Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Szybkie przetwarzanie enzymatyczne białek w celu wykrywania stwardnienia rozsianego za pomocą mikroreaktora przepływowego

7.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53564

⸱

6 kwietnia 2016

 ,  , 
1Biological Sciences, Virginia Tech

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono szybki protokół trawienia proteolitycznego za pomocą własnego mikroreaktora tryptycznego sprzężonego ze spektrometrem masowym z jonizacją elektrorozpylania (ESI). Opisano sposób wytwarzania mikroreaktora, układ doświadczalny i proces pozyskiwania danych.

Streszczenie

Zdecydowana większość metod analizy białek opartych na spektrometrii mas (MS) obejmuje etap trawienia enzymatycznego przed wykryciem, zazwyczaj z trypsyną. Ten krok jest niezbędny do wytwarzania peptydów o małej masie cząsteczkowej, zwykle o MW < 3,000-4,000 Da, które mieszczą się w efektywnym zakresie skanowania oprzyrządowania spektrometrii mas. Konwencjonalne protokoły obejmują trawienie enzymatyczne O/N w temperaturze 37 ºC. Ostatnie postępy doprowadziły do opracowania różnych strategii, zazwyczaj obejmujących wykorzystanie mikroreaktora z unieruchomionymi enzymami lub szeregu uzupełniających się procesów fizycznych, które skracają czas niezbędny do trawienia proteolitycznego do kilku minut (np. mikrofale lub wysokociśnienie). W tej pracy opisujemy proste i opłacalne podejście, które można wdrożyć w każdym laboratorium w celu uzyskania szybkiego trawienia enzymatycznego białka. Białko (lub mieszanina białek) jest adsorbowane na cząstkach krzemionki z wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) z wiązaniem C18 wstępnie załadowanych w kolumnie kapilarnej, a trypsyna w wodnym buforze jest podawana na cząstki przez krótki okres czasu. Aby umożliwić wykrywanie stwardnienia rozsianego w trybie on-line, peptydy tryptyczne są eluowane za pomocą systemu rozpuszczalnikowego o zwiększonej zawartości organicznej bezpośrednio w źródle jonów MS. Takie podejście pozwala uniknąć użycia drogich unieruchomionych cząstek enzymu i nie wymaga żadnej pomocy w zakończeniu procesu. Trawienie białek i pełną analizę próbki można przeprowadzić odpowiednio w czasie krótszym niż ~3 minuty i ~30 minut.

Wprowadzenie

Identyfikacja i charakterystyka oczyszczonych białek jest często osiągana za pomocą technik MS. Białko jest trawione przez enzym, a jego peptydy są dalej analizowane przez SM przy użyciu prostego zestawu eksperymentalnego do infuzji. Trawienie proteolityczne jest niezbędne do generowania małych fragmentów peptydów, które mieszczą się w użytecznym zakresie mas większości analizatorów MS i które można łatwo rozdrobnić poprzez dysocjację wywołaną zderzeniem o niskiej energii w celu wygenerowania informacji o sekwencji aminokwasów. W przypadku wyizolowanych białek lub prostych mieszanin białek nie ma już potrzeby chromatograficznego rozdzielania peptydów przed wykryciem stwardnienia rozsianego. Mieszaninę 25-50 peptydów można łatwo analizować, wprowadzając próbkę za pomocą pompy strzykawkowej bezpośrednio w źródle jonów MS.

