Ten manuskrypt opisuje, jak przygotować płynowe biochipy z komórkami nabłonkowymi skrzeli pstrąga tęczowego do użycia w przenośnym czujniku impedancji podłoża elektrycznego ogniwa. Opisano również protokół przeprowadzania szybkiego testu toksyczności wody pitnej za pomocą czujnika.
Artykuł metodologiczny
Przygotowanie i testowanie opartych na impedancji biochipów fluidycznych z ogniwami RTgill-W1 do szybkiej oceny próbek wody pitnej pod kątem toksyczności
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ten manuskrypt opisuje, jak przygotować płynowe biochipy z komórkami nabłonkowymi pstrąga tęczowego (RTgill-W1) do użycia w przenośnym czujniku toksyczności wody w terenie. Monowarstwa ogniw RTgill-W1 tworzy się na elektrodach czujnikowych zamkniętych w biochipach. Biochipy są następnie wykorzystywane do testowania w terenie przenośnego urządzenia do wykrywania impedancji podłoża elektrycznego (ECIS), przeznaczonego do szybkiego testowania toksyczności wody pitnej. W manuskrypcie opisano ponadto, w jaki sposób przeprowadzić test toksyczności przy użyciu przygotowanych biochipów. Kontrolna próbka wody i badana próbka wody są mieszane ze wstępnie odmierzonymi sproszkowanymi pożywkami i wstrzykiwane do oddzielnych kanałów biochipa. Odczyty impedancji z elektrod czujnikowych w każdym z kanałów biochipa są mierzone i porównywane przez zautomatyzowany program statystyczny. Na ekranie instrumentu ECIS pojawi się komunikat "Wykryto zanieczyszczenie" lub "Nie wykryto skażenia" w ciągu godziny od wstrzyknięcia próbki. Zaletami są łatwość użycia i szybka reakcja na szerokie spektrum nieorganicznych i organicznych chemikaliów w stężeniach istotnych dla zdrowia ludzkiego, a także długoterminowa stabilność przechowywanych biochipów w stanie gotowym do testów. Ograniczeniami są wymóg przechowywania biochipów w chłodni i ograniczona wrażliwość na pestycydy hamujące cholinoesterazy. Zastosowania tego detektora toksyczności są przeznaczone do szybkiego, przenośnego testowania zapasów wody pitnej przez personel wojskowej medycyny prewencyjnej lub do użytku w miejskich zakładach uzdatniania wody.
Wprowadzenie
Ogólnym celem było opracowanie metody wysiewania komórek, przechowywania i testowania płynnych biochipów w biosensorze ECIS. Celem opracowania tego biosensora było spełnienie specyfikacji Armii USA dotyczących urządzenia przenośnego do użytku polowego, które mogłoby wykrywać potencjalne zanieczyszczenie zapasów wody pitnej używanej przez żołnierzy. Wymagania dotyczące czujnika toksyczności obejmowały możliwość szybkiego (w ciągu godziny) wykrywania szerokiego spektrum toksycznych związków przemysłowych w stężeniach istotnych dla zdrowia ludzi, przenośność urządzenia oraz zapewnienie co najmniej dziewięciomiesięcznego okresu trwałości komponentów biologicznych. Dopuszczalne było chłodzenie, lecz nie zamrażanie, komponentów łatwo psujących się.
Historycznie, przenośne technologie do analizy wody w terenie, zawierające komponent biologiczny (taki jak przeciwciała, enzymy lub kwasy nukleinowe), były specyficzne dla konkretnego anality1-3. Wadą tego typu biosensorów jest to, że wykrywają one tylko jeden rodzaj substancji chemicznej w danym czasie. W przypadku podejrzenia obecności więcej niż jednej substancji chemicznej konieczne jest zastosowanie wielu sensorów. Jeśli w zestawie testowym brakuje konkretnego sensora, zanieczyszczenia chemiczne w wodzie mogą pozostać niewykryte.
Z kolei sensory toksyczności o szerokim zakresie działania mają potencjał do wypełnienia tej luki technologicznej. Zazwyczaj posiadają one komponent komórkowy4-8. Zaletą biosensorów toksyczności o szerokim zakresie jest możliwość wykrycia obecności szerokiego spektrum zanieczyszczeń chemicznych, w tym mieszanin i substancji nieznanych, w stosunkowo krótkim czasie5,9,10.
Koncepcja wykorzystania pomiaru impedancji elektrycznej monowarstw komórkowych jako potencjalnego sensora toksyczności, znana również jako elektryczne pomiary impedancji komórka-podłoże (electric cell-substrate impedance sensing – ECIS), została po raz pierwszy opisana przez Giaevera i Keese'a11. W ciągu ostatnich dwóch dekad wykazano, że jest ona czułym wskaźnikiem żywotności komórek oraz cytotoksyczności. W zasadzie monowarstwa komórek przylegająca do elektrod na biochipach jest poddawana działaniu prądu przemiennego o wysokiej częstotliwości, niskim napięciu i niskim natężeniu. Zwarte monowarstwy komórek utrudniają przepływ elektronów. Gdy integralność monowarstwy komórkowej zostaje naruszona (na przykład w wyniku wprowadzenia toksycznej substancji chemicznej), sensor ECIS rejestruje zmianę impedancji elektrycznej11-14. Rysunek 1 ilustruje zasadę działania ECIS w odniesieniu do monowarstwy komórek na biochipie.
Figura 1: Zasada ECIS. Ilustracja monowarstwy komórek na biochipie wraz z uproszczonym schematem elektrycznym czytnika ECIS. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej figury.
