Artykuł metodologiczny

Opracowanie szkieletowej biblioteki cyklicznych peptydów jako potencjalnych terapii przeciwpasożytniczych z wykorzystaniem promieniowania mikrofalowego

DOI:

10.3791/53589

⸱

26 stycznia 2016

 , 
1Department of Chemical and Systems Biology, Stanford University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono prostą i ogólną metodę syntezy cyklicznych peptydów za pomocą promieniowania mikrofalowego. Procedura ta umożliwia syntezę cyklicznych peptydów szkieletowych ze zbiorem różnych konformacji przy zachowaniu łańcuchów bocznych i ugrupowań farmakoforycznych, a tym samym pozwala na badanie przesiewowe pod kątem konformacji bioaktywnej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interakcje białko-białko (PPI) są ściśle związane z prawie wszystkimi procesami biologicznymi i są powiązane z wieloma chorobami ludzkimi. W związku z tym podejmowane są znaczne wysiłki na rzecz ukierunkowania IPP na badania podstawowe i w przemyśle farmaceutycznym. Interfejsy białko-białko są zwykle duże, płaskie i często pozbawione kieszeni, co komplikuje odkrycie małych cząsteczek, które celują w takie miejsca. Alternatywne podejścia do celowania z wykorzystaniem przeciwciał mają ograniczenia ze względu na słabą biodostępność po podaniu doustnym, niską przepuszczalność komórek i nieefektywność produkcji.

Używanie peptydów do atakowania interfejsów PPI ma kilka zalet. Peptydy mają wyższą elastyczność konformacyjną, zwiększoną selektywność i są na ogół niedrogie. Jednak peptydy mają swoje ograniczenia, w tym słabą stabilność i nieefektywność przenikania przez błony komórkowe. Aby przezwyciężyć takie ograniczenia, można przeprowadzić cyklizację peptydów. Wykazano, że cyklizacja poprawia selektywność peptydów, stabilność metaboliczną i biodostępność. Jednak przewidywanie bioaktywnej konformacji cyklicznego peptydu nie jest trywialne. Aby sprostać temu wyzwaniu, jednym z atrakcyjnych podejść jest badanie przesiewowe ukierunkowanej biblioteki do badań przesiewowych, w której wszystkie cykliczne peptydy szkieletowe mają tę samą sekwencję pierwotną, ale różnią się parametrami wpływającymi na ich budowę, takimi jak rozmiar pierścienia i położenie.

Opisujemy szczegółowy protokół syntezy biblioteki cyklicznych peptydów szkieletowych ukierunkowanych na określone pasożytnicze PPI. Stosując racjonalne podejście projektowe, opracowaliśmy peptydy pochodzące z białka rusztowania receptora Leishmania dla aktywowanej kinazy C (LACK). Postawiliśmy hipotezę, że sekwencje w LACK, które są konserwatywne u pasożytów, ale nie w homologu gospodarza ssaków, mogą reprezentować miejsca interakcji dla białek, które są krytyczne dla żywotności pasożytów. Cykliczne peptydy zsyntetyzowano przy użyciu promieniowania mikrofalowego w celu skrócenia czasu reakcji i zwiększenia wydajności. Opracowanie biblioteki cyklicznych peptydów szkieletowych o różnych rozmiarach pierścieni ułatwia systematyczne badanie przesiewowe w celu uzyskania najbardziej aktywnej biologicznie konformacji. Ta metoda zapewnia ogólny, szybki i łatwy sposób syntezy cyklicznych peptydów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oddziaływania białko-białko (PPI) odgrywają kluczową rolę w większości procesów biologicznych, od wewnątrzkomórkowej transdukcji sygnałów po śmierć komórki1. Dlatego też celowanie w PPI ma fundamentalne znaczenie dla badań podstawowych oraz zastosowań terapeutycznych. Oddziaływania PPI mogą być regulowane za pomocą specyficznych i stabilnych przeciwciał, jednak przeciwciała są kosztowne, trudne w produkcji i wykazują słabą biodostępność. Alternatywnie PPI można celować za pomocą małych cząsteczek. Małe cząsteczki są łatwiejsze w syntezie i tańsze w porównaniu z przeciwciałami; są one jednak stosunkowo mniej elastyczne i lepiej dopasowują się do małych wnęk niż do dużych powierzchni styku białko-białko2,3. Różne badania wykazały, że peptydy, które są prostsze i tańsze od przeciwciał oraz bardziej elastyczne niż małe cząsteczki, mogą wiązać się z powierzchniami białek i regulować PPI4,5. Globalny rynek peptydów terapeutycznych był wyceniany na około piętnaście miliardów dolarów w 2013 roku i rośnie w tempie 10,5% rocznie6. Ponadto istnieje ponad 50 peptydów wprowadzonych na rynek, około 270 peptydów w różnych fazach badań klinicznych oraz około 400 peptydów w zaawansowanych fazach przedklinicznych7. Choć liczne peptydy są stosowane jako leki, wciąż stawiają one kilka wyzwań ograniczających ich powszechne zastosowanie, w tym słabą biodostępność i stabilność, nieefektywność w przenikaniu przez błony komórkowe oraz elastyczność konformacyjną8,9. Jedną z alternatyw pozwalających przezwyciężyć te wady jest zastosowanie różnych modyfikacji, takich jak ograniczenia lokalne (D-aminokwasy i N-alkilacja) oraz globalne (cyklizacja)8,10-12. Modyfikacje te występują również w naturze. Na przykład cyklosporyna A, immunosupresyjny cykliczny peptyd naturalny, zawiera pojedynczy D-aminokwas i ulega modyfikacjom N-alkilacji13,14.

Modyfikacja naturalnych aminokwasów w celu wprowadzenia ograniczeń lokalnych, takich jak alkilacja D- oraz N-, często wpływa na aktywność biologiczną peptydów. Jednak cyklizacja, w której sekwencja docelowa może pozostać niezmieniona, z większym prawdopodobieństwem pozwala na zachowanie aktywności biologicznej. Cyklizacja jest niezwykle atrakcyjną metodą ograniczania przestrzeni konformacyjnej peptydów poprzez redukcję równowagi między różnymi konformacjami. Zazwyczaj zwiększa ona aktywność biologiczną i selektywność, ograniczając peptyd do konformacji aktywnej, która pośredniczy tylko w jednej funkcji. Cyklizacja poprawia również stabilność peptydów, utrzymując je w konformacji, która jest słabiej rozpoznawana przez enzymy degradujące. Rzeczywiście wykazano, że peptydy cykliczne charakteryzują się lepszą stabilnością metaboliczną, biodostępnością i selektywnością w porównaniu do ich liniowych odpowiedników15-17.

Cyklizacja może być jednak obosiecznym mieczem, ponieważ w niektórych przypadkach ograniczenia te mogą uniemożliwić peptydom przyjęcie konformacji bioaktywnej. Aby pokonać tę przeszkodę, można zsyntetyzować ukierunkowaną bibliotekę, w której wszystkie peptydy mają tę samą sekwencję pierwotną, a w konsekwencji stałe farmakofory. Peptydy w bibliotece różnią się parametrami wpływającymi na ich strukturę, takimi jak wielkość i położenie pierścienia, aby w dalszej kolejności wyłonić konformację o najwyