Artykuł metodologiczny

Generowanie delecji monoallelicznych za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w celu zbadania funkcji wzmacniacza w embrionalnych komórkach macierzystych myszy

12.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53552

⸱

2 kwietnia 2016

 , 
1Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto

W tym artykule

Podsumowanie

Eksperymentalne potwierdzenie aktywności wzmacniacza najlepiej podejść poprzez analizę utraty funkcji. Przedstawiono tutaj skuteczny protokół, który wykorzystuje delecję za pośrednictwem CRISPR/Cas9 do badania specyficznej dla alleli regulacji transkrypcji genów w komórkach F1 ES, które zawierają genom hybrydowy (Mus musculus129 x Mus castaneus).

Streszczenie

Wzmacniacze kontrolują tożsamość komórki, regulując ekspresję genów specyficznych dla tkanek w sposób niezależny od pozycji i orientacji. Te wzmacniacze są często zlokalizowane dystalnie od regulowanego genu w regionach międzygenowych lub nawet w ciele innego genu. Niezależny od pozycji charakter działania wzmacniacza sprawia, że trudno jest dopasować wzmacniacze do genów, które regulują. Delecja regionu wzmacniającego dostarcza bezpośrednich dowodów na aktywność wzmacniacza i jest złotym standardem ujawniającym rolę wzmacniacza w endogennej transkrypcji genów. Konwencjonalne metody delecji oparte na rekombinacji homologicznej zostały prześcignięte przez niedawne postępy w technologii edycji genomu, które umożliwiają szybkie i precyzyjnie zlokalizowane zmiany w genomach wielu organizmów modelowych. Edycja genomu za pośrednictwem CRISPR/Cas9 może być wykorzystywana do manipulowania genomem w wielu typach komórek i organizmach szybko i tanio, ze względu na łatwość, z jaką Cas9 może być kierowany do genomu przez przewodnik RNA z plazmidu ekspresyjnego na zamówienie. Homozygotyczna delecja podstawowych elementów regulatorowych genów może prowadzić do śmiertelności lub zmiany fenotypu komórkowego, podczas gdy monoalleliczna delecja wzmacniaczy transkrypcji pozwala na badanie cis-regulacji ekspresji genów bez tego kłopotliwego problemu. Przedstawiono protokół delecji za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w embrionalnych komórkach macierzystych myszy F1 (Mus musculus129 x Mus castaneus). Delecja monoalleliczna, badanie przesiewowe i analiza ekspresji są ułatwione dzięki polimorfizmom pojedynczego nukleotydu (SNP) między dwoma allelami, które występują średnio co 125 pz w tych komórkach.

Wprowadzenie

Elementy regulacyjne transkrypcji są kluczowe dla czasowo-przestrzennego dostrajania ekspresji genów podczas rozwoju1, a modyfikacje tych elementów mogą prowadzić do chorób w wyniku aberracyjnej ekspresji genów2. Wiele regionów związanych z chorobami, zidentyfikowanych w badaniach genome-wide association studies, znajduje się w obszarach niekodujących i wykazuje cechy enhancerów transkrypcyjnych3-4. Identyfikacja enhancerów i przypisanie ich do regulowanych przez nie genów jest skomplikowane, ponieważ często znajdują się one w odległości kilku kilobaz od genów, które regulują, i mogą być aktywowane w sposób specyficzny dla danej tkanki5-6. Przewidywania dotyczące enhancerów opierają się zazwyczaj na sygnaturach modyfikacji histonów, kompleksach mediator-kohezyna oraz wiązaniu czynników transkrypcyjnych specyficznych dla danego typu komórek7-10. Walidacja przewidywanych enhancerów najczęściej odbywa się za pomocą testu opartego na wektorze, w którym enhancer aktywuje ekspresję genu reporterowego11-12. Dane te dostarczają cennych informacji o potencjale regulacyjnym domniemanych sekwencji enhancerów, ale nie ujawniają ich funkcji w endogennym kontekście genomicznym ani nie identyfikują genów, które one regulują. Edycja genomu służy jako potężne narzędzie do badania funkcji elementów regulacyjnych transkrypcji w ich endogennym kontekście poprzez analizę utraty funkcji (loss-of-function).

Ostatnie postępy w edycji genomu, a w szczególności system edycji genomu CRISPR/Cas9, ułatwiają badanie funkcji genomu. System CRISPR/Cas9 jest łatwy w użyciu i możliwy do adaptacji w wielu systemach biologicznych. Białko Cas9 jest kierowane do specyficznego miejsca w genomie za pomocą przewodzącego RNA (gRNA)13. Kompleks SpCas9/gRNA skanuje genom w poszukiwaniu docelowej sekwencji genomicznej, która musi znajdować się w pozycji 5' względem sekwencji motywu sąsiadującego z protospacerem (PAM), NGG14-15. Parowanie zasad gRNA z jego celem, 20-nukleotydową (nt) sekwencją komplementarną do gRNA, aktywuje aktywność nukleazy SpCas9, co prowadzi do pęknięcia obu nici (DSB) 3 bp powyżej sekwencji PAM. Specyficzność jest osiągana dzięki pełnemu parowaniu zasad w regionie seed gRNA, obejmującym 6-12 nt sąsiadujących z PAM; przeciwnie, niedopasowania w pozycji 5' względem regionu seed są zazwyczaj tolerowane16-17. Wprowadzone DSB może zostać naprawione albo przez mechanizm niehomologicznego łączenia końców (NHEJ), albo przez mechanizm naprawy sterowanej homologią (HDR). Naprawa DNA przez NHEJ często prowadzi do powstania insercji lub delecji (indeli) o długości kilku bp w miejscu docelowym, co może zakłócić otwartą ramkę odczytu (ORF) genu. Aby wygenerować większe delecje w genomie, można zastosować dwa gRNA, które flankują interesujący region18-19. Podejście to jest szczególnie przydatne w badaniu enhancerów transkrypcyjnych skupionych w regionach kontroli locus lub super-enhancerów, które są większe od konwencjonalnych enhancerów9,18,20-22.