Spektrometr masowy może przeprowadzić analizę i potwierdzić sekwencję białka w krótkim czasie. Dzięki nowoczesnym metodom pozyskiwania danych proces ten można zrealizować w ciągu kilku minut, a nawet sekund. Czynnikiem ograniczającym zakończenie całego procesu w krótkiej skali czasowej jest etap trawienia proteolitycznego. Zazwyczaj wykonuje się to w ciągu kilku godzin (lub O/N), w roztworze, w temperaturze 37 ºC, przy użyciu proporcji substratu do enzymu (50-100):1. Aby skrócić czas trawienia enzymatycznego do minut lub sekund, opisano unieruchomione mikroreaktory enzymatyczne, w postaci reaktorów mikroprzepływowych lub dostępnych na rynku wkładów. 1-6 Zazwyczaj enzym jest unieruchomiany przez adsorpcję kowalencyjną, niekowalencyjną/fizyczną, tworzenie kompleksu lub enkapsulację,3,6 przy czym zwiększona wydajność procesu enzymatycznego jest możliwa dzięki dużym stosunkom powierzchni do objętości i enzymu do substratu. Dodatkowe zalety unieruchomionych reaktorów obejmują zmniejszoną autolizę i interferencję enzymu w analizie SM, lepszą stabilność enzymu i możliwość ponownego użycia. Opisano różne podejścia wykorzystujące szklane lub polimerowe mikrofabrykowane urządzenia, wykorzystujące enzymy unieruchomione na kulkach magnetycznych przez interakcje przeciwciało-antygen,7,8 uwięzione w sieciach nanocząstek złota,9 zamknięte w zol-żelach tytanowo-tlenku glinu10 i nanozeolitach,11 lub wychwycone przez tworzenie kompleksu Ni-NTA lub His-Tag. 6 Alternatywnie, opracowano również naczynia włosowate z unieruchomionymi enzymami. 12 Co więcej, wykazano zwiększone rozszczepienie proteolityczne dzięki zastosowaniu kontrolowanego promieniowania mikrofalowego13 lub technologii wspomagania ciśnieniem lub cyklicznych zmian ciśnienia (PCT) w celu skrócenia czasu reakcji do 30-120 min.14

Pomimo wielu zalet unieruchomionych reaktorów enzymatycznych, koszty komercyjnych kartridży są wysokie, dostępność urządzeń mikroprzepływowych do rutynowego użytku jest ograniczona, a użycie technologii mikrofalowych lub PCT powoduje potrzebę dodatkowego oprzyrządowania. Celem tej pracy było opracowanie metody, która pozwala obejść te wady i którą można łatwo wdrożyć w każdym laboratorium, aby zapewnić naukowcom proste i skuteczne podejście do przeprowadzania enzymatycznego rozszczepiania białek w ramach przygotowań do analizy stwardnienia rozsianego w ciągu kilku minut. Podejście to opiera się na wykorzystaniu hydrofobowych cząstek C18, które są wstępnie załadowane w urządzeniu kapilarnym lub mikroprzepływowym, oraz na adsorpcji białka (interesujących białka) na tych cząstkach, a następnie trawieniu enzymatycznym podczas infuzji enzymu przez wypełnione złoże i wychwycone białko. W tym podejściu substrat jest unieruchamiany poprzez oddziaływania niekowalencyjne, a enzym jest podawany na unieruchomione białko. Wydajność trawienia proteolitycznego jest zwiększona dzięki dużym powierzchniom cząstek, które wystawiają białko na przetwarzanie enzymatyczne, zmniejszonym odległościom i czasom dyfuzji do i z powierzchni cząstek, lepszemu przenoszeniu masy, brakowi przyłączania kowalencyjnego, które może wpływać na aktywność enzymu, zdolności do szybkiej oceny kombinacji różnych enzymów, jednorazowości i multipleksowania, jeśli proces jest wykonywany w formacie mikroprzepływowym. Podejście to demonstruje się przy użyciu mieszaniny standardowych białek i trypsyny - najczęściej stosowanego enzymu do trawienia proteolitycznego przed wykryciem ESI-MS. Spektrometr masowy użyty do detekcji w tym badaniu był instrumentem z liniowym kwadrupolem pułapkowym (LTQ).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie mikroreaktora kapilarnego