Początkowo w mikroprzepływowych biochipach zasiewano linie komórkowe ssaków, które wykorzystywano w opisanej tutaj technologii czujników ECIS12. Komórki te nie były jednak praktyczne do zastosowań w terenie, ponieważ wymagały częstej wymiany pożywki, miały ograniczony okres trwałości oraz wymagały sztucznej atmosfery CO2 i temperatury inkubacji 37 °C. Odkryto, że komercyjnie dostępna linia komórkowa pochodząca z nabłonka skrzeli pstrąga tęczowego (komórki RTgill W-1) może być badana w temperaturze pokojowej i przy otoczeniowym poziomie CO2, tworzy w biochipach konfluentną monowarstwę, może być przechowywana w temperaturach chłodniczych oraz wykazuje szybką odpowiedź (1 hr lub krócej) na szerokie spektrum substancji chemicznych w stężeniach istotnych dla zdrowia ludzi12. Zastosowania komórek RTgill-W1 w toksykologii, a także w badaniach podstawowych, zostały omówione przez Lee et al.15
Opisano tutaj metody wysiewania, przechowywania i testowania biochipów płynnych zawierających monowarstwy komórek RTgill-W1 w biosensorze ECIS. Biochipy płynne mogą być przechowywane w stanie chłodniczym do 9 miesięcy i mogą być transportowane w pojemniku chłodniczym w celu badania zasobów wody pitnej. Towarzyszące im czytniki ECIS, czyli jednostki testowe, są wysyłane oddzielnie. Biochipy składają się z dwóch elementów: górnej warstwy poliwęglanowej z dwoma oddzielnymi kanałami płynowymi oraz dolnej warstwy elektronicznej zawierającej cztery pola elektrod na kanał do pomiaru impedancji. Na każde pole przypada 10 elektrod roboczych; każda elektroda ma średnicę 250 µm. Zmontowane biochipy posiadają złote połączenia elektrod służące do pomiaru impedancji po włożeniu do jednostki testowej ECIS. Każdy z dwóch zamkniętych płynowych kanałów w kształcie litery U mieści 2 ml zawiesiny komórek RTgill-W1. Rysunek 2 przedstawia biochip płynny w czytniku ECIS wraz z powiększeniem konfluencyjnych komórek na pojedynczej elektrodzie sensorycznej.
Rysunek 2: Biochip płynowy w czytniku ECIS. Powiększony obszar przedstawia konfluencyjną monowarstwę komórek RTgill-W1 na pojedynczej elektrodzie pomiarowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Protokół
1. Przygotowanie materiałów badawczych
UWAGA: W celu przygotowania biochipów do testów należy przygotować kilka kolb z konfluencyjnymi komórkami RTgill-W1. Przybliżone zapotrzebowanie to jedna konfluencyjna kolba T175 na każde 16 biochipów przeznaczonych do zasiewu.
- Wykonaj następujące czynności w komorze z laminarnym przepływem powietrza (biohood) klasy II, stosując technikę aseptyczną. Do dezynfekcji komory oraz wszystkich umieszczonych w niej materiałów użyj 70% etanolu.
- Przygotuj podłoże z fibronektyny do biochipów płynowych poprzez rozmrożenie fiolki zawierającej 1 mg fibronektyny i rozcieńczenie jej w 100 ml sterylnej pożywki L-15 do uzyskania stężenia 10 µg/ml. Zamroź w 40 ml aliquotach w sterylnych 50 ml stożkowych probówkach z polipropylenu w temperaturze -20 °C. Rozmroź w temperaturze pokojowej na kilka godzin przed zasiewaniem biochipów. Po rozmrożeniu nie zamrażaj ponownie.
- Przygotuj pożywkę do hodowli komórkowej, dodając 50 ml płodowej surowicy bydlęcej, 5 ml suplementu L-alanylo-L-glutaminy 200 mM oraz 5 ml roztworu penicyliny/streptomycyny (10 000 jednostek penicyliny/ml i 10 000 µg streptomycyny/ml) do 500 ml pożywki L-15. Otrzyma się w ten sposób 560 ml pożywki do hodowli komórkowej zawierającej 9% surowicy. Przechowuj w lodówce.
Uwaga: Będzie to kompletna pożywka do hodowli komórkowej używana do kolb hodowlanych oraz biochipów.
- Fiolki z pożywką w proszku
- Przygotuj wcześniej fiolki z zamknięciem typu snap-cap o pojemności 0,1 drama zawierające 60 mg ± 0,5% proszku L-15ex, używając automatycznego dozownika proszku. Oznacz fiolki datą dozowania proszku i przechowuj je w lodówce (w grupach po 50 sztuk) w zamykanych metalizowanych torbach polietylenowych; każda z nich powinna zawierać trzy 1 g saszetki z żelem krzemionkowym do osuszania.
Uwaga: Fiolki z pożywką L-15ex w proszku mogą być przygotowane i przechowywane do 9 miesięcy przed testami.
- Przygotuj wcześniej fiolki z zamknięciem typu snap-cap o pojemności 0,1 drama zawierające 60 mg ± 0,5% proszku L-15ex, używając automatycznego dozownika proszku. Oznacz fiolki datą dozowania proszku i przechowuj je w lodówce (w grupach po 50 sztuk) w zamykanych metalizowanych torbach polietylenowych; każda z nich powinna zawierać trzy 1 g saszetki z żelem krzemionkowym do osuszania.
- Przygotuj 100 ml 20% roztworu wybielacza, rozcieńczając wybielacz domowy wodą dejonizowaną (DI). Przyjmij, że dla każdego biochipu będziesz potrzebować 5 ml roztworu wybielacza.
- Przygotuj zestawy rurek do biochipów, wycinając 27 mm odcinki autoklawowalnej rurki biokompatybilnej (2 odcinki dla każdego biochipu do zasiewania) i montując na obu końcach rurki poliwęglanowe złączki Luer slip. Umieść zestawy rurek w autoklawowalnej torbie i autoklawuj przez 8 min w temperaturze 134 °C. W osobnej torbie, przy tych samych ustawieniach, autoklawuj również korki do biochipów (2 na biochip).
- Autoklawuj wodę DI przez 30 min w temperaturze 121 °C.