Delecje monoalleliczne stanowią cenny model do badania regulacji cis-transkrypcji. Obserwowana zmiana poziomu transkryptu po monoallelicznej delecji enhancera koreluje z rolą tego enhancera w regulacji genów, eliminując efekt zakłócający, który może wystąpić, gdy transkrypcja obu alleli zostanie naruszona, co potencjalnie wpływa na kondycję komórki. Ocena obniżonej ekspresji jest jednak trudna bez możliwości odróżnienia allelu z delecją od allelu typu dzikiego. Ponadto genotypowanie delecji w każdym allelu bez możliwości rozróżnienia tych dwóch alleli jest problematyczne, szczególnie w przypadku dużych delecji od >10 kb do 1 Mb23, w których trudno jest przeprowadzić amplifikację całego regionu typu dzikiego metodą PCR. Zastosowanie komórek ES F1, otrzymanych przez krzyżowanie Mus musculus129 z Mus castaneus, umożliwia rozróżnienie dwóch alleli za pomocą allele-specyficznego PCR18,24. Hybrydowy genom w tych komórkach ułatwia allele-specyficzne przesiewanie delecji oraz analizę ekspresji. Średnio co 125 bp między tymi dwoma genomami występuje SNP, co zapewnia elastyczność w projektowaniu starterów do analiz ekspresji i genotypowania. Obecność jednego SNP może wpływać na temperaturę topnienia (Tm) startera oraz specyficzność docelową w amplifikacji za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qPCR), co pozwala na rozróżnienie dwóch alleli25. Co więcej, niedopasowanie w obrębie końca 3' startera w znacznym stopniu wpływa na zdolność polimerazy DNA do elongacji od startera, zapobiegając amplifikacji niepożądanego celu allelicznego26. W poniższym protokole opisano wykorzystanie komórek ES F1 do allele-specyficznych delecji enhancerów o wielkości powyżej 1 kb oraz późniejszą analizę ekspresji z wykorzystaniem systemu edycji genomu CRISPR/Cas9 (Rycina 1).

Proces edycji genów; Cas9-gRNA, pęknięcie dwuniciowe DNA; schemat i wyniki PCR; metoda CRISPR.
Rycina 1. Delecja enhancera za pomocą CRISPR/Cas9 w celu zbadania cis-regulacji ekspresji genów. (A) Komórki ES F1 uzyskane w wyniku krzyżówki Mus musculus129 i Mus castaneus są wykorzystywane, aby umożliwić delecję specyficzną dla allelu. (B) Dwie cząsteczki przewodzącego RNA (gRNA) są używane do indukcji rozległej delecji regionu enhancera za pośrednictwem Cas9. (C) Zestawy starterów służą do identyfikacji dużych delecji mono- i bi-allelicznych. Pomarańczowe startery to startery wewnętrzne, fioletowe startery to startery zewnętrzne, a zielone startery to startery flankujące gRNA. (D) Zmiany w ekspresji genów są monitorowane za pomocą allelo-specyficznego qPCR. RFU oznacza względne jednostki fluorescencji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Projektowanie i konstruowanie gRNA

