Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Nowatorska strategia łącząca macierz CGH, sekwencjonowanie całego eksomu i elektroporację in utero u gryzoni w celu identyfikacji genów odpowiedzialnych za wady rozwojowe mózgu

8.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53570

⸱

1 grudnia 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1University of Florence, 2INSERM INMED, 3Aix-Marseille University, 4Plateforme Biologie Moléculaire et Cellulaire INMED, 5Royal Children's Hospital, 6Murdoch Children's Research Institute, 7University of Melbourne, 8Plateforme postgenomique INMED, 9University of Pavia, 10Wellcome Trust Centre for Human Genetics, 11Oxford Radcliffe NHS Trust, 12IRCCS Casimiro Mondino Foundation, 13Research Institute of Molecular Pathology, 14IRCCS Stella Maris, 15Columbia University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Okołokomorowa heterotopia guzkowa (PNH) jest najczęstszą formą wady rozwojowej kory mózgowej (MCD) w wieku dorosłym, ale jej podłoże genetyczne pozostaje nieznane w większości sporadycznych przypadków. Niedawno opracowaliśmy strategię identyfikacji nowych genów kandydujących do MCD i bezpośredniego potwierdzenia ich przyczynowej roli in vivo.

Streszczenie

Wady wrodzone, które obejmują korę mózgową - znane również jako wady rozwojowe kory mózgowej (MCD) - są ważnymi przyczynami niepełnosprawności intelektualnej i odpowiadają za 20-40% lekoopornej padaczki w dzieciństwie. Obrazowanie mózgu w wysokiej rozdzielczości ułatwiło identyfikację in vivo dużej grupy fenotypów MCD. Pomimo postępów w obrazowaniu mózgu, analizie genomowej i generowaniu modeli zwierzęcych, brakuje prostego przepływu pracy w celu systematycznego priorytetyzacji genów kandydujących i testowania funkcjonalnych skutków przypuszczalnych mutacji. Aby przezwyciężyć ten problem, opracowano i zweryfikowano eksperymentalną strategię umożliwiającą identyfikację nowych genów odpowiedzialnych za MCD. Strategia ta opiera się na identyfikacji kandydujących regionów lub genów genomu za pomocą sekwencjonowania macierzowego CGH lub całego eksomu i scharakteryzowaniu skutków ich inaktywacji lub nadekspresji określonych mutacji w rozwijających się mózgach gryzoni za pomocą elektroporacji in utero. Podejście to doprowadziło do zidentyfikowania genu C6orf70, kodującego przypuszczalne białko pęcherzykowe, do patogenezy okołokomorowej heterotopii guzkowej, MCD spowodowanej wadliwą migracją neuronów.

Wprowadzenie

Kora mózgowa odgrywa kluczową rolę w procesach poznawczych i intelektualnych oraz jest zaangażowana w kontrolę emocjonalną, jak również uczenie się i pamięć. Nic więc dziwnego, że wiele chorób neurologicznych i psychiatrycznych wynika z wad rozwojowych kory mózgowej (MCD). Etiologia MCD jest złożona, ponieważ w grę wchodzą zarówno czynniki nabyte, jak i genetyczne. Skumulowana częstość występowania genetycznie uwarunkowanego odsetka MCD wynosi około 2% i w większości przypadków występują one sporadycznie. Na przykład częstość występowania wrodzonej dysgenezji mózgu oszacowano na wyższą niż 1% w populacji ludzkiej, a niektóre formy MCD obserwuje się u ponad 14% wszystkich pacjentów z padaczką i u 40% pacjentów z ciężką lub nieuleczalną padaczką1,2.

Okołokomorowa heterotopia guzkowa (PNH) jest jednym z najczęstszych MCD i jest spowodowana nieprawidłową migracją neuronów ze strefy komorowej (VZ) do rozwijającej się kory mózgowej. Niezdolność neuronów do migracji powoduje skupiska neuronów heterotopowych wzdłuż ścian komór bocznych, które zwykle można uwidocznić za pomocą rezonansu magnetycznego (MRI). Cechy kliniczne, anatomiczne i obrazowe PNH są niejednorodne. Guzki mogą wahać się od małych i jednostronnych do obustronnych i symetrycznych. Do częstych następstw klinicznych należą: padaczka i niepełnosprawność intelektualna3. Mutacje w genie filaminy A (lub FLNA), który mapuje się w Xq28, stwierdzono w 100% rodzin z obustronnym PNH sprzężonym z chromosomem X i u 26% pacjentów sporadycznie3,4. Rzadka, recesywna forma PNH spowodowana mutacjami w genie ARFGEF2, który mapuje się w 20q13, została zgłoszona w dwóch spokrewnionych rodzinach5. Ostatnio mutacje bialleliczne w genach kodujących parę kadheryna receptor-ligand DCHS1 i FAT4 zostały zidentyfikowane u dziewięciu pacjentów dotkniętych zaburzeniem wieloukładowym, które obejmuje PNH6. PNH jest również związany z zespołem łamliwego chromosomu X7, zespół Williamsa8, zespół mikrodelecji 22q119, duplikacje w 5p1510, usunięcia w 1p3611, 5q14.3-q1512, 6p2513 i zespół delecji końcowej 6q14,15,16,17,18,19, co sugeruje, że dodatkowe geny sprawcze są rozproszone po całym genomie. Jednak w przypadku około 74% sporadycznie występujących PNH podstawa genetyczna pozostaje do wyjaśnienia17.

Klasyczne metody mapowania genów, takie jak porównawcza hybrydyzacja genomowa (array-CGH), okazały się potężnym narzędziem do wykrywania submikroskopijnych nieprawidłowości chromosomowych, jednak regiony genomu zidentyfikowane za pomocą tego podejścia są często duże i zawierają liczne geny.

Pojawienie się masowych technik sekwencjonowania równoległego (tj. sekwencjonowania całego egzomu (WES) i sekwencjonowania całego genomu (WGS)) znacznie zmniejszyło zarówno koszty, jak i czas potrzebny do zsekwencjonowania całego ludzkiego egzomu lub genomu. Niemniej jednak interpretacja danych WES i WGS pozostaje w większości przypadków wyzwaniem, ponieważ na każdego pacjenta przypadają od dziesiątek do setek (a nawet tysięcy, w zależności od rodzaju analizy) wariantów wyłaniających się z filtrowania danych.