Uwaga: Woda ta będzie służyć do płukania biochipów po zasiewaniu. Przyjmij, że dla każdego biochipu będzie potrzebne 10 ml.
Uwaga: Rzeczywista objętość każdego kanału biochipu wynosi 2 ml, ale po usunięciu roztworu wybielacza przez każdy kanał przepłukuje się 5 ml sterylnej wody. - Przygotuj zestawy rurek do iniekcji strzykawką, wycinając 27 mm odcinki rurki biokompatybilnej i mocując męskie złączki Luer slip na obu końcach rurki. Umieść zestawy rurek w papierowej sterylizacyjnej torebce zgrzewalnej i autoklawuj przez 8 min w temperaturze 134 °C.
2. Procedura zasiewu biochipu płynowego
Uwaga: Wszystkie procedury obejmujące manipulację biochipami lub podłożami należy przeprowadzać w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II, stosując technikę aseptyczną.
- Na 24 godziny przed planowanym wysiewem wyjąć biochipy z opakowań producenta w komorze z laminarnym przepływem powietrza i umieścić je w wysterylizowanych plastikowych etui na instrumenty.
- Sterylizować biochipy, używając 20% roztworu wybielacza, w następujący sposób:
Uwaga: Historycznie procedura ta, polegająca na wybielaniu, zapobiegała wzrostowi grzybów w biochipach podczas długotrwałego przechowywania w przypadku, gdy sterylizacja plazmowa biochipów przeprowadzona przez producenta była nieskuteczna.- Używając sterylnej strzykawki o pojemności 20 ml z podłączonym zestawem rurek do wstrzykiwania i pracując w komorze z laminarnym przepływem powietrza, wstrzyknij 2 ml 20% roztworu wybielacza do każdego kanału biochipa. Pozostaw biochipy z roztworem wybielacza na 1 godzinę.
- Po upływie jednej godziny odessać roztwór wybielacza z obu kanałów za pomocą sterylnego zestawu z końcówką Luer-lock prądkowa podłączonej do przewodów ssących pompy próżniowej. Podczas płukania biochipów jeden z zestawów przewodów biochipa należy wykorzystać jako odpływ.
- Używając sterylnej strzykawki o pojemności 20 ml podłączonej do sterylnego zestawu do iniekcji, należy przepłukać każdy kanał chipa 5 ml sterylnej wody, pozwalając nadmiarowi wody spłynąć do naczynia w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Następnie wodę należy odessać za pomocą aspiratora próżniowego, tak jak opisano wcześniej w przypadku podchlorynu, po czym umieścić biochipy z powrotem w plastikowych etui i pozostawić je w komorze do następnego dnia, do czasu zasiania komórek.
- Na sześćdziesiąt minut przed zasiewaniem biochipów wstrzyknij 2 ml 10 µg/ml roztwór fibronektyny do każdego kanału biochipu. Pozostaw biochipy w komorze laminarnej na 60 min, a następnie odessaj fibronektynę za pomocą próżni (zgodnie z opisem w punkcie 2.2.3) przed wysianiem komórek na biochip. Umieść dwa fragmenty sterylnych zestawów rurek do biochipów (patrz sekcja 1.4) na portach biochipów.
- Trypsynizuj jedną konfluencyjną kolbę T175 z linią RTgill-W1 na każde 16 biochipów, zgodnie z procedurami opisanymi w arkuszu opisu produktu American Type Culture Collection (ATCC)16.
- Odssać pożywkę z konfluentnych kolb z komórkami.
- Przepłucz warstwę komórek 15 ml PBS, a następnie odessij roztwór.
- Do warstwy komórek w każdej kolbie T175 dodać 6 ml trypsyny/EDTA i pozostawić komórki do trypsynizacji na ok. 5 min.
- Do każdej kolby należy dodać 15 ml kompletnej pożywki do hodowli komórkowych L-15, aby zatrzymać proces trypsynizacji.
- Połączyć zawiesiny komórkowe w sterylnym jednorazowym pojemniku.
Uwaga: Wielkość pojemnika może wynosić od 150 do 500 ml, w zależności od liczby zasiających biochipów. Przyjmij, że na jeden biochip będziesz potrzebować 5 ml zawiesiny komórkowej.
- Pobrać około 1 ml zawiesiny komórkowej i umieścić w probówce do mikrocentryfugi w celu policzenia komórek. Wykorzystując mikroskop w jasnym polu z obiektywem 10X oraz komorę countingową (hemocytometr), policzyć 10 µl alikwot komórek i obliczyć objętość pełnej pożywki do hodowli komórek L-15 potrzebną do uzyskania zawiesiny komórkowej o stężeniu 2,5 x 105 komórek/ml.
Uwaga: Jeśli zawiesina komórkowa ma zostać użyta do zasiania kolb w celu kontynuowania hodowli, należy to zrobić na tym etapie. Stężenie zawiesiny komórkowej należy dostosować za pomocą kompletnej pożywki L-15 do hodowli komórek. - Używając sterylnej strzykawki o pojemności 20 ml podłączonej do sterylnego zestawu przewodów do wstrzykiwania (patrz sekcja 1.6), wstrzyknij 2,5 ml zawiesiny komórkowej do zewnętrznego portu każdego kanału biochipu (t. j.(porty, do których nie podłączono rurek), umożliwiając wypłynięcie części nadmiarowej zawiesiny komórkowej z rurek do pojemnika na odpady znajdującego się w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
Uwaga: Zapewni to, że cały kanał oraz dołączone przewody zostaną całkowicie wypełnione zawiesiną komórkową.- Utwórz zamkniętą pętlę dla każdego kanału biochipa, wkładając wolny koniec węża z końcówką Luer do zewnętrznych portów każdego kanału.
- Nadmiar pożywki z zamkniętych pętli należy usunąć ręcznikiem papierowym zwilżonym 70% etanolem, a następnie umieścić bioczipy z powrotem w plastikowym pudełku w 20 °C inkubator. Przypisz każdemu biochipowi unikalny numer identyfikacyjny.