  1. Przyciąć kapilarnę o średnicy wewnętrznej 100 μm (ID) x 360 μm średnicy zewnętrznej (OD) na długość 7-8 cm, a kapilarnę o średnicy wewnętrznej 20 μm x 90 μm OD na 3-5 cm za pomocą szklanego tasaka kapilarnego; sprawdzić pod mikroskopem, czy oba końce kapilary mają czyste, proste cięcie, bez wystających zadziorów.
  2. Włóż kapilarnę o średnicy zewnętrznej 20 μm x 90 μm do jednego końca kapilary o średnicy zewnętrznej 100 μm üm ø x 360 μm, na długość ~6 mm; w razie potrzeby obserwuj tę operację pod mikroskopem.
  3. Nałóż małą kroplę kleju E6000 wokół połączenia kapilar 90 μm OD/100 μm ID z końcem końcówki Q i pozwól klejowi utwardzić się O/N przy RT.
  4. Przyciąć włożoną kapilarnę o średnicy wewnętrznej 20 μm x 90 μm średnicy zewnętrznej na długość ~10-15 mm; będzie to emiter jonizacji elektrorozpylania.
  5. Wstępnie przyciąć rurki PTFE 1/32" OD PEEK, 1/16" OD PEEK i 1/16" OD PTFE na kawałki o długości 4-5 cm; będą to tuleje stosowane w złączkach kapilarnych w celu zapewnienia szczelnego połączenia.
  6. Podłącz przeciwległy koniec kapilary o średnicy wewnętrznej 100 μm x 360 μm do złączki PEEK; użyj tulei PEEK 1/32", aby zapewnić szczelne połączenie.
  7. Włóż/dokręć kawałek rurki PTFE 1/16" o długości ~5 cm do przeciwległego końca złącza.
  8. Zważyć ~4 mg cząstek C18 (5 μm) we wstępnie oczyszczonej/wysuszonej szklanej fiolce o pojemności 2 ml; dodać 0,5 ml izopropanolu, zamknąć fiolkę i rozproszyć zawiesinę w kąpieli ultradźwiękowej.
  9. Pobrać za pomocą strzykawki o pojemności 250 μl około 200 μl zawiesiny, włożyć igłę strzykawki do rurki PTFE 1/16" złącza PEEK i powoli dozować zawiesinę do kapilary o średnicy zewnętrznej 100 μm ID x 360 μm; obserwować pod mikroskopem, jak kapilara wypełnia się cząstkami, aż do uzyskania długości wypełnienia 2-3 mm; będzie to mikroreaktor (rysunek 1). Kapilara ID o średnicy wewnętrznej 20 μm zatrzymuje cząstki w mikroreaktorze dzięki efektowi Keystone. 15
  10. Przepłukać mikroreaktor ~50 μl roztworuH2O/CH3CN 50:50 v/v, a następnie ~50 μl roztworuH2O/CH3CN 98:2 v/v.

2. Przygotowanie roztworów próbek

Uwaga: Operacje, które obejmują obchodzenie się z rozpuszczalnikami organicznymi i kwasami oraz przygotowanie roztworu, powinny być wykonywane w dygestorium. Nosić okulary, rękawice i odzież ochronną.

  1. Przepłukać CH3OH i osuszyć kilka szklanych fiolek (4 ml) oraz probówki polipropylenowe (15 ml).
  2. Przygotować 10 ml roztworuH2O/CH3CN (98:2 v/v) w probówce polipropylenowej o pojemności 15 ml, mieszając 9,8 mlH2Oz 200 μlCH3CN; wymieszać metodą sonikacji.
  3. Przygotować 10 ml roztworuH2O/CH3CN (50:50 v/v) w probówce polipropylenowej o pojemności 15 ml, mieszając 5 mlH2Oz 5 mlCH3CN; wymieszać metodą sonikacji.
  4. Przygotować 4 ml zakwaszonego roztworu wodnego (TFA 0,01% v/v) dodając 4 μl TFA(10%) do 4 ml H2O/CH3CN (98:2 v/v) w szklanej fiolce o pojemności 4 ml; wymieszać metodą sonikacji.
  5. Przygotować 4 ml zakwaszonego roztworu organicznego (TFA 0,01% v/v) dodając 4 μl TFA(10%) do 4 ml H2O/CH3CN (50:50 v/v) w szklanej fiolce o pojemności 4 ml; wymieszać metodą sonikacji.
  6. Zważyć 16 mg NH4HCO3 za pomocą mikrowagi analitycznej w szklanej fiolce o pojemności 4 ml; dodać 4 ml roztworu H2O/CH3CN (98:2 v/v) i rozproszyć przez sonikację; w wyniku czego otrzymamy 50 mM roztwór NH4HCO3 (pH ~ 7,8) w buforze wodnym.
  7. Odważyć 5 mg wzorcowego białka (np. albuminy surowicy bydlęcej, hemoglobiny α/β, cytochromu C, anhydrazy węglanowej, glikoproteiny α-2-HS itp.) za pomocą mikrowagi analitycznej w szklanej fiolce o pojemności 4 ml; dodać 4 ml wody demineralizowanej i zdyspergować za pomocą sonikacji; zwykle daje to roztwór o wysokim stężeniu μM.
  8. Przygotować 1 ml roztworu białkowego (1-2 μM) przez rozcieńczenie roztworu o wysokim stężeniu μM odpowiednią objętością buforu wodnego NH4HCO3 (50 mM); wymieszać przez sonikację.
  9. Przygotować roztwór trypsyny (5 μM) rozpuszczając 20 μg trypsyny do sekwencjonowania w 170 μl NH4HCO3 (50 mM) buforze wodnym; rozproszyć przez sonikację.