Aby przyspieszyć proces identyfikacji nowych genów wywołujących MCD, zaprojektowano nowatorską strategię systematyczną łączącą macierz CGH, WES i badania przesiewowe genów kandydujących metodą elektroporacji in utero (IUE). IUE pozwala na selektywną inaktywację (lub nadekspresję) określonych genów lub mutacji w mózgach gryzoni, umożliwiając szybką ocenę ich udziału w kortykogenezie18,19. Oczekuje się, że knockdown lub nadekspresja jednego lub więcej genów kandydujących za pośrednictwem RNAi powoduje, gdy gen jest związany z rozwojem choroby, zlokalizowane defekty w migracji neuronów i / lub dojrzewaniu. Po zidentyfikowaniu genu, którego inaktywacja (lub nadekspresja) odtwarza fenotyp obserwowany u pacjentów z gryzoniami, staje się on znakomitym kandydatem do badań przesiewowych u sporadycznych pacjentów z MCD. Korzystając z tego podejścia, niedawno ujawniliśmy kluczowy wkład genu C6orf70 (znanego również jako ERMARD) w patogenezie PNH u pacjentów z delecjami chromosomu 6q2716.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Oświadczenie etyczne: Szczury rasy Wistar były kryte, utrzymywane i wykorzystywane w obiektach dla zwierząt INMED, zgodnie z prawem Unii Europejskiej i Francji.

1. Ekstrakcja i kwantyfikacja DNA dla tablicy-CGH i WES

  1. Ekstrakcja genomowego DNA (gDNA) z leukocytów krwi ludzkiej od pacjentów za pomocą zautomatyzowanego robota do izolacji DNA lub dostępnych na rynku zestawów do ręcznej ekstrakcji DNA zgodnie z protokołem producenta. Oznacz ilościowo wszystkie próbki za pomocą spektrofotometru.

2. Protokół tablicowo-CGH

  1. Trawienie restrykcyjne gDNA
    1. Podwójne trawienie 500 ng oczyszczonego gDNA od pacjenta i dostępnego w handlu ludzkiego DNA kontrolnego z RsaI i AluI przez 2 godziny w temperaturze 37 °C. Do każdej reakcji należy użyć 0,5 μl 10 U/μL enzymu. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 65 °C w celu dezaktywacji enzymów i przeniesienia probówek z próbkami do lodu.
  2. Przykładowe etykietowanie
    1. Do każdej probówki reakcyjnej dodać odpowiednią objętość starterów losowych potrzebnych do używanego formatu mikromacierzy (np. 5 μl dla mikromacierzy 1-pakowych, 2-pakowych i 4-pakowych). Dobrze wymieszaj, delikatnie pipetując w górę i w dół.
    2. Przenieść probówki z próbkami do termocyklera. Inkubować w temperaturze 95 °C przez 3 minuty, a następnie w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
    3. Przygotować jeden cyjaninę 3 i jeden cyjaninę 5 Znakowanie Master Mix na lodzie, mieszając następujące objętości: 10,0 μl 5X buforu reakcyjnego, 5,0 μl 10x dNTP, 3,0 μl cyjaniny 3-dUTP lub cyjaniny 5-dUTP i 1,0 μl enzymu egzo(-)Klenowa, 2,0 μl wody wolnej od nukleaz. Wybierz objętość każdego odczynnika zgodnie z używanym formatem mikromacierzy.
    4. Dodać Mistrzowską Mieszankę Znakowania do każdej probówki reakcyjnej zawierającej gDNA. Dobrze wymieszaj, delikatnie pipetując w górę i w dół.
    5. Przenieść probówki z próbkami do termocyklera i inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny, 65 °C przez 10 minut, a następnie utrzymywać próbki w temperaturze 4 °C.
  3. Oczyszczanie znakowanego gDNA
    1. Dodać 430 μl 1x TE (pH 8,0) do każdej probówki reakcyjnej.
    2. Umieść kolumnę oczyszczającą w probówkach zbiorczych o pojemności 2 ml i odpowiednio oznacz kolumny. Załaduj każde znakowane gDNA do kolumny oczyszczającej.
    3. Wirować przez 10 minut przy 14 000 x g w mikrowirówce w temperaturze pokojowej. Odrzucić przepływowy płyn i umieścić kolumnę z powrotem w probówce zbiorczej o pojemności 2 ml.
    4. Dodaj 480 μl 1x TE (pH 8,0) do każdej kolumny. Wirować przez 10 minut przy 14 000 x g w mikrowirówce w temperaturze pokojowej. Odrzuć przepływ.
    5. Odwrócić kolumnę do świeżej probówki zbiorczej o pojemności 2 ml i wirować przez 1 minutę przy 1 000 x g w mikrowirówce w temperaturze pokojowej w celu zebrania oczyszczonej próbki.
    6. Doprowadzić objętość próbki do wymaganej dla używanego formatu mikromacierzy za pomocą koncentratora lub dodając 1x TE (pH 8,0). Na przykład, w przypadku mikromacierzy składającej się z 1 opakowania, zwiększyć objętość do 80,5 μl. Inkubować próbkę na lodzie przez 5 minut, a następnie pipetować roztwór w górę i w dół 10 razy.
  4. Przygotowanie znakowanego gDNA do hybrydyzacji
    1. Połącz próbki testowe i referencyjne, używając odpowiedniej próbki znakowanej cyjaniną 5 i próbki znakowanej cyjaniną 3 w świeżej probówce o pojemności 1,5 ml bez RNazy. Na przykład w przypadku mikromacierzy 1-pakowej należy upewnić się, że końcowa objętość wynosi 158 μl. Wybierz objętość każdej próbki zgodnie z używanym formatem mikromacierzy.
    2. Użyć spektrofotometru do pomiaru wydajności, stopnia znakowania lub aktywności specyficznej, mierząc absorbancję przy A260 nm (DNA), A550 nm (cyjanina 3) i A650 nm (cyjanina 5).
      1. Obliczyć wydajność za pomocą wzoru: [stężenie DNA (ng / μl) x objętość próbki (μl)]/1 000 (ng / μg). Obliczać Aktywność specyficzną za pomocą wzoru: pmol na μl barwnika/μg na μl gDNA.
        UWAGA: Na przykład dla 0,5 μg wejściowego DNA wydajność powinna wynosić od 8 do 11 μg, a aktywność właściwa (pmol/μg) powinna wynosić od 25 do 40 dla próbki znakowanej cyjaniną-3 i od 20 do 35 dla próbki znakowanej cyjaniną-5.
    3. Aby przygotować ilość Hybridization Master Mix potrzebną dla używanego formatu mikromacierzy, wymieszaj następujące odczynniki: 50 μl Cot-1 DNA (1,0 mg/ml), 52 μl 10x środek blokujący aCGH i 260 μl 2x bufor hybrydyzacyjny HI-RPM.
    4. Dodaj odpowiednią objętość Hybridization Master Mix do 1,5 ml probówki wolnej od RNazy, która zawiera znakowane gDNA, aby uzyskać całkowitą objętość wymaganą dla używanego formatu mikromacierzy. Na przykład w przypadku mikromacierzy z 1 opakowaniem należy upewnić się, że końcowa objętość dla każdej reakcji wynosi 362 μl.
    5. Wymieszać próbkę, pipetując w górę i w dół, a następnie szybko odwirować przy 14 000 x g i inkubować przez 3 minuty w temperaturze 95 °C i w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
  5. Montaż komór i hybrydyzacja
    1. Załaduj czystą prowadnicę uszczelki do podstawy komory z etykietą uszczelki skierowaną do góry i wyrównaną z prostokątną częścią podstawy komory. Upewnij się, że suwak uszczelki jest zlicowany z podstawą komory i nie jest uchylony.
    2. Dozować mieszaninę próbki hybrydyzacji na uszczelkę, upewniając się, że próbka jest równomiernie rozprowadzona.
    3. Umieść szkiełko mikromacierzy w dół na suwaku uszczelki, oceniając, czy para kanapek jest prawidłowo wyrównana. Następnie zmontuj komorę reakcyjną, zakładając pokrywę na szkiełka warstwowe i ręcznie dokręcając zacisk.
    4. Upewnij się, że szkiełka są zwilżone, obracając zmontowaną komorę w pionie. Upewnij się, że w komorze nie ma pęcherzyków. W razie potrzeby postukaj zespołem o twardą powierzchnię, aby przesunąć nieruchome pęcherzyki.
    5. Umieść zmontowane komory ślizgowe w zębatce rotatora ustawionej tak, aby obracała się z prędkością 20 obr./min. Umieścić komorę hybrydyzacyjną w piecu i przeprowadzić hybrydyzację w temperaturze 65 °C przez 24 lub 40 godzin, zgodnie z używanym formatem mikromacierzy.
  6. Mycie i skanowanie mikromacierzy
    1. Wyjmij komorę hybrydyzacyjną z pieca i zanurz ją w buforze myjącym 1. Przystąp do jego demontażu.
    2. Wyjmij szkiełko do mikromacierzy i szybko włóż je do stojaka na szkiełka w buforze do mycia 1 w temperaturze pokojowej.
    3. Myj szkiełko matrycowe przez 5 minut, mieszając (użyj pcheł i mieszadła magnetycznego). Dostosuj prędkość mieszadła do ustawienia 4 (średnia prędkość), aby uzyskać dobre, ale niezbyt energiczne mieszanie.
    4. Umyj szkiełko matrycy w buforze myjącym 2 przez 90 sekund mieszania. Delikatnie wyjmij szkiełko z bufora (powinno wyschnąć) i załaduj je do uchwytu szkiełka za pomocą osłony suwaka.
    5. Załaduj szkiełko do skanera macierzy i wykonaj skanowanie zgodnie z instrukcjami producenta matrycy.
    6. Przeanalizuj wyniki za pomocą oprogramowania do ekstrakcji dostarczonego z używanym skanerem zgodnie z instrukcjami producenta (V.9.1.3.1).