- W 4. i 7. dniu wyjmij biochipy z 20 °C inkubator i uzupełnij medium we wszystkich biochipach, używając wyrównanego temperaturowo kompletnego medium do hodowli komórkowej L-15. Postępuj zgodnie z procedurą opisaną w kroku 2.6, z wyjątkiem zastosowania wyłącznie medium do hodowli komórkowej L-15 (bez zawiesiny komórek). Umieść biochipy z powrotem w 20 °C inkubator po karmieniu w 4. dniu.
- Po karmieniu w 7. dniu należy usunąć i wyrzucić wężyki z chipów, a następnie włożyć autoklawowane korki odpływowe do biochipów.
- Umieść biochipy w pudełku w 6 °C inkubator do momentu wykorzystania do testów.
Uwaga: Chipy mogą być przechowywane w temperaturze chłodniczej do 9 miesięcy i nadal nadają się do testowania w czytnikach ECIS.
3. Badania ECIS z wykorzystaniem biochipów
- Przygotować odczynniki testowe, jeśli są stosowane. (Patrz Brennan, et al., 20127 w celu przygotowania odczynników testowych).
- Wyjąć czytnik ECIS oraz akcesoria testowe z etui. Wyjąć przygotowany biochip z inkubatora ustawionego na 6 °C. Położyć biochip na ręczniku papierowym. Włączyć czytnik ECIS.
- Za pomocą strzykawek 10 ml odmierzyć 10 ml wody kontrolnej do oznakowanego, przezroczystego plastikowego słoika kontrolnego o pojemności 0,5 uncji oraz 10 ml próbki testowej do oznakowanego, przezroczystego plastikowego słoika testowego o pojemności 0,5 uncji.
Uwaga: 1) Należy usunąć pęcherzyki powietrza, aby zapewnić dokładność pomiaru. 2) Strzykawki i słoiki są oznaczone kolorami: niebieski dla kontroli i czerwony dla próbki testowej. - Wyjąć dwie fiolki z proszkowym medium z woreczków foliowych. Otworzyć jedną z fiolek z proszkowym medium (w razie potrzeby użyć narzędzia wielofunkcyjnego) i wsypać całą zawartość fiolki do słoika z wodą kontrolną, wrzucając do roztworu również samą fiolkę. Powtórzyć tę procedurę dla słoika z próbką testową. Zakręcić i potrząsnąć słoikami, aby upewnić się, że proszek został rozpuszczony.
- Napełnić każdą z kolorowych strzykawek 10 ml ilością 9 ml odpowiednio roztworu kontrolnego (niebieska strzykawka) lub testowego (czerwona strzykawka) z odpowiednich fiolek. Usunąć pęcherzyki powietrza ze strzykawek.
- Wyjąć korki z portów biochipu i podłączyć dren.
- Umieścić biochip w wyjmowanej plastikowej tacy w czytniku ECIS i zamknąć pokrywę.
- Podłączyć napełnione strzykawki do zewnętrznych portów biochipu i zamocować tłoki strzykawek.
- Z ekranu głównego wybrać „NEXT”, aby rozpocząć wstępny test.
Uwaga: Oprogramowanie czytnika sprawdzi impedancje. Jeśli impedancje mieszczą się w zakresie ustawionym przez użytkownika (zazwyczaj od 1 000 do 3 000 omów), na ekranie pojawi się komunikat „Cartridge Passed”, jak pokazano na Rysunku 3, a użytkownik zostanie poproszony o wybranie „Next”, po czym oprogramowanie przejdzie do kroku 3.10). Jeśli impedancje nie mieszczą się w ustawionym zakresie z powodu wadliwego biochipu lub błędnego połączenia biochipu z czytnikiem (zazwyczaj z powodu niewłaściwego ustawienia elektrod), na ekranie pojawi się komunikat „Cartridge Failed”, a użytkownik będzie miał możliwość wyboru opcji „Abort” (Przerwij) lub „Verify” (Weryfikuj) test.- Wybrać „Abort”, aby powrócić do kroku 3.9). Wybrać „Verify”, aby przejść do kroku 3.10) po otrzymaniu komunikatu „Cartridge Passed” i wybraniu „Next”.
Uwaga: W przypadku otrzymania komunikatu „Cartridge Failed” najlepiej wyjąć biochip i wizualnie sprawdzić go pod kątem uszkodzeń lub wycieków przed rozpoczęciem pracy z nowym biochipem.
- Wybrać „Abort”, aby powrócić do kroku 3.9). Wybrać „Verify”, aby przejść do kroku 3.10) po otrzymaniu komunikatu „Cartridge Passed” i wybraniu „Next”.
Rycina 3: Zrzut ekranu z czytnika ECIS przedstawiający biochip z akceptowalnymi wartościami impedancji. Zrzut ekranu pokazuje początkowe pomiary impedancji w omach dla każdej z 4 elektrod kontrolnych (CE) oraz 4 elektrod próbkowych (SE) wewnątrz mikroprzepływowego biochipu. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
- Po wyświetleniu komunikatu przez czytnik, wprowadź informacje o próbce za pomocą klawiatury ekranowej, a następnie wybierz „Accept” po zakończeniu.
Uwaga: Oprogramowanie czytnika ECIS automatycznie oznaczy każdy zestaw danych datą, godziną i innymi informacjami wprowadzonymi przez użytkownika, takimi jak numer biochipu oraz rodzaj i stężenie substancji chemicznej. Przez dwie minuty będą zbierane dane o impedancji z włożonego biochipu, a licznik na ekranie będzie odliczać czas. - Po dwóch minutach, gdy pojawią się migające w czerwonej ramce instrukcje na ekranie, naciśnij „NEXT”. Gdy pojawi się migająca zielona ramka z napisem „Inject samples now”, wstrzyknij jednocześnie z dołączonych strzykawek podłoża kontrolne i testowe do kanałów biochipu. Po zakończeniu pozostaw strzykawki w biochipach.