  1. Aby usunąć regiony wzmacniacza transkrypcji, użyj dwóch gRNA, jednego 5' i jednego 3' regionu zainteresowania. Użyj ścieżki przeglądarki genomu myszy UCSC wygenerowanej przez laboratorium Zhang, aby zidentyfikować unikalne sekwencje gRNA (http://www.genome-engineering.org15). Następnie sprawdź te gRNA i przylegające do nich PAM pod kątem SNP i indeli, korzystając z narzędzi online dostarczonych przez Sanger Institute (www.sanger.ac.uk/sanger/Mouse_SnpViewer/rel-1211)27-28. Aby celować w oba allele z równą skutecznością, unikaj sekwencji gRNA/PAM, które zawierają SNP lub indel.
    1. Wybierając gRNA, sprawdź możliwość zaprojektowania starterów specyficznych dla alleli do genotypowania delecji. Patrz sekcja 5, aby zapoznać się z projektem startera specyficznym dla alleli.
  2. Złóż dwa plazmidy gRNA w oparciu o protokół opisany w Mali i in. 201315. Włącz wybraną unikalną sekwencję docelową 20 pz do 61-merowych oligonukleotydów, jak pokazano w tabeli 7 (sekwencje są wyświetlane w orientacji od 5' do 3', a pogrubione zasady to sekwencja docelowa 20 pz, która jest odwrotnym uzupełnieniem względem siebie).
    1. Wymieszaj 10 μl 10 μM gRNA Primer_F i 10 μl 10 μM Primer_R komplementarnych w probówce.
    2. Wyżarzać startery przez inkubację mieszanki starterów w temperaturze 100 °C przez 5 minut, a następnie schłodzić od 1 °C/s do 25 °C. Na tym etapie użyj maszyny do PCR lub umieść probówkę we wrzącej wodzie i pozwól jej ostygnąć do temperatury RT.
    3. Do wyżarzonej mieszaniny starterów dodać następującą mieszaninę reakcyjną i inkubować w temperaturze 72 °C przez 30 minut, aby przedłużyć każdy starter: 18,5 μl wody, 10 μl 5x buforu HF, 1 μl 10 mM mieszaniny dNTP i 0,5 μl polimerazy DNA o wysokiej wierności.
    4. Uruchom 10 μl fragmentu docelowego na 2% żelu agarozowym, aby potwierdzić, że wyprodukowano 100 pz fragmentów prowadzących.
    5. Linearyzacja wektora gRNA (prezent od George'a Churcha; Dodaj plazmid geneczny # 41824)15 z AflII przy użyciu następującej konfiguracji reakcji: 5 μl szkieletu wektora gRNA (2-4 μg), 5 μl buforu 10x, 3 μl AflII (20 jednostek/μl) i 32 μl wody. Inkubować mieszaninę reakcyjną przez 3 godziny w temperaturze 37 °C.
    6. Uruchom strawiony produkt na 1% żelu agarozowym i oczyść prążek DNA odpowiadający 3,5 kb zlinearyzowanego wektora gRNA za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
    7. Ustaw reakcje składania Gibsona29-30 przy użyciu zlinearyzowanego wektora gRNA i fragmentu docelowego z kroku 1.2.3 w następujący sposób: 1 μl liniowego wektora gRNA (50 ng / μl), 1 μl fragmentu docelowego, 10 μl 2x mieszanki głównej zespołu Gibsona i 8 μl wody. Inkubować reakcje w temperaturze 50 °C przez 60 minut.
  3. Transformacja komórek E.coli ze złożonym wektorem gRNA.
    1. Wymieszaj 1 μl złożonego wektora gRNA z 1,2,7 i 50 μl komórek DH5α (szczep E.coli) w probówce. Przekształć ogniwa DH5α metodą szoku cieplnego, wystawiając ogniwa na działanie temperatury 42 °C przez 45 sekund.
    2. Schładzać probówki na lodzie przez 5 minut, następnie dodać 400 μl pożywki SOC i inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 minut w inkubatorze z wytrząsaniem.
    3. Rozprowadzić 100 μl komórek DH5α na płytce LB-kanamycyny (50 μg/ml) w celu pozytywnej selekcji przekształconych komórek i inkubować O/N w temperaturze 37 °C.
  4. Badania przesiewowe dodatnich kolonii E. coli pod kątem insercji gRNA.
    1. Wybrać kolonię oporną na kanamycynę i ponownie zawiesić w 3 ml LB zawierającym 50 μg/ml kanamycyny. Powtórz to samo dla 6-8 rodzin i inkubuj wszystkie probówki w temperaturze 37 °C O/N w inkubatorze z wytrząsaniem.
    2. Ekstrahuj plazmidy z kultury wyhodowanej O/N za pomocą mini zestawu przygotowawczego plazmidu, postępując zgodnie z instrukcją producenta.
    3. Przygotuj mieszaninę reakcyjną fermentacji EcoRI, aby sprawdzić, czy w plazmidzie nie ma wstawienia sekwencji gRNA. Dla każdej próbki należy przygotować mieszaninę reakcyjną w następujący sposób: 2 μl buforu enzymatycznego, 1 μl EcoRI, 15 μl wody. Podwielokrotność mieszaniny reakcyjnej rozlać do probówek o pojemności 1,5 ml i dodać 2 μl plazmidu. Inkubować probówki w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
    4. Zmiksowany produkt należy umieścić na 1,5% żelu agarozowym.
      Uwaga: Próbki z insertem będą miały rozmiar pasma 475 pz, który jest o 100 pz wyższy niż w przypadku klonów bez wstawek.
      Uwaga: Alternatywnie, dodatnie klony można przesiewać metodą PCR kolonii przy użyciu starterów Sp6 (do przodu) i T7 (do tyłu) (Tabela 7), które wiążą się z sekwencją wektorową, aby uzyskać fragment o wielkości 642 pz w obecności insercji gRNA. Podejście colony PCR jest korzystne, gdy w sekwencji gRNA znajduje się miejsce restrykcyjne EcoRI.
  5. Potwierdź sekwencję wstawki gRNA przez sekwencjonowanie DNA przy użyciu startera T7.

2. Transfekcja

Uwaga: Elektroporacja to skuteczna metoda transfekcji plazmidów do komórek ES. Opisana tutaj metoda wykorzystuje technologię transfekcji mikroporatora.

  1. Hodować komórki F1 ES w 10-centymetrowym naczyniu pokrytym żelatyną, zawierającym 10 ml pożywki z komórek ES (tabela 1) w temperaturze 37 °C/5% CO2 . Gdy komórki osiągną 85% zbieżności, usuń pożywkę i dodaj 2 ml trypsyny. Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 przez 5 min.
    Uwaga: Ogniwa F1 ES zostały uzyskane od Barbara Panning24 i są dostępne na życzenie.
  2. Zneutralizować trypsynę, dodając 10 ml pożywki wirowej (Tabela 2). Kilkakrotnie pipetować, aby całkowicie odłączyć komórki.
  3. Zebrać wszystkie komórki w probówce o pojemności 15 ml i wirować z prędkością 300 x g przez 5 minut. Zawiesić w 3 ml PBS i policzyć komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
  4. Osad 1 x 106 komórek ES w probówce o pojemności 1,5 ml przez odwirowanie przy 300 x g przez 5 minut i ponownie zawieś w 100 μl buforu R (do resuspensji) dostarczonego przez producenta zestawu.
  5. Dodaj po 5 μg każdego z pCas9_GFP (prezent od Kiran Musunuru; Dodaj plazmid gRNA # 44719)31, 5' i 3' gRNA w celu usunięcia regionu docelowego i delikatnie wymieszaj pipetą, aby uniknąć wprowadzenia pęcherzyków.
  6. Użyj elektronicznej końcówki pipety, aby zassać 100 μl mieszanki do elektroporacji, uważając, aby uniknąć pęcherzyków w końcówce.
  7. Zaprogramuj wolty, szerokość i impulsy do elektroporacji. W przypadku ogniw F1 ES użyj 1,400 V, 10 ms dla 3 impulsów.
  8. Podczas elektroporacji obserwuj końcówkę, aby zobaczyć, czy w roztworze nie ma iskier. Iskra wskazuje na obecność pęcherzyka powietrza i będzie zakłócać transfekcję.
  9. Wyrzucić transfekowane komórki ES do 10 cm naczynia pokrytego żelatyną, zawierającego 10 ml pożywki z komórek ES (tabela 1) i inkubować w temperaturze 37 °C/5% CO2 .