3. Protokół WES

  1. Wzbogacanie celów
    1. Użyj testu dsDNA BR, aby określić stężenie próbki gDNA zgodnie z protokołem instrumentu.
    2. Rozcieńczyć 5 μg wysokiej jakości dwuniciowego DNA z 1x buforem o niskiej zawartości TE w 1,5 ml probówce o niskiej zawartości wiązania w całkowitej objętości 50 μL.
    3. Ustaw sonikator i włóż mikroprobówkę do stacji załadowczo-rozładowczej zgodnie z instrukcją producenta. Trzymaj nakrętkę na tubie.
    4. Powoli przenieś próbkę DNA o objętości 50 μl przez wstępnie podzieloną przegrodę bez wprowadzania pęcherzyków.
    5. Ścinać DNA zgodnie z ustawieniami sugerowanymi przez producenta sonikatora i oceniać jakość za pomocą bioanalizatora zgodnie z instrukcją producenta. Docelowy rozmiar fragmentu DNA wynosi od 150 do 200 pz.
  2. Naprawa końców DNA
    1. Przygotuj mieszaninę reakcji naprawy końca, mieszając 40 μl mieszanki enzymów naprawy końcówek z 10 μl mieszanki oligonugolakotydów naprawy końcówek. Dobrze wymieszaj na mikserze wirowym.
    2. Próbki inkubować w temperaturze 20 °C przez 30 minut w termocyklerze, a następnie utrzymywać je w temperaturze 4 °C. Nie używaj podgrzewanej pokrywy.
    3. Dodać 50 μl mieszanki reakcyjnej do naprawy końcowej przygotowanej w kroku 3.2.1 do każdej 50 μl ściętej próbki DNA. Dobrze wymieszać, pipetując w górę i w dół lub delikatnie wirując.
    4. Oczyść próbkę za pomocą zestawu do oczyszczania na bazie kulek zgodnie z protokołem producenta.
  3. Poliadenylacja końców 3'.
    1. Dodać 20 μl dA-Tailing Master Mix do każdej naprawionej na końcu, oczyszczonej próbki DNA (około 20 μl).
    2. Dobrze wymieszać, pipetując w górę i w dół lub delikatnie wirując.
    3. Próbki należy inkubować w temperaturze 37 °C w termocyklerze, a następnie utrzymywać je w temperaturze 4 °C. Nie używaj podgrzewanej pokrywy.
  4. Podwiązanie adaptera indeksującego do wstępnego przechwytywania.
    1. Dodać 5 μl Ligation Master Mix do każdej próbki DNA z ogonkiem A.
    2. Do każdej próbki dodać 5 μl odpowiedniego roztworu wskaźnikowego do wstępnego wychwytywania.
    3. Uszczelnij studzienki i dokładnie wymieszaj, wirując przez 5 sekund. Krótko odwirować próbki.
    4. Próbki inkubować w temperaturze 20 °C przez 15 minut w termocyklerze, a następnie utrzymywać w temperaturze 4 °C. Nie używaj podgrzewanej pokrywy.
    5. Oczyść próbki za pomocą zestawu do oczyszczania na bazie kulek zgodnie z protokołem producenta.
  5. Wzmocnienie indeksowanej biblioteki.
    1. Przygotować odpowiednią objętość mieszaniny reakcyjnej PCR przed wychwytywaniem, mieszając 1 μl Primer Mix i 25 μl PCR Master Mix. Dobrze wymieszaj na mikserze wirowym.
    2. Połączyć 26 μl mieszaniny amplifikacyjnej w oddzielnych studzienkach płytki PCR i 24 μl każdej indeksowanej próbki biblioteki gDNA.
    3. Uruchom program PCR, wykonując następujące czynności: 98 °C przez 2 minuty, 5 cykli w temperaturze 98 °C przez 30 s, 60 °C przez 30 s i 72 °C przez 1 minutę i końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 10 minut. Przytrzymaj próbki w temperaturze 4 °C.
    4. Oczyść próbkę za pomocą zestawu do oczyszczania na bazie kulek zgodnie z protokołem producenta.
    5. Oceń jakość za pomocą bioanalizatora zgodnie z protokołem producenta.
  6. Łączenie indeksowanych próbek DNA do hybrydyzacji
    1. Dla każdej puli reakcji wychwytywania połącz odpowiednią objętość każdej indeksowanej próbki biblioteki gDNA w jednym dołku płytki PCR. Na przykład w przypadku bibliotek przechwytywania wszystkich eksonów przez człowieka lub mysz połącz 8 bibliotek na pulę, używając 187,5 ng każdej indeksowanej biblioteki. Upewnij się, że każda końcowa pula reakcji wychwytywania zawiera 1,500 ng indeksowanego gDNA.
    2. Zmniejszyć objętość w każdym studzience do <7 μl za pomocą koncentratora próżniowego. Unikać całkowitego wysuszenia próbki.
    3. Dodaj wystarczającą ilość wody wolnej od nukleaz do każdej skoncentrowanej puli gDNA, aby doprowadzić końcową objętość studzienki do 7 μl, a następnie energicznie wirować płytkę zawierającą gDNA przez 30 s. Odwirować w wirówce lub wirówce mini-płytki, aby zebrać płyn na dnie studzienek.
  7. Hybrydyzacja pul bibliotek gDNA do biblioteki przechwytywania
    1. Do każdej 7 μl indeksowanej puli gDNA dodaj 9 μl blokującej mieszanki. Pipetować w górę i w dół, aby wymieszać.
    2. Zakryć studzienki, przenieść szczelnie zapieczętowaną płytkę zawierającą gDNA do termocyklera i inkubować w temperaturze 95 °C przez 5 minut, a następnie utrzymać ją w temperaturze 65 °C. Upewnij się, że płytka jest utrzymywana w temperaturze 65 °C przez co najmniej 5 minut.
    3. Przygotuj odpowiednie rozcieńczenie bloku RNazy, na podstawie rozmiaru biblioteki przechwytywania (10% rozcieńczenie dla bibliotek < 3,0 Mb i 25% rozcieńczenie dla bibliotek >3,0 Mb).
    4. W zależności od rozmiaru biblioteki przechwytywania, połącz odpowiednią ilość biblioteki przechwytywania i rozcieńczony roztwór bloku RNazy na płytce PCR trzymanej na lodzie. Dobrze wymieszać przez pipetowanie. W przypadku bibliotek przechwytywania <3,0 Mb należy użyć 2 μl biblioteki i 5 μl bloku RNazy w rozcieńczeniu 10%. W przypadku bibliotek przechwytywania >3,0 Mb należy użyć 5 μl biblioteki i 2 μl bloku RNazy w rozcieńczeniu 25%.
    5. Dodaj 37 μl buforu hybrydyzacyjnego do każdej studzienki zawierającej 7 μl mieszanki biblioteki przechwytywania / bloku RNazy. Dobrze wymieszać przez pipetowanie i krótko odwirować płytkę zawierającą mieszankę.