3. Konfiguracja eksperymentalna

Uwaga: System LTQ-MS jest wyposażony w zmodyfikowane źródło ESI, które zawiera domowy stolik XYZ, który umożliwia połączenie spektrometru masowego z różnymi podejściami do wprowadzania próbek.

  1. Odłącz mikroreaktor kapilarny od złącza PEEK i podłącz do trójnika PEEK.
  2. Włóż drut Pt o długości ~2 cm do bocznego ramienia trójnika PEEK; użyj tulei PEEK 1/32", aby zapewnić szczelne połączenie i zaizolować drut Pt.
  3. Podłącz kapilarnę do przenoszenia próbki o średnicy wewnętrznej 50 μm x 360 μm (~0,5 m długości) do przeciwległego końca trójnika PEEK; użyj tulei PEEK 1/32", aby zapewnić szczelne połączenie.
  4. Zabezpiecz trójnik PEEK na stoliku XYZ i umieść emiter ESI w odległości ~ 2 mm od kapilary wlotowej spektrometru mas.
  5. Podłącz przewód Pt do źródła zasilania ESI spektrometru masowego.
  6. Podłącz przeciwległy koniec kapilary do przenoszenia próbki do złączki ze stali nierdzewnej; użyj tulei PEEK 1/16", aby zapewnić szczelne połączenie.
  7. Podłącz rurkę 1/16" z PTFE o długości 4-5 cm do przeciwległego końca złączki ze stali nierdzewnej i włóż igłę strzykawki o pojemności 250 μl do rurki PTFE; włącz pompę i ustaw natężenie przepływu na żądaną wartość (np. 2 μl/min).
  8. Wprowadź parametry akwizycji danych MS w tandemie do pakietu oprogramowania sterującego urządzeniem MS i zapisz jako plik metody, aby przygotować konfigurację do przeprowadzenia analizy; dla systemu LTQ-MS należy użyć następujących parametrów analizy zależnej od danych: dynamiczne wyłączanie włączone na 180 sekund z szerokością masy wykluczenia ±1,5 m/z; jeden skan MS, a następnie jeden zoom i MS2 Skanuje 5 najbardziej intensywnych szczytów, szerokość skanowania w powiększeniu ±5 m/z; parametry dysocjacji wywołanej kolizją (CID) ustawione na szerokość izolacji 3 m/z, znormalizowana energia zderzenia 35%, aktywacja Q 0,25 i czas aktywacji 30 ms.

4. Konfiguracja mikroprzepływowa

  1. Przygotuj urządzenie mikroprzepływowe z podłoży szklanych lub polimerowych; 16-18 układ urządzenia przedstawiono na rysunku 2A, składającego się z mikroreaktora (1) (0,13 mm szerokości x 2 mm długości x 50 μm głębokości) podłączonego do wlotu (2), wylotu (3) i portu bocznego (4); Kanały łączące do manipulacji płynami mają szerokość ~110 μm i głębokość ~50 μm; Struktura wielokanałowa (5), składająca się z mikrokanalików o głębokości ~1,5-2 μm x szerokości 10 μm x długości 100 μm umieszczonych w odległości 25 μm od siebie, będzie działać jako filtr zatrzymujący cząstki w mikroreaktorze.
  2. Umożliwiają one podłączanie płynów do układu scalonego poprzez przyklejenie specjalistycznych złączy do portów wlotowych lub poprzez opracowanie polimerowej podstawy, w której mieszczą się złączki do dostarczania płynów (ilustracja 2B). 16
  3. Przygotować zawiesinę cząstek C18 (5 μm) zgodnie z opisem w kroku 1.8; dostarczyć zawiesinę do mikroreaktora za pomocą strzykawki za pomocą rurki PTFE 1/16" podłączonej do portu po stronie chipa (4); uszczelnić port po załadowaniu cząstek klejem epoksydowym i utwardzać przez 1 godzinę w piecu w temperaturze 90 °C.16
  4. Włóż kapilatę (20 μm ID x 90 μm OD x 10 mm długości) do portu wylotowego, uszczelnij klejem E6000 i pozwól utwardzić O/N; stanie się to emiterem ESI (6).
  5. Podłączyć kapilarnę do przenoszenia próbki o średnicy wewnętrznej 50 μm × 360 μm (~0,5 m długości) do portu wlotowego chipa (2); podłączyć przeciwległy koniec kapilary do strzykawki o pojemności 250 μl i pompy strzykawkowej, jak opisano w ppkt 3.6-3.7.
  6. Umieść lekkie złącze trójnikowe PEEK na linii przesyłowej próbki tuż przed portem wlotowym (2) i włóż drut Pt na boczne ramię trójnika, jak opisano w 3.2; będzie to elektroda ESI.
  7. Zabezpieczyć urządzenie mikroprzepływowe na stoliku XYZ z emiterem ESI umieszczonym w odległości ~2 mm od kapilary wlotowej spektrometru masowego; przygotować MS do analizy, jak opisano w ppkt 3.8.

