Charakterystyka tkanek po nowej metodzie dezagregacji do generowania mikroprzeszczepów skóry

Summary

Protokół opisuje nową metodę dezagregacji tkanek ludzkich i tworzenia autologicznych mikro-przeszczepów, które w połączeniu z gąbkami kolagenowymi dają początek ludzkim bio-kompleksom gotowym do użycia w leczeniu zmian skórnych. Co więcej, system ten zachowuje żywotność mikroprzeszczepów w różnym czasie po mechanicznej dezagregacji.

Abstract

W dziedzinie biotechnologii opracowano kilka nowych metod uzyskiwania autologicznych zawiesin komórkowych podczas operacji, aby zapewnić jednoetapowe leczenie ostrych i przewlekłych zmian skórnych. Ponadto leczenie przewlekłych, ale także ostrych ran powstałych w wyniku urazów, cukrzycy, infekcji i innych przyczyn pozostaje wyzwaniem. W niniejszej pracy opisano nową metodę tworzenia autologicznych mikroprzeszczepów z tkanki skórnej pojedynczego pacjenta oraz ich zastosowanie kliniczne. Ponadto przeprowadzono również biologiczną charakterystykę in vitro tkanki skórnej pochodzącej ze skóry, skóry właściwej pozbawionej naskórka (Ded) oraz skóry właściwej dawców wielonarządowych i/lub wielotkankowych. Wszystkie tkanki zostały zdezagregowane za pomocą tego nowego protokołu, co pozwoliło nam uzyskać żywotne mikroprzeszczepy. W szczególności informowaliśmy, że ten innowacyjny protokół jest w stanie tworzyć biokompleksy złożone z autologicznych mikroprzeszczepów i gąbek kolagenowych gotowych do zastosowania na zmiany skórne. Opisano również kliniczne zastosowanie autologicznych biokompleksów na zmianę nogi, wykazując poprawę zarówno procesu reepitalizacji, jak i miękkości zmiany. Ponadto nasz model in vitro wykazał, że żywotność komórek po mechanicznej dezagregacji za pomocą tego systemu utrzymuje się w czasie przez okres do siedmiu (7) dni hodowli. Za pomocą analizy cytometrii przepływowej zaobserwowaliśmy również, że pula komórek uzyskanych w wyniku dezagregacji składa się z kilku typów komórek, w tym mezenchymalnych komórek macierzystych, które odgrywają kluczową rolę w procesach regeneracji i naprawy tkanek, ze względu na ich wysoki potencjał regeneracyjny. Wreszcie, wykazaliśmy in vitro, że ta procedura utrzymuje sterylność mikroprzeszczepów podczas hodowli na szalkach agarowych. Podsumowując, dochodzimy do wniosku, że to nowe podejście regeneracyjne może być obiecującym narzędziem dla klinicystów do uzyskania w jednym kroku żywotnych, sterylnych i gotowych do użycia mikroprzeszczepów, które można stosować samodzielnie lub w połączeniu z najpopularniejszymi rusztowaniami biologicznymi.

Introduction

W ostatnich latach opracowano kilka nowych metod w dziedzinie biotechnologii, aby uzyskać autologiczne zawiesiny komórkowe podczas operacji, aby zapewnić jednoetapowe leczenie ostrych i przewlekłych zmian skórnych. Co więcej, leczenie ostrych, ale głównie przewlekłych ran powstałych w wyniku urazu, cukrzycy, infekcji i innych przyczyn pozostaje wyzwaniem. Istnieje coraz więcej dowodów na to, że rany przewlekłe stały się poważnym globalnym problemem zdrowotnym, powodując ogromne obciążenie finansowe dla systemów opieki zdrowotnej na całym świecie¹.

Aby zwiększyć wskaźnik sukcesu w leczeniu zmian skórnych, niezbędny jest brak rozległej manipulacji (w tym wzmacnianie komórek) i utrzymanie sterylnych warunków, aby stworzyć zawiesinę komórkową, która może być natychmiast nałożona na uszkodzony obszar pacjentów, unikając w ten sposób dłuższego przetwarzania w czystych pomieszczeniach, takich jak fabryki komórek. Począwszy od małych biopsji skóry, mielenie, wirowanie i inne metody separacji (np. enzymatyczne lub mechaniczne) są często stosowane w celu uzyskania zawiesiny komórkowej, którą można hodować w pożywce wzrostowej. Wszystkie te metody na ogół wymagają długiego czasu wykonania, obciążając struktury komórkowe i prowadząc do zmniejszenia żywotności komórek. Kolejnym istotnym aspektem jest uzyskanie autologicznej zawiesiny komórkowej gotowej do użycia przez klinicystów, na przykład do naprawy uszkodzonych obszarów. Ponadto dobrze wiadomo, że autologiczne przeszczepy tkankowe przeżywają procedury transferu, aby ostatecznie przetrwać w miejscu biorczym zgodnie z zasadami indukcji i przewodzenia ^{2, 3}. Idealna tkanka przeszczepu powinna być łatwo dostępna i mieć niską antygenowość oraz zachorowalność w miejscu dawczym ⁴.