    6. Utrzymuj płytkę puli gDNA w temperaturze 65 °C, używając pipety wielokanałowej, aby przenieść całe 44 μl mieszaniny biblioteki przechwytywania z kroku 3.7.5 do każdej studzienki próbki na płytce puli gDNA. Dobrze wymieszaj, powoli pipetując w górę i w dół 8 do 10 razy.
    7. Uszczelnij studzienki kopulastymi zaślepkami pasków. Upewnij się, że wszystkie studzienki są całkowicie uszczelnione. Umieść matę uciskową na płytce PCR w termocyklerze.
    8. Mieszaninę do hybrydyzacji inkubować przez 24 godziny w temperaturze 65 °C. Uwaga: Próbki mogą być hybrydyzowane przez okres do 72 godzin, ale muszą sprawdzić, czy przedłużona hybrydyzacja nie powoduje nadmiernego parowania w dołkach na próbki.
  8. Przygotowanie kulek magnetycznych pokrytych streptawidyną
    1. Wstępnie rozgrzany bufor mycia 2 w temperaturze 65 °C w łaźni wodnej lub bloku grzewczym.
    2. Energicznie ponownie zawiesić kulki magnetyczne Streptawidyny w mieszalniku wirowym. Koraliki magnetyczne osiadają podczas przechowywania.
    3. Do każdej próbki hybrydyzacji dodać 50 μl zawieszonych kulek do dołków płytki PCR.
    4. Umyj kulki i ponownie zamieszaj je w 200 μl buforu wiążącego.
  9. Wychwytywanie zhybrydyzowanego DNA za pomocą kulek streptawidyny.
    1. Oszacuj i zapisz objętość roztworu hybrydyzacyjnego, która pozostaje po 24 godzinnej inkubacji.
    2. Utrzymać płytkę do hybrydyzacji w temperaturze 65 °C i za pomocą pipety wielokanałowej przenieść całą objętość (około 60 μl) każdej mieszaniny hybrydyzacyjnej do dołków płytki zawierających 200 μl przemytych kulek streptawidyny. Dobrze wymieszaj, powoli pipetując w górę i w dół 3 do 5 razy.
    3. Zakryj studzienki i inkubuj płytkę wychwytującą na mieszalniku nutatorowym lub równoważnym przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że próbki są prawidłowo wymieszane w studzienkach.
    4. Krótko odwirować płytkę wychwytującą w wirówce lub wirówce do minipłytek.
    5. Umieść płytkę przechwytującą w separatorze magnetycznym, aby zebrać kulki z zawiesiny. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad.
    6. Ponownie zawiesić kulki w 200 μl buforu do płukania 1. Mieszać, pipetując w górę i w dół, aż kulki zostaną całkowicie zawieszone.
    7. Krótko odwirować w wirówce lub mini-wirówce płytkowej.
    8. Umieść płytkę w separatorze magnetycznym.
    9. Poczekaj, aż roztwór się klaruje, a następnie usuń i wyrzuć supernatant.
  10. Przetwarzanie próbek po przechwyceniu na potrzeby sekwencjonowania multipleksowego
    1. Przygotować odpowiednią objętość mieszaniny reakcyjnej PCR, mieszając następujące elementy: 9 μl wody wolnej od nukleaz, 25 μl Master Mix i 1 μl Primer Mix w zależności od liczby amplifikacji. Dobrze wymieszaj za pomocą miksera wirowego i trzymaj na lodzie.
    2. Dla każdej reakcji amplifikacji umieścić 35 μl mieszaniny reakcyjnej PCR z kroku 3.10.1 w dołkach płytki PCR.
    3. Odpipetować każdą z pobranych próbek z puli bibliotecznej w górę i w dół, aby upewnić się, że zawiesina kulek jest jednorodna.
    4. Dodać 15 μl każdej przechwyconej zawiesiny kulek w puli bibliotecznej do odpowiedniej mieszaniny reakcyjnej PCR. Dokładnie wymieszać pipetując, aż zawiesina kulek będzie jednorodna.
    5. Umieścić płytkę przygotowaną w pkt 3.10.2 w termocyklerze i uruchomić następujący program amplifikacji PCR: 98 °C przez 2 minuty, 8-11 cykli w temperaturze 98 °C przez 30 s, 60 °C przez 30 s i 72 °C przez 1 minutę, a następnie końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 10 minut. Utrzymać próbki w temperaturze 4 °C.
    6. Oczyść próbkę za pomocą oczyszczania na bazie kulek zgodnie z protokołem producenta.
    7. Oceń jakość za pomocą bioanalizatora zgodnie z protokołem producenta.
  11. Przygotowanie próbek do sekwencjonowania multipleksowego
    UWAGA: Końcowe wzbogacone próbki zawierają pule 8 lub 16 indeksowanych bibliotek, w zależności od rozmiaru biblioteki przechwytywania i wynikającej z niej strategii łączenia przed przechwyceniem. Całkowita liczba indeksowanych bibliotek, które mogą być multipleksowane na jednym torze sekwencjonowania, jest określana przez specyfikacje wyjściowe używanej platformy, wraz z ilością danych sekwencjonowania wymaganych dla biblioteki przechwytywania.
    1. Oblicz liczbę indeksów, które można połączyć na pas ruchu, w zależności od pojemności platformy. Całkowita liczba indeksowanych bibliotek, które mogą być multipleksowane na jednym torze sekwencjonowania, jest określana przez specyfikacje wyjściowe używanej platformy, wraz z ilością danych sekwencjonowania wymaganych dla biblioteki przechwytywania. Na przykład w przypadku biblioteki Human All Exon v5 zalecane dane sekwencjonowania na indeksowaną bibliotekę to 4 GB, a zalecane dane sekwencjonowania na pulę wstępnego przechwytywania to 32 GB (pule z 8 indeksami).
  12. Uporządkuj biblioteki w kolejności.
    1. Załaduj biblioteki na wybraną platformę sekwencjonowania nowej generacji i wykonaj sekwencjonowanie zgodnie ze specyfikacją urządzenia.
  13. Analizuj dane sekwencjonowania egzomu.
    1. Uruchom potok i wybrane oprogramowanie do dzwonienia do bazy. Na przykład, użyj Stampy'ego do mapowania reads20, usuń duplikaty za pomocą Picarda (http://broadinstitute.github.io/picard/) i zidentyfikuj polimorfizmy pojedynczych nukleotydów oraz insercję lub delecję zasad (indels) za pomocą Platypus21. Filtruj warianty synonimiczne i te obserwowane z częstością alleli <5% i porównaj dane z tymi z egzomu rodzicielskiego, aby zidentyfikować warianty de novo.

