Mikroprzepływowy model biomimetycznie oddychających zrazikowych dróg oddechowych płuc

Podsumowanie

Miękka litografia została wykorzystana do stworzenia reprezentatywnego modelu pęcherzyków płucnych w prawdziwej skali, które okresowo rozszerzają się i kurczą, naśladując fizjologiczne ruchy oddechowe. Platforma ta odtwarza oddychające przepływy groniaste na chipie i oczekuje się, że ułatwi eksperymentalne badanie dynamiki wdychanego aerozolu i depozycji w ziarniasce płucnej.

Streszczenie

Ilościowe określenie charakterystyki przepływu oddechowego w głębokościach ziarniaków płuc i ich wpływu na transport aerozoli wdychanych jest kluczowe dla optymalizacji technik inhalacji leków, jak również przewidywania wzorców osadzania się potencjalnie toksycznych cząstek unoszących się w powietrzu w pęcherzykach płucnych. W tym przypadku techniki miękkiej litografii są wykorzystywane do wytwarzania złożonych, przypominających worki struktur dróg oddechowych w prawdziwych anatomicznych skalach długości, które odtwarzają fizjologiczne zjawiska przepływu zrazikowego w optycznie dostępnym systemie. Urządzenie mikroprzepływowe składa się z 5 generacji rozwidlających się kanałów pęcherzykowych o okresowo rozszerzających się i kurczących ściankach. Uruchamianie ścian odbywa się poprzez zmianę ciśnienia wewnątrz wypełnionych wodą komór otaczających cienkie ścianki kanału groniastego PDMS zarówno z boków, jak i od góry urządzenia. W przeciwieństwie do zwykłych wielowarstwowych urządzeń mikroprzepływowych, w których wymagane jest układanie kilku form PDMS, przedstawiono prostą metodę wytwarzania górnej komory poprzez osadzenie sekcji cylindrycznej strzykawki w formie PDMS. Ta nowatorska konfiguracja mikroprzepływowa zapewnia fizjologiczne ruchy oddechowe, które z kolei powodują charakterystyczne ziarniaste przepływy powietrza. W obecnym badaniu wykorzystano obrazową prędkość mikrocząstek (μPIV) z zawieszonymi cząstkami cieczy do ilościowego określenia takich przepływów powietrza w oparciu o dopasowanie podobieństwa hydrodynamicznego. Dobra zgodność między wynikami μPIV a oczekiwanymi zjawiskami przepływu ziarniastego sugeruje, że platforma mikroprzepływowa może w niedalekiej przyszłości służyć jako atrakcyjne narzędzie in vitro do badania bezpośrednio unoszącego się w powietrzu transportu i osadzania reprezentatywnych cząstek w obszarach zrazikowych płuc.

Wprowadzenie

Szczegółowa kwantyfikacja dynamiki przepływu oddechowego w dystalnych, pęcherzykowatych obszarach płuc jest kluczowa dla zrozumienia mieszania przepływu powietrza w ziarniastek płucnych i przewidywania losu wdychanych aerozoli w najgłębszych drogach oddechowych^1-3. Ten ostatni aspekt jest szczególnie niepokojący, gdy z jednej strony zajmujemy się zagrożeniami związanymi z wdychanymi cząstkami zanieczyszczeń lub odwrotnie, gdy poszukuje się nowych strategii lepszego i ukierunkowanego dostarczania leków wziewnych do zlokalizowanych miejsc w płucach^{4, 5}, a także dostarczania ogólnoustrojowego.

