tabela 1: Ustawienia automatycznego przetwarzania tkanek. Przegląd ustawień stosowanych do przetwarzania tkanki macicy
2. Ocena stereologiczna
- Barwienie H&E
- Sekcje odparafinować poprzez zanurzenie szkiełek zamontowanych w stojaku na szkiełka w kąpieli 100% ksylenowej na 10 minut w temperaturze pokojowej.
UWAGA: Ksylen jest łatwopalny i podejrzewa się, że jest rakotwórczy, który jest toksyczny w kontakcie i wdychaniu . Prace te należy wykonywać pod wyciągiem, przy użyciu środków ochrony osobistej (PPE). - Zanurz szkiełka w kąpieli zawierającej czysty ksylen na kolejne 10 minut.
- Kolejno zanurzaj szkiełka w wannach zawierających 100% etanolu, 95% etanolu, 70% etanolu i oczyszczonej wody na 5 minut każda.
- Zanurz szkiełka w 50% roztworze hematoksyliny Gill No 3, rozcieńczonym oczyszczoną wodą, na 5 min.
UWAGA: Hematoksylina jest szkodliwa po spożyciu i kontakcie z oczami. Podczas obsługi należy nosić odpowiednie środki ochrony indywidualnej. - Myć szkiełka w korycie barwiącym pod bieżącą wodą z kranu przez 10 minut.
- Zanurz szkiełka w 1% roztworze kwasu/alkoholu (1% 10 M kwas solny w 70% etanolu) na 10 sekund i umyj w korycie barwiącym pod bieżącą wodą z kranu.
- Zanurz szkiełka w roztworze eozyny na 30 sekund i umyj w korycie barwiącym pod bieżącą wodą z kranu przez 10 minut.
- W dygestorium należy kolejno zanurzać szkiełka w wannach zawierających 70% etanolu, 95% etanolu i 100% etanolu na 5 minut każda.
- Zanurz szkiełka w kąpieli zawierającej ksylen na 10 minut.
- Szkiełka nakrywkowe należy zamontować za pomocą podłoża montażowego na bazie ksylenu. Wysuszyć poziomo i dokładnie w dygestorium przed wizualizacją szkiełek pod mikroskopem.
- Sekcje odparafinować poprzez zanurzenie szkiełek zamontowanych w stojaku na szkiełka w kąpieli 100% ksylenowej na 10 minut w temperaturze pokojowej.
- Stereologiczna ocena wielkości statku i stanu przebudowy
- Dla każdego miejsca implantacji określ, które sekcje znajdują się blisko punktu strzałkowego. Przyczepienie kosmówkowo-omocznikowe między płodem a rozwijającym się łożyskiem służy jako dobry wskaźnik punktu środkowego strzałkowego.
- Do analizy należy wybrać 3 sekcje w odstępach 49 μm w pobliżu punktu strzałkowego. Skanowanie wybranych slajdów. Aby uniknąć włączania żył, które, jak wykazano, są bardziej obwodowo zlokalizowane w miejscach implantacji16, należy ograniczyć analizę do centralnych 2/4 każdego miejsca implantacji (ryc. 2A).
- Aby ocenić wielkość światła, obrysuj wnętrze naczyń i zapisz obszar tego kształtu. Aby uzyskać całkowity rozmiar naczynia, obrysuj zewnętrzną ścianę naczynia, w tym komórki śródbłonka, perycyty i leukocyty śródścienne.
Uwaga: Stosunek całkowitej wielkości naczynia do strumienia świetlnego jest wskaźnikiem zastępczym dla statusu przebudowy statku. Ponieważ naczynia wiją się przez płaszczyznę, wzdłuż której przecięto przekrój, na jednym slajdzie może znajdować się wiele przekrojów tej samej tętnicy. Unikaj wielokrotnego mierzenia tej samej tętnicy. - Zapisz pomiary z 5 naczyń w każdym miejscu implantacji o największych i najbardziej okrągłych lumenach. Zmierzyć każde miejsce implantacji w trzech egzemplarzach (trzy sekcje oddalone od siebie o 49 μm). Średnia z tych 15 pomiarów reprezentuje średnią średnicę największych zbiorników.