Na podstawie tych dowodów, pierwszym celem tego badania było stworzenie autologicznych bio-kompleksów nadających się do klinicznego zastosowania w naprawie tkanek. W tym celu opisujemy nową metodę uzyskiwania autologicznych mikroprzeszczepów, zaczynając od tkanek skóry, które zostały zdezagregowane za pomocą tego protokołu. W niniejszym dokumencie opisano również przypadek jako kliniczne zastosowanie autologicznych mikroprzeszczepów uzyskanych za pomocą tego protokołu w połączeniu z gąbkami kolagenowymi. Podejście to zostało już uznane za skuteczne w mechanicznej dezagregacji tkanek ludzkich⁵ i było stosowane klinicznie do przeszczepów i regeneracji tkanek skóry właściwej ^6,7, a także do terapii regeneracyjnych tkanek łącznych w chirurgii jamy ustnej i szczękowo-twarzowej ^8-10.

Ponadto, drugim celem tego badania była biologiczna charakterystyka tkanek skórnych po ich dezagregacji za pomocą tego protokołu. W tym celu w Regionalnym Banku Skóry Emilia-Romania przetworzono różne homologiczne próbki tkanki skórnej pochodzące z obszaru tułowia różnych dawców wielonarządowych i/lub wielotkankowych zgodnie z krajowymi przepisami dotyczącymi pobierania, przetwarzania i dystrybucji tkanek do przeszczepów (CNT 2013).

PREZENTACJA PRZYPADKU:

35-letnia pacjentka wykazująca skomplikowany uraz spowodowany wypadkiem samochodowym została przyjęta na Oddział Intensywnej Terapii Szpitala w Ankonie. Pacjent wykazywał infekcję na nodze z powodu otwartej rany i złamania złożonego stabilizowanego zewnętrzną stabilizacją. Wykonano dwa radykalne oczyszczenia, a gdy rana stała się czysta po terapii podciśnieniowej (terapia V.A.C.), a okostna wydawała się zdrowa, zastosowaliśmy protokół po dwóch miesiącach od wyzdrowienia. Po dezagregacji za pomocą tego systemu, uzyskane mikroprzeszczepy wykorzystano do stworzenia biokompleksów z gąbką kolagenową, które następnie wszczepiono w celu zbadania ich skuteczności w naprawie zmiany.

Protocol

Oświadczenie etyczne: ponieważ kliniczne zastosowanie protokołu wymaga użycia autologicznej tkanki skórnej pacjenta, jego charakterystyka in vitro została przeprowadzona przed klinicznym użyciem na homologicznej tkance skórnej w Regionalnym Banku Skóry Emilia-Romania zgodnie z wytycznymi Krajowych Przepisów dotyczących pobierania, przetwarzania i dystrybucji tkanek do przeszczepu (CNT 2013).

1. Budynek biokompleksu do zastosowań klinicznych

UWAGA: Ten protokół jest klinicznie oparty na użyciu Rigeneracons (substantora tkankowego) i Rigenera Machine (systemu zaburzającego tkanki) (Rysunek 1A). Zaburzacz tkankowy to biologiczny medyczny zaburzacz tkanek ludzkich, zdolny do rozbijania małych fragmentów tkanek za pomocą siatki dostarczanej przez sześciokątne ostrza oraz komórki filtrujące i składniki macierzy zewnątrzkomórkowej z odcięciem około 50 mikronów.

1. Pobrać próbki skóry pacjenta za pomocą stempla biopsyjnego (ryc. 1B) i rozdrobnić, dodając 1 ml roztworu soli fizjologicznej na każdy fragment, aby uzyskać autologiczne mikroprzeszczepy ^6,7,9 (lub patrz krok 2.1).
2. Umieść 1 ml mikroprzeszczepów na gąbkach kolagenowych (ryc. 1C), aby utworzyć biokompleksy do wykorzystania do zastosowania klinicznego.
3. Hodowla kolejnych 1 ml mikroprzeszczepów na gąbkach kolagenowych w obecności 6 ml pożywki DMEM uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze 5% CO₂ .
4. Po 3 dniach hodowli utrwalić biokompleksy 0,3% paraformaldehydem przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Wlać parafinę za pomocą specjalnego dozownika bezpośrednio na próbkę. Uzyskać plastry za pomocą mikromu o grubości 5 μm i umieścić bezpośrednio w szkiełku podstawowym.
5. Plastry parafiny o wielkości 5 μm zanurzyć w szklance do analiz histologicznych, zawierającej 15 - 20 ml ksylenu (dostępny w handlu - mieszanina m-ksylenu (40 - 65%), p-ksylenu (20%), o-ksylenu (20%) i etylobenzenu (6 - 20%) oraz śladowe ilości toluenu, trimetylobenzenu, fenolu, tiofenu, pirydyny i siarkowodoru) na 3 minuty każdy.
6. Zanurz plastry w malejących gatunkach (100% do 70%) etanolu (100% etanolu przez 1 godzinę, 95% etanolu przez 1 godzinę, 80% etanolu przez 1 godzinę, 70% etanolu przez 1 godzinę), a następnie w wodzie dejonizowanej w celu odparafinowania i ponownego uwodnienia sekcji.
7. Zabarwić skrawki 1-2 ml 1g/l ematoksyliny przez 1-2 minuty, a następnie spłukać w wodzie, aby usunąć nadmiar ematoksyliny.
8. Skrawki barwić przez 4 - 5 minut roztworem alkoholowym Eozyny Y o stężeniu 1% zmieszanym z etanolem 70% i rozcieńczonym w wodzie.
9. Użyj 1 - 2 ml Eozyny Y na każdą sekcję szkiełka i spłucz pod bieżącą wodą z kranu.
10. Zanurz skrawki w rosnących gatunkach etanolu (patrz krok 1.6), a na koniec, po przejściu w ksylenie przez 1 godzinę, nakryj szkiełko z podłożem montażowym na bazie i obserwuj pod mikroskopem świetlnym przy 100-krotnym powiększeniu (rysunek 1D).