4. Przygotowanie plazmidowego DNA do elektroporacji in utero

  1. Zaprojektuj kilka krótkich spinek do włosów RNA (shRNA) ukierunkowanych na sekwencję kodującą lub 3'UTR genów kandydujących, jak opisano wcześniej22.
  2. Aby zapobiec efektom niepożądanym, przetestuj swoistość shRNA za pomocą BLAST, przeszukaj bazy danych przy użyciu standardowych metod. Wyklucz shRNA wykazujące więcej niż 50% komplementarności z innymi genami szczurów.
  3. Sklonuj wyżarzane oligonukleotydy do wektora mU6-pro, jak opisano wcześniej23.
  4. Oczyść plazmidowe DNA za pomocą Maxi-prep zgodnie z instrukcjami producenta i uzyskaj końcowe stężenie 3 μg/μL.
  5. Podaniec 20 μl DNA (0,5 mg/ml pCAGGS-GFP samodzielnie lub z 1,5 mg/ml konstruktu shRNA) i dodać 2 μl Fast Green Dye (2 mg/ml), aby umożliwić wizualne monitorowanie wstrzyknięcia.

5. Elektroporacja in utero

  1. Zabiegu chirurgicznego
    1. Znieczulenie ciężarnych samic szczurów E15,5 (E0 zdefiniowano jako dzień potwierdzenia obecności czopa pochwowego z dodatnim wynikiem plemników), stosując kombinację z mieszaniną ketaminy/ksylazyny (odpowiednio 0,1 i 0,01 mg na masę ciała), którą podaje się we wstrzyknięciu dootrzewnowym w celu indukcji znieczulenia.
    2. Upewnij się, że zwierzę jest w pełni znieczulone, obserwując zanik odruchu szczypania palców u stóp.
    3. Ogol dolną część brzucha zwierzęcia za pomocą maszynki do strzyżenia, aby usunąć sierść. Zdezynfekuj skórę za pomocą peelingów z jodowidonu i 70% alkoholu. Nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu pod narkozą.
    4. Umieść zwierzę na źródle ciepła i umieść sterylną serwetę (z otwartym oknem 4 - 5 cm pośrodku) na miejscu nacięcia. Noś maski na twarz, fartuch laboratoryjny, czepki i sterylne rękawice chirurgiczne. Zachowaj sterylność do końca zabiegu.
    5. Za pomocą ostrych nożyczek wykonaj pionowe nacięcie (2 - 2,5 cm) w skórze wzdłuż linii środkowej w brzuchu ogonowym, a następnie wykonaj nacięcie ściany mięśniowej pod skórą - również o długości 2,5 cm - wzdłuż linii środkowej.
    6. Ostrożnie odsłoń jeden róg macicy z jamy brzusznej. Upuść 37 °C wstępnie podgrzany roztwór soli fizjologicznej, aby nawilżyć zarodki. Utrzymuj macicę wilgotną przez cały czas.
  2. Iniekcja DNA i elektroporacja
    1. Delikatnie przytrzymaj jeden z rogów macicy za pomocą obrączkowanych kleszczy i ostrożnie dociśnij jeden zarodek do ściany macicy. Trzymaj zarodek w jednej ręce, a drugą ręką ostrożnie włóż szklane naczynia włosowate w odległości 1 mm od linii środkowej do lewej bocznej komory (o głębokości 2-3 mm) i wstrzyknij około 1 μl DNA za pomocą Fast Green, aby umożliwić wizualne monitorowanie wstrzyknięcia za pomocą mikrowstrzykiwacza.
    2. Upuść normalny roztwór soli fizjologicznej na powierzchnię elektrod 3 x 7 mm2. Umieścić dodatnią sterylną elektrodę po stronie wstrzyknięcia (lewa boczna komora), a ujemną sterylną elektrodę po prawej komorze. Dostarczaj 5 impulsów elektrycznych w odstępach 950 ms za pomocą pedału sterowanego nożnie (kondensator 4000 mF ładowany do 40 V za pomocą elektroporatora).
  3. Zabiegi po elektroporacji
    1. Włóż rogi macicy z powrotem do jamy brzusznej, dodaj krople normalnego roztworu soli fizjologicznej do jamy, aby umożliwić zarodkom bardziej naturalne ustawienie i uwzględnić śródoperacyjną utratę płynów.
    2. Zamknij ścianę mięśni brzucha wchłanialnymi szwami chirurgicznymi, a następnie skórę za pomocą szwu o prostym przerwaniu.
    3. Umieść szczura z powrotem w klatce i monitoruj zwierzę, aż wyjdzie ze znieczulenia.
    4. W celu leczenia bólu należy podawać zwierzęciu buprenorfinę (0,03 mg/kg) we wstrzyknięciu podskórnym co 8 - 12 godzin, przez okres do 48 godzin.

