Przygotowanie i testowanie opartych na impedancji biochipów fluidycznych z ogniwami RTgill-W1 do szybkiej oceny próbek wody pitnej pod kątem toksyczności

Podsumowanie

Ten manuskrypt opisuje, jak przygotować płynowe biochipy z komórkami nabłonkowymi skrzeli pstrąga tęczowego do użycia w przenośnym czujniku impedancji podłoża elektrycznego ogniwa. Opisano również protokół przeprowadzania szybkiego testu toksyczności wody pitnej za pomocą czujnika.

Streszczenie

Ten manuskrypt opisuje, jak przygotować płynowe biochipy z komórkami nabłonkowymi pstrąga tęczowego (RTgill-W1) do użycia w przenośnym czujniku toksyczności wody w terenie. Monowarstwa ogniw RTgill-W1 tworzy się na elektrodach czujnikowych zamkniętych w biochipach. Biochipy są następnie wykorzystywane do testowania w terenie przenośnego urządzenia do wykrywania impedancji podłoża elektrycznego (ECIS), przeznaczonego do szybkiego testowania toksyczności wody pitnej. W manuskrypcie opisano ponadto, w jaki sposób przeprowadzić test toksyczności przy użyciu przygotowanych biochipów. Kontrolna próbka wody i badana próbka wody są mieszane ze wstępnie odmierzonymi sproszkowanymi pożywkami i wstrzykiwane do oddzielnych kanałów biochipa. Odczyty impedancji z elektrod czujnikowych w każdym z kanałów biochipa są mierzone i porównywane przez zautomatyzowany program statystyczny. Na ekranie instrumentu ECIS pojawi się komunikat "Wykryto zanieczyszczenie" lub "Nie wykryto skażenia" w ciągu godziny od wstrzyknięcia próbki. Zaletami są łatwość użycia i szybka reakcja na szerokie spektrum nieorganicznych i organicznych chemikaliów w stężeniach istotnych dla zdrowia ludzkiego, a także długoterminowa stabilność przechowywanych biochipów w stanie gotowym do testów. Ograniczeniami są wymóg przechowywania biochipów w chłodni i ograniczona wrażliwość na pestycydy hamujące cholinoesterazy. Zastosowania tego detektora toksyczności są przeznaczone do szybkiego, przenośnego testowania zapasów wody pitnej przez personel wojskowej medycyny prewencyjnej lub do użytku w miejskich zakładach uzdatniania wody.

Wprowadzenie

Ogólnym celem było opracowanie metody sadzenia, przechowywania i testowania biochipów płynnych w biosensorze ECIS. Celem opracowania tego biosensora było spełnienie specyfikacji armii amerykańskiej dla przenośnego urządzenia terenowego, które mogłoby wykrywać możliwe zanieczyszczenie zasobów wody pitnej używanych przez żołnierzy. Wymagania dotyczące czujnika toksyczności polegały na tym, że może on szybko (w ciągu godziny) wykrywać szerokie spektrum toksycznych związków przemysłowych w stężeniach istotnych dla zdrowia ludzkiego, że urządzenie może być przenośne w terenie, a składniki biologiczne będą miały okres trwałości wynoszący co najmniej dziewięć miesięcy. Dopuszczalne było chłodzenie, ale nie zamrażanie, łatwo psujących się komponentów.

Historycznie, technologie przemysłowego testowania wody z komponentem biologicznym (takim jak przeciwciała, enzymy lub kwasy nukleinowe) były specyficzne dla analitów^1-3. Wadą tego typu bioczujników jest to, że wykrywają one tylko jeden rodzaj substancji chemicznej na raz. Jeśli podejrzewa się, że obecna jest więcej niż jedna substancja chemiczna, potrzebnych jest wiele czujników. Jeśli konkretny czujnik nie znajduje się w repertuarze testowym, zanieczyszczenia chemiczne w wodzie mogą łatwo pozostać niewykryte.

Z drugiej strony, czujniki toksyczności o szerokim zasięgu mają potencjał, aby wypełnić tę lukę technologiczną. Zwykle mają one komponent komórkowy^4-8. Zaletą bioczujników toksyczności o szerokim zasięgu jest to, że mogą one wykrywać obecność szerokiej gamy zanieczyszczeń chemicznych, w tym mieszanin i niewiadomych, w stosunkowo krótkim czasie^5,9,10.

Koncepcja wykorzystania pomiaru impedancji elektrycznej monowarstw komórek jako możliwego czujnika toksyczności, który jest również znany jako wykrywanie impedancji elektrycznej komórki i podłoża (ECIS), została po raz pierwszy opisana przez Giaevera i Keese'a¹¹. W ciągu ostatnich dwóch dekad wykazano, że jest to czuły wskaźnik żywotności komórek i cytotoksyczności. Zasadniczo monowarstwa ogniwa, która jest przyklejona do elektrod na biochipach, jest wystawiona na działanie sygnału prądu przemiennego o wysokiej częstotliwości i niskim napięciu oraz natężeniu. Zlewająca się monowarstwa komórek utrudnia przepływ elektronów. Gdy integralność monowarstwy ogniwa jest zagrożona (np. po wprowadzeniu toksycznej substancji chemicznej), czujnik ECIS rejestruje zmianę impedancji elektrycznej^11-14. Rysunek 1 ilustruje zasadę działania ECIS w odniesieniu do monowarstwy komórki na biochipie.

