Method Article

Kwantyfikacja architektury naczyń mózgowych za pomocą mikroskopii dwufotonowej w mysim modelu zapalenia nerwów wywołanego przez HIV

DOI:

10.3791/53582

⸱

January 12th, 2016

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester Medical Center, 2Department of Human Genetics, University of Chicago

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł opisuje metodę, za pomocą której architektura naczyniowa w mózgu może być określona ilościowo za pomocą mikroskopii dwufotonowej in vivo i ex vivo.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zakażenie ludzkim wirusem niedoboru odporności 1 (HIV-1) często prowadzi do zaburzeń neuropoznawczych związanych z HIV-1 (HAND) i charakteryzuje się przewlekłym stanem neurozapalnym w obrębie ośrodkowego układu nerwowego (OUN), uważanym za głównie napędzany przez wirusową aktywację mikrogleju i makrofagów rezydujących w mózgu. Zakażeniu wirusem HIV-1 towarzyszą również zmiany w przepływie krwi w naczyniach mózgowych (CBF), co zwiększa prawdopodobieństwo, że przewlekłe zapalenie nerwów związane z HIV może prowadzić do zmian w CBF i/lub architekturze naczyń mózgowych. Aby odpowiedzieć na to pytanie, użyliśmy mysiego modelu zapalenia nerwów wywołanego przez HIV i sprawdziliśmy, czy długotrwałe narażenie na to środowisko zapalne może uszkodzić naczynia krwionośne mózgu i spowodować rozrzedzenie sieci naczyń włosowatych. W tym artykule opisano metodę ilościowego określania zmian gęstości naczyń włosowatych kory mózgowej w mysim modelu choroby neurozapalnej (myszy transgeniczne HIV-1 Tat). To uogólnione podejście wykorzystuje obrazowanie in vivo dwufotonowe naczyń włosowatych kory mózgowej przez cienkie okienko korowe czaszki, a także obrazowanie ex vivo dwufotonowe naczyń włosowatych kory mózgowej w wycinkach mózgu myszy. Procedury te generują obrazy i pliki z-stack sieci naczyń włosowatych, które można następnie poddać analizie ilościowej w celu oceny zmian w architekturze naczyń mózgowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzki wirus niedoboru odporności 1 (HIV-1) atakuje mózg podczas ostrej fazy infekcji wirusowej i produktywnie infekuje zarówno mikroglej, jak i makrofagi rezydujące w mózgu, prowadząc do ich aktywacji - i uwolnienia zarówno mediatorów stanu zapalnego pochodzących od gospodarza, jak i rozpuszczalnych wirusotoksyn HIV-1, takich jak Tat i gp120 (omówione w 1,2). W konsekwencji w OUN tworzy się przewlekły stan neurozapalny, który, jak się uważa, przyczynia się do patogenezy zaburzeń neuropoznawczych związanych z HIV-1 (HAND)3-5.

Wykazano, że

Wykazano, że przewlekła nadekspresja HIV-1 Tat lub interleukiny (IL)-17A w OUN myszy powoduje rozrzedzenie mikrokrążenia6,7. Stwarza to możliwość, że przewlekłe zapalenie układu nerwowego może przyczyniać się do patogenezy HAND poprzez wpływ na układ naczyniowy mózgu. Aby dokładniej zbadać tę kwestię, opracowaliśmy metody ilościowego określania struktur naczyniowych mózgu.

Ten artykuł opisuje metodę ilościowego określania liczby węzłów kapilarnych, segmentów kapilary, średniej długości segmentu, całkowitej długości segmentu, średniej średnicy kapilary i całkowitej objętości kapilary przy użyciu obrazowania in vivo sieci kapilarnych przez cienkie okienko korowe czaszki (zmodyfikowane z wcześniej opisanych protokołów)8,9, a także ex vivo obrazowanie wycinków mózgu przy użyciu mikroskopii dwufotonowej. To połączone podejście zapewnia holistyczną ocenę ilościową parametrów naczyń mózgowych, ponieważ okienko korowe cienkoczaszki in vivo pozwala na zachowanie środowiska mózgowego, podczas gdy obrazowanie ex vivo sieci naczyń włosowatych w wycinkach mózgu umożliwia rekonstrukcję kompletnych, trójwymiarowych sieci naczyń włosowatych - które można następnie określić ilościowo za pomocą dostępnego na rynku oprogramowania.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komitet Uniwersytecki ds. Zasobów Zwierzęcych Uniwersytetu w Rochester zatwierdził wszystkie procedury wykonane w tym artykule.