Do tej pory, przepływy oddechowe w głębokich obszarach ziarniastych płuc były zazwyczaj badane in silico za pomocą obliczeniowej dynamiki płynów (CFD) lub alternatywnie in vitro z rozszerzonymi modelami eksperymentalnymi po dopasowaniu podobieństwa hydrodynamicznego. W ciągu ostatnich kilku dekad metody CFD były coraz częściej stosowane do badania zjawisk przepływu ziarniastego, od pojedynczych modeli pęcherzyków płucnych^{6, 7} i przewodów pęcherzykowych^8–12 do bardziej skomplikowanych modeli in silico, które rejestrują anatomicznie realistyczne struktury drzew zrazikowych z wieloma generacjami przewodów pęcherzykowych i nawet kilkuset pojedynczych pęcherzyków płucnych^13–15.

Razem, wysiłki numeryczne były kluczowe w rzuceniu światła na rolę i wpływ ruchu ścian podczas ruchów oddechowych na wynikające z tego wzorce przepływu powietrza ziarniastego. W przypadku braku ruchu oddechowego, pęcherzyki statyczne charakteryzują się przepływami recyrkulacyjnymi w swoich jamach, które nie wykazują konwekcyjnej wymiany powietrza między przewodem groniastym a zębodołem^{6, 7}; Innymi słowy, przepływy pęcherzykowe byłyby całkowicie odizolowane od przepływów w obrębie drzew groniastych, a wymiana powietrza wynikałaby wyłącznie z mechanizmów dyfuzyjnych. Jednak wraz z istnieniem cyklicznych ekspansji domeny pęcherzykowej, topologie przepływu pęcherzykowego są drastycznie modyfikowane, a wynikające z tego wzorce przepływu wewnątrz pęcherzyków płucnych są ściśle związane z lokalizacją pęcherzyka płucnego wzdłuż drzewa groniastego (np. pokolenia proksymalne i dystalne).

W szczególności, w symulacjach wysunięto hipotezę, że na wzorce przepływu pęcherzykowego silnie wpływa stosunek natężenia przepływu pęcherzykowego do przewodowego, tak że proksymalne generacje ziarniaka płucnego, gdzie stosunek ten jest stosunkowo duży po zachowaniu masy w strukturze drzewa, charakteryzują się złożonymi przepływami recyrkulacyjnymi wewnątrz jam pęcherzykowych z nieodwracalnymi ścieżkami płynów. Z każdą głębszą generacją zrazikarstwa stosunek natężeń przepływu pęcherzykowego do przewodowego stopniowo maleje, tak że dystalne generacje zrazikowe wykazują bardziej promieniste strumienie, które przypominają proste naprężenia i opróżnienia balonu. Dzięki postępom w nowoczesnych metodach obrazowania, dane z obrazowania płuc^{16, 17} gryzoni, w tym szczurów i myszy, dały początek jednym z pierwszych symulacji CFD anatomicznie zrekonstruowanych przepływów groniastych w zrekonstruowanych pęcherzykach płucnych. Pomimo tak obiecującego postępu, ostatnie badania nadal ograniczają się do zajmowania się zjawiskami przepływu powietrza w końcowych pęcherzykach płucnych tylko^{18, 19} lub kilku pęcherzykach płucnych otaczających pojedynczy kanał²⁰. W rezultacie, najnowocześniejsze badania zjawisk przepływu oddechowego w acinus pozostają zdominowane przez badania koncentrujące się na ogólnych anatomicznie inspirowanych geometriach środowiska zrazikowego².

Z punktu widzenia eksperymentów, w latach^21–24 opracowano różne konfiguracje z drogami oddechowymi z jednym lub kilkoma pęcherzykami płucnymi. Nie istnieją jednak eksperymentalne modele rozwidlających się pęcherzyków płucnych, które byłyby w stanie naśladować oddychanie fizjologiczne poprzez rozszerzanie się i kurczenie w sposób podobny do oddychania. Biorąc pod uwagę brak atrakcyjnych platform eksperymentalnych, badania zjawisk transportu ziarniastego pozostają ograniczone w odniesieniu do walidacji badań obliczeniowych i, co najważniejsze, nadal brakuje dostępnych danych eksperymentalnych. W ostatnich latach Ma i in. (2009) skonstruowali przeskalowany model o sztywnych ściankach acinusa składającego się z trzech pokoleń zrazików; Jednak brak ruchu ściany w tym modelu ograniczył jego zdolność do uchwycenia realistycznych wzorców przepływu pęcherzyków płucnych w warunkach oddychania.