Rys. 1: Zasada działania ECIS. Ilustracja monowarstwy komórki na biochipie z uproszczonym schematem elektrycznym czytnika ECIS. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Początkowo linie komórkowe ssaków były umieszczane w płynnych biochipach i były używane w technologii czujników ECIS opisanej tutaj¹². Ogniwa te nie nadawały się jednak do użytku w terenie, ponieważ wymagały częstej wymiany pożywki, miały ograniczony okres trwałości i wymagały sztucznego środowiska CO₂ oraz temperatury inkubacji wynoszącej 37 °C. Odkryto, że dostępna na rynku linia komórkowa pochodząca z komórek nabłonka skrzelowego pstrąga tęczowego (komórki RTgill W-1) może być testowana w temperaturze pokojowej przy temperaturze otoczenia CO_{2 ,} tworzy zlewającą się monowarstwę w biochipach, może być przechowywana w temperaturach chłodniczych i szybko reaguje (1 godzina lub mniej) na szerokie spektrum chemikaliów w stężeniach istotnych dla zdrowia ludzkiego¹². Zastosowania komórek RTgill-W1 w toksykologii, a także w badaniach podstawowych, są recenzowane przez Lee i wsp. ¹⁵

Metody sadzenia, przechowywania i testowania płynnych biochipów zawierających monowarstwy komórek RTgill-W1 na płynnych biochipach w biosensorze ECIS są opisane tutaj. Płynne biochipy mogą być przechowywane do 9 miesięcy w stanie chłodniczym i mogą być wysyłane w chłodni w celu przetestowania zapasów wody pitnej. Dołączone czytniki ECIS lub jednostki testowe są wysyłane oddzielnie. Biochipy składają się z dwóch elementów; Górna warstwa poliwęglanu z dwoma oddzielnymi kanałami płynu i dolna warstwa elektroniczna, która zawiera cztery elektrody na kanał do wykrywania impedancji. W każdym padzie znajduje się 10 elektrod roboczych; Każda elektroda ma średnicę 250 μm. Zmontowane biochipy mają złote elektrody do uzyskiwania odczytów impedancji po włożeniu do jednostki testowej ECIS. Każdy z dwóch zamkniętych płynnych kanałów w kształcie litery U pomieści 2 ml zawiesiny komórek RTgill-W1. Rysunek 2 przedstawia biochip fluidyczny w czytniku ECIS z powiększeniem zbiegających się komórek na pojedynczej elektrodzie czujnikowej.

Rysunek 2: Biochip Fluidic w czytniku ECIS. Powiększony obszar pokazuje zlewającą się monowarstwę ogniw RTgill-W1 na pojedynczej elektrodzie czujnikowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protokół

1. Przygotowanie materiałów testowych

UWAGA: Aby przygotować biochipy do testów, musi być gotowych kilka zlewających się kolb komórek RTgill-W1. Dobre oszacowanie liczby potrzebnych kolb to jedna zlewająca się kolba T175 na 16 biochipów do wysiania.