5. Ładowanie próbki, trawienie proteolityczne i elucja do analizy MS

Uwaga: Wszystkie etapy transferu roztworu/próbki są wykonywane za pomocą pompy strzykawkowej i powinny pozwolić na kilka dodatkowych minut na zakończenie, aby skompensować martwe objętości związane z liniami przesyłowymi do i z mikroreaktora; niezbędny czas będzie zależał od natężeń przepływu.

  1. Przepłukać mikroreaktor i przygotować go do analizy, wlewając wodny roztwór NH4HCO3 (50 mM) w H2O/CH3CN (98:2 v/v) przy 2 μl/min przez 5 minut; użyć strzykawki o pojemności 250 μl.
  2. Załadować próbkę białka (1 μM) do mikroreaktora, podając roztwór próbki z prędkością 2 μl/min przez 5 minut; użyć strzykawki o pojemności 250 μl.
  3. Roztwór trypsyny (5 μM) nasycić zaadsorbowanym białkiem w mikroreaktorze z prędkością 2 μl/min przez 1-3 minuty.
  4. Ugasić proces trawienia proteolitycznego przez przepłukanie mikroreaktora zakwaszonym wodnym roztworem TFA (0,01% v/v) w H2O/CH3CN (98:2 v/v) przy 2 μl/min przez 5 min; użyć strzykawki o pojemności 250 μl.
  5. Rozpocznij elucję trawienia białka z mikroreaktora, podając zakwaszony roztwór organiczny TFA (0,01% v/v) w H2O/CH3CN (50:50 v/v) przy 300 nl/min.
  6. Włącz proces akwizycji danych MS i napięcie ESI (~2,000 V); pobierz dane MS przy użyciu parametrów akwizycji danych podanych w kroku 3.8; obserwuj elucję peptydów tryptycznych.