Uwaga: Wartości impedancji będą zbierane raz na minutę przez 60 min. Jeśli oprogramowanie czytnika ECIS stwierdzi, że kanał testowy różni się statystycznie od kanału kontrolnego w dowolnym momencie między 10 a 60 min od rozpoczęcia testu, wyświetlacz wskaże, że próbka jest „Contaminated”. Jeśli traktowanie nie różni się od kanału kontrolnego, na ekranie po zakończeniu testu pojawi się komunikat „No Contamination Detected”. - Zapisz wyniki testów dla każdej próbki jako zanieczyszczone lub niezanieczyszczone.
- Po zakończeniu testu wyjmij i utylizuj biochip. Opłucz i wysusz na powietrzu strzykawki, fiolki testowe oraz wyjmowaną plastikową tackę, w której znajdował się biochip podczas testów.
Uwaga: Czytnik ECIS posiada 4 GB pamięci wewnętrznej na oprogramowanie operacyjne, modele kontrolne i pliki testowe generowane podczas przeprowadzania testów. Pozwala to na przechowywanie kilku tysięcy plików testowych w czytniku. Pliki można pobrać za pomocą dysku USB i przesłać do komputera w celu dalszej analizy badawczej, jeśli jest to wymagane.
Wyniki
Technologia ECIS opisana w niniejszej pracy została poddana testom w ramach Programu Testowania i Ewaluacji Technologii (TTEP), sponsorowanego przez Amerykańską Agencję Ochrony Środowiska (USEPA). Do badań wybrano trzynaście substancji chemicznych jako reprezentantów szerokiego spektrum toksycznych związków przemysłowych, które mogą być potencjalnymi zanieczyszczeniami wody pitnej. Podczas testów 9 z 13 związków zostało wykrytych przez system ECIS w ciągu godziny przy stężeniach istotnych dla zdrowia ludzi8. Tabela 1 przedstawia wyniki tych testów zanieczyszczeń. Rysunek 4 obrazuje, jak wyglądałby wynik „Zanieczyszczony” na ekranie czytnika ECIS. W większości przypadków impedancje komórkowe dla próbek zanieczyszczonych były niższe w porównaniu z próbkami kontrolnymi. Okazjonalnie niektóre związki mogą powodować wzrost impedancji.
W Tabeli 1 podsumowano również testowanie czystej wody. Przebadano czterdzieści próbek czystej wody i w żadnej z nich nie wykryto zanieczyszczeń (patrz Rysunek 5), gdzie przedstawiono reprezentatywny zrzut ekranu z komunikatem „No Contamination Detected” (nie wykryto zanieczyszczeń).
Rysunek 4: Zrzut ekranu z czytnika ECIS dla „zanieczyszczonej” próbki wody. Przykład grafiki znormalizowanej impedancji i wyników z próbki wody, która była zanieczyszczona. Linie niebieskie reprezentują znormalizowane impedancje każdej z elektrod kontrolnych; linie czerwone reprezentują znormalizowane impedancje każdej z elektrod próbki badawczej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rycina 5: Zrzut ekranu z czytnika ECIS dla próbki wody z wynikiem „Brak wykrytego zanieczyszczenia”. Przykład wykresów znormalizowanej impedancji i wyników z próbki wody, która nie była zanieczyszczona. Niebieskie linie reprezentują znormalizowane impedancje każdej z elektrod kontrolnych; czerwone linie reprezentują znormalizowane impedancje każdej z elektrod próbki badawczej. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
| Kategoria | Zanieczyszczenie | Testowane stężenie (mg/L)1 | Wykryto ≤1 godzina n = 4/4 chipów | |||
| Środki ochrony roślin | Aldikarb | 0.17 | nie | |||
| Arsenik (arsenian sodu) | 4.5 | Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. | ||||
| Azyd (azydek sodu) | 46.7 | Tak | ||||
| Fenamifos | 0.56 | nie | ||||
| Metamidofos | 1.4 | nie | ||||
| Metyl paration | 33.6 | Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. | ||||
| Parakwat (dwuchlorek) | 4.6 | nie | ||||
| Pentachlorofenian (sodu) | 71.9 | Tak | ||||
| Chemikalia przemysłowe | Amoniak | 924 | Ponieważ nie dostarczyłeś tekstu źródłowego do tłumaczenia, proszę o przesłanie treści, którą chcesz przełożyć na język polski. Po otrzymaniu tekstu przygotuję profesjonalne tłumaczenie zgodnie z Twoimi wytycznymi dotyczącymi stylu naukowego, terminologii oraz standardów JoVE. | |||
| Miedź (siarczan(II) miedzi) | 103 | Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. | ||||
| Cyjanek (sodu) | 14 | Tak | ||||
| Rtęć (chlorek) | 24.7 | Proszę o przesłanie tekstu źródłowego do tłumaczenia. | ||||
| Toluen | 444 | Tak | ||||
| Czysta woda2 | Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. | ND | nie | |||
| 1Testowane stężenia są takie same, jak w publikacji Widdera, i wsp.. (2014). | ||||||
| 2Przeanalizowano 40 próbek czystej wody, w których nie stwierdzono zanieczyszczeń. | ||||||
Tabela 1: Zanieczyszczenia w próbkach wody wykryte za pomocą ECIS.
Dyskusja
Technologia ECIS sprawdziła się w warunkach laboratoryjnych i była w stanie wykryć potencjalne zanieczyszczenia wody w stężeniach istotnych dla zdrowia ludzkiego. Przenośność i opakowanie technologii sprawia, że sprzyja ona użytkowaniu w terenie.