1. Wykonaj następujące czynności w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II (biokapturze) przy użyciu techniki aseptycznej. Do dezynfekcji okapu biologicznego i wszelkich materiałów umieszczonych w okapie należy używać 70% etanolu.
   1. Przygotować substrat fibronektyny do płynnych biochipów, rozmrażając fiolkę fibronektyny o pojemności 1 mg i rozcieńczając w 100 ml sterylnej pożywki L-15 o stężeniu 10 μg/ml. Zamrażać w 40 ml podwielokrotności w sterylnych stożkowych probówkach polipropylenowych o pojemności 50 ml w temperaturze -20 °C. Rozmrażać w temperaturze pokojowej na kilka godzin przed wysiewem biochipów. Po rozmrożeniu nie zamrażaj ponownie.
   2. Przygotować pożywkę do hodowli komórkowych, dodając 50 ml płodowej surowicy bydlęcej, 5 ml 200 mM suplementu L-alanylo-L-glutaminy i 5 ml roztworu penicyliny/streptomycyny (10 000 jednostek penicyliny/ml i 10 000 μg streptomycyny/ml) do 500 ml pożywki L-15. W ten sposób otrzyma się 560 ml pożywki do hodowli komórkowych zawierającej 9% surowicy. Przechowywać w lodówce.
      Uwaga: Będzie to kompletna pożywka do hodowli komórkowych używana do kolb hodowlanych i biochipów.
2. Fiolki ze sproszkowanymi pożywkami
   1. Przygotować z wyprzedzeniem fiolki z zatrzaskiem o pojemności 0,1 dram zawierające 60 mg ± 0,5% proszku L-15ex za pomocą automatycznego dozownika proszku. Oznaczyć fiolki datą wydania proszku i przechowywać fiolki (w ilości 50 sztuk) w zamykanych metalizowanych torebkach foliowych; Każdy z nich zawiera trzy saszetki z żelem krzemionkowym o pojemności 1 g.
      Uwaga: Fiolki z pożywką w proszku L-15ex mogą być wykonane i przechowywane do 9 miesięcy przed badaniem.
3. Przygotuj roztwór 100 ml 20% wybielacza, rozcieńczając wybielacz domowy wodą dejonizowaną (DI). Oszacuj, że do każdego biochipa potrzeba 5 ml roztworu wybielacza.
4. Wykonaj zespoły rurek biochipowych, przecinając 27-milimetrowe odcinki biokompatybilnych rurek autoklawowalnych (2 sekcje dla każdego biochipa, który ma zostać wysiewany) i dopasuj oba końce rurki za pomocą poliwęglanowych złączek poślizgowych luer. Umieścić przewody w torbie nadającej się do sterylizacji w autoklawie i sterylizować w autoklawie przez 8 minut w temperaturze 134 °C. Również zatyczki do biochipów w autoklawie (po 2 na biochip) w osobnej torbie przy tych samych ustawieniach.
5. Woda w autoklawie DI przez 30 min w temperaturze 121 °C.
   Uwaga: Ta woda będzie używana do płukania biochipów po wysiewie. Szacuje się, że na każdy biochip potrzeba 10 ml.
   Uwaga: Rzeczywista objętość każdego kanału biochipa wynosi 2 ml, ale 5 ml sterylnej wody jest spłukiwane przez każdy kanał po usunięciu roztworu wybielacza.
6. Wykonaj zespoły rurek iniekcyjnych strzykawki, przecinając 27-milimetrowe odcinki biokompatybilnych rurek i mocując męskie złączki poślizgowe luer na obu końcach rurki. Umieścić przewody w papierowej torebce do sterylizacji na gorąco i w autoklawie na 8 minut w temperaturze 134 °C.

2. Procedura wysiewu płynowego biochipa

Uwaga: Wykonuj wszystkie procedury, w których biochipy lub media są obsługiwane w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II, używając techniki aseptycznej.

1. Dwadzieścia cztery godziny przed planowanym wysiewem wyjmij biochipy z opakowania producenta w biokapturze i umieść w wysterylizowanych plastikowych skrzynkach na narzędzia.
2. Wysterylizuj biochipy za pomocą 20% roztworu wybielacza w następujący sposób
   Uwaga: Historycznie rzecz biorąc, ta procedura wybielania zapobiegała rozwojowi grzybów w biochipach podczas długotrwałego przechowywania w przypadku, gdy sterylizacja plazmowa biochipów przeprowadzona przez producenta nie była skuteczna.
   1. Za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 20 ml z dołączonym zespołem rurki do wstrzykiwań strzykawki i pracującym w kapturze biologicznym, wstrzyknij 2 ml 20% roztworu wybielacza do każdego kanału biochipa. Pozostaw biochipy na 1 godzinę z roztworem wybielacza.
   2. Po godzinie odessać próżniowo roztwór wybielacza z obu kanałów za pomocą sterylnego męskiego zestawu luer poślizgowego przymocowanego do rurki ssącej próżniowej. Użyj jednego z przewodów biochipowych jako odpływu podczas płukania biochipów.
   3. Za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 20 ml dołączonej do sterylnego zestawu do wstrzykiwań strzykawki, przepłucz każdy kanał chipa 5 ml sterylnej wody, pozwalając nadmiarowi wody spłynąć do pojemnika w kapturze biologicznym. Następnie odessaj próżniowo wodę zgodnie z opisem dla wybielacza i umieść biochipy z powrotem w plastikowych pojemnikach na instrumenty i pozostaw w biokapturze do momentu zasiania komórek następnego dnia.
3. Sześćdziesiąt minut przed wysiewem biochipów wstrzyknąć 2 ml roztworu fibronektyny o stężeniu 10 μg/ml do każdego kanału biochipa. Pozostaw biochipy w kapturze biologicznym na 60 minut, a następnie odessaj próżniowo fibronektynę (zgodnie z opisem w kroku 2.2.3) przed zasiewem biochipa komórkami. Umieść dwie sekcje sterylnych przewodów biochipowych (patrz sekcja 1.4) na portach biochipów.
4. Trypsynizować jedną zlewającą się kolbę RTgill-W1 T175 na każde 16 biochipów, stosując procedury opisane w arkuszu opisu produktu American Type Culture Collection (ATCC)¹⁶.
   1. Odessać pożywkę z kolby (kolb) konfluentnych komórek.
   2. Przepłukać warstwę komórkową 15 ml PBS, a następnie odessać.
   3. Dodaj 6 ml trypsyny/EDTA do warstwy komórkowej w każdej kolbie T175 i pozwól komórkom trypsynizować przez ~5 minut.
   4. Dodać 15 ml kompletnej pożywki do hodowli komórkowych L-15 do każdej kolby, aby zatrzymać trypsynizację.
   5. Połączyć zawiesiny komórek w sterylnym pojemniku jednorazowego użytku.
      Uwaga: Wielkość pojemnika może wahać się od 150 do 500 ml, w zależności od liczby wysiewanych biochipów. Oszacuj, że na biochip potrzeba 5 ml zawiesiny komórek.
5. Usunąć ~1 ml zawiesiny komórek i umieścić w probówce mikrowirówkowej w celu zliczenia. Używając mikroskopu jasnego pola z obiektywem 10X i hemocytometrem, policz 10 μl podwielokrotności komórek i oblicz objętość kompletnej pożywki do hodowli komórek L-15 potrzebnej do uzyskania zawiesiny komórkowej 2,5 x 10⁵ komórek/ml.
   Uwaga: W przypadku użycia zawiesiny komórkowej do kolb nasiennych w celu kontynuowania hodowli, byłby to cel, aby to zrobić. Dostosuj stężenie zawiesiny komórkowej za pomocą kompletnych pożywek do hodowli komórkowych L-15.
6. Za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 20 ml podłączonej do sterylnego zespołu rurki do wstrzykiwań strzykawki (patrz punkt 1.6), wstrzyknąć 2,5 ml zawiesiny komórek do zewnętrznego portu każdego kanału biochipa (tj. portów, do których nie jest podłączony dren), pozwalając części dodatkowej zawiesiny komórkowej wypłynąć z rurki do pojemnika na odpady w biokapturze.
   Uwaga: Zapewni to, że cały kanał i dołączone rurki będą wypełnione zawiesiną ogniw.
   1. Utwórz zamkniętą pętlę dla każdego kanału biochipa, wkładając wolny koniec węża ze złączką luer do zewnętrznych portów dla każdego kanału.
   2. Zetrzyj nadmiar pożywki z zamkniętych pętli ręcznikiem papierowym zwilżonym 70% etanolem i umieść biochipy z powrotem w plastikowym pudełku w inkubatorze o temperaturze 20 °C. Nadaj każdemu biochipowi unikalny numer identyfikacyjny.
7. W dniach 4 i 7 wyjąć biochipy z inkubatora w temperaturze 20 °C i uzupełnić pożywkę we wszystkich biochipach kompletnymi pożywkami do hodowli komórkowych L-15 w równowadze temperaturowej. Postępuj zgodnie z tą samą procedurą, co w kroku 2.6, z wyjątkiem tego, że zamiast tego użyj tylko pożywki do hodowli komórkowych L-15 (bez zawiesiny komórek). Umieść biochipy z powrotem w inkubatorze w temperaturze 20 °C po karmieniu w 4 dniu.
   1. Po karmieniu w 7 dniu wyjmij i wyrzuć węże z wiórów i włóż autoklawowane korki spustowe do biochipów.
   2. Umieścić biochipy w pudełku w inkubatorze o temperaturze 6 °C do czasu użycia do testów.
      Uwaga: Chipy mogą być przechowywane w temperaturach chłodniczych przez okres do 9 miesięcy i nadal nadają się do testowania w czytnikach ECIS.