3. FACS sortuje transfekowane komórki

  1. Po 48 godzinach odłączyć komórki, dodając 2 ml trypsyny i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 przez 5 minut.
  2. Zneutralizować płytkę, dodając 10 ml buforu do zbierania próbek (Tabela 3). Zebrać komórki do probówki o pojemności 15 ml i wirować w masie 300 x g przez 5 minut.
  3. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml buforu sortującego (tabela 4). Policz komórki i rozcieńcz w oparciu o platformę sortującą. Rozcieńczyć komórki do 0,5-1 x 106 komórek/ml w celu sortowania do probówek o pojemności 15 ml i sortowania pojedynczych komórek bezpośrednio do płytek 96-dołkowych, rozcieńczyć komórki do 2-5 x 106 komórek/ml.
  4. Sortuj komórki Cas9-GFP+ ES za pomocą cytometru przepływowego FACS32. Zebrać komórki luzem w probówkach z 2 ml pożywki regeneracyjnej (Tabela 5) i płytką zgodnie z opisem w 3.5 w celu pobrania kolonii lub posortować pojedyncze komórki bezpośrednio na 96-dołkowe płytki pokryte żelatyną, zawierające 100 μl pożywki z komórek ES/basenika (Tabela 1).
  5. Wysiew: 1-1,5 x 104 komórki GFP+ ES w 10 cm naczyniu pokrytym żelatyną, zawierającym 10 ml pożywki z komórek ES (Tabela 1). Posiew o tak niskiej gęstości ułatwi pobieranie pojedynczych kolonii komórek ES.

4. Hodowla klonów do genotypowania, analizy ekspresji i zamrażania zasobów komórkowych

  1. W 4-5 dniu po sortowaniu należy naciąć każdą studzienkę bezpośrednio posortowanych 96-dołkowych płytek pod kątem obecności kolonii komórek ES.
    1. Dysocjuj kolonie komórek ES, usuwając pożywkę i dodając 30 μl trypsyny. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Zneutralizuj trypsynę, dodając 170 μl pożywki komórkowej ES (Tabela 1) i pipetuj w górę iw dół, aby całkowicie zdysocjować kolonię na pojedyncze komórki. Hoduj komórki w temperaturze 37 °C/5% CO2 do momentu, aż większość studzienek będzie zlewać się w ponad 70% (zwykle 2-3 dni).
  2. Alternatywnie, można pobrać pojedyncze kolonie komórek ES z 10-centymetrowych szalek za pomocą odwróconego mikroskopu. Po zassaniu kolonii do końcówki pipety należy postępować zgodnie z krokiem 4.1.1, umieszczając każdą kolonię w jednym dołku na 96-dołkowej płytce, wstępnie potraktowanej żelatyną i zawierającej 30 μl trypsyny.
    Uwaga: Kolonie mogą siedzieć w trypsynie w temperaturze pokojowej, podczas gdy zbierany jest cały rząd kolonii.
  3. Po wybraniu wszystkich kolonii i dysocjacji na pożywki, hoduj komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 do momentu, gdy większość studzienek osiągnie ponad 70% zlewu (zwykle 2 dni).
  4. Gdy 96-dołkowe płytki są gotowe do rozszczepienia, usunąć pożywkę, dodać 30 μl trypsyny i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Zneutralizować trypsynę, dodając 180 μl pożywki z komórek ES (Tabela 1) do każdej studzienki i pipetować w górę iw dół w celu całkowitej dysocjacji na pojedyncze komórki.
  5. Z otrzymanych 210 μl wysiewać 70 μl na trzy 96-dołkowe płytki pokryte żelatyną, z których każda zawiera 130 μl pożywki/basenika komórkowego ES (Tabela 1). Użyj tych płytek do genotypowania, analizy ekspresji i zamrażania zasobów komórek dla każdego klonu, jak opisano poniżej.
  6. Gdy płytka genotypowania osiągnie 70-85% zbieżności, należy potraktować płytkę zgodnie z opisem w sekcji 6 "Genotypowanie delecji".
  7. Gdy płytka do analizy ekspresji osiągnie 70-85% konfluencji, usuń pożywkę, uszczelnij płytkę taśmą uszczelniającą i przechowuj w temperaturze -80 °C, aż klony zostaną zgenotypowane.
    Uwaga: Płytka do analizy ekspresji jest przydatna do analizy zmian w ekspresji genów we wczesnych pasażach klonów. Możliwa jest analiza ekspresji genów z płytki 96-dołkowej, ale ponieważ liczba komórek jest niska, zalecany jest zestaw do mikroekstrakcji RNA.
  8. Przygotowanie 96-dołkowego wywaru do zamrażania płytek:
    1. Gdy płytka do zamrożonych komórek (stado-1) osiągnie zbieżność 70-85%, odessać pożywkę, dodać 30 μl trypsyny i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
    2. Zneutralizuj trypsynę, dodając 100 μl pożywki komórkowej ES (Tabela 1) do każdej studzienki i pipetuj w górę iw dół, aby całkowicie zdysocjować na pojedyncze komórki.
    3. Przenieść 15 μl zawieszonych komórek z każdej studzienki na dwie 96-dołkowe płytki pokryte żelatyną, z których każda zawiera 185 μl pożywki komórkowej ES (Tabela 1) i pozostawić do wzrostu w temperaturze 37 °C/5% CO2,
      Uwaga: Dotyczy to płytek stock-2 i -3, które są dodatkowymi klonami zapasowymi na wypadek, gdyby ożywienie komórek z stock-1 się nie powiodło.
  9. W międzyczasie, do 100 μl pozostałych komórek w 96-dołkowej płytce (stock-1), dodaj 100 μl 2x pożywki do zamrażania (Tabela 6). Uszczelnij płytkę taśmą uszczelniającą i szybko odwróć płytkę 4-5 razy, aby uzyskać prawidłowe wymieszanie. Przechowywać płytkę w temperaturze -80 °C do czasu genotypowania klonów.
  10. Gdy płytki stock-2 i stock-3 są gotowe do zamrożenia, odessać pożywkę, dodać 30 μl trypsyny i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Zneutralizować trypsynę, dodając 70 μl pożywki z komórkami ES (Tabela 1) do każdej studzienki i pipetować w górę iw dół w celu całkowitej dysocjacji na pojedyncze komórki.
  11. Dodaj 100 μl 2x pożywki do zamrażania, uszczelnij płytkę taśmą uszczelniającą i szybko odwróć płytkę 4-5 razy w celu prawidłowego wymieszania. Przechowywać płytkę w temperaturze -80 °C do czasu, gdy te płytki będą potrzebne.