- Aby uniknąć nadreprezentacji większych naczyń w niektórych próbkach, należy zmierzyć tę samą liczbę naczyń w każdym miejscu implantacji.
3. Ocena jakościowa z wykorzystaniem immunohistochemii
- Deparafinizacja i nawodnienie
- Sekcje odparafinować poprzez zanurzenie szkiełek zamontowanych w żaroodpornym stojaku na prowadnice w kąpieli 100% ksylenowej na 10 minut w temperaturze pokojowej.
- Zanurz szkiełka w kąpieli zawierającej czysty ksylen na kolejne 10 minut.
- Kolejno zanurzaj szkiełka w wannach zawierających 100% etanolu, 95% etanolu i 70% oraz oczyszczonej wody na 5 minut każda.
- Pobieranie antygenu
- Przygotować 10 mM bufor cytrynianu sodu w oczyszczonej wodzie i dostosować do pH 6 za pomocą 10 M kwasu solnego.
- Napełnij żaroodporny pojemnik, który może pomieścić 600 ml, 400 ml buforu cytrynianu sodu i umieść w domowym szybkowarze zawierającym wystarczającą ilość wody, aby zanurzyć połowę pojemnika. Luźno przymocuj pokrywę szybkowaru i podgrzewaj do wrzenia.
- Umieść ruszt wsuwany w buforze cytrynianu sodu i szczelnie zamocuj pokrywę szybkowaru. Po osiągnięciu ciśnienia gotuj przez 3 minuty.
- Rozhermetyzuj szybkowar i wyjmij pojemnik wewnętrzny. Pozostawić szkiełka do ostygnięcia w buforze cytrynianu sodu przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
- Myć szkiełka w kąpieli z oczyszczoną wodą przez 5 min.
- Ocal sekcje za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego.
- Umyj szkiełka, zanurzając je w PBS na 5 minut.
- Blokowanie endogennej peroksydazy i niespecyficzne wiązanie
- Inkubować sekcje z 3% nadtlenkiem wodoru rozcieńczonym w oczyszczonej wodzie w wilgotnej komorze przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
UWAGA: Nadtlenek wodoru działa silnie drażniąco na oczy, skórę i po spożyciu. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej. - Strzepnąć nadmiar roztworu nadtlenku wodoru i dwukrotnie umyć szkiełka, zanurzając je w buforowanej soli fizjologicznej Tris (TBS) na 2 minuty każda.
- Inkubuj skrawki z odczynnikiem blokującym immunoglobulinę myszy z zestawu mysz na myszy przygotowanego zgodnie z instrukcjami producenta.
- Umyj szkiełka dwukrotnie w TBS po 2 minuty każda.
- Inkubować sekcje z 3% nadtlenkiem wodoru rozcieńczonym w oczyszczonej wodzie w wilgotnej komorze przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
- Immunodetekcja aktyny mięśni gładkich
- Przygotować roztwór rozcieńczalnika przeciwciał (dostarczony w zestawie) i inkubować z sekcjami przez 5 minut w temperaturze pokojowej lub zgodnie z instrukcjami producenta.
- Rozcieńczyć mysią aktynę anty-ludzkich mięśni gładkich w stosunku 1:100 (DAKO M0851) w roztworze rozcieńczalnika przeciwciał. Rozcieńczyć kontrolę izotypu mysiego IgG2a w roztworze rozcieńczalnika przeciwciał, upewniając się, że końcowe stężenie immunoglobuliny jest równoważne w obu roztworach.
- Strzepnąć nadmiar roztworu rozcieńczalnika przeciwciał i przykryć skrawki rozcieńczonymi roztworami kontrolnymi przeciwciał lub izotypu. Inkubować w wilgotnej komorze przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
- Umyj szkiełka dwukrotnie w TBS po 2 minuty każda.
- Rozcieńczyć biotynylowane przeciwciało drugorzędowe przeciwko mysim i inkubować sekcje przez 10 minut w temperaturze pokojowej lub zgodnie z instrukcjami producenta.