3. Testy ECIS z biochipami

1. Przygotować badane substancje chemiczne, jeżeli są używane. (Zob. Brennan i in., 2012⁷ w celu przygotowania badanych substancji chemicznych).
2. Wyjąć czytnik ECIS i materiały testowe z walizki. Wyjąć przygotowany biochip z inkubatora o temperaturze 6 °C. Umieść biochip na ręczniku papierowym. Włącz czytnik ECIS.
3. Za pomocą strzykawek o pojemności 10 ml dozuj 10 ml wody kontrolnej do oznakowanego przezroczystego plastikowego słoika kontrolnego o pojemności 0,5 uncji i 10 ml próbki testowej do oznaczonego przezroczystego plastikowego słoika testowego o pojemności 0,5 uncji.
   Uwaga: 1) Pamiętaj, aby usunąć pęcherzyki, aby uzyskać dokładny pomiar. 2) Strzykawki i słoiki są oznaczone kolorami; Niebieski dla kontroli i czerwony dla testu.
4. Wyjąć dwie fiolki z sproszkowaną pożywką z torebki foliowej. Otworzyć jedną z fiolek ze sproszkowaną pożywką (w razie potrzeby użyć narzędzia wielofunkcyjnego) i wlać całą zawartość jednej fiolki do słoika z wodą kontrolną, wrzucając całą fiolkę do roztworu. Powtórz tę procedurę ze słoikiem testowym. Zakręć słoikami i potrząśnij nimi, aby upewnić się, że proszek się rozpuścił.
5. Napełnić każdą z kolorowych strzykawek o pojemności 10 ml 9 ml roztworu kontrolnego (niebieska strzykawka) lub testowego (czerwona strzykawka) z odpowiednich fiolek. Usunąć pęcherzyki powietrza ze strzykawek.
6. Wyjmij korki z portów biochipa i podłącz odpływ.
7. Umieść biochip w wyjmowanej plastikowej tacce w czytniku ECIS i zamknij pokrywę.
8. Podłączyć napełnione strzykawki do zewnętrznych portów biochipa i założyć tłok strzykawki.
9. Na ekranie głównym wybierz "DALEJ", aby rozpocząć test wstępny.
   Uwaga: Oprogramowanie czytnika sprawdzi impedancje. Jeśli impedancje mieszczą się w zakresie ustawionym przez użytkownika (zwykle od 1,000 do 3,000 omów), na ekranie pojawi się komunikat "Cartridge Passed", jak pokazano na rysunku 3, i poinstruuje użytkownika, aby wybrał "Dalej", a oprogramowanie przejdzie do kroku 3.10). Jeśli impedancje nie mieszczą się w ustawionym zakresie z powodu wadliwego biochipa lub wadliwego połączenia biochipa z czytnikiem (zwykle z powodu niewspółosiowości elektrod), na ekranie pojawi się komunikat "Awaria wkładu", a użytkownik będzie miał możliwość "Przerwij" lub "Sprawdź" test.
   1. Wybierz "Przerwij", aby wrócić do kroku 3.9). Wybierz "Weryfikuj", aby przejść do kroku 3.10) po otrzymaniu komunikatu "Kartridż przekazany" i wybraniu "Dalej".
      Uwaga: Najlepiej jest wyjąć biochip i sprawdzić go wzrokowo pod kątem wad lub wycieków, jeśli zostanie odebrany komunikat "Awaria wkładu" przed przystąpieniem do nowego biochipa.