2. Zbieranie, dezagregacja i analiza in vitro tkanek

1. Za pomocą dermatomu należy pobrać niezależną tkankę skórną, brodawkowatą skórę właściwą pozbawioną naskórka (Ded) lub siatkowatą skórę właściwą (Dermis) o grubości odpowiednio 0,6 mm, 1 mm lub 2 mm z obszaru tułowia od 4 różnych dawców wielonarządowych i/lub wielotkankowych w wieku od 40 do 55 lat, zgodnie z krajowymi przepisami dotyczącymi pobierania, przetwarzania i dystrybucji tkanek do przeszczepu (CNT 2013).
   1. Delikatnie przepłucz wszystkie próbki w 0,9% roztworze NaCl, umieszczając je w naczyniu na wytrząsarce orbitalnej na 5 minut.
   2. Za pomocą dziurkacza do biopsji o średnicy 5 mm utwórz próbki o jednolitej średnicy z tkanki skórnej, Ded i skóry właściwej i zważ wszystkie próbki tkanek przed dezagregacją.
   3. Wprowadzić osiem, trzy lub cztery jednolite próbki tkanki skórnej, odpowiednio Ded lub Skóra właściwa, do substancji zaburzającej funkcjonowanie tkanek, dodając 1,5 ml roztworu soli fizjologicznej w celu dezagregacji.
   4. Przeprowadzić różne czasy dezagregacji dla wszystkich próbek tkanek, jak wskazano w tabeli 1.
   5. Jako kontrolę należy użyć odpowiedniej liczby biopsji stempla pochodzących z nienaruszonych próbek tkanek.
   6. Po dezagregacji mechanicznej odessać roztwór soli fizjologicznej zawierający mikroprzeszczepy i umieścić oddzielnie każdą próbkę w jednym dołku na płytce 12-dołkowej. Wykonaj ten sam protokół dla nienaruszonych biopsji stempla kontrolnego.
   7. Do każdej próbki dodać 1 ml pożywki RPMI 1640 uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i antybiotykami.
   8. Natychmiast oceń żywotność komórki. Do każdej studzienki zawierającej mikroprzeszczep (otrzymany przez jednoczesną dezagregację ośmiu, trzech lub czterech jednolitych próbek tkanki skórnej, odpowiednio Ded lub Skóra właściwa) dodać 1 ml pożywki zawierającej 0,5 mg/ml roztworu MTT (bromek 3-[4,5-dimetylotiazol-2-ylo]-2,5 difenylotetrazolu) i inkubować przez 3 godziny w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO₂ na powietrze. Wykonaj ten sam protokół dla nienaruszonych biopsji stempla kontrolnego.
   9. Po inkubacji usunąć całą pożywkę zawierającą MTT i dodać do każdej próbki 1 ml dimetylosulfotlenku (DMSO) na 10 minut.
   10. Przenieść każdą próbkę i DMSO do kuwety i odczytać z gęstością optyczną (OD) przy długości fali 570 nm za pomocą spektrofotometru. Obliczyć żywotność komórek jako stosunek absorbancji przy długości fali 570 nm do masy w gramach (gr) tkanki użytej przed dezagregacją. Wykonaj ten sam protokół dla nienaruszonych biopsji stempla kontrolnego.
2. Po mechanicznej dezagregacji odessać roztwór soli fizjologicznej zawierający mikroprzeszczep pochodzący z tkanki skórnej, próbek Ded i Skóry właściwej od jednego dawcy.
   1. Umieścić oddzielnie każdą próbkę w pojedynczym dołku na płytce 12-dołkowej lub w kolbie hodowlanej w celu przeprowadzenia odpowiednio badania żywotności komórek i analizy morfologicznej.
   2. Mikroprzeszczepy hodowlane dodać 1 ml (płytka 12-dołkowa) lub 5 ml (kolba hodowlana) pożywki RPMI 1640 uzupełnionej 10% FBS i antybiotykami w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%_CO2/powietrze przez 24 godziny lub 7 dni.
   3. Oceń żywotność komórek po 24 godzinach lub 7 dniach (powtórz kroki 2.1.8-2.1.10).
   4. Przeprowadzić analizę morfologiczną oceniającą obecność zawiesiny komórkowej za pomocą mikroskopii świetlnej po 24 godzinach i 7 dniach hodowli w kolbie.
   5. Przeanalizuj próbki skóry właściwej pod kątem dodatniego wyniku dla markerów komórek mezenchymalnych i krwiotwórczych, w tym antygenów CD146, CD34 i CD45 za pomocą analizy FACS ⁶.
   6. Pod kapturem z przepływem laminarnym wysiewa się każdy mikroprzeszczep (otrzymany przez jednoczesną dezagregację ośmiu, trzech lub czterech jednolitych próbek tkanki skórnej, odpowiednio Ded lub Dermis) i odpowiadający mu mały fragment każdej próbki tkanki, która nie jest całkowicie zdezagregowana (>50 mikronów wielkości po procesie dezagregacji) na płytce agarowej Columbia zawierającej 5% bulionu z krwi owczej 100 μl.
   7. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez trzy dni i przeprowadzić analizę mikrobiologiczną na płytce z agarem Columbia w celu oceny sterylności¹¹.

Results

W tym wstępnym badaniu, pierwszym celem było zbadanie zdolności ludzkich autologicznych mikro-przeszczepów w połączeniu z biologicznym wsparciem, takim jak kolagen, do wytwarzania bio-kompleksów gotowych do użycia. Te biokompleksy wszczepiono pacjentowi ze zmianą w nodze spowodowaną wypadkiem samochodowym (ryc. 2A) i zaobserwowano całkowitą reepitelializację związaną z naprawą tkanek po 30 dniach (ryc. 2B). Co więcej, obs...

Discussion

To wstępne badanie wykazało, że mikroprzeszczepy uzyskane za pomocą tego protokołu można łączyć z gąbkami kolagenowymi, jak już opisano w innych zastosowaniach klinicznych, w celu optymalizacji skuteczności implantów mikroprzeszczepów^{9, 10}. W szczególności w badaniu tym wykazano zdolność biokompleksów, składających się z mikroprzeszczepów i gąbek kolagenowych, do wspomagania gojenia się ran po zmianie nogi po 30 dniach od zastosowania klinicznego. Co więcej, wyniki in vitro dostarczają dowodów na skut...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rigenera Machine	Human Brain Wave	79210R
Rigeneracons	Ludzka fala mózgowa	79450S
MTT	Roche Diagnostic GmbH	11465007001
Medium RPMI	PBI International	733-2292
DMEM medium	PBI International	F 0415
Antybiotyki	biologiczne Branże PBI	03-038-1
Przeciwciała do analizy FACS	eBiosciences	kod 12-1469 dla CD146-P; kod 17-0349  dla CD34-APC
Agar Columbia	BioMerieux Company	43041
Condress®	Gąbka kolagenowa	Abiogen Pharma
DMSO	Bioniche Pharma USA LLC, Lake Forest, IL
roztwór NaCl	Fresenius Kabi, Bad Homburg, Niemcy
Ksylen	Carlo Erba