6. Przetwarzanie danych

  1. Przetwarzaj tandemowe dane MS za pomocą wyszukiwarki zgodnej z surowym formatem danych MS.
    1. Przetwarzaj surowe pliki LTQ-MS przy użyciu specyficznej dla organizmu minimalnie nadmiarowej bazy danych białek; prześlij surowe dane do wyszukiwarki, ustaw tolerancje masy jonów macierzystych i fragmentów odpowiednio na 2 i 1 Da, a do wyszukiwania używaj tylko w pełni tryptycznych fragmentów z maksymalnie dwoma pominiętymi rozszczepieniami; nie dopuszczaj modyfikacji potranslacyjnych; ustaw wskaźniki fałszywych odkryć o wysokim i średnim poziomie ufności (FDR) na 1% i 3%, i nie zezwalaj na modyfikacje potranslacyjne.
  2. Przefiltruj dane, aby wybrać tylko peptydy o wysokim poziomie ufności dopasowania do białek w bazie danych; oceń wyniki na poziomie białka i peptydu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Reprezentatywny wynik procesu trawienia proteolitycznego przeprowadzonego jednocześnie na mieszaninie białek z wykorzystaniem opisanych powyżej mikroreaktorów (Rysunki 1 lub 2) przedstawiono w Tabeli 1. Tabela zawiera unikalne sekwencje peptydów identyfikujące konkretne białko, wynik korelacji wzajemnej (Xcorr) (t.j. wynik charakteryzujący jakość dopasowania danych eksperymentalnych do teoretycznych dla odpowiadającego im widma masowego tandemowe...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Mikroreaktor opisany w tej pracy zapewnia łatwy do wdrożenia zestaw eksperymentalny do przeprowadzania enzymatycznego trawienia białek, aby umożliwić analizę i identyfikację MS w czasie krótszym niż 30 minut. Wyraźne zalety tego systemu, w porównaniu z konwencjonalnymi podejściami, to prostota, szybkość, niskie zużycie odczynników i niskie koszty. W szczególności nie ma potrzeby stosowania drogich unieruchomionych kulek i wkładów z trypsyną. Przygotowanie mikroreaktora kapilarnego jest proste (rysunek 1A...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez grant NSF/DBI-1255991 dla IML.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pułapka jonowa ESI-MSThermo ElectronLTQSpektrometr masowy LTQ służy do pozyskiwania tandemowych danych MS
Stopień XYZNewportWiele częściZbudowany w domu stopień XYZ służy do adaptacji komercyjnego źródła LTQ nano-ESI do odbierania danych wejściowych z różnych systemów dostarczania próbek
Mikroskop stereoskopowyEdmund optykaG81-278Mikroskop służy do obserwacji procesu pakowania mikroreaktora
Waga analityczna/MetlerVWR46600-204Waga służy do ważenia próbek białek
Kąpiel ultradźwiękowa/BransonVWR33995-540Kąpiel soniczna służy do mieszania/homogenizacji próbek i dyspersji zawiesiny cząstek C18
Pompa strzykawkowa 22Aparatura Harvarda552222Mikropompa służy do ładowania, płukania i elucji próbki i enzymu na i z wypełnionego mikroreaktora kapilarnego
Milli-Q ultraczysty system wodnyEMD MilliporeZD5311595 System wodny MilliQ służy do przygotowania oczyszczonej wody demineralizowanej
Pipettor/Eppendorf (1,000  &mikro; l)VWR53513-410Pipetor służy do pomiaru małych objętości roztworów próbek
Pipettor/Eppendorf (100  &mikro; l)VWR53513-406Pipetor służy do pomiaru małych objętości roztworów próbek
Pipettor/Eppendorf (10  &mikro; l)VWR53513-402Pipetor służy do pomiaru małych objętości roztworów próbek
Kapilarna stopiona krzemionka (100 &mikro; m ID x 360 &mikro; m OD)Polymicro TechnologiesTSP100375Ta kapilara służy do wytwarzania mikroreaktora
Kapilara ze stopionej krzemionki (20  &mikro; m ID x 100 i mikro; m OD)Polymicro TechnologiesTSP020090Ta kapilara służy do wytwarzania kapilary z topionej krzemionki emitera ESI
(50  &mikro; m ID x 360 &mikro; m OD)Polymicro TechnologiesTSP050375Ta kapilara służy do przenoszenia próbek i eluentu z pompy strzykawkowej do mikroreaktora kapilarnego