5. Projekt podkładu specyficzny dla alleli

  1. Zaprojektuj 4 zestawy starterów (Rysunek 1C) do przesiewania klonów pod kątem pożądanej delecji: startery wewnętrzne, startery zewnętrzne i startery flankujące gRNA (zarówno dla miejsc docelowych gRNA 5', jak i 3'), jak opisano poniżej.
    1. Uzyskaj ścieżkę SNP odpowiadającą genotypom 129 i Cast w http://labs.csb.utoronto.ca/mitchell/crispr.html. Podana ścieżka pokazuje podstawienia zasad między 129 i Cast na współrzędnych w zespole genomu myszy mm9.
      Uwaga: Link na powyższej stronie przekieruje do przeglądarki genomu UCSC i doda niestandardową ścieżkę zawierającą SNP między genomami 129 i Cast.
    2. Wprowadź współrzędne regionu, który ma zostać usunięty. Powiększ obszar o długości około 500 punktów bazowych w środku żądanej delecji zawierającej >3 SNP.
    3. Przejdź do view>DNA na pasku opcji i kliknij pobierz DNA, aby pobrać sekwencję docelową we wszystkich wielkich formatach.
    4. Utwórz dwie sekwencje FASA: jedną dla 129 i jedną dla rzutowania przez podstawienie bazy w pozycji SNP. Oznacz SNP małymi literami.
    5. Przejdź do Primer3 plus (http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi/) i wklej sekwencję SNP podstawioną przez 129. Użyj ustawień domyślnych, aby zaprojektować podkłady.
    6. Aby zaprojektować wewnętrzne startery specyficzne dla alleli, wybierz Primer_List z menu rozwijanego zadania i kliknij przycisk Wybierz startery. Wybierz starter do przodu lub do tyłu, który ma SNP na końcu 3' lub w odległości 4 zasad od 3' i mieści się w obszarze, który ma zostać usunięty.
      Uwaga: Startery, które mają SNP na końcu 3', wykazują zwiększoną swoistość allelu w qPCR.
    7. Aby wybrać drugi powrót startera do strony głównej, wybierz Wykrywanie w menu rozwijanym zadania i wklej pierwszą sekwencję startera w odpowiednim polu u dołu strony. Na karcie General Settings (Ustawienia ogólne) zmień ustawienie zakresu rozmiarów produktu na 80-200 bp i kliknij opcję Pick Primers (Wybierz podkłady). Wybierz zestaw podkładów z wymienionych par podkładów; Będzie to 129 wewnętrznych starterów specyficznych dla alleli.
    8. Powtórz kroki od 5.1.5 do 5.1.7, aby zaprojektować startery dla allelu Cast.
    9. Wróć do przeglądarki genomu UCSC i wprowadź współrzędne regionu, który ma zostać usunięty. Przejdź do view>DNA na pasku opcji, w sekcji Opcje regionu pobierania sekwencji dodaj 1,000 bp w górę i w dół kliknij pobierz DNA, aby pobrać sekwencję docelową.
    10. Zaznacz docelową sekwencję gRNA w nawiasach. Zapisz całą tę sekwencję przed kontynuowaniem.
    11. Aby zaprojektować zewnętrzne startery, usuń sekwencję między dwiema sekwencjami docelowymi gRNA. Powtórz kroki 5.1.4-5.1.8, aby zaprojektować zewnętrzne startery specyficzne dla alleli, ale zmień rozmiar produktu na 400-800 pz.
    12. Podziel sekwencję otrzymaną w kroku 5.1.10 na dwie sekwencje, z których każda zawiera 500 pz 5' i 3' docelowej sekwencji gRNA. Powtórz kroki od 5.1.5 do 5.1.7, projektując startery niespecyficzne dla alleli dla regionów flankujących gRNA, ale zmień rozmiar produktu 400-800 p.
      Uwaga: W przypadku starterów niespecyficznych dla alleli można użyć sekwencji 129 lub Cast i należy wybrać startery, które nie zawierają SNP. Zaleca się ustawienie wielkości produktu na 400-800 pz w celu zaprojektowania starterów zewnętrznych i flankujących gRNA. Pozwala to na amplifikację nawet w przypadku obecności małych indeli.
  2. Przetestuj wewnętrzne startery pod kątem swoistości allelowej za pomocą qPCR przy użyciu czystego genomowego DNA szczepu 129 i Cast strain przy 2 ng / μl. Wykonaj kroki 6.2-6.4, aby skonfigurować reakcję qPCR.
    Uwaga: Jeśli genotyp 129 w regionie docelowym jest taki sam jak C57BL/6J, DNA z C57BL/6J można użyć zamiast DNA 129. Startery specyficzne dla alleli powinny wykazywać co najmniej 5 cykli różnicy między wartością Ct (próg cyklu) dla prawidłowego a nieprawidłowego genotypu. Zewnętrzne startery można przetestować, aby upewnić się, że amplifikują delecję przy użyciu transfekowanych komórek ES Cas9 / gRNA i genomowego DNA F1 odpowiednio jako kontroli pozytywnej i negatywnej. Swoistość alleli starterów zewnętrznych można zbadać po zidentyfikowaniu klonów monoallelicznych.