6. Przygotowanie próbki mózgu

  1. Metoda utrwalania
    1. Ciężarną szczur należy złożyć w ofierze 5 dni po zabiegu chirurgicznym za pomocą znieczulenia gazowego (izofluranu), a następnie szybkiego zwichnięcia szyjki macicy.
    2. Wykonaj pionowe nacięcie, aby ponownie otworzyć jamę brzuszną.
    3. Odsłoń rogi macicy, usuń zarodki z macicy i odetnij je ostrymi nożyczkami.
    4. Usuń mózg z minimalnym uszkodzeniem tkanki: za pomocą ostrych nożyczek wykonaj małe nacięcie wzdłuż tylnej (móżdżek) / przedniej (opuszki węchowe) głowy, aby przebić skórę i czaszkę, a następnie za pomocą kleszczy oderwij czaszkę, aby odsłonić mózg i usuń go za pomocą małej szpatułki.
    5. Zanurz mózgi na noc w temperaturze 4 °C w 4% paraformaldehydzie w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
  2. Sekcja mózgu
    1. Myj mózgi w 1x PBS przez 10 min.
    2. Osadź mózgi w 4% agarze w plastikowych foremkach do zatapiania.
      1. Przygotuj 50 ml 4% agaru w 1x PBS do osadzenia 5 embrionalnych mózgów. Upewnij się, że rozpuszczona agaroza ma temperaturę nie wyższą niż 50 °C.
    3. Utrzymuj mózgi w agarozie do polimeryzacji przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 4°C. Usuń nadmiar agarozy z mózgu.
    4. Przyklej mózg do płytki podstawy wibratomu, zorientowanej tak, aby przednia/tylna oś mózgu była prostopadła do ostrza. Poczekaj kilka minut, aż klej wyschnie i umieść płytkę z przyklejonym mózgiem w komorze wibratomowej.
    5. Napełnij wibratomem 1x PBS. Pokrój odcinki o grubości 100 μm.
    6. Przenieś plasterki mózgu na szkiełka, usuń nadmiar płynu, dodaj kilka kropli podłoża montażowego i umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu mózgów

7. Obrazowanie konfokalne i analiza ilościowa

  1. Pozostaw podłoże montażowe do wyschnięcia na noc przed obrazowaniem. Wycinki obrazu z powiększeniem 10X na laserowo-skaningowym mikroskopie konfokalnym.
  2. Korzystając z oprogramowania do ilościowej analizy obrazu, przekonwertuj obraz na 8-bitowy, wybierz jedną reprezentatywną dodatnią komórkę fluorescencyjną GFP i ręcznie zdefiniuj jej kształt. Aby to zrobić, kliknij "Oszacowaj" i narysuj granicę komórki za pomocą narzędzia do zaznaczania odręcznego. W ten sposób próg średnicy i intensywności ogniwa jest automatycznie zachowywany przez oprogramowanie.
  3. Kliknij "Znajdź komórki", aby umożliwić oprogramowaniu zlokalizowanie transfekowanych komórek w całej korze mózgowej. Następnie, w razie potrzeby, ręcznie usuń wyniki fałszywie dodatnie.
  4. Podziel całą grubość kory na 8 obszarów zainteresowania znormalizowanych w poszczególnych sekcjach. Aby to osiągnąć, kliknij "Narzędzie regionu", wybierz 8 "Paski regionu", gdzie pierwszy (1) i ostatni (8) pasek odpowiadają odpowiednio VZ i górze CP. Kliknij "Zastosuj", aby umożliwić oprogramowaniu policzenie względnej pozycji komórek transfekowanych GFP w całej korze mózgowej. Na koniec kliknij "Zapisz kwantyfikację", aby wyeksportować dane do pliku Excel do analizy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Strategia eksperymentalna zaprojektowana w celu identyfikacji nowych genów sprawczych MCD została przedstawiona na Rysunku 1.

Przeprowadzając badanie array-CGH w kohorcie 155 pacjentów z rozwojowymi wadami mózgu, u których występowała zmienna kombinacja PNH (Rysunek 2A), dysgenezji ciałamóżgowatego, kolpocefalii, hipoplazji móżdżku oraz polimikrogirii związanej z epilepsją, ataksją i upośledzeni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