Niedawno wprowadzono inne eksperymenty na dużą skalę, w tym model ruchomej ściany oparty na danych anatomicznych z odlewanej repliki²⁵; jednakże, ponieważ model uchwycił tylko dwie ostatnie generacje zrazików (tj. końcowe worki), nie udało mu się uchwycić złożonych przepływów recyrkulacyjnych, które charakteryzują bardziej proksymalne generacje zrazików. Te ostatnie przykłady eksperymentów na większą skalę jeszcze bardziej uwypuklają ciągłe ograniczenia związane z takimi podejściami. W szczególności żaden istniejący eksperyment do tej pory nie wykazał hipotetycznego przejścia od przepływów recyrkulacyjnych do radialnych wzdłuż acinus, a tym samym potwierdził numeryczne przewidywania topologii przepływu, które hipotetycznie występują w rzeczywistych ziarnikach płuc^{7, 15}. Być może najbardziej krytyczne jest to, że eksperymenty na większą skalę są niezwykle ograniczone w badaniu dynamiki transportu i osadzania cząstek wdychanych²⁶ ze względu na trudności w dopasowaniu wszystkich istotnych parametrów niewymiarowych (np. dyfuzja cząstek, krytyczny mechanizm transportu cząstek submikronowych, jest całkowicie zaniedbana).

W związku z ciągłymi wyzwaniami eksperymentalnymi, poszukuje się nowych platform eksperymentalnych, które pozwalają na badanie przepływu powietrza oddechowego i dynamiki cząstek w skomplikowanych ruchomych ścianach sieci akoninarnych. W tym przypadku wprowadzany jest inspirowany anatomią model ziarniasty in vitro. Ta platforma mikroprzepływowa naśladuje przepływy groniaste płuc bezpośrednio w reprezentatywnej skali zrazikowej i poszerza rosnący zakres modeli mikroprzepływowych płuc²⁷, w tym przepływy tłokowe płynu oskrzelowego^28–30 i barierę pęcherzykowo-kapilarną³¹.

Mianowicie, obecny projekt przedstawia uproszczone, pięciopokoleniowe drzewo pęcherzyków płucnych z cyklicznie rozszerzającymi się i kurczącymi ścianami, gdzie cykliczne ruchy są osiągane poprzez kontrolowanie ciśnienia wewnątrz komory wodnej, która otacza cienkie boczne ścianki PDMS i gdzie górna ściana jest zdeformowana przez dodatkową komorę wodną znajdującą się bezpośrednio nad strukturą groniarną. W przeciwieństwie do zwykłych wielowarstwowych urządzeń mikroprzepływowych, komora ta jest po prostu formowana przez osadzenie sekcji cylindrycznej strzykawki wewnątrz urządzenia PDMS i nie wymaga przygotowania dodatkowej formy PDMS.

Przedstawione tutaj zminiaturyzowane podejście oferuje prosty i wszechstronny sposób na odtworzenie skomplikowanych struktur ziarniastych z ruchomymi ścianami w porównaniu do modeli skalowanych, przy jednoczesnym uchwyceniu podstawowych cech środowiska przepływu ziarniastego. Platforma ta może być używana do wizualizacji przepływu za pomocą cząstek zawieszonych w płynie wewnątrz dróg oddechowych (patrz reprezentatywne wyniki poniżej). W niedalekiej przyszłości model będzie wykorzystywany wraz z cząstkami unoszącymi się w powietrzu do badania dynamiki cząstek groniastych wdychanych.