Tasak kapilarnyszklany Supelco23740-UJest to narzędzie do cięcia kapilar ze stopionej krzemionki na żądaną długość
KlejProdukty eklektyczneE6000 CraftKlej ten służy do mocowania emitera ESI do mikroreaktora kapilarnego lub chipa mikroprzepływowego
Klej epoksydowyEpo-Tek353NDTTen klej służy do uszczelniania mikroprzepływowego otworu wlotowego, przez który ładowane są cząstki C18
Cząstki C18 o odwróconej fazie (5  &mikro; m)Agilent TechnologiesZorbax 300SB-C18Są to cząstki C18, na których adsorbowane są białka; Cząstki wyekstrahowano z 4  mm x 20 cm Kolumna C18 LC firmy Agilent
Strzykawka/szkło (250 µ l)Hamilton81130-1725RNSzklane strzykawki służą do ładowania zawiesiny cząstek C18 do mikroreaktora kapilarnego oraz do dostarczania próbki i eluentów do mikroreaktora
Wewnętrzna redukcyjna złączka PEEK (1/16 "do 1/32")ValcoZRU1.5FPKTo złącze służy do podłączenia 250 & micro; l strzykawka do mikroreaktora do ładowania 5 & mikro; m zawiesina cząstek
Złącze ze stali nierdzewnej (1/16 ")ValcoZU1XCZłączka ze stali nierdzewnej służy do łączenia szklanej igły strzykawki z kapilarą infuzyjną
Złącze trójnikowe Microvolume PEEK (1/32")ValcoMT.5XCPKTrójnik Peek służy do połączenia kapilary do przenoszenia próbki z mikroreaktorem kapilarnym; na jego bocznym ramieniu umożliwia włożenie łącznika trójnika z drutu Pt
(lekkiego)ValcoC-NTXFPKTo złącze trójnikowe służy do podawania napięcia ESI do układu mikroprzepływowego przez linię przesyłu próbki
Drut Pt (0,404 mm)VWR66260-126Przewód Pt zapewnia połączenie elektryczne do generowania ESI i jest podłączony do rurki PTFE zasilacza spektrometru mas ESI
(1/16" OD)ValcoTTF115-10FTRurka teflonowa służy do umożliwienia hermetycznego połączenia między igłą strzykawki a złączką ze stali nierdzewnej 
Rurki PEEK (0,015" Średnica wewnętrzna x 1/16" OD)Upchurch Scientific1565Rurka Peek służy jako tuleja, aby umożliwić hermetyczne połączenie między złączem ze stali nierdzewnej a 50  &mikro; m ID kapilarny kapilarny
PEEK (0,015 " Średnica wewnętrzna x 1/32" OD)ValcoTPK.515-25Rurka Peek służy jako tuleja, aby umożliwić szczelne połączenie między stopionymi kapilarami krzemionkowymi a
obcinakiem do rurek polimerowychValcoJR-797Ten nóż służy do wstępnego cięcia 1/16" i 1/32' Rurka polimerowa Peek, która służy jako tuleja do szczelnych połączeń w kawałkach o długości ~4-5 cm
Fiolka z bursztynem (2 ml)Agilent HP-5183-2069Fiolki służą do przygotowania roztworów próbek i zawiesiny cząstek C18 
Fiolka z bursztynową (4 ml)VWR66011-948Fiolki służą do przygotowywania roztworów próbek
Probówka polipropylenowa (15  ml)Fisher12-565-286DFiolki służą do przygotowania roztworów buforowych
Butla (100 ml)VWR24710-463Butla służy do pomiaru objętości rozpuszczalnika
Butla (10 ml)VWR24710-441Butla służy do pomiaru objętości rozpuszczalnika
Końcówki do pipet (1,000 &mikro; l)VWR83007-386Końcówki do pipet służą do pomiaru małych objętości roztworów próbek
Końcówki do pipet (100 &mikro; l)VWR53503-781Końcówki do pipet służą do pomiaru małych objętości roztworów próbek
Końcówki do pipet (10 &mikro; l)VWR53511-681Końcówki do pipet służą do pomiaru małych objętości roztworów próbek
Podłoża szklaneNanofilmB270 biała korona, 3" x 3"Są to szklane podłoża do produkcji mikroczipów
Złączka z nakrętką męską (1/16")UpchurchP203XTa złączka służy do łączenia kapilar transferowych z układem mikroprzepływowym
Zespół NanoportUpchurchN-122HTa złączka służy do łączenia kapilar transferowych z chipem mikroprzepływowym
Wzorce białkoweSigmaMultiple #
Acetonitryle, klasa HPLCMetanol FisherA955
, klasaHPLCFisherA452
Izopropanol, klasa HPLCSigma650447
Kwas trifluorooctowySigma302031
Wodorowęglan amonuAldrichA6141
Trypsyna, klasa sekwencjonowaniaPromegaV5111
Peek Tee Clean-cut