Kluczowe kroki w protokole dla powodzenia technologii są następujące: 1) Utrzymuj warunki aseptyczne podczas hodowli, siewu i podawania biochipów, 2) Przechowuj biochipy z nasionami w warunkach chłodniczych, dopóki nie będą gotowe do testowania, ponieważ komórki RTgill-W1 nie przetrwają zbyt długo, gdy zostaną poddane działaniu temperatur powyżej 25 °C, 3) Dokładnie zważyć L-15ex w fiolkach ze sproszkowanymi pożywkami i dokładnie zmierzyć próbki wody, aby uniknąć uzyskania wyników fałszywie dodatnich, które mogą być spowodowane zmianą osmolalności pożywki, a nie toksycznością próbki, 4) Postępuj zgodnie z instrukcjami użytkownika wyświetlanymi na ekranie ECIS, aby przeprowadzić testy. Oprogramowanie w czytniku powiadomi użytkownika, jeśli biochip nie nadaje się do testowania (na podstawie początkowych odczytów impedancji), gdy biochip zostanie po raz pierwszy włożony do czytnika. Jeśli poziomy impedancji są nie do zaakceptowania do testowania, oprogramowanie nie pozwoli użytkownikowi na kontynuowanie testowania, dopóki nie zostanie użyty nowy biochip. Przyczyną niedopuszczalnych odczytów impedancji jest zwykle niewielka niewspółosiowość elektrod biochipa z pinami czytnika ECIS lub wyciek płynu wzdłuż jednej z krawędzi klejenia biochipa.
Technologia ta ma pewne ograniczenia, ponieważ czujnik ECIS został przetestowany tylko z wodą pitną, a nie z wodą powierzchniową. Komórki RTgill-W1, które znajdują się na biochipie, nie tolerują zamarzania lub temperatur znacznie przekraczających 25 °C przez dłuższy czas (ramy czasowe mogą wynosić od godzin do dni w zależności od temperatury. Biochipy działają najlepiej w zakresie temperatur od temperatury schłodzonej do temperatury pokojowej7. Są one gotowe do natychmiastowego użycia, jednak zaraz po wyjęciu z chłodni. Przenośne kontenery chłodnicze są obecnie używane przez personel wojskowy w terenie do zaopatrzenia wrażliwego na temperaturę. Te same pojemniki mogą być używane do transportu biochipów z nasionami.
Kolejnym ograniczeniem tej technologii jest to, że mimo że jest to szerokopasmowy czujnik toksyczności, nie reaguje dobrze, jeśli w ogóle, na związki hamujące cholinoesterazy, takie jak niektóre pestycydy. Aby wypełnić tę lukę, czujnik ECIS zaprojektowano tak, aby można go było używać w połączeniu z dostępnym na rynku szybkim testem na obecność pestycydów podczas badania próbek wody, aby zapewnić użytkownikowi szerszy zakres badań toksyczności. Zestaw jest szybkim testem enzymatycznym przeznaczonym do wykrywania pestycydów fosforoorganicznych i karbaminianowych w ciągu 30 minut.
Czujnik ECIS uzupełnia polowy system badania wody WQAS-PM (Water Quality Analysis System - Preventive Medicine), który jest obecnie używany przez wojskowy personel medycyny prewencyjnej do wykrywania arsenu, ołowiu lub cyjanku w próbce wody pitnej. Chociaż czujnik ECIS nie określi, co to za zanieczyszczenie, wskaże, czy obecne są określone metale lub związki organiczne, co wskazuje, że woda może nie nadawać się do spożycia przez ludzi. Wyniki testu ECIS są dostępne w ciągu godziny. Próbki wody mogą być następnie wysłane do dalszej analizy w celu identyfikacji zanieczyszczenia, jeśli wynik testu jest pozytywny.
Jak opisano powyżej, czytnik ECIS został zaprojektowany jako część systemu, który zawiera oddzielny zestaw enzymatycznego ACE w celu pokrycia szerokiego spektrum wykrywania zanieczyszczeń. Oba te czytniki są zapakowane w solidną walizkę do transportu polowego do użytku polowego przez żołnierzy.
Oświadczenia
Opinie, interpretacje, wnioski i zalecenia są opiniami autorów i niekoniecznie są popierane przez armię amerykańską. Cytaty z organizacji komercyjnych lub nazw handlowych w tym raporcie nie stanowią oficjalnego poparcia lub aprobaty Departamentu Armii dla produktów lub usług tych organizacji. Autorzy Linda M. Brennan i Mark W. Widder, oboje z Centrum Badań nad Zdrowiem Środowiskowym Armii Stanów Zjednoczonych, deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych. Michael Mayo, Michael McAleer i Alex Greis są pracownikami firmy Nanohmics, która produkuje jednorazowe biochipy i instrumenty używane w tym artykule.10251980
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Dowództwo Badań Medycznych i Materiałowych Armii Stanów Zjednoczonych oraz przez program Small Business Innovation Research and Small Business Technology Transfer; Numer umowy: W81XWH-13-C-0093. Chcielibyśmy podziękować dr Lucy Lee z University of Fraser za bycie naszym mentorem w zakresie hodowli komórkowych RTgill-W1 oraz dr Nielsowi Bolsowi z Uniwersytetu Waterloo za rozwój linii komórek RTgill-W1.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Płodowa surowica bydlęca | Life Technologies, Inc. www.lifetechnologies.com | 16000-085 | Przechowywać @ -20 & st. C. Rozmrozić @ temperatura pokojowa przed użyciem. Składnik kompletnych pożywek do hodowli komórkowych L-15 (10%). |