Protokół

1. Mistrzowska produkcja

1. Użyj głębokiego reaktywnego wytrawiania jonowego (DRIE) płytki krzemowej na izolatorze (SOI), aby wytworzyć główną płytkę krzemową, jak opisano w poprzednich pracach^{32, 33}.
   UWAGA: DRIE jest preferowany w stosunku do standardowej mikroobróbki SU-8 ze względu na wysoki współczynnik proporcji (wykopy o szerokości 40 μm i głębokości 90 μm).

2. Odlewanie i uszczelnianie urządzenia mikroprzepływowego

1. Wymieszaj PDMS i utwardzacz w stosunku wagowym 10:1 w czystym małym pojemniku, takim jak plastikowe naczynie do ważenia.
2. Odgazować mieszaninę w eksykatorze w próżni do momentu usunięcia wszystkich pęcherzyków powietrza.
   UWAGA: Przygotuj wystarczającą ilość PDMS dla wszystkich kolejnych kroków. Poniżej akronim "PDMS" odnosi się zawsze do odgazowanej mieszaniny PDMS:utwardzacz w stosunku 10:1, która została przygotowana w krokach 2.1 i 2.2.
3. Wlać odgazowaną mieszaninę na wysokość około 1 mm powyżej wafla wzorcowego. Odgazowuje ponownie przez co najmniej 40 minut, aby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza nad płytką i zminimalizować pęcherzyki poniżej płytki.
   UWAGA: Upewnij się, że wafel znajduje się jak najbliżej dna płytki. W razie potrzeby delikatnie dociśnij wafel do dna za pomocą 2 patyczków do mieszania i ponownie odgazuj.
4. Piec w temperaturze 65 °C przez 20 minut w piecu z naturalną konwekcją.
   UWAGA: Po 20 minutach PDMS jest utwardzony i prawie całkowicie utwardzony. Chociaż możliwy jest dłuższy czas pieczenia, pieczenie przez 20 minut oszczędza czas i poprawia przyczepność drugiej warstwy PDMS (patrz poniżej) do pierwszej.
5. Spiłuj część cylindra plastikowej strzykawki o pojemności 2 ml za pomocą drobnoziarnistego papieru ściernego, aby poprawić przyczepność do PDMS. Ponadto użyj papieru ściernego, aby spłaszczyć podstawę cylindra strzykawki, umieszczając papier ścierny na płaskiej powierzchni i wsuwając na nią podstawę cylindra strzykawki. Oczyścić strzykawkę za pomocą sprężonego powietrza.
6. Umieścić część cylindryczną strzykawki na wierzchu pierwszej warstwy PDMS z dużym otworem skierowanym w stronę powierzchni PDMS i wylać drugą warstwę PDMS na wierzch pierwszej na wysokość ~5 mm i ponownie odgazować PDMS w eksykatorze.
   UWAGA: Drugą warstwę PDMS należy wylać z małego pojemnika wokół lufy i nie należy do niego wchodzić.
7. Piecz cały zestaw w temperaturze 65°C przez co najmniej 2 godziny w piecu z naturalną konwekcją.
   UWAGA: Nie ma potrzeby trzymania lufy na miejscu podczas procesów utwardzania, ponieważ ciężar PDMS dociskający do szerokiej podstawy lufy utrzymuje lufę mocno na miejscu.
8. Przeciąć foremkę PDMS wokół wzorzystego obszaru wafla głównego za pomocą skalpela. Podczas krojenia skalpel powinien słabo dotykać powierzchni wafla. Następnie delikatnie włóż cienkie narzędzie, takie jak kleszczyki waflowe, w nacięcie utworzone przez skalpel i oderwij odlew PDMS z płytki wzorcowej.
9. Umieść odlew na miękkiej powierzchni pokrytej folią aluminiową wzorzystą stroną do góry (tj. lufa powinna zwisać z krawędzi stołu) i wybij otwór w PDMS na wlocie komory i wlocie kanału za pomocą stempla biopsyjnego 1 mm.
10. Pokryć czyste szkiełko (odgazowanym) mieszaniną PDMS:utwardzacz w stosunku 10:1 za pomocą powlekarki wirowej zaprogramowanej na 3 000 obr./min przez 30 sekund i piec przez >1 godzinę w temperaturze 65 °C. Następnie wyczyść szkiełko i odlew PDMS za pomocą przezroczystej taśmy.
11. Powierzchnię formy PDMS i szkiełka szklanego z powłoką PDMS należy traktować plazmą_{O2 (}np. za pomocą ręcznej obróbki koronowej) przez 1 minutę, a następnie delikatnie docisnąć powierzchnie do siebie i piec w temperaturze 65 °C przez noc (O/N).