Rysunek 3: Zrzut ekranu czytnika ECIS przedstawiający biochip z dopuszczalnymi odczytami impedancji. Zrzut ekranu pokazuje początkowe odczyty impedancji w omach każdej z 4 elektrod kontrolnych (CE) i 4 elektrod próbki testowej (SE) w biochipie fluidycznym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

10. Po wyświetleniu monitu przez czytnik wprowadź przykładowe informacje za pomocą klawiatury programowej, a następnie wybierz "Akceptuj" po zakończeniu.
    Uwaga: Oprogramowanie czytnika ECIS automatycznie ostempluje każdy zestaw danych datą, godziną i innymi informacjami wprowadzonymi przez użytkownika; takie jak numer biochipa oraz rodzaj substancji chemicznej i stężenie. Dwie minuty danych o impedancji zostaną zebrane z włożonego biochipa, a zegar na ekranie będzie odliczał czas.
11. Po dwóch minutach, po wyświetleniu monitu zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie, które w czerwonym polu, naciśnij "DALEJ". Po wyświetleniu monitu przez zielone pole, aby "Wstrzyknąć próbki teraz", wstrzyknij jednocześnie pożywkę kontrolną i testową z dołączonych strzykawek do kanałów biochipa. Po zakończeniu pozostawić strzykawki na miejscu na biochipach.
    Uwaga: Wartości impedancji będą zbierane raz na minutę przez 60 minut. Jeśli oprogramowanie czytnika ECIS stwierdzi, że kanał badawczy różni się statystycznie od kanału kontrolnego w dowolnym momencie między 10 a 60 minutami po rozpoczęciu testu, wówczas na wyświetlaczu ekranowym pojawi się informacja, że próbka jest "Zanieczyszczona". Jeśli leczenie nie różni się od kanału kontrolnego, na ekranie pojawi się komunikat "Nie wykryto zanieczyszczenia" na końcu przebiegu testu.
12. Dla każdej próbki należy zapisać wyniki badań jako zanieczyszczone lub nieskażone.
13. Pod koniec przebiegu testowego wyjmij i wyrzuć biochip. Wypłucz i wysusz na powietrzu strzykawki, fiolki testowe i wyjmowaną plastikową tackę, w której znajdował się biochip podczas testów.
    Uwaga: Czytnik ECIS posiada 4 GB wbudowanej pamięci na oprogramowanie operacyjne, modele kontrolne i pliki testowe wygenerowane w wyniku przeprowadzenia testu. Pozwala to na zapisanie w czytniku kilku tysięcy plików testowych. Pliki można pobrać za pomocą dysku skokowego USB i przesłać do komputera w celu dalszej analizy w celach badawczych, jeśli jest to pożądane.

Wyniki

Technologia ECIS opisana w tym artykule została poddana testom w sponsorowanym przez amerykańską Agencję Ochrony Środowiska (USEPA) Programie Testowania i Oceny Technologii (TTEP). Trzynaście substancji chemicznych zostało wybranych do testów jako przedstawiciele szerokiego spektrum toksycznych związków przemysłowych, które mogą być potencjalnymi zanieczyszczeniami wody pitnej. Podczas badań 9 z 13 wirusów zostało wykrytych przez ECIS w ciągu godziny w stężeniach istotnych dla zdrowia ludzkiego⁸ . Tabela 1 ilustruje wyniki tych badań zanieczyszczeń. Rysunek 4 przedstawia reprezentatywny wygląd, jak wyglądałby wynik "Zanieczyszczony" na ekranie czytnika ECIS. W większości przypadków impedancje komórkowe zmniejszyły się w przypadku zanieczyszczonych próbek w porównaniu z kontrolą. Czasami niektóre związki mogą powodować wzrost impedancji.

W Tabeli 1 podsumowano również testy czystej wody. Przeprowadzono czterdzieści próbek czystej wody i nie wykryto żadnego zanieczyszczenia w żadnej z próbek (patrz rysunek 5) dla reprezentatywnego zrzutu ekranu "Nie wykryto zanieczyszczenia".