| Fibronektyna, osocze bydlęce | EMD Millipore Corp. www.emdmillipore.com | 341631-1 mg | Przechowywać @ -20 °C. Rozmrozić @ temperatura pokojowa przed użyciem. Zmieszać z pożywką L-15 uzyskać stężenie 10 μ g/ml i zamrażać @ -20 ° C w podwielokrotnościach. Służy jako podłoże do biochipów. |
| Pożywka L-15 bez L-glutaminy | Lonza www.lonzabioscience.com | 12-700F | Pożywka bazowa do hodowli komórkowych i podawania biochipów. Przechowywać w temperaturze 6 stopni Celsjusza. |
| Pożywka w proszku L-15ex z czerwienią fenolową | US Biological www.usbio.net | Pożywki L1501 | odważa się w podwielokrotnościach 60 mg w fiolkach o pojemności 0,1 dram i przechowuje w temperaturze 6 ° C w woreczkach foliowych z opakowaniami ze środkiem osuszającym. Dziewięciomiesięczny okres przydatności do spożycia. Zmieszany z 10 ml próbki wody do badania w biochipach. |
| PBS, bez Ca2+ lub Mg2+ | Lonza www.lonzabioscience.com | 17-516F | Przechowywać w temperaturze pokojowej. Służy do płukania pożywki podczas trypsynizacji kolb do hodowli komórkowych. |
| Trypsyna, EDTA | Lonza www.lonzabioscience.com | CC-5012 | Przechowywać @ -20 °C. Rozmrozić w temperaturze pokojowej i użyć do trypsynizacji kolb do hodowli komórkowych. |
| Kolby hodowlane T175 | Fisher Scientific www.fishersci.com | 12-565-30 | Służy do hodowli komórek RTgill-W1. |
| Wybielacz | Chlorox | Rozcieńczony do 20% wodą mieloną lub destylowaną do czyszczenia wiórów ECIS. Dopuszczalny jest każdy wybielacz domowy. | |
| 70% alkohol | Do dezynfekcji powierzchni biokapturów i wszelkich materiałów umieszczanych w biokapturze. | ||
| Komórki skrzelowe pstrąga tęczowego (RTgill-W1) | Kolekcja kultur tkankowych typu amerykańskiego www.atcc.org | CRL-2523 | Komórki hodowane i wykorzystywane do biosensora (biochipy do wysiewu). |
| Suplement GlutaMAX-1, 200 mM | Lonza www.lonzabioscience.com | 35050-061 | Przechowywać w temperaturze pokojowej. Składnik kompletnych pożywek do hodowli komórkowych L-15 (1%). |
| Penn/Strep Stock 10K/10K | Lonza www.lonzabioscience.com | 17-602E | Przechowywać @ -20 °C. Rozmrozić @ temperatura pokojowa przed użyciem. Składnik kompletnych pożywek do hodowli komórkowych L-15 (1%). |
| Rurki Pharmed BPT | U.S. Plastic Corp. www.usplastic.com | 57317 | Pocięte na odcinki 27 mm i sterylizowane w autoklawie. Służy do wysiewania biochipów z komórkami oraz jako zamknięta pętla między zmianami pożywki. |
| Złączki luer z poliwęglanu do wiązek rurowych | Pharmed Value Plastics | MTLS210-9 | Przymocowane do każdego końca przeciętej rurki Pharmed w celu włożenia do bichipów. |
| Strzykawki 20 ml z końcówką wsuwaną | VWR Scientific us.vwr.com | BD302831 | Służy do wstrzykiwania zawiesiny komórkowej do wysiewu wiórów ECIS, a także do podawania wiórów. |
| 0,1 dram zatrzaskowe mikrofiolki z polipropylenu | Butelki Słoiki i tubki, Inc. www.bottlesjarsandtubes.com | 30600 | Służy do przechowywania 60 mg podwielokrotności sproszkowanej pożywki L-15ex. |
| 60 mil Lexan fluidic ECIS biochips | Nanohmics, Inc. | Wykonane na zamówienie przez Nanohmics, Inc. Komórki RTgill-W1 zostaną wstrzyknięte do biochipów, a chipy z nasionami zostaną umieszczone w czytniku ECIS w celu przetestowania. | |
| Autoklawowalna plastikowa skrzynka na narzędzia 17 1/2" x 7 3/4" x 2 3/8" | Medi-Dose EPS medidose.com | IB701 | Służy do przechowywania: autoklawowanych zatyczek, oczyszczonych biochipów, biochipów z nasionami. |
| Papierowe woreczki do sterylizacji zgrzewanej, 7 i frac12; ” x 13" | KardynałZdrowie www.cardinalhealth.com | 90713 | Służy do autoklawowania rurek i złączek oraz zatyczek. |
| Automatyczny dozownik proszku Quantos | Mettler Toledo www.mt.com | QB5 | Automatyczne rozdzielanie 60 mg porcji sproszkowanego L-15ex do fiolek o pojemności 0,1 dram. |
| Czytnik ECIS | Nanohmics, Inc. | Wykonany na zamówienie przez Nanohmics, Inc. Biochip z nasionami jest wkładany do czytnika w celu przeprowadzenia testów toksyczności wody. | |
| 3 x 5 metalizowane polipropylenowe worki wielokrotnego zamykania o grubości 2,5 mil | Uline www.uline.com | S-16893 | Pakowanie i przechowywanie zarówno biochipów z nasionami, jak i fiolek ze sproszkowanymi pożywkami L-15ex. |
| Tryskanie Leatherman ps4 | Amazonka | Służy do otwierania fiolek ze sproszkowanymi pożywkami. | |
| Opakowania 1 g osuszacza z żelem krzemionkowym | Uline www.uline.com | S-3902 | Umieść w polipropylenowych torebkach z fiolkami ze sproszkowanymi mediami L-15ex, aby zapobiec gromadzeniu się wilgoci w proszku. |
| Sterylne butelki Nalgene o pojemności 250 lub 500 ml | Fisher Scientific www.fishersci.com | 09-740-25C lub E | Zawiesiny komórkowe Hold do wysiewu chipsów ECIS w biohood. |
| Zatyczki do biochipów | Nanohmics, Inc. | Wykonane na zamówienie przez Nanohmics, Inc. Służy do uszczelniania portów w biochipach przed przechowywaniem w temperaturze 6 stopni Celsjusza. | |