1. Przygotowanie przedoperacyjne (i myszy)

  1. Przygotuj obszar operacyjny ze wszystkimi wymaganymi urządzeniami. Wszystkie narzędzia używane podczas zabiegu należy wcześniej wysterylizować przy użyciu 70% etanolu. Opcjonalnie użyj sterylizatora z kulkami szklanymi lub autoklawu do sterylizacji narzędzi.
  2. Umieść mysz w komorze indukcyjnej izofluranu podłączonej do waporyzatora izofluranu. Ustawić poziom izofluranu na 4% z szybkością 1 l/min.
    Uwaga: w opisanych tutaj eksperymentach myszy z indukowanym doksycykliną (DOX) transgenem HIV-1 Tat napędzanym przez promotor białka fibrylarnego swoistego dla astrocytów (GFAP) (myszy HIV Tat-Tg)10 wykorzystano do zbadania wpływu zapalenia nerwów wywołanego przez HIV-1 na strukturę naczyń mózgowych, jak opisano wcześniej7,10.
  3. Delikatnie przechyl komorę indukcyjną, aby obserwować odruch prostowania myszy. Po stłumieniu odruchu prostowania należy ustawić poziom izofluranu na 2% i przekierować przepływ powietrza z komory indukcyjnej do stożka nosowego na stole operacyjnym.
  4. Szybko przenieś mysz z komory indukcyjnej na poduszkę grzewczą nasączoną wodą. Kontynuuj stosowanie izofluranu (1,5-2%) przez stożek nosowy. Dostosuj znieczulenie zgodnie z indywidualną tolerancją myszy ocenianą za pomocą monitorowania częstości oddechów (RR).
    Uwaga: Depresja RR może zaburzać fizjologiczne parametry gazów, zmieniając przepływ krwi w mózgu i ocenę średnicy naczyń. Staraj się utrzymywać RR na poziomie 55-65 oddechów na minutę. Tętno (HR) może być również wykorzystane do oceny głębokości znieczulenia; Utrzymuj tętno w zakresie 300-450 uderzeń na minutę, aby zapobiec fizjologicznym zmianom średnicy naczynia. Zazwyczaj znieczulenie będzie wystarczające w zakresie 1,5-2,0% izofluranu w dawce 1 l/min dla danej myszy.
  5. Wykonaj uszczypnięcie palca u nogi, aby dokładniej sprawdzić głębokość znieczulenia. Jeśli mysz nie reaguje, rozpocznij zabiegi chirurgiczne.

2. Przygotowanie okna czaszkowego z cienkoczaszką

  1. Nałóż sztuczny żel łzowy na oczy myszy. Całkowicie usuń włosy ze skóry głowy myszy za pomocą nożyczek lub elektrycznej maszynki do golenia.
  2. Wysterylizuj skórę głowy, stosując roztwór jodu powidonu; pozostaw do wyschnięcia. Następnie pod mikroskopem świetlnym usuń skórę ze skóry głowy myszy, całkowicie odsłaniając kości ciemieniowe, kości czołowe ogona i oznaczenie bregma.
  3. Nałóż niewielką ilość 10% roztworu chlorku żelaza na czaszkę, aby wysuszyć błony i ułatwić usunięcie. Usuń wysuszone błony za pomocą kleszczy #5/45, delikatnie zeskrobując czaszkę.
  4. Nałóż cienką warstwę kleju wokół okienka płyty czołowej. Delikatnie dociśnij główkę do czaszki myszy, utrzymując obszar zainteresowania na środku okna. Nałóż kroplę cementu dentystycznego na płytę główną, aby spolimeryzować klej.
  5. Nałóż cienką warstwę kleju wzdłuż krawędzi okienka płyty czołowej, aby stworzyć zbiornik, w którym można przechowywać sól fizjologiczną. Po wyschnięciu kleju przykręć główkę do uprzęży nagłówka myszy.
    Uwaga: uprząż nagłówka myszy używana w tej procedurze to konstrukcja z metalową podstawą i dwiema metalowymi kolumnami. Na każdej kolumnie znajduje się jedna sprężyna i jedna nakrętka motylkowa. Główkę umieszcza się na sprężynie, a nakrętkę motylkową dokręca się, aż głowica znajdzie się poziomo i nie będzie się poruszać.
  6. Usuń klej z szyby płyty czołowej za pomocą wiertła dołączonego do zestawu wierteł z mikromomentem obrotowym przy 6,000 obr./min. Zatrzymuj się co 10-15 sekund, aby zapobiec przegrzaniu czaszki myszy, co może spowodować uszkodzenie strukturalne naczyń.
    1. Za pomocą nowego wiertła umieść wiertło z mikromomentem 1.5 mm w bok od linii środkowej (jedna trzecia średnicy okienka głowicy). Zacznij rozrzedzać czaszkę w tym miejscu przy 4,000 obr./min. Delikatnie przesuwaj wiertło po czaszce, bez bezpośredniego nacisku w dół.
    2. Przerwij wiercenie co 10-15 sekund, aby zapobiec przegrzaniu czaszki myszy. W tym czasie usuń nagromadzony pył czaszki za pomocą kanistra ze sprężonym powietrzem.
    3. Użyj kropli soli fizjologicznej RT, aby schłodzić czaszkę przez 5-10 sekund. Delikatnie usuń cały płyn miękką tkanką, aby kontynuować rozrzedzenie czaszki.
  7. Aby ostatecznie przerzedzić czaszkę, umieść niewielką objętość soli fizjologicznej w zbiorniku na główce i delikatnie przeciągnij mikroostrzem dentystycznym po obszarze zainteresowania, aż małe naczynia będą wyraźnie widoczne.