- Myj szkiełka raz za pomocą TBS i PBS odpowiednio przez 2 minuty.
- Przygotować roztwór 3,3'-diaminobenzydyny (DAB) zgodnie z instrukcjami producenta. Przykryj sekcje roztworem DAB i inkubuj do 4 minut, upewniając się, że monitorujesz sekcje, aby uniknąć nadmiernego rozwoju koloru.
UWAGA: DAB jest łatwopalny i podejrzewa się, że jest rakotwórczy, który jest toksyczny w kontakcie i wdychaniu . Podczas obsługi należy nosić odpowiednie środki ochrony indywidualnej. - Zanurz szkiełka w oczyszczonej wodzie po osiągnięciu pożądanej intensywności barwienia.
- Przeciwbarwić 50% hematoksyliną Gill nr 3 przez 20 sekund i umyć w korycie barwiącym pod bieżącą wodą z kranu, aż woda będzie czysta.
- Odwodnienie i montaż
- W dygestorium należy kolejno zanurzać szkiełka w wannach zawierających 70% etanolu, 95% etanolu i 100% etanolu na 5 minut każda.
- Zanurz szkiełka w kąpieli zawierającej ksylen na 10 minut.
- Szkiełka nakrywkowe należy zamontować za pomocą podłoża montażowego na bazie ksylenu. Wysuszyć poziomo i dokładnie w dygestorium przed wizualizacją szkiełek pod mikroskopem
Wyniki
Myszy Rag2-/-IL2rg-/- nie posiadają wszystkich dojrzałych limfocytów, w tym komórek NK17, a ich tętnice maciczne nie ulegają zmianom naczyniowym obserwowanym u kongenicznych myszy typu dzikiego C57BL/6 (WT) w połowie okresu ciąży5,14. W wyniku tego ograniczonego przebudowywania naczynia u myszy Rag2-/-IL2rg-/- wykazują znacznie mniejszą powierzchnię światła, co wskazuje na ogólnie mniejszą średnicę naczyń, co można zwizualizować na przekrojach barwionych H&E i określić ilościowo stereologicznie (Rysunek 2). Ponadto względna grubość ściany (stosunek naczynia do światła) jest większa w tętnicach spiralnych u tych myszy, co sugeruje zmniejszony dopływ krwi i wyższą prędkość przepływu krwi.
Tę ocenę ilościową potwierdzono za pomocą detekcji immunohistochemicznej SMA. Dla myszy typu dzikiego (WT) charakterystyczna jest utrata większości SMA w błonie środkowej naczyń tętnic spiralnych do połowy okresu ciąży. Jeśli ten proces napędzany przez komórki NK nie zachodzi, SMA pozostaje w błonie środkowej naczyń i może zostać łatwo wykryta immunohistochemicznie w formie pierścieni wokół naczyń krwionośnych (Rysunek 3).
Rycina 1: Macica myszy w gd9.5, schematyczny przegląd. Rysunek przedstawiający względne położenie rogów macicy, szyjki macicy (kolor niebieski) i głównych tętnic macicznych (kolor czerwony). Wskazano oś długą rogów macicy (strzałki) oraz punkty podwiązania (strzałki przerywane). Przekroje do immunohistochemii są wykonywane wzdłuż płaszczyzny widoku.
Rysunek 2: Ocena stereologiczna przebudowy tętnic w połowie okresu ciąży. (A) Przykład oceny powierzchni światła oraz całkowitej powierzchni naczynia na przekrojach barwionych H&E u samic WT w środkowej 2/4 decidua basalis (wyznaczonej przez pionowe czarne linie przerywane) w dniu gd9,5. W naczyniach przy większym powiększeniu czerwona linia przerywana wyznacza całkowitą powierzchnię naczynia, a żółta linia przerywana wyznacza powierzchnię światła. Pasek skali = 500 µm (lewo), 50 µm (prawo). Długa oś macicy jest w tej orientacji linią poziomą. (B) Ilościowe oznaczenie powierzchni światła (panel lewy) oraz stosunku powierzchni światła do całkowitej powierzchni naczynia (panel prawy) u myszy WT (C57BL/6) i Rag2-/-Il2rg-/- (na tle C57BL/6). Każdy punkt danych reprezentuje średnią z 15 pomiarów (5 pomiarów na przekrój, 3 przekroje na miejsce implantacji). Słupki reprezentują średnią z n = 11-13 miejsc implantacji z 4 ciąż na grupę; wartość p pochodzi z dwustronnego, nieparzystego testu Mann-Whitneya. WT: typ dziki.