3. Napełnianie i uruchamianie urządzenia

1. Wymieszaj zawieszone w wodzie fluorescencyjne cząstki polistyrenu z wodą i glicerolem w szklanej fiolce, aby uzyskać mieszaninę glicerolu i wody 64/36 (v/v) z cząstkami 0,25% (w/w).
2. Umieść kroplę roztworu glicerolu na wlocie kanału i kroplę wody DI na wlocie do komory, a następnie umieść urządzenie w eksykatorze i odkurz przez ~ 5 min.
   UWAGA: Przed zwolnieniem próżni poczekaj, aż bąbelki, które tworzą się w kroplach roztworu glicerolu i wody DI, pękną. Po uwolnieniu próżni ciecze są zasysane do pustych przestrzeni wewnątrz urządzenia. Jeśli resztki powietrza pozostaną w kanałach, wyeliminuj je, wywierając zewnętrzne ciśnienie na płyny (np. za pomocą strzykawki) i pozwalając powietrzu dyfundować do PDMS.
3. Wstrzyknąć ~ 2 ml wody DI do górnej komory (tj. cylindra strzykawki, rys. 2b), aż zostanie całkowicie napełniona wodą. Następnie przykryj górną komorę końcówką strzykawki w rozmiarze 19, odetnij końcówkę kolejnej końcówki strzykawki w rozmiarze 19 i włóż tę końcówkę do wlotu bocznej komory. Podłącz obie końcówki strzykawki do strzykawki o pojemności 1 ml za pomocą cienkiej rurki teflonowej i łącznika w kształcie litery T.
   UWAGA: Upewnij się, że strzykawka o pojemności 1 ml, rurka teflonowa, łącznik w kształcie litery T i górna komora (cylinder strzykawki 2 ml) są wypełnione wodą bez pęcherzyków. Można to osiągnąć poprzez otwarcie punktów połączeń, przepychanie wody przez puste odcinki przewodów i ponowne podłączenie punktów połączeń.
4. Podłączyć strzykawkę o pojemności 1 ml do pompy strzykawkowej zaprogramowanej tak, aby naśladować na przykład cichy cykl oddychania oddechowego (z okresem T = 4 sekundy) zbudowany z liniowych ramp, tj. od zera do 1,8 ml/min w ciągu 1 sekundy, od 1,8 ml/min do -1,8 ml/min w ciągu 2 sekund i od -1,8 ml/min z powrotem do zera w ciągu 1 sekundy.