6. Genotypowanie usunięcia

  1. Wyodrębnij genomowe DNA z genotypującej płytki 96-dołkowej za pomocą płytki z kroku 4.6, która jest generowana po ekspansji kolonii.
    1. Przygotuj mieszankę do ekstrakcji genomowego DNA: 89 μl wody, 10 μl 10x buforu i 1 μl odczynnika ekstrakcyjnego (dostarczonego przez producenta). Dodać 100 μl mieszanki do ekstrakcji genomowego DNA do każdego dołka i uszczelnić płytkę taśmą uszczelniającą.
    2. Inkubować płytkę w temperaturze 75 °C przez 5 minut, a następnie w temperaturze 95 °C przez 5 minut.
    3. Pozwól szalce ostygnąć, inkubując na lodzie przez kilka minut, a następnie krótko odwirować, aby osadzać kondensację na dnie studzienki. Służy ona jako matrycowa płytka DNA do badań przesiewowych w kierunku usunięcia.
  2. Ustaw reakcje qPCR w dwóch przypadkach dla każdego klonu w następujący sposób: 5 μl 2x mieszanki SYBR qPCR, starter do przodu i do tyłu (3 μM) po 1 μl i 1 μl wody. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 2 μl matrycowego DNA, a następnie 8 μl mieszanki reakcyjnej do każdego dołka płytki 384-dołkowej.
  3. Uszczelnij płytkę taśmą uszczelniającą i wiruj z prędkością 600 x g przez 2 minuty, aby wymieszać zawartość. Umieść 384-dołkową matrycę płytek w cyklerze czasu rzeczywistego.
  4. Zaprogramuj cykler czasu rzeczywistego na 2-etapowy PCR, a następnie analizę krzywej topnienia z wykrywaniem w następujący sposób: 1 cykl w temperaturze 95 °C przez 10 minut, 40 cykli w temperaturze 95 °C przez 15 s, 62 °C przez 30 sekund z odczytem płytki i 95 °C przez 10 s, 65 °C do 95 °C z przyrostem 5 °C przez 5 sekund + odczyt płytki.
    Uwaga: Oprócz konstrukcji startera, mieszanka qPCR i parametry cyklu również przyczyniają się do specyficzności startera. Opisane powyżej parametry i odczynniki wymienione w materiałach częściej dają amplifikację specyficzną dla alleli.
  5. Analiza wyników qPCR
    1. Sprawdź każdy allel pod kątem amplifikacji za pomocą wewnętrznych starterów specyficznych dla alleli. Brak amplifikacji jednego allelu lub wysokie różnice w wartości Ct (>5 cykli) między allelami sugerują, że klony te mają heterozygotyczną delecję allelu o wysokiej/nieobecnej wartości Ct. Brak amplifikacji obu alleli sugeruje, że są one nosicielami homozygotycznej delecji.
    2. Sprawdź każdy allel pod kątem amplifikacji za pomocą zewnętrznych starterów specyficznych dla alleli. Gdy docelowa delecja jest większa niż 1 kb, amplifikacja z zewnętrznymi starterami występuje tylko wtedy, gdy obecna jest delecja. Wartość Ct 22-28 potwierdza usunięcie. W przypadku docelowych delecji mniejszych niż 1 kb, potwierdź rozmiar amplikonu za pomocą elektroforezy.
      Uwaga: Jeżeli startery zewnętrzne wykazują tylko umiarkowaną swoistość allelową (patrz rysunek 2), amplikony można uzyskać z obydwoma zestawami starterów allelicznych w klonach monoallelicznych ze względu na amplifikację starterów zewnętrznych poza celem. W takim przypadku różnica wartości Ct między dwoma allelami wynosząca co najmniej pięć cykli powinna potwierdzić, że prawidłowy allel (niższa wartość Ct) został usunięty na podstawie wyników uzyskanych z wewnętrznych starterów. Jeśli różnica Ct między allelem docelowym a innym jest mniejsza niż pięć cykli, zaprojektuj nowe startery zewnętrzne specyficzne dla allelu.
    3. W klonach z delecją monoalleliczną sprawdź integralność nieusuniętego allelu za pomocą wtórnego badania przesiewowego, starterów flankujących gRNA.
      Uwaga: Indele o wielkości >25 pz wokół miejsca docelowego gRNA można zidentyfikować, obserwując przesunięcie krzywej topnienia w qPCR dla amplikonów 400-800 pz. Alternatywnie, amplikony ze starterów flankujących gRNA można sekwencjonować w celu wykrycia małych indeli o <25 pz.
      1. Wykonaj qPCR z 2 zestawami starterów flankujących gRNA, tj. 5' i 3' gRNA używanych do generowania delecji CRISPR. Brak amplifikacji tymi zestawami starterów wskazuje, że indele większe niż amplikon qPCR są obecne w miejscu docelowym gRNA na nieusuniętym allelu monoallelicznych klonów delecyjnych. Odrzuć klony zawierające te duże indele z dalszej analizy, ponieważ wyniki mogą być trudne do zinterpretowania bez znajomości zakresu delecji.
  6. Oczyść amplikony otrzymane z zewnętrznej reakcji qPCR startera za pomocą zestawu do czyszczenia PCR zgodnie z instrukcją producenta.
  7. Potwierdź sekwencję usuniętego allelu poprzez sekwencjonowanie DNA oczyszczonego produktu PCR z poprzedniego etapu. Użyj starterów do amplifikacji qPCR do sekwencjonowania do przodu i do tyłu.
    Uwaga: Na tym etapie SNP w amplikonie działają jako wtórne potwierdzenie genotypu usuniętego allelu.