3. Monitorowanie parametrów fizjologicznych

  1. Gdy czaszka zostanie całkowicie przerzedzona, odłącz mysz od uchwytu i połóż ją na plecach. Delikatnie przyklej taśmą obie tylne nogi, aby wyraźnie odsłonić przyśrodkowe uda.
  2. Usuń włosy z obu przyśrodkowych ud nożyczkami lub golarką elektryczną. Zdezynfekuj miejsce operowane, pokrywając uda jodonem powidonu.
  3. Uszczypnij skórę na przyśrodkowym prawym udzie powyżej żyły udowej i tętnicy za pomocą kleszczy #5. Delikatnie pociągnij skórę do góry i użyj nożyczek, aby przeciąć i usunąć skórę.
    Uwaga: lewe udo jest zarezerwowane na wypadek powikłań chirurgicznych (anomalie naczyniowe, pęknięte naczynka).
  4. Nanieś około 3-5 kropli 0,9% soli fizjologicznej na miejsce operowane. Pozwala to na większe powiększenie naczyń, a także utrzymanie nawilżenia miejsca i zapobieganie wysuszaniu naczynek. Oddziel żyłę udową od tętnicy, tępo przecinając pęczek nerwowo-naczyniowy kości udowej za pomocą dwóch kleszczy #5/45.
  5. Umieść dwa, 3 cm kawałki szwu chirurgicznego pod tętnicą udową w odległości około 1 cm od siebie. Przekręć górny szew zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby utworzyć naczyniową opaskę uciskową, która pomoże zapobiec nadmiernej utracie krwi podczas cewnikowania.
  6. Wykonaj małe nacięcie w tętnicy udowej za pomocą nożyczek sprężynowych. Umieść cewnik w tętnicy przez nacięcie i przesuwaj się, aż cewnik znajdzie się bezpiecznie w tętnicy.
  7. Odkręć górny szew (opaskę uciskową), aby ocenić szczelność i prawidłowe umieszczenie cewnika. Zabezpiecz cewnik w tętnicy udowej, zawiązując dwa węzły wokół cewnika w naczyniu za pomocą szwów.
  8. Wstrzyknąć 10 μl heparyny (100 j.m./ml) przez cewnik, aby zapobiec krzepnięciu krwi. Następnie chirurgicznie zamknij prawe udo, zszywając skórę razem z szwem 4-0 w prosty, przerywany wzór.
  9. Wstrzyknąć 50 μl uretanu (1,2 mg/g) dootrzewnowo w prawy dolny kwadrant. Pięć minut później powtórz z kolejnym wstrzyknięciem 50 μl do lewego dolnego kwadrantu, co daje w sumie 100 μl dootrzewnowego uretanu. Powoli zmniejszaj poziom izofluranu do około 0,25%, jednocześnie ponownie sprawdzając mysz pod kątem głębokości znieczulenia.
    Uwaga: Igła powinna być wbita powierzchownie w jamie otrzewnej wzdłuż tylnej ściany jamy brzusznej, tak aby nie przebijała jelita. Można to osiągnąć, odsuwając mięśnie proste brzucha od wnętrzności, a następnie wstrzykując.
  10. Za pomocą rurki kapilarnej pobrać 40 μl próbki krwi tętniczej z cewnika. Podłącz cewnik do przetwornika ciśnienia krwi wyposażonego w czterokierunkowy kran wypełniony solą fizjologiczną i strzykawkę wypełnioną heparyną.
  11. Przyklej przetwornik ciśnienia krwi do aparatu chirurgicznego, aby zapobiec niezamierzonemu usunięciu cewnika. Rozpocząć monitorowanie średniego ciśnienia tętniczego.
  12. Włóż rurkę kapilarną wypełnioną krwią do portu wejściowego analizatora parametrów krytycznych krwi. Po pobraniu całej krwi wyjmij rurkę kapilarną z portu wejściowego. Poziomy gazometriiO2 i CO2 we krwi pojawią się na papierze wydrukowanym z analizatora parametrów krytycznych krwi.