MCD są ważnymi przyczynami niepełnosprawności intelektualnej i odpowiadają za 20-40% lekoopornej padaczki dziecięcej 1,2. Zainteresowanie MCD gwałtownie wzrosło w ciągu ostatniej dekady w wyniku dwóch głównych czynników. Pierwszym z nich jest poprawa obrazowania mózgu (w szczególności rezonansu magnetycznego), które pozwala lekarzom i naukowcom na wizualizację wielu wad rozwojowych mózgu, które wcześniej nie były rozpoznawane. Drugim jest ewolucja narzędzi genety...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Dr. G. McGillivrayowi, Pr. J. Clayton-Smithowi, Pr. W.B. Dobynsowi, Pr. P. Striano, Pr. I.E. Schefferowi, Pr. S.P. Roberstonowi i Pr. S.F. Berkovicowi za pomoc pacjentom z MCD. Dziękujemy dr F. Michelowi i D. Mei za porady techniczne i pomoc. Prace te zostały sfinansowane przez fundusze z Siedmiu Programów Ramowych UE, projekt DESIRE, numer umowy: Health-F2-602531-2013, (dla V.C., R.G., A.R., A.F. i C.C.), INSERM (dla A.R. i C.C.), Fondation Jérôme Lejeune (R13083AA dla A.F, E.P.P i C.C) oraz Région Provence Alpes Côte d'Azur (APO2014 - DEMOTIC dla C.C. i A.A.D.). D.A.K jest Młodym Badaczem EMBO i jest wspierany przez granty FWF (I914 i P24367).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Picospritzer IIIParker Hannifin CorpP/N 051-0500-900Wewnątrzkomórkowe systemy dozowania mikroiniekcji
Fast Green FCFSigma-AldrichF7252Fast green umożliwiają wizualne monitorowanie wtrysku
Elektroporator BTX ECM 830Aparat BTX Harvard45-0002ECM 830 to generator impulsów fali prostokątnej przeznaczony do zastosowań
in vitro i in vivoMikrotom HM 650 VMicrom10076838Microtome HM 650 V wibratom 240V 50/60Hz z ostrzem wibracyjnym
FluoView 300Olympus OlympusFluoViewTM 300 to konfokalny laserowy mikroskop skaningowy przeznaczony do zastosowań badawczych w biologii
Oprogramowanie eCELLenceTechnologie Vision TechnologieeCELLence to oprogramowanie przeznaczone do ilościowej analizy migracji komórek
skanerów mikromatrycowych AgilentSzkiełka podstawowe
do 1 x 244K, 2 x 105K, 4 x 44K lub 8 x 15KAgilentAgilent p/n G4900DA, G2565CA lub G2565BA
dla 1 x 1M, 2 x 400K, 4 x 180K lub 8 x 60KAgilentAgilent p/n G4900DA lub G2565CA
Komora do hybrydyzacji, nierdzewnaAgilentAgilent p/n G2534AKomora do hybrydyzacji
matrycowej CGHProwadnice uszczelkowe komory hybrydyzacyjnej, 5-pakUszczelka do matrycy Hybrydyzacja CGH
do mikromacierzy 1-pak lubAgilentAgilent p/n G2534-60003
do mikromacierzy 2-pak lubAgilentAgilent p/n G2534-60002
do mikromacierzy 4-pak lubAgilentAgilent p/n G2534-60011
do mikromacierzy 8-pakAgilentAgilent p/n G2534-60014
Piec do hybrydyzacjiAgilentAgilent p/n G2545A Rotator pieca
do hybrydyzacji do komór hybrydyzacyjnych Agilent Microarray AgilentAgilentp/n G2530-60029
Termocykler z podgrzewaną pokrywąAgilentAgilent p/n G8800A lub równoważnyTermiczny cykler do inkubacji
1,5 ml Probówka do mikrofuge bez RNazAmbionp/n AM12400 lub równoważnyMikrowirówka
Mieszadło magnetyczneCorningp/n 401435 lub równoważnyPrzyrząd do mieszania
Fluorometr kubitowyTechnologiesp/n Q32857Przyrząd do oznaczania ilościowego DNA Zestaw do oznaczania ilościowego
Qubit dsDNA BR, do użytku z fluorometrem QubitInvitrogenp/n Q32850Zestaw do fluorometru kubitowego
UV-VIS spektrofotometrThermo ScientificNanoDrop 8000 lub 2000 lub równoważnyPrzyrząd do oznaczania ilościowego DNA
Pipety P10, P20, P200 i P1000Pipetman lub równoważnyDozowanie DNA
Koncentrator próżniowyThermo Scientificp/n Odpowiednik DNA120-115 lub
Instrument		do koncentracji DNA
SureTag Kompletny zestaw do znakowania DNAAgilentp/n 5190-4240Zestaw do etykietowania DNA (dla próbek ludzkich)
Kolumny oczyszczające (50 sztuk)Agilentp/n 5190-3391(do próbek ludzkich)
AutoScreen A, płytki 96-dołkoweGE Healthcarep/n 25-9005-98Zestaw do etykietowania DNA (dla próbek ludzkich)
Zestaw do czyszczenia GenElute PCR Zestaw do etykietowaniaSigma-Aldrichp/n NA1020(dla próbek ludzkich)
Genomika człowieka Zestawp/n G1521(dla próbek ludzkich)
Do mikromacierzy CGH:Promega(żeński) lub p / n G1471 (męski)Tablica Kontrola DNA
CGH Dla mikromacierzy CGH + CGH:Coriellp/n NA18507, NA18517, NA12891, NA12878 lub NA18579Array CGH control DNA
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer Kit lubAgilentp/n 5188-5226Array CGH hybrydyzacja i mycie
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 iAgilentp/n 5188-5221Array CGH hybrydyzacja i mycie
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 2Agilentp/n 5188-5222Array CGH hybridization and wash
Stabilizacja i suszenie RoztwórAgilentp/n 5185-5979Array CGH hybrydyzacja i mycie
Zestaw do hybrydyzacji Oligo aCGH/ChIP-on-chipAgilentNr części 5188-5220 (25) lub nr części 5188-5380 (100)Matryca CGH hybrydyzacja i mycie
DNA ludzkiego Cot-1Agilentp/n 5190-3393Matryca CGH hybrydyzacja i mycie
Skaner Agilent CSkaner Agilentdo szkiełek matrycowych CGH
ZestawZestaw do wzbogacania celu
Platforma HiSeq (HSQ), 16 próbekAgilentp/n G9621A
Platforma HiSeq (HSQ), 96 próbekAgilentp/n G9621B
Platforma HiSeq (HSQ), 480 próbekAgilentp/n G9621C
Platforma MiSeq (MSQ), 16 próbekAgilentp/n G9622A
Platforma MiSeq (MSQ), 96 próbekAgilentp/n G9622B
Platforma MiSeq (MSQ), 480 próbekAgilentp/n G9622C
Zestaw DNA 1000Agilentp/n 5067-1504Zestaw do separacji, wymiarowania i oznaczania ilościowego fragmentów dsDNA od 25 do 1000 pz.
Zestaw DNA o wysokiej czułościAgilentp/n 5067-4626Zestaw do analizy fragmentarycznego DNA lub bibliotek DNA.
Zestaw AMPure XP Kitdo automatycznego oczyszczania PCR.
5 mlAgencourtp/n A63880
60 mlAgencourtp/n A63881
450 mlAgencourtp/n A63882
Dynabeads MyOne Streptawidyna T1Izolacja i postępowanie z biotynylowanymi kwasami nukleinowymi
2 mlLife TechnologiesCat #65601
10 mlLife TechnologiesCat #65602
Zestaw testowy Quant-iT dsDNA BR, do fluorometruKwantyfikacja DNA
100 testów, 2-1000 ngLife TechnologiesCat #Q32850
500 testów, 2-1000 ngLife TechnologiesCat #Q32853
probówki do testów kubitowychTechnologiesp/n Q32856Kwantyfikacja DNA
Biblioteki przechwytywania SureSelec tXT2Agilentw zależności od eksperymentuZestaw do przechwytywania
bibliotek SureCycler 8800 Thermal CyclerAgilentp/n G8800AAmplifikacja DNA
Moduł 96-dołkowy do SureCycler 8800 Thermal CyclerAgilentp/n G8810AAmplifikacja DNA
SureCycler 8800-kompatybilna z SureCycler 8800Agilentp/n 410088Amplifikacja DNA
Pasek optyczny czapkiAgilentp/n 401425amplifikacja DNA
Paski nasadki do probówek, wypukłeAgilentp/n 410096amplifikacja DNA
Maty kompresyjneAgilentp/n 410187Amplifikacja DNA
2100 Bioanalyzer Laptop BundleAgilentp/n G2943CAAmplifikacja DNA
2100 Bioanalizator Zestaw do elektroforezyAgilentp/n G2947CAAmplifikacja DNA
System przygotowania próbek Covaris, seria E lub seria SŚcinanie DNACovaris
Uchwytyp/n 520078ścinanie DNA
Mieszalnik płytkowyBD Diagnosticsp/n 421105 lub równoważnyMieszalnik płytek
GaIIxIlluminamaszyna do sekwencjonowania nowej generacji
Pakiet Life Zestaw do etykietowania DNA DNA do znakowania DNA odczynników SureSelect XT2 Qubit Life na próbki Covaris