Bibliografia

  1. Petersen, D. H. Microfluidic Bioreactors. Encyclopedia of Microfluidics and Nanofluidics. , Springer Science+Business Media. New York. (2014).
  2. Matosevic, S., Szita, N., Baganz, F. Fundamentals and applications of immobilized microfluidic enzymatic reactors. J. Chem. Technol. Biotechnol. 86 (3), 325-334 (2011).
  3. Liu, Y., Liu, B., Yang, P., Girault, H. H. Microfluidic enzymatic reactors for proteome research. Anal. Bioanal. Chem. 390 (1), 227-229 (2008).
  4. Wu, H., Zhai, J., Tian, Y., Lu, H., Wang, X., Jia, W., Liu, B., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. Microfluidic enzymatic-reactors for peptide mapping: strategy, characterization, and performance. LabChip. 4 (6), 588-597 (2004).
  5. Jin, L. J., Ferrance, J., Sanders, J. C., Landers, J. P. A microchip-based proteolytic digestion system driven by electroosmotic pumping. LabChip. 3 (1), 11-18 (2003).
  6. Asanomi, Y., Yamaguchi, H., Miyazaki, M., Maeda, H. Enzyme-immobilized microfluidic process reactors. Molecules. 7 (16), 6041-6059 (2011).
  7. Aravamudhan, S., Joseph, P. J., Kuklenyik, Z., Boyer, A. E., Barr, J. R. Integrated microfluidic enzyme reactor mass spectrometry platform for detection of anthrax lethal factor. 31.st. Annual International Conference of the IEEE EMBS, , 1071-1074 (2009).
  8. Liu, X., Lo, R. C., Gomez, F. A. Fabrication of a microfluidic enzyme reactor utilizing magnetic beads. Electrophoresis. 30 (12), 2129-2133 (2009).
  9. Liu, Y., Xue, Y., Ji, J., Chen, X., Kong, J., Yang, P., Girault, H. H., Liu, B. Gold nanoparticle assembly microfluidic reactor for efficient on-line proteolysis. Mol. Cell. Proteomics. 6 (8), 1428-1436 (2007).
  10. Wu, H., Tian, Y., Liu, B., Lu, H., Wang, X., Zhai, J., Jin, H., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. Titania and alumina sol-gel-derived microfluidics enzymatic-reactors for peptide mapping: design, characterization, and performance. J. Proteome Res. 3 (6), 1201-1209 (2004).
  11. Ji, J., Zhang, Y., Zhou, X., Kong, J., Tang, Y., Liu, B. Enhanced protein digestion through the confinement of nanozeolite-assembled microchip reactors. Anal. Chem. 80 (7), 2457-2463 (2008).
  12. Hustoft, H. K., Brandtzaeg, O. K., Rogeberg, M., Misaghian, D., Torsetnes, S. B., Greibrokk, T., Reubsaet, L., Wilson, S. R., Lundanes, E. Integrated enzyme reactor and high resolving chromatography in "sub-chip" dimensions for sensitive protein mass spectrometry. Scientific Reports. 3 (3511), 1-7 (2013).
  13. Pramanik, B. N., Mirza, U. A., Ing, Y. H., Liu, Y. H., Bartner, P. L., Weber, P. C., Bose, A. K. Microwave-enhanced enzyme reaction for protein mapping by mass spectrometry: A new approach to protein digestion in minutes. Protein Sci. 11 (11), 2676-2687 (2002).
  14. Olszowy, P. P., Burns, A., Ciborowski, P. S. Pressure-assisted sample preparation for proteomic analysis. Anal. Biochem. 438 (1), 67-72 (2013).
  15. Lord, G. A., Gordon, D. B., Myers, P., King, B. W. Tapers and restrictors for capillary electrochromatography and capillary electrochromatography-mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 768, 9-16 (1997).
  16. Lazar, I. M., Kabulski, J. L. Microfluidic LC Device with Orthogonal Sample Extraction for On-Chip MALDI-MS Detection. Lab Chip. 13 (11), 2055-2065 (2013).
  17. Harrison, D. J., Manz, A., Fan, Z. H., Ludi, H., Widmer, H. M. Capillary electrophoresis and sample injection systems on a planar glass chip. Anal. Chem. 64 (17), 1926-1932 (1992).
  18. Jacobson, S. C., Hergenroder, R., Koutny, L. B., Warmack, R. J., Ramsey, J. M. Effects of Injection Schemes and Column Geometry on the Performance of Microchip Electrophoresis Devices. Anal. Chem. 66 (7), 1107-1113 (1994).
  19. Armenta, J. M., Perez, M. J., Yang, X., Shapiro, D., Reed, D., Tuli, L., Finkielstein, C. V., Lazar, I. M. Fast Proteomic Protocol for Biomarker Fingerprinting in Cancerous Cells. J. Chromatogr. A. 1217, 2862-2870 (2010).
  20. Doucette, A., Craft, D., Li, L. Mass Spectrometric Study of the Effects of Hydrophobic Surface Chemistry and Morphology on the Digestion of Surface-Bound Proteins. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 14, 203-214 (2003).
  21. Lazar, I. M., Trisiripisal, P., Sarvaiya, H. A. Microfluidic Liquid Chromatography System for Proteomic Applications and Biomarker Screening. Anal. Chem. 78 (15), 5513-5524 (2006).
  22. Lazar, I. M., Karger, B. L. Multiple Open-Channel Electroosmotic Pumping System for Microfluidic Sample Handling,". Anal. Chem. 74 (24), 6259-6268 (2002).
  23. Lazar, I. M., Rockwood, A. L., Lee, E. D., Sin, J. C. H., Lee, M. L. High-speed TOFMS Detection for Capillary Electrophoresis. Anal. Chem. 71 (13), 2578-2581 (1999).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

trawienie enzymatycznetrawienie białekroztwór trypsynycząsteczki C18spektrometria maskolumna kapilarnajonizacja z rozpylaniem elektrycznymelucja peptydówanaliza próbek
Szybkie przetwarzanie enzymatyczne białek w celu wykrywania stwardnienia rozsianego za pomocą mikroreaktora przepływowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.