4. Wstrzykiwanie barwnika fluorescencyjnego

  1. Ściśnij skórę na przyśrodkowym lewym udzie za pomocą kleszczy #5. Delikatnie pociągnij skórę do góry i użyj nożyczek, aby przeciąć i usunąć skórę. Przygotować sprzężony z dekstranem barwnik rodaminy emitujący czerwień (70 kDa) (10 mg/kg rozpuszczony w soli fizjologicznej).
  2. Zlokalizuj żyłę udową. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z dołączoną igłą 30 G pobrać uprzednio przygotowany roztwór barwnika fluorescencyjnego odpowiedniego do obrazowania do linii 130 μl strzykawki. Usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza, całkowicie wciągając barwnik do strzykawki i mocno przesuwając ściankę strzykawki.
    1. Zegnij igłę 30 G pod kątem około 30 stopni, dociskając ją do twardej powierzchni ukośnie do góry. Napełnij igłę barwnikiem i wyrzuć nadmiar płynu, pozostawiając próbkę o objętości 100 μl.
  3. Powoli wstrzyknąć 100 μl próbki barwnika do żyły udowej. Po wyjęciu igły należy równomiernie, delikatnie uciskać miejsce wstrzyknięcia, aby zatamować krwawienie. Pozwól barwnikowi krążyć przez 5 minut.
    Uwaga: alternatywnie, prawa żyła udowa może być użyta zamiast wstrzyknięcia barwnika fluorescencyjnego, aby zapobiec dalszej utracie krwi poprzez utworzenie innego pola operacyjnego. Ponadto, jeśli zwierzę krwawi w niekontrolowany sposób z pola operacyjnego, może to oznaczać, że podano zbyt dużo heparyny, aby przepłukać cewnik. Jeśli w ciągu 10-15 minut nie wystąpi zakrzep, a mysz nadal krwawi, rozważ ponowne rozpoczęcie eksperymentu z nową myszką.
  4. Zamknij lewe udo, zszywając skórę szwem 4-0, a następnie ostrożnie przełóż mysz na brzuch i umieść ją w uprzęży nagłówka myszy.

5. Obrazowanie dwufotonowe in vivo

  1. Przenieś aparat chirurgiczny do mikroskopu dwufotonowego, upewniając się, że utrzymujesz ciągły poziom znieczulenia. Umieść niewielką ilość 0,9% soli fizjologicznej w zbiorniku na płycie głównej i opuść obiektyw mikroskopu tak, aby zetknął się z solą fizjologiczną. Zlokalizuj obszar zainteresowania za pomocą obiektywu z jasnością pola
  2. Ustaw wzbudzenie lasera dwufotonowego na długość fali odpowiednią dla barwnika fluorescencyjnego. Rozpocznij obrazowanie dwufotonowe za pomocą obiektywu 25x.
    Zauważ, że w tych eksperymentach użyliśmy dekstranu sprzężonego z emitującym czerwień barwnikiem rodaminy, który był wzbudzany na długości fali 780 nm. Do wykrywania autofluorescencji tętniczej zastosowano filtr emisyjny pasmowoprzepustowy 607/36 do wykrywania fluorescencji barwnika oraz filtr emisyjny pasmowoprzepustowy 480/20
  3. Zlokalizuj złoże kapilarne na ekranie widoku i powiększ ten obszar za pomocą zoomu optycznego 2. Uzyskaj obrazy naczyń włosowatych za pomocą oprogramowania do obrazowania dwufotonowego.
  4. Po zakończeniu obrazowania należy złożyć mysz w ofierze przez zwichnięcie szyjki macicy, a następnie ścięcie głowy.