Rysunek 4: Zrzut ekranu czytnika ECIS przedstawiający "zanieczyszczoną" próbkę wody. Przykład grafiki znormalizowanej impedancji i wyników z próbki wody, która została zanieczyszczona. Niebieskie linie reprezentują znormalizowane impedancje każdej z elektrod kontrolnych; Czerwone linie reprezentują znormalizowane impedancje każdej z elektrod badanej próbki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Zrzut ekranu z czytnika ECIS przedstawiający próbkę wody z komunikatem "nie wykryto zanieczyszczenia". Przykład grafiki znormalizowanej impedancji i wyników z próbki wody, która nie była zanieczyszczona. Niebieskie linie reprezentują znormalizowane impedancje każdej z elektrod kontrolnych; Czerwone linie reprezentują znormalizowane impedancje każdej z elektrod badanej próbki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

kategoria	Zanieczyszczeń	Testowane stężenie (mg/L)1			Wykryto ≤1 godzinę n = 4/4 żetonów
Pestycydy	Aldikarb	0.17			nie
	Arsen (arsenin sodu)	4.5			tak
	Azydek (azydek sodu)	46.7			tak
	Fenamifos	0.56			nie
	Metamidofos	1.4			nie
	Paration metylowy	33.6			tak
	Parakwat (dichlorek)	4.6			nie
	Pentachlorofenian (sód)	71.9			tak
Chemikalia przemysłowe	amoniak	924			tak
	Miedź (siarczan miedzi II)	103			tak
	Cyjanek (sód)	14			tak
	Rtęć (chlorek)	24.7			tak
	toluen	444			tak
Czysta woda2	żaden	BRAK DANYCH			nie
1Badane stężenia są takie same jak w manuskrypcie Widdera i wsp. (2014).
240 próbek czystej wody zostało pobranych bez zanieczyszczeń.

Tabela 1: Zanieczyszczenia w próbkach wody wykryte przez ECIS.

Dyskusja

Technologia ECIS sprawdziła się w warunkach laboratoryjnych i była w stanie wykryć potencjalne zanieczyszczenia wody w stężeniach istotnych dla zdrowia ludzkiego. Przenośność i opakowanie technologii sprawia, że sprzyja ona użytkowaniu w terenie.

Kluczowe kroki w protokole dla powodzenia technologii są następujące: 1) Utrzymuj warunki aseptyczne podczas hodowli, siewu i podawania biochipów, 2) Przechowuj biochipy z nasionami w warunkach chłodniczych, dopóki nie będą gotowe do testowania, ponieważ komórki RTgill-W1 nie przetrwają zbyt długo, gdy zostaną poddane działaniu temperatur powyżej 25 °C, 3) Dokładnie zważyć L-15ex w fiolkach ze sproszkowanymi pożywkami i dokładnie zmierzyć próbki wody, aby uniknąć uzyskania wyników fałszywie dodatnich, które mogą być spowodowane zmianą osmolalności pożywki, a nie toksycznością próbki, 4) Postępuj zgodnie z instrukcjami użytkownika wyświetlanymi na ekranie ECIS, aby przeprowadzić testy. Oprogramowanie w czytniku powiadomi użytkownika, jeśli biochip nie nadaje się do testowania (na podstawie początkowych odczytów impedancji), gdy biochip zostanie po raz pierwszy włożony do czytnika. Jeśli poziomy impedancji są nie do zaakceptowania do testowania, oprogramowanie nie pozwoli użytkownikowi na kontynuowanie testowania, dopóki nie zostanie użyty nowy biochip. Przyczyną niedopuszczalnych odczytów impedancji jest zwykle niewielka niewspółosiowość elektrod biochipa z pinami czytnika ECIS lub wyciek płynu wzdłuż jednej z krawędzi klejenia biochipa.

Technologia ta ma pewne ograniczenia, ponieważ czujnik ECIS został przetestowany tylko z wodą pitną, a nie z wodą powierzchniową. Komórki RTgill-W1, które znajdują się na biochipie, nie tolerują zamarzania lub temperatur znacznie przekraczających 25 °C przez dłuższy czas (ramy czasowe mogą wynosić od godzin do dni w zależności od temperatury. Biochipy działają najlepiej w zakresie temperatur od temperatury schłodzonej do temperatury pokojowej⁷. Są one gotowe do natychmiastowego użycia, jednak zaraz po wyjęciu z chłodni. Przenośne kontenery chłodnicze są obecnie używane przez personel wojskowy w terenie do zaopatrzenia wrażliwego na temperaturę. Te same pojemniki mogą być używane do transportu biochipów z nasionami.

Kolejnym ograniczeniem tej technologii jest to, że mimo że jest to szerokopasmowy czujnik toksyczności, nie reaguje dobrze, jeśli w ogóle, na związki hamujące cholinoesterazy, takie jak niektóre pestycydy. Aby wypełnić tę lukę, czujnik ECIS zaprojektowano tak, aby można go było używać w połączeniu z dostępnym na rynku szybkim testem na obecność pestycydów podczas badania próbek wody, aby zapewnić użytkownikowi szerszy zakres badań toksyczności. Zestaw jest szybkim testem enzymatycznym przeznaczonym do wykrywania pestycydów fosforoorganicznych i karbaminianowych w ciągu 30 minut.