7. Analiza ekspresji za pomocą starterów specyficznych dla alleli

  1. Rozmrozić 96-dołkową płytkę podstawową przechowywaną w temperaturze -80 °C (zapas-1 z kroku 4.9), umieszczając ją w ciepłej kąpieli perełkowej. Gdy więcej niż połowa dołków w płytce zostanie rozmrożona, wirować z prędkością 300 x g przez 5 minut.
  2. Ostrożnie usunąć taśmę uszczelniającą i szybko przenieść komórki z dołków delecyjnych dodatnich do pokrytych żelatyną, 12-dołkowych płytek zawierających 1 ml pożywki z komórek ES (Tabela 1) i inkubować w temperaturze 37 °C/5% CO2 .
  3. Gdy płytka osiągnie 70-85% konfluencji, przepuść komórki i podziel je na trzy dołki pokrytej żelatyną, 6-dołkowej płytki, z których każda zawiera 2 ml pożywki komórkowej ES (Tabela 1). Użyj dwóch studzienek, aby przygotować 2 fiolki z zamrożonymi zapasami komórek do długotrwałego przechowywania w ciekłym azocie (opisanym w kroku 8), a trzeci dołek do ekstrakcji RNA.
  4. Ekstrakcja RNA za pomocą zestawu do ekstrakcji RNA.
  5. Przekształć 100-500 ng RNA w cDNA poprzez odwrotną transkrypcję (RT) RNA przy użyciu zestawu do syntezy cDNA zgodnie z protokołem producenta. Uwzględnij ujemną reakcję RT dla każdej próbki RNA, aby monitorować ilość zanieczyszczającego DNA w próbkach RNA.
  6. Rozcieńczyć cDNA przed qPCR w stosunku od 1:2 do 1:4; w zależności od poziomu ekspresji docelowego genu w komórkach ES.
  7. Ustawić qPCR zgodnie z powyższym opisem, w tym genomowe DNA F1, jako krzywą wzorcową (5-krotne rozcieńczenia od 250 do 0,08 ng/μl) w celu bezwzględnej kwantyfikacji poziomów transkryptów. Porównaj ekspresję każdego allelu interesującego genu w każdym potwierdzonym usuniętym klonie z odpowiednim genem kontrolnym, na przykład Gapdh (startery wymienione w Tabeli 7).
    Uwaga: Startery genów kontrolnych nie muszą być specyficzne dla alleli. Konstrukcja startera specyficznego dla alleli jest taka sama dla starterów RT-qPCR, jak opisano dla starterów genotypowania, z wyjątkiem regionu docelowego do amplifikacji. Należy użyć sekwencji genu; w przypadku stosowania starterów dla pojedynczego eksonu lub granicy ekson-intron (w celu monitorowania pierwotnego transkryptu), genomowe DNA F1 można zastosować do krzywej standardowej. Więcej informacji na temat RT-qPCR można znaleźć w Forlenza i wsp. 201233.

8. Przygotowanie do zamrażania zapasów do długoterminowego przechowywania komórek ES

  1. Dodać 300 μl trypsyny do każdej 6-dołkowej (z kroku 7.3) i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Dodać 2 ml pożywki wirowej (Tabela 2) w celu zneutralizowania trypsyny i kilkakrotnie pipetować w górę i w dół, aby dysocjować na pojedyncze komórki.
  2. Przenieść komórki do probówki o pojemności 15 ml i wirować w masie 300 x g przez 5 minut.
  3. Odessać supernatant i dodać 500 μl pożywki z komórek ES (Tabela 1). Pipetować w górę i w dół, aby ponownie zawiesić komórki.
  4. Przenieść zawartość do probówki kriowialnej o pojemności 1,5 ml i dodać 500 μl 2x pożywki do zamrażania komórek ES (Tabela 3). Dobrze wymieszaj, odwracając probówkę i umieść probówkę w bezalkoholowym pojemniku do zamrażania komórek. Umieścić te pojemniki do zamrażania komórek w temperaturze -80 °C na co najmniej 12 godzin przed przeniesieniem do zbiornika do przechowywania ciekłego azotu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opisany tutaj protokół wykorzystuje komórki ES F1 do badania regulacji cis ekspresji genów w komórkach z monoalleliczną delecją enhancera, wytworzonych przy użyciu edycji genomu CRISPR/Cas9 (Ryc. 1). Kluczowymi czynnikami w tym podejściu są projekt gRNA oraz allelospecyficznych starterów do genotypowania i analizy ekspresji genów. Każdy zestaw starterów allelospecyficznych musi zostać zwalidowany za pomocą qPCR w celu potwierdzenia specyficzności allelicznej. Ide...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Technologia edycji genomu za pośrednictwem CRISPR/Cas9 zapewnia prostą, szybką i niedrogą metodę modyfikacji genomu. Opisana tutaj metoda generowania i analizowania delecji wzmacniacza monoallelicznego w celu charakterystyki wzmacniacza funkcjonalnego wykorzystuje SNP w komórkach myszy F1. Zaletami tego typu podejścia są: 1) delecje wzmacniacza monoallelicznego nie wywołują efektów zakłócających, które występują, gdy krytyczny wzmacniacz jest usuwany z obu alleli, tj. znaczne obniżenie poziomu białka regulowaneg...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy zapoznali się z polityką JoVE dotyczącą konfliktu interesów i nie mają żadnych konfliktów do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować wszystkim członkom laboratorium Mitchella za pomocne dyskusje. Prace te były wspierane przez Kanadyjskie Instytuty Badań nad Zdrowiem, Kanadyjską Fundację na rzecz Innowacji oraz Ministerstwo Badań i Innowacji Ontario (granty operacyjne i infrastrukturalne będące w posiadaniu JAM).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Polimeraza DNA o wysokiej wierności PhusionNEBM0530Spolimeraza DNA o wysokiej wierności stosowana w składaniu gRNA
Gibson Assembly Master MixNEBE2611L
gRNA_Cloning VectorAddgene41824Sekwencja docelowa jest klonowana do tego wektora w celu wytworzenia plazmidu gRNA
pCas9_GFPAddgene44719SpCas9 i EGFP zoptymalizowane pod kątem kodonów plazmid o koekspresji
AflIINEBR0520S
EcoRINEBR3101S
System transfekcji neonowej 100 &mikro; L KitLife TechnologiesMPK10096Technologia transfekcji mikroporatora
prepGEMZyGEMPT10500odczynnik do ekstrakcji genomowego DNA
Nucleo Spin Gel & PCR Clean-upMacherey-Nagel740609.5
Szybki mini zestaw plazmidowyGeneaidPD300
Maxi Plasmid Kit Bez endotoksyn GeneaidPME25
SYBR select mix do CFXLife Technologies4472942odczynnik qPCR
Zestaw do syntezy cDNA iScriptBio-rad170-8891Odczynnik do odwrotnej transkrypcji
0,25% Trypsyna z EDTALife Technologies25200072
PBS bez Ca/Mg2+SigmaD8537
0,5 M EDTABioshopEDT111.500
HBSSLife Technologies14175095
1 M HEPESLife Technologies13630080
BSA frakcja V (7,5%)Life Technologies15260037
Maksymalna wydajność Kompetentne ogniwa DH5 i alfaInvitrogen
18258012 FBS ESFBS jest poddawany wcześniejszym testom na mysich komórkach ES pod kątem pluripotencji
DMSOSigmaD2650
GlutamaxInvitrogen35050
DMEMLife Technologies11960069
Pencillin/StreptomycynaInvitrogen15140
Pirogronian soduInvitrogen11360
Istotne aminokwasInvitrogen11140
β-merkaptoetanolSigmaM7522
96-dołkowa płytkaSarstedt83.3924
Taśma uszczelniającaSarstedt95.1994
CoolCell LXBiocisionBCS-405bezalkoholowy pojemnik do zamrażania komórek
CHIR99021Biovision1748-5Inhibitor hodowli komórek F1 ES
PD0325901Invivogeninh-pd32Inhibitor hodowli komórek F1 ES
LIFChemiconESG1107Inhibitor do hodowli komórek F1 ES