6. Obrazowanie dwufotonowe ex vivo

  1. Za pomocą bardzo cienkich nożyczek wykonaj nacięcie na skórze głowy od kości międzyciemieniowych do kości czołowych myszy. Przymocuj skórę do boków czaszki za pomocą palca wskazującego i kciuka.
  2. Umieść bardzo cienkie nożyczki pod przyśrodkową kością międzyciemieniową i przetnij czaszkę wzdłuż szwu strzałkowego. Przerwać cięcie czaszki na około 3 mm po oznaczeniu bregma.
    Uwaga: Podczas cięcia czaszki należy wywierać nacisk w górę, aby zapobiec przecięciu mózgu.
  3. Za pomocą kleszczy #5 oddziel czaszkę od mózgu i ostrożnie usuń wszelkie opony mózgowe z powierzchni mózgu. Pozostałe opony mózgowe mogą przypadkowo uszkodzić mózg; Należy zachować szczególną ostrożność, aby tego uniknąć. Delikatnie wsuń kleszcze #5 pod mózg, posuwając się powoli do przodu, aż mózg uwolni się od czaszki.
    Uwaga: należy stosować nacisk w dół, aby uniknąć przebicia mózgu.
  4. Umieść mózg w narzędziu do cięcia mózgu przeznaczonym specjalnie dla myszy. Umyj mózg, nakładając krople sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego na mózg.
  5. Usuń 2 mm przekrój koronalny mózgu z bregma 0 do bregma -2. Umieść przekrój koronalny na wklęsłym szkiełku zawierającym sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy z bregmą 0 (najbardziej czaszkowa część sekcji) skierowaną do góry. Delikatnie przykryj plasterek mózgu szklanym szkiełkiem nakrywkowym.
    Uwaga: Unikaj naciskania szkła po umieszczeniu go w części mózgu, ponieważ może to zdeformować architekturę naczyń krwionośnych.
  6. Przenieś szkiełko do stolika mikroskopu i umieść niewielką ilość 0,9% soli fizjologicznej na szkiełku nakrywkowym. Obniż obiektyw mikroskopu, aż wejdzie w kontakt z solą fizjologiczną. Zlokalizuj linię środkową mózgu za pomocą obiektywu w jasnym polu.
  7. Rozpocznij obrazowanie dwufotonowe i ponownie zlokalizuj linię środkową za pomocą obiektywu 25x. Osiągnij to, szukając podłużnej szczeliny na korowej powierzchni odcinka koronalnego. Umieść prawą krawędź ekranu obrazowania na linii środkowej i przesuń ekran przeglądarki na bok o trzy pełne klatki (około 1,5 mm od linii środkowej).
    Należy zauważyć, że w tych eksperymentach parametry obrazowania były identyczne z tymi wymienionymi w notatce w kroku 5.2.
  8. Zlokalizuj głębokość, na której naczynia włosowate są ledwo widoczne na ekranie widoku. Obniż płaszczyznę ostrości o dodatkowe 20 μm, aby określić górną część stosu z.
  9. Ustaw grubość obrazu na 1 μm. Obniż ekran widoku o 100 μm i dostosuj moc lasera w całym obszarze tak, aby mniej niż 1% pikseli było przesyconych.
    Uwaga: obrazy z-stack są kompilowane z serii 100 kolejnych obrazów o wymiarach 500x500x1 μm. Im większy stos z, tym dokładniejsze będą obliczenia przetwarzania końcowego. Ogólnie rzecz biorąc, spróbuj zebrać stos z o wielkości 100 μm lub większej.
  10. Naciśnij ikonę XY Repeat, a następnie sąsiednią ikonę XY. Po zakończeniu tworzenia stosu z naciśnij ikonę Seria Gotowe i zapisz plik.