Czujnik ECIS uzupełnia polowy system badania wody WQAS-PM (Water Quality Analysis System - Preventive Medicine), który jest obecnie używany przez wojskowy personel medycyny prewencyjnej do wykrywania arsenu, ołowiu lub cyjanku w próbce wody pitnej. Chociaż czujnik ECIS nie określi, co to za zanieczyszczenie, wskaże, czy obecne są określone metale lub związki organiczne, co wskazuje, że woda może nie nadawać się do spożycia przez ludzi. Wyniki testu ECIS są dostępne w ciągu godziny. Próbki wody mogą być następnie wysłane do dalszej analizy w celu identyfikacji zanieczyszczenia, jeśli wynik testu jest pozytywny.

Jak opisano powyżej, czytnik ECIS został zaprojektowany jako część systemu, który zawiera oddzielny zestaw enzymatycznego ACE w celu pokrycia szerokiego spektrum wykrywania zanieczyszczeń. Oba te czytniki są zapakowane w solidną walizkę do transportu polowego do użytku polowego przez żołnierzy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Płodowa surowica bydlęca	Life Technologies, Inc. www.lifetechnologies.com	16000-085	Przechowywać @ -20 & st. C. Rozmrozić @ temperatura pokojowa przed użyciem. Składnik kompletnych pożywek do hodowli komórkowych L-15 (10%).
Fibronektyna, osocze bydlęce	EMD Millipore Corp.    www.emdmillipore.com	341631-1 mg	Przechowywać @ -20 °C. Rozmrozić @ temperatura pokojowa przed użyciem. Zmieszać z pożywką L-15 uzyskać stężenie 10 μ g/ml i zamrażać @ -20 ° C w podwielokrotnościach. Służy jako podłoże do biochipów.
Pożywka L-15 bez L-glutaminy	Lonza  www.lonzabioscience.com	12-700F	Pożywka bazowa do hodowli komórkowych i podawania biochipów. Przechowywać w temperaturze 6 stopni Celsjusza.
Pożywka w proszku L-15ex z czerwienią fenolową	US Biological              www.usbio.net	Pożywki L1501	odważa się w podwielokrotnościach 60 mg w fiolkach o pojemności 0,1 dram i przechowuje w temperaturze 6 ° C w woreczkach foliowych z opakowaniami ze środkiem osuszającym. Dziewięciomiesięczny okres przydatności do spożycia. Zmieszany z 10 ml próbki wody do badania w biochipach.
PBS, bez Ca2+ lub Mg2+	Lonza  www.lonzabioscience.com	17-516F	Przechowywać w temperaturze pokojowej. Służy do płukania pożywki podczas trypsynizacji kolb do hodowli komórkowych.
Trypsyna, EDTA	Lonza  www.lonzabioscience.com	CC-5012	Przechowywać @ -20 °C. Rozmrozić w temperaturze pokojowej i użyć do trypsynizacji kolb do hodowli komórkowych.
Kolby hodowlane T175	Fisher Scientific www.fishersci.com	12-565-30	Służy do hodowli komórek RTgill-W1.
Wybielacz	Chlorox		Rozcieńczony do 20% wodą mieloną lub destylowaną do czyszczenia wiórów ECIS. Dopuszczalny jest każdy wybielacz domowy.
70% alkohol			Do dezynfekcji powierzchni biokapturów i wszelkich materiałów umieszczanych w biokapturze.
Komórki skrzelowe pstrąga tęczowego (RTgill-W1)	Kolekcja kultur tkankowych typu amerykańskiego                      www.atcc.org	CRL-2523	Komórki hodowane i wykorzystywane do biosensora (biochipy do wysiewu).
Suplement GlutaMAX-1, 200 mM	Lonza  www.lonzabioscience.com	35050-061	Przechowywać w temperaturze pokojowej.  Składnik kompletnych pożywek do hodowli komórkowych L-15 (1%).
Penn/Strep Stock 10K/10K	Lonza  www.lonzabioscience.com	17-602E	Przechowywać @ -20 °C. Rozmrozić @ temperatura pokojowa przed użyciem. Składnik kompletnych pożywek do hodowli komórkowych L-15 (1%).
Rurki Pharmed BPT	U.S. Plastic Corp.          www.usplastic.com	57317	Pocięte na odcinki 27 mm i sterylizowane w autoklawie. Służy do wysiewania biochipów z komórkami oraz jako zamknięta pętla między zmianami pożywki.
Złączki luer z poliwęglanu do wiązek rurowych	Pharmed Value Plastics	MTLS210-9	Przymocowane do każdego końca przeciętej rurki Pharmed w celu włożenia do bichipów.
Strzykawki 20 ml z końcówką wsuwaną	VWR Scientific          us.vwr.com	BD302831	Służy do wstrzykiwania zawiesiny komórkowej do wysiewu wiórów ECIS, a także do podawania wiórów.