| Odpływy do biochipów ECIS | Nanohmics, Inc. | Wykonane na zamówienie przez Nanohmics, Inc. Umieszczony na 2 wewnętrznych portach na biochipach przed włożeniem do czytnika ECIS. Pozwala na odpływ nadmiaru mediów z kanałów podczas wtrysków testowych. | |
| Hemocytometr | Fisher Scientific www.fishersci.com | S17040 | Potrzebny do liczenia komórek przed dostosowaniem zawiesiny komórek do wstrzyknięcia do biochipów. |
| Mikroskop jasnego pola z obiektywem 10X | Leitz Labovert | Każdy mikroskop jasnego pola jest dopuszczalny. | |
| bezpieczeństwa biologicznego klasy II | Dopuszczalna jest każda komora bezpieczeństwa biologicznego klasy II, w której hodowla komórkowa może być przeprowadzana w sterylnych warunkach. | ||
| Probówki do mikrowirówek, 0,6 ml | Fisher Scientific www.fishersci.com | 02-681-311 | Mieści 1 ml zawiesiny komórkowej przed zliczeniem komórek. |
| Czerwone strzykawki Slip 10 cc | Procedure Products, Inc. www.procedureproducts.com | S/49S 30-R | Pobiera 9 ml próbki wody testowej i służy do wstrzykiwania próbki do biochipa. |
| Niebieskie strzykawki Slip 10 cc | Procedure Products, Inc. www.procedureproducts.com | S/49S 30-B | Pobiera 9 ml próbki wody kontrolnej i służy do wstrzykiwania próbki do biochipa. |
| ½ oz. przezroczysty plastikowy słoik dla zwierząt domowych z białymi prążkowanymi nakrętkami | Butelka SKS i Opakowania, Inc. www.sks-bottle.com | 0605-30 | Fiolki na próbki używane do mieszania proszku L-15ex i 10 ml próbki wody do badań. |
| 50 ml sterylne stożkowe probówki wirówkowe z polipropylenu | Fisher Scientific www.fishersci.com | 12-565-269 | Służy do przechowywania 40 ml porcji 10 μ g/ml fibronektyny w temperaturze -20 & st. C. |
| Test wykrywania inhibitora acetylocholinoesterazy NIDS ACE | ANP Technologies, Inc. www.anptinc.com | ACE-400 | Czujnik przeznaczony do szybkiego wykrywania pestycydów w wodzie pitnej |
Bibliografia
- Pancrazio, J. J., Whelan, J. P., Borkholder, D. A., Ma, A., Stenger, D. A. Development and application of cell-based biosensors. Ann. Biomed. Eng. 27, 697-711 (1999).
- States, S., Scheuring, M., Kuchta, J., Newberry, J., Casson, L. Utility-based analytical methods to ensure public water supply security. J. Am. Water Works Assoc. 95, 103-115 (2003).
- Kelly, T., Baxter, W., McCauley, M., Koglin, E. Testing of Screening Technologies for Detection of Toxic Industrial Chemicals in All Hazards Receipt Facilities. EPA/600/R-08/034. , Washington, DC. 1-25 (2008).
- van der Schalie, W. H., James, R. R., Gargan, T. P. Selection of a battery of rapid toxicity sensors for drinking water evaluation. Biosens. Bioelectron. 22, 18-27 (2006).
- Iuga, A., Lerner, E., Shedd, T. R., van der Schalie, W. H. Rapid responses of a melanophore cell line to chemical contaminants in water. J. Appl. Toxicol. 29, 346-349 (2009).
- Curtis, T. M., et al. Suitability of invertebrate and vertebrate cells in a portable impedance-based toxicity sensor: temperature mediated impacts on long-term survival. Toxicol In Vitro. 27, 2016-2066 (2013).
- Brennan, L. M., Widder, M. W., Lee, L. E. J., van der Schalie, W. H. Long-term storage and impedence-based water toxicity testing capabilities of fluidic biochips seeded with RTgill-W1 cells. Toxicol In Vitro. 26, 736-745 (2012).
- Widder, M. W., Brennan, L. M., Hanft, E. A., Schrock, M. E., James, R. R., van der Schalie, W. H. Evaluation and refinement of a field-portable drinking water toxicity sensor and a fluidic biochip. J. Appl. Toxicol. , (2014).
- O'Shaughnessy, T. J., Gray, S. A., Pancrazio, J. J. Cultured neuronal networks as environmental biosensors. J. Appl.Toxicol. 24, 379-385 (2004).
- Eltzov, E., Marks, R. S. Whole-cell aquatic biosensors. Anal. Bioanal. Chem. 400, 895-913 (2011).
- Giaever, I., Keese, C. R. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366, 591-592 (1993).
- Curtis, T. M., et al. A portable cell-based impedance sensor for toxicity testing of drinking water. Lab on a Chip. 9, 2176-2183 (2009).
- Xiao, C., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity by emerging impedance spectroscopy. Toxicol. .Appl. Pharmacol. 206 (2), 102-112 (2005).
- Xing, J. Z., Zhu, L., Gabos, S., Xie, L. Microelectronic cell sensor assay for detection of cytotoxicity and prediction of acute toxicity. Toxicol. In Vitro. 20, 995-1004 (2006).
- Lee, L. E. J., Dayeh, V. R., Schirmer, K., Bols, N. C. Applications and potential uses of fish gill cell lines: examples with RTgill-W1. In Vitro Cell. Develop. Biol.- Animal. 45, 127-134 (2009).
- RT-gill-W1 (ATCC CRL-2523) Culture Method. American Type Culture Collection (ATCC). , Manassas, VA. Available from: https://www.atcc.org/ATCCAdvancedCatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/Default.aspx? ATCCNum=CRL-2523&Template=cellBiology#aPropba73c (2015).
Przedruki i uprawnienia
Tagi