Rycina 3: Detekcja immunohistochemiczna aktyny mięśni gładkich w decidua basalis. Reprezentatywne barwienie SMA u myszy WT (góra) oraz Rag2-/-IL2rg-/- (na tle C57BL/6, dół) w dniu gd9.5. Pasek = 100 µm. WT: typ dziki.
Dyskusja
Przedstawiony tutaj protokół ma na celu zapewnienie powtarzalnej metody oceny zmian naczyniowych, które są niezbędne do udanej ciąży. Decydujące znaczenie dla powodzenia tej oceny ma jakość skrawków tkanek. Zarówno dokładne określenie wieku ciążowego miejsc implantacji, jak i niezawodne podwiązanie tętnic macicznych są kluczowymi krokami. Zmiany parametrów, takich jak czas utrwalenia, protokół przetwarzania tkanek itp., mogą również mieć wpływ na wynik. Aby uzyskać bezstronną ocenę stereologiczną, ważne jest, aby zmierzyć tę samą liczbę naczyń w każdym miejscu implantacji. Zaleca się zmierzenie 5 naczyń w każdym miejscu implantacji i każde miejsce implantacji w trzech egzemplarzach. Średnia z tych 15 pomiarów reprezentuje średnią wielkość 5 największych statków.
W nawiązaniu do danych z alymfoidalnych myszy Rag2-/-IL2rg-/- pokazanych tutaj, uznaliśmy ten protokół za przydatny dla wielu modeli nieodpowiedniej funkcji immunologicznej matki, w tym jednego z hamowanych komórek NK14. Wady w przebudowie tętnic wykazano również w modelach upośledzonej inwazji trofoblastu18 i opisane tutaj techniki mogą być pomocne w ocenie unaczynienia w tych przypadkach. Zoptymalizowaliśmy i zwalidowaliśmy ten protokół do badania dziesiętnej przebudowy naczyń w połowie ciąży u myszy, ale możliwe jest również dostosowanie tego protokołu do pracy w innych systemach modelowych (np . szczurach), a nawet w innych narządach. Chociaż stwierdzamy, że przebudowa zależna od NK może być solidnie oceniona na poziomie gd9,5, może ona zostać zmieniona dla innych punktów czasowych, takich jak gd12,5, kiedy unaczynienie matki jest całkowicie przebudowane. W tym momencie wewnątrznaczyniowa inwazja trofoblastu jest głębsza16 i ten punkt czasowy może być bardziej odpowiedni do badań nad rolą trofoblastu w zmianach naczyniowych. Jeśli pożądane są dodatkowe odczyty ilościowe, badacze mogą również zwiększyć liczbę odcinków wybarwionych pod kątem SMA i ocenić odsetek częściowo przebudowanych naczyń w każdym miejscu implantacji.
Ograniczeniem tego protokołu jest opisowy charakter badań histologicznych. Testy funkcjonalne stają się jednak dostępne dopiero powoli (takie jak USG Dopplera19). Techniki te wymagają specjalistycznej wiedzy technicznej i znacznie wyższych wydatków na zakup i konserwację sprzętu, ale mają tę zaletę, że zapewniają podłużny odczyt in vivo dla efektu zmian, które można zaobserwować histologicznie. Ewentualną wadą wszystkich badań stereologicznych jest subiektywizm badaczy. W tym celu korzystanie z usług dwóch niezależnych egzaminatorów, którzy niezależnie analizują wszystkie próbki, może pomóc w uniknięciu tego problemu. Chociaż przedstawiony tutaj protokół daje wgląd w to, ile krwi może dotrzeć do granicy faz płodu-matki, korzystne może być połączenie go z uzupełniającym podejściem polegającym na ocenie całkowitej ilości krwi w dowolnym momencie w układzie naczyniowym za pomocą plastikowychgipsów16.