Bibliografia

  1. Meencke, H. J., Veith, G. Migration disturbances in epilepsy. Epilepsy Res. 9, 31-39 (1992).
  2. Shorvon, S., Stefan, H. Overview of the safety of newer antiepileptic drugs. Epilepsia. 38 (1), 45-51 (1997).
  3. Parrini, E., et al. Periventricular heterotopia: phenotypic heterogeneity and correlation with Filamin A mutations. Brain. 129 (7), 1892-1906 (2006).
  4. Fox, J. W., et al. Mutations in filamin 1 prevent migration of cerebral cortical neurons in human periventricular heterotopia. Neuron. 21 (6), 1315-1325 (1998).
  5. Sheen, V. L., et al. Mutations in ARFGEF2 implicate vesicle trafficking in neural progenitor proliferation and migration in the human cerebral cortex. Nat Genet. 36 (1), 69-76 (2004).
  6. Cappello, S., et al. Mutations in genes encoding the cadherin receptor-ligand pair DCHS1 and FAT4 disrupt cerebral cortical development. Nat Genet. 45 (11), 1300-1308 (2013).
  7. Moro, F., et al. Periventricular heterotopia in fragile X syndrome. Neurology. 67 (4), 713-715 (2006).
  8. Ferland, R. J., Gaitanis, J. N., Apse, K., Tantravahi, U., Walsh, C. A., Sheen, V. L. Periventricular nodular heterotopia and Williams syndrome. Am J Med Genet A. 140 (12), 1305-1311 (2006).
  9. van Kogelenberg, M., et al. Periventricular heterotopia in common microdeletion syndromes. Mol Syndromol. 1 (1), 35-41 (2010).
  10. Sheen, V. L., et al. Periventricular heterotopia associated with chromosome 5p anomalies. Neurology. 60 (6), 1033-1036 (2003).
  11. Neal, J., Apse, K., Sahin, M., Walsh, C. A., Sheen, V. L. Deletion of chromosome 1p36 is associated with periventricular nodular heterotopia. Am J Med Genet A. 140 (15), 1692-1695 (2006).
  12. Cardoso, C., et al. Periventricular heterotopia, mental retardation, and epilepsy associated with 5q14.3-q15 deletion. Neurology. 72 (9), 784-792 (2009).
  13. Cellini, E., et al. Periventricular heterotopia with white matter abnormalities associated with 6p25 deletion. Am J Med Genet A. 158 (7), 1793-1797 (2006).
  14. Bertini, V., De Vito, G., Costa, R., Simi, P., Valetto, A. Isolated 6q terminal deletions: an emerging new syndrome. Am J Med Genet A. 140 (1), 74-81 (2006).
  15. Dobyns, W. B., et al. Consistent chromosome abnormalities identify novel polymicrogyria loci in 1p36.3, 2p16.1-p23.1, 4q21.21-q22.1, 6q26-q27, and 21q2. Am J Med Genet A. 146 (13), 1637-1654 (2008).
  16. Conti, V., et al. Periventricular heterotopia in 6q terminal deletion syndrome: role of the C6orf70 gene. Brain. 136 (11), 3378-3394 (2013).
  17. Sheen, V. L., et al. Etiological heterogeneity of familial periventricular heterotopia and hydrocephalus. Brain Dev. 26 (5), 326-334 (2004).
  18. Jaglin, X. H., et al. Mutations in the beta-tubulin gene TUBB2B result in asymmetrical polymicrogyria. Nat. Genet. 41 (6), 746-752 (2009).
  19. Falace, A., et al. TBC1D24 regulates neuronal migration and maturation through modulation of the ARF6-dependent pathway. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (6), 2337-2342 (2014).
  20. Lunter, G., Goodson, M. Stampy: a statistical algorithm for sensitive and fast mapping of Illumina sequence reads. Genome Res. 21 (6), 936-939 (2011).
  21. Pagnamenta, A. T., et al. Exome sequencing can detect pathogenic mosaic mutations present at low allele frequencies. J Hum Genet. 57 (1), 70-72 (2012).
  22. Yu, J. Y., DeRuiter, S. L., Turner, D. L. RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (9), 6047-6052 (2002).
  23. Bai, J., et al. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nat Neurosci. 6 (12), 1277-1283 (2003).
  24. Carabalona, A., et al. A glial origin for periventricular nodular heterotopia caused by impaired expression of Filamin-A. Hum Mol Genet. 21 (5), 1004-1017 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Rozwój kory mózgowejmigracja neuronówperiwentrykularna heterotopia guzkowagen C6orf70mikroskopia konfokalnailościowy PCR
Nowatorska strategia łącząca macierz CGH, sekwencjonowanie całego eksomu i elektroporację in utero u gryzoni w celu identyfikacji genów odpowiedzialnych za wady rozwojowe mózgu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.