4. Eksperymenty z wizualizacją przepływu: Prędkość obrazowania mikrocząstek (μPIV)

1. Podczas uruchamiania urządzenia należy uzyskać serię 9 - 12 dwuklatkowych obrazów przepływu cząstek z synchronizacją fazową za pomocą systemu prędkości obrazu mikrocząstek (μPIV) składającego się na przykład z kamery CCD z podwójną klatką i wielokrotną ekspozycją (np. 1 600 × 1 200 pikseli, aby osiągnąć wystarczającą rozdzielczość), dwuimpulsowego lasera Nd-YAG (długość fali: 532 nm, energia wyjściowa: 400 mJ, czas trwania impulsu: 4 nsec) oraz mikroskop odwrócony.
   UWAGA: Taki system jest w stanie uzyskać pary klatek z opóźnieniem czasowym do kilku mikrosekund między pierwszą a drugą klatką. Aby uzyskać obrazy dwuklatkowe z synchronizacją fazową, przydatne jest uzyskanie serii podwójnych klatek z częstotliwością np. 10 Hz (pary klatek są od siebie oddalone o 0,1 sekundy). Następnie dane mogą zostać zreorganizowane w taki sposób, aby wszystkie pary ramek, które są oddzielone pełnym czasem cyklu (tutaj T = 4 sekundy) tworzyły nowy szereg czasowy. Akwizycję obrazu należy powtórzyć kilka razy, modyfikując czas opóźnienia między pierwszą a drugą klatką w każdej parze klatek (tj. 100 μs do 0,1 s) w celu rozdzielenia różnych obszarów przepływu wewnątrz jamy pęcherzykowej.
   Uwaga: dostępne są również alternatywne konfiguracje w odniesieniu do najlepszych kombinacji systemów akwizycji obrazu (tj. kamery) i źródeł oświetlenia (tj. laserów) do obrazowania takich mikroprzepływów^{34, 35}.
2. Użyj algorytmu sumy korelacji, aby obliczyć mapy wektorów prędkości sprzężenia fazowego wynikowego pola przepływu z serii obrazów dla każdego użytego opóźnienia czasowego. Powtórz ten proces kilka razy z różnymi czasami opóźnienia między pierwszą a drugą klatką w każdej parze ramek, aby rozwiązać różne obszary przepływu wewnątrz jamy pęcherzyków płucnych. Następnie użyj programu do analizy danych, aby połączyć poszczególne mapy przepływu w kompletną i bardzo szczegółową mapę wzorców przepływu, uśredniając nakładające się punkty danych³³.

Wyniki

Projektowanie wspomagane komputerowo (CAD) oraz obrazy mikroskopowe platformy acinar in vitro są przedstawione na Rys. 1. Biomimetyczny model osiakowaty składa się z pięciu generacji rozgałęzionych prostokątnych kanałów wyłożonych cylindrycznymi wgłębieniami przypominającymi pęcherzyki płucne (ryc. 1). W tym przypadku generacje modeli są ponumerowane od generacji 1 (dla generacji najbardziej proksymalnej) do generacji 5 (dla generacji najbardziej dystalnej). Należy zauważyć, że ...

Dyskusja

Kluczową cechą przedstawionej tutaj mikroprzepływowej platformy groniastej jest jej zdolność do odtwarzania fizjologicznie realistycznych ruchów oddechowych, które powodują powstanie fizjologicznych profili przepływu i prędkości w przewodach groniastych i pęcherzykach płucnych. Ponieważ kanały mikroprzepływowe są wytwarzane ze stosunkowo niskim współczynnikiem kształtu (tj. w_d/h ≈ 3,9, gdzie w_d jest szerokością kanału, a h jest wysokości...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Polidimetylosiloksan (PDMS) i utwardzacz	Dow Corning	(240)4019862	Sylgard® 184 Zestaw elastomerów silikonowych
Plastipak Strzykawka 2 ml	BD	300185
Norm-Ject Luer slip 1 ml	Henke Sass Wolf	4010-200V0
1 mm Dziurkacz do biopsji	Kai Medical	BP-10F
Laboratoryjny Corona Treater	Produkty elektrotechniczne	BD-20AC
PHD Ultra Pompa strzykawkowa	Aparat Harvard	703006
Barwione na czerwono wodne cząstki fluorescencyjne	Thermo-Scientific		Uncatalloged 0,86 i mikro; m zastosowano kulki
glicerynowe AR	Gadot	830131320
FlowMaster MITAS do pomiaru prędkości obrazu mikrocząstek (µ PIV) system	LaVision	1108630