0,1 dram zatrzaskowe mikrofiolki z polipropylenu	Butelki Słoiki i tubki, Inc.    www.bottlesjarsandtubes.com	30600	Służy do przechowywania 60 mg podwielokrotności sproszkowanej pożywki L-15ex.
60 mil Lexan fluidic ECIS biochips	Nanohmics, Inc.		Wykonane na zamówienie przez Nanohmics, Inc. Komórki RTgill-W1 zostaną wstrzyknięte do biochipów, a chipy z nasionami zostaną umieszczone w czytniku ECIS w celu przetestowania.
Autoklawowalna plastikowa skrzynka na narzędzia 17 1/2" x 7 3/4" x 2 3/8"	Medi-Dose EPS        medidose.com	IB701	Służy do przechowywania: autoklawowanych zatyczek, oczyszczonych biochipów, biochipów z nasionami.
Papierowe woreczki do sterylizacji zgrzewanej, 7 i frac12; ” x 13"	KardynałZdrowie              www.cardinalhealth.com	90713	Służy do autoklawowania rurek i złączek oraz zatyczek.
Automatyczny dozownik proszku Quantos	Mettler Toledo            www.mt.com	QB5	Automatyczne rozdzielanie 60 mg porcji sproszkowanego L-15ex do fiolek o pojemności 0,1 dram.
Czytnik ECIS	Nanohmics, Inc.		Wykonany na zamówienie przez Nanohmics, Inc. Biochip z nasionami jest wkładany do czytnika w celu przeprowadzenia testów toksyczności wody.
3 x 5 metalizowane polipropylenowe worki wielokrotnego zamykania o grubości 2,5 mil	Uline                                www.uline.com	S-16893	Pakowanie i przechowywanie zarówno biochipów z nasionami, jak i fiolek ze sproszkowanymi pożywkami L-15ex.
Tryskanie Leatherman ps4	Amazonka		Służy do otwierania fiolek ze sproszkowanymi pożywkami.
Opakowania 1 g osuszacza z żelem krzemionkowym	Uline                                www.uline.com	S-3902	Umieść w polipropylenowych torebkach z fiolkami ze sproszkowanymi mediami L-15ex, aby zapobiec gromadzeniu się wilgoci w proszku.
Sterylne butelki Nalgene o pojemności 250 lub 500 ml	Fisher Scientific www.fishersci.com	09-740-25C lub E	Zawiesiny komórkowe Hold do wysiewu chipsów ECIS w biohood.
Zatyczki do biochipów	Nanohmics, Inc.		Wykonane na zamówienie przez Nanohmics, Inc. Służy do uszczelniania portów w biochipach przed przechowywaniem w temperaturze 6 stopni Celsjusza.
Odpływy do biochipów ECIS	Nanohmics, Inc.		Wykonane na zamówienie przez Nanohmics, Inc. Umieszczony na 2 wewnętrznych portach na biochipach przed włożeniem do czytnika ECIS.  Pozwala na odpływ nadmiaru mediów z kanałów podczas wtrysków testowych.
Hemocytometr	Fisher Scientific www.fishersci.com	S17040	Potrzebny do liczenia komórek przed dostosowaniem zawiesiny komórek do wstrzyknięcia do biochipów.
Mikroskop jasnego pola z obiektywem 10X	Leitz Labovert		Każdy mikroskop jasnego pola jest dopuszczalny.
		bezpieczeństwa biologicznego klasy II	Dopuszczalna jest każda komora bezpieczeństwa biologicznego klasy II, w której hodowla komórkowa może być przeprowadzana w sterylnych warunkach.
Probówki do mikrowirówek, 0,6 ml	Fisher Scientific www.fishersci.com	02-681-311	Mieści 1 ml zawiesiny komórkowej przed zliczeniem komórek.
Czerwone strzykawki Slip 10 cc	Procedure Products, Inc.            www.procedureproducts.com	S/49S 30-R	Pobiera 9 ml próbki wody testowej i służy do wstrzykiwania próbki do biochipa.
Niebieskie strzykawki Slip 10 cc	Procedure Products, Inc.            www.procedureproducts.com	S/49S 30-B	Pobiera 9 ml próbki wody kontrolnej i służy do wstrzykiwania próbki do biochipa.
½ oz. przezroczysty plastikowy słoik dla zwierząt domowych z białymi prążkowanymi nakrętkami	Butelka SKS i Opakowania, Inc.              www.sks-bottle.com	0605-30	Fiolki na próbki używane do mieszania proszku L-15ex i 10 ml próbki wody do badań.
50 ml sterylne stożkowe probówki wirówkowe z polipropylenu	Fisher Scientific        www.fishersci.com	12-565-269	Służy do przechowywania 40 ml porcji 10 μ g/ml fibronektyny w temperaturze -20 & st. C.
Test wykrywania inhibitora acetylocholinoesterazy NIDS ACE	ANP Technologies, Inc. www.anptinc.com	ACE-400	Czujnik przeznaczony do szybkiego wykrywania pestycydów w wodzie pitnej