7. Przetwarzanie danych

  1. Otwórz obraz kapilarny in vivo w oprogramowaniu ImageJ. Ręcznie ustaw stosunek pikseli do odległości na podstawie wartości uzyskanych z oprogramowania dwufotonowego.
    1. Wybierz ikonę *straight* z menu narzędzi. Narysuj linię biegnącą od jednej ściany kapilary do przeciwległej ściany kapilary i zapisz długość podaną przez ImageJ.
      Należy pamiętać, że może być konieczne powiększenie obrazu, aby wyraźnie uwidocznić krawędzie ścian naczyń włosowatych.
    2. Powtórz krok 7.1.1 w różnych miejscach wzdłuż kapilary, a także dla wielu naczyń włosowatych na obrazie.
  2. Otwórz plik z-stack w oprogramowaniu analitycznym, takim jak Amira. Wybierz ikonę Edytora filamentów z paska narzędzi podaplikacji
    1. Ustaw grubość przeglądarki na około 20. Przesuń przeglądarkę na górę lub na dół stosu z.
    2. Wybierz ikonę Śledź i przesuń kursor na załadowany obraz. Umieść węzły na naczyniach włosowatych w miejscach opisanych na rysunku 2C; Segmenty pojawią się automatycznie między sąsiednimi węzłami. Śledź naczynia włosowate w całym stosie z.
      Uwaga: konieczne będzie umieszczenie węzłów między punktami końcowymi a punktami rozgałęzień, aby prześledzić kapilary w całym stosie z.
    3. Aby usunąć te węzły, kliknij ikonę Usuń pośrednie.
      Uwaga: Może to spowodować powstanie błędnych zapętlonych segmentów, które należy usunąć ręcznie, zaznaczając pętlę za pomocą ikony Wybierz pojedynczą, a następnie wybierając ikonę Usuń wybrane. Jeśli pętle nadal pojawiają się w tym samym obszarze podczas śledzenia, jest prawdopodobne, że węzły zostały umieszczone na różnych naczyniach włosowatych.
    4. Po zakończeniu śledzenia wybierz ikonę Graph Info, aby otworzyć arkusz kalkulacyjny zawierający automatycznie wyodrębnione parametry naczyniowe. Liczba węzłów i segmentów jest dostępna na ekranie widoku głównego.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cienkie okno korowe czaszki pozwala na obrazowanie in vivo dwufotonowych naczyń włosowatych kory (Rysunek 1). Odpowiedni obszar do wykonania zdjęcia pokazuje liczne, wyraźne naczynia włosowate (ryc. 1A). W tym samym polu widzenia nie ma autofluorescencji ściany komórkowej tętnicy i mogą występować inne sygnały fluorescencyjne, takie jak fluorescencja kolagenu, indukowane przez generację drugiej harmonicznej11 (ryc. 1B)...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisana tutaj metoda może być stosowana do analizy struktur mikronaczyniowych mózgu w szerokim zakresie modeli/ustawień eksperymentalnych. Aby ta metoda zakończyła się sukcesem, należy opanować trzy kluczowe kroki. Po pierwsze, cienkie okienko czaszki nie może uszkodzić czaszki ani leżącego pod nią mózgu. Łatwo jest przebić czaszkę podczas rozrzedzania lub spowodować wyciek naczyniowy wywołany ciepłem. Może to zakłócać obrazowanie, ponieważ barwnik fluorescencyjny będzie przeciekał do płaszczyzny ostrości i zasłaniał nac...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Marii Jepson, dr Paivi Jordan i dr Lindzie Callahan z University of Rochester Multiphoton Core za porady techniczne podczas realizacji tego protokołu. Dziękujemy również dr Changyong Feng za fachowe porady statystyczne oraz dr Maiken Nedergaard z University of Rochester Medical Center za projekt płyty głowy wykorzystany w tym artykule. Prace te były częściowo wspierane przez granty T32GM007356 i R01DA026325 z National Institutes of Health (NIH); oraz przez University of Rochester Center for AIDS Research grant P30AI078498 (NIH).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Mikroskop LeicaLeica Inc.MZ8
Oświetlacz o wysokiej intensywnościDolan-Jenner180
Poduszka grzewczaStryker TP3E
T/PUMPGaymar Industries, Inc.TP-500
TEC-4 Waporyzator izofluranowyDatex Ohmeda447
Sztuczny żel do łezButler AHS7312
Roztwór jodu powidonu Aplicare52380-1855-9
Extra Fine Bonn NożyczkiNarzędzia naukowe14084-08
Dumot #5 KleszczeNarzędzia naukowe11295-10
Dumont #5/45 KleszczeNarzędzia naukowe11251-35
Roztwór chlorku żelazaRicca Chemical Company3120-16
Loctite 454 Prism Instant Adhesive GelHenkel45404
Stoeltingcementu dentystycznego51459
Zestaw rękojeści Microtoruqe IIPearson DentalR14-0002
005 Frez do mikrowiertarkiFine Science Tools19007-05
Norland Blade (mikroostrze dentystyczne)Salvin Dental6900
UretanSigma-AldrichU2500Grupa 2B Czynnik rakotwórczy
Pleciony szewEthicon735G
Vannas Nożyczki sprężynoweNarzędzia do nauki15000-03
  Cewnik tętniczySAI Infusion TechnologiesMAC-01Koniec cewnika został ręcznie rozciągnięty w celu zmniejszenia jego średnicy.
Monitor ciśnienia krwiŚwiat Precyzyjne urządzeniaSYS-BP1
Przetwornik ciśnienia krwi i światPrecyzyjne urządzeniaBLPR2
RAPIDLab Analizator parametrów krytycznych krwi Siemens 248
40 μ l Rurka kapilarnaVWR15401-413
Texas Red-dextran (70 000 MW, 10 mg/kg rozpuszczony w soli fizjologicznej)InvitrogenD-1830
Adult Mouse Brain Slicer MatrixZivic InstrumentsBSMAS001-1
Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM Mikroskop wielofotonowyOlypmusFV-1000 MPE
MaiTai HP DeepSee Ti:Sa laserSpectra-Physics
Oprogramowanie ImageJNational Institutes of Health (NIH)Dostępne pod adresem http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html
Amira SoftwareVisage Imaging 
do