Bibliografia

  1. Sagai, T., Hosoya, M., Mizushina, Y., Tamura, M., Shiroishi, T. Elimination of a long-range cis-regulatory module causes complete loss of limb-specific Shh expression and truncation of the mouse limb. Development. 132 (4), 797-803 (2005).
  2. Kleinjan, D. A., Lettice, L. A. Long-range gene control and genetic disease. Adv Genet. 61, 339-388 (2008).
  3. Visel, A., Rubin, E. M., Pennacchio, L. A. Genomic views of distant-acting enhancers. Nature. 461 (7261), 199-205 (2009).
  4. Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
  5. Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
  6. Shen, Y., et al. A map of the cis-regulatory sequences in the mouse genome. Nature. 488 (7409), 116-120 (2012).
  7. Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
  8. Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
  9. Whyte, W. A., et al. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
  10. Chen, C. Y., Morris, Q., Mitchell, J. A. Enhancer identification in mouse embryonic stem cells using integrative modeling of chromatin and genomic features. BMC Genomics. 13 (1), 152(2012).
  11. Patwardhan, R. P., et al. Massively parallel functional dissection of mammalian enhancers in vivo. Nat Biotechnol. 30 (3), 265-270 (2012).
  12. Melnikov, A., et al. Systematic dissection and optimization of inducible enhancers in human cells using a massively parallel reporter assay. Nat Biotechnol. 30 (3), 271-277 (2012).
  13. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  14. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  15. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  16. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).
  17. Cho, S. W., et al. Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases. Genome Res. 24 (1), 132-141 (2014).
  18. Zhou, H. Y., et al. A Sox2 distal enhancer cluster regulates embryonic stem cell differentiation potential. Genes Dev. 28 (24), 2699-2711 (2014).
  19. Fujii, W., Kawasaki, K., Sugiura, K., Naito, K. Efficient generation of large-scale genome-modified mice using gRNA and CAS9 endonuclease. Nucleic Acids Res. 41 (20), e187(2013).
  20. Tuan, D. Y., Solomon, W. B., London, I. M., Lee, D. P. An erythroid-specific, developmental-stage-independent enhancer far upstream of the human 'beta-like globin' genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (8), 2554-2558 (1989).
  21. Amano, T., et al. Chromosomal dynamics at the Shh locus: limb bud-specific differential regulation of competence and active transcription. Dev Cell. 16 (1), 47-57 (2009).
  22. Li, Y., et al. CRISPR reveals a distal super-enhancer required for Sox2 expression in mouse embryonic stem cells. PLoS One. 9 (12), e114485(2014).
  23. Canver, M. C., et al. Characterization of genomic deletion efficiency mediated by clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 nuclease system in mammalian cells. J Biol Chem. 289 (31), 21312-21324 (2014).
  24. Mlynarczyk-Evans, S., et al. X chromosomes alternate between two states prior to random X-inactivation. PLoS Biol. 4 (6), e159(2006).
  25. Lefever, S., Pattyn, F., Hellemans, J., Vandesompele, J. Single-nucleotide polymorphisms and other mismatches reduce performance of quantitative PCR assays. Clin Chem. 59 (10), 1470-1480 (2013).
  26. Huang, M. M., Arnheim, N., Goodman, M. F. Extension of base mispairs by Taq DNA polymerase: implications for single nucleotide discrimination in PCR. Nucleic Acids Res. 20 (17), 4567-4573 (1992).
  27. Keane, T. M., et al. Mouse genomic variation and its effect on phenotypes and gene regulation. Nature. 477 (7364), 289-294 (2011).
  28. Yalcin, B., et al. Sequence-based characterization of structural variation in the mouse genome. Nature. 477 (7364), 326-329 (2011).
  29. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  30. Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nat Methods. 7 (11), 901-903 (2010).
  31. Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).
  32. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
  33. Forlenza, M., Kaiser, T., Savelkoul, H. F., Wiegertjes, G. F. The use of real-time quantitative PCR for the analysis of cytokine mRNA levels. Methods Mol Biol. 820, 7-23 (2012).
  34. Wu, J. H., Hong, P. Y., Liu, W. T. Quantitative effects of position and type of single mismatch on single base primer extension. J Microbiol Methods. 77 (3), 267-275 (2009).
  35. Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. The long-range interaction landscape of gene promoters. Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Delecja zapo redniczona przez CRISPR Cas9delecja monoallelicznaprimery specyficzne dla allelupolimorfizmy pojedynczego nukleotyduprojektowanie gRNAtransfekcja metod elektroporacjisortowanie metod cytometrii przep ywowejekstrakcja genomowego DNAscreening delecji metod qPCR

Powiązane artykuły