Siłą tego protokołu jest to, że łączy w sobie dwa niezależne podejścia. Zmiany naczyniowe są najpierw oceniane ilościowo za pomocą stereologii, a następnie wynik jest walidowany jakościowo za pomocą immunohistochemii. Wiarygodność wyników można dodatkowo zwiększyć poprzez randomizację prób. Próbki przygotowane do tego protokołu mogą być z łatwością wykorzystane do zbadania również innych parametrów ciąży, takich jak decydualizacja, rozwój mesometrialnego agregatu limfatycznego ciąży (MLAp) lub immunodetekcja komórek będących przedmiotem zainteresowania, w celu rygorystycznej oceny fenotypu ciąży w połowie ciąży.
Przebudowa tętnic jest krytycznym krokiem w przypadku niepowikłanych ciąż u kobiet, a niepowodzenie tych zmian leży u podstaw wielkich zespołów położniczych (GOS), a mianowicie stanu przedrzucawkowego, ograniczenia wzrostu płodu i urodzenia martwego dziecka. Przedstawiamy tutaj techniki dokładnej oceny fenotypu ciąży w modelach mysich, które naśladują niektóre cechy patofizjologii GOS.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować wszystkim członkom laboratorium Colucci za pomocne dyskusje. Praca ta została sfinansowana przez The Wellcome Trust [094073/Z/10/Z], The Centre for Trophoblast Research oraz The British Heart Foundation.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Myszy C57BL/6 (8-12 tygodni) | Charles River | ||
| Nić | |||
| Polistyren | Służy do utrzymywania tkanki na miejscu | ||
| Nożyczki proste do preparowania | Igły EMS | 72940 | |
| 25 G | BD | 300600 | Służy do utrzymywania tkanki na miejscu |
| 50 ml probówki stożkowe | Falcon | 352070 | |
| Roztwór formaliny, neutralnie buforowany, 10% | Sigma | HT501128-4L | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami | Sigma | P3813-10PAK | |
| Etanol | Sigma | 32221-2,5L | |
| Parafina | Sigma | 327204-1KG | |
| Xylene | Fisher Scientific | X/0250/17 | |
| Automatyczny procesor tkanek | Sakura | 6032 | |
| Microtome | Leica | RM2245 | |
| Stojak na slajdy | Sigma | Z710989 | |
| Słoik Coplin | Sigma | S5891 | |
| Woda | |||
| Roztwór hematoksyliny, Gill nr 3 | Sigma | GHS332-1L | |
| Eosin Y roztwór | Sigma | HT110116-500ML | |
| Wyciąg | |||
| Nośniki montażowe na bazie ksylenu | VWR | 361254D | |
| Skaner slajdów | Hamamatsu | NanoZoomer | |
| Oprogramowanie do skanowania slajdów | Przeglądarka | NDP | |
| Cytrynian sodu trójzasadowy dwuwodny | Sigma | 32320 | Przygotować 10 mM roztwór i dostosować pH do 6 |
| Szybkowar | Służy do pobierania antygenu | ||
| Płyta | Służy do pobierania antygenu | ||
| Hydrofobowy długopis barierowy | Vector | H-4000 | |
| Nadtlenek wodoru | Fisher Scientific | H/1800/15 | |
| Tris buforowana sól fizjologiczna | Sigma | T6664-10PAK | |
| Zestaw mysz na myszy | Wektor | BMK-2202 | Znacznie zmniejsza tło |
| Mysz anty-ludzka aktyna mięśni gładkich | DAKO | M0851 | Reakcja krzyżowa z |
| kontrolą izotypu IgG2a | myszy DAKO | X0943 | |
| Komora nawilżana | Sigma | H6644 | |
| roztwór 3,3'-diaminobenzydyny | Sigma | D4293-5SET | |
| Kwas solny | Fisher Scientific | H/1050/PB17 |
Bibliografia
- Burton, G. J., Woods, A. W., Jauniaux, E., Kingdom, J. C. Rheological and physiological consequences of conversion of the maternal spiral arteries for uteroplacental blood flow during human pregnancy. Placenta. 30 (6), 473-482 (2009).