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kraft-Terry, S. D., Buch, S. J., Fox, H. S., Gendelman, H. E. A coat of many colors: neuroimmune crosstalk in human immunodeficiency virus infection. Neuron. 64 (1), 133-145 (2009).
  2. Ghafouri, M., Amini, S., Khalili, K., Sawaya, B. E. HIV-1 associated dementia: symptoms and causes. Retrovirology. 3, 28(2006).
  3. Antinori, A., et al. Updated research nosology for HIV-associated neurocognitive disorders. Neurology. 69 (18), 1789-1799 (2007).
  4. Clifford, D. B., Ances, B. M. HIV-associated neurocognitive disorder. The Lancet. Infectious diseases. 13 (11), 976-986 (2013).
  5. Lindl, K. A., Marks, D. R., Kolson, D. L., Jordan-Sciutto, K. L. HIV-associated neurocognitive disorder: pathogenesis and therapeutic opportunities. Journal of neuroimmune pharmacology : the official journal of the Society on NeuroImmune Pharmacology. 5 (3), 294-309 (2010).
  6. Zimmermann, J., et al. CNS-targeted production of IL-17A induces glial activation, microvascular pathology and enhances the neuroinflammatory response to systemic endotoxemia. PloS one. 8 (2), e57307(2013).
  7. Silva, J. N., et al. Chronic central nervous system expression of HIV-1 Tat leads to accelerated rarefaction of neocortical capillaries and loss of red blood cell velocity heterogeneity. Microcirculation. 21 (7), 664-676 (2014).
  8. Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation. Journal of visualized experiments : JoVE. (43), (2010).
  9. Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).
  10. Bruce-Keller, A. J., et al. Morphine causes rapid increases in glial activation and neuronal injury in the striatum of inducible HIV-1 Tat transgenic mice. Glia. 56 (13), 1414-1427 (2008).
  11. Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (17), 11014-11019 (2002).
  12. Silva, J., et al. Transient hypercapnia reveals an underlying cerebrovascular pathology in a murine model for HIV-1 associated neuroinflammation: role of NO-cGMP signaling and normalization by inhibition of cyclic nucleotide phosphodiesterase-5. Journal of neuroinflammation. 9, 253(2012).
  13. Farber, N. E., et al. Region-specific and agent-specific dilation of intracerebral microvessels by volatile anesthetics in rat brain slices. Anesthesiology. 87 (5), 1191-1198 (1997).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Two photon MicroscopyCortical Capillary DensityHIV induced NeuroinflammationMouse Brain SectionsCapillary Network AnalysisIn Vivo ImagingEx Vivo ImagingCerebral Vascular ArchitectureHIV 1 Tat Transgenic MiceCapillary Morphological Parameters

Related Articles