- Pijnenborg, R., Vercruysse, L., Hanssens, M. The uterine spiral arteries in human pregnancy: facts and controversies. Placenta. 27 (9-10), 939-958 (2006).
- Ashkar, A. A., Croy, B. A. Interferon-gamma contributes to the normalcy of murine pregnancy. Biol Reprod. 61 (2), 493-502 (1999).
- Ashkar, A. A., Croy, B. A. Functions of uterine natural killer cells are mediated by interferon gamma production during murine pregnancy. Semin Immunol. 13 (4), 235-241 (2001).
- Ashkar, A. A., Di Santo, J. P., Croy, B. A. Interferon gamma contributes to initiation of uterine vascular modification, decidual integrity, and uterine natural killer cell maturation during normal murine pregnancy. J Exp Med. 192 (2), 259-270 (2000).
- Ashkar, A. A., et al. Assessment of requirements for IL-15 and IFN regulatory factors in uterine NK cell differentiation and function during pregnancy. J Immunol. 171 (6), 2937-2944 (2003).
- Barber, E. M., Pollard, J. W. The uterine NK cell population requires IL-15 but these cells are not required for pregnancy nor the resolution of a Listeria monocytogenes infection. J Immunol. 171 (1), 37-46 (2003).
- Colucci, F., Boulenouar, S., Kieckbusch, J., Moffett, A. How does variability of immune system genes affect placentation. Placenta. 32 (8), 539-545 (2011).
- Pijnenborg, R., Vercruysse, L., Brosens, I. Deep placentation. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 25 (3), 273-285 (2011).
- Colucci, F., Kieckbusch, J. Maternal uterine natural killer cells nurture fetal growth: in medio stat virtus. Trends Mol Med. 21 (2), 60-67 (2015).
- Hanna, J., et al. Decidual NK cells regulate key developmental processes at the human fetal-maternal interface. Nat Med. 12 (9), 1065-1074 (2006).
- Xiong, S., et al. Maternal uterine NK cell-activating receptor KIR2DS1 enhances placentation. J Clin Invest. 123 (10), 4264-4272 (2013).
- Croy, B. A., Zhang, J., Tayade, C., Colucci, F., Yadi, H., Yamada, A. T. Analysis of uterine natural killer cells in mice. Methods Mol Biol. 612, 465-503 (2010).
- Kieckbusch, J., Gaynor, L. M., Moffett, A., Colucci, F. MHC-dependent inhibition of uterine NK cells impedes fetal growth and decidual vascular remodelling. Nat Commun. 5, (2014).
- Zhang, J., Chen, Z., Smith, G. N., Croy, B. A. Natural killer cell-triggered vascular transformation: maternal care before birth. Cell Mol Immunol. 8 (1), 1-11 (2010).
- Adamson, S. L., et al. Interactions between trophoblast cells and the maternal and fetal circulation in the mouse placenta. Dev Biol. 250 (2), 358-373 (2002).
- Colucci, F., Soudais, C., Rosmaraki, E., Vanes, L., Tybulewicz, V. L. J., Di Santo, J. P. Dissecting NK cell development using a novel alymphoid mouse model: Investigating the role of the c-abl proto-oncogene in murine NK cell differentiation. J Immunol. 162 (5), 2761-2765 (1999).
- Hu, D., Cross, J. C. Ablation of Tpbpa-positive trophoblast precursors leads to defects in maternal spiral artery remodeling in the mouse placenta. Dev Biol. 358 (1), 231-239 (2011).
- Zhang, J. H., Croy, B. A. Using Ultrasonography to Define Fetal-Maternal Relationships: Moving from Humans to Mice. Comparative Med. 59 (6), 527-533 (2009).
Przedruki i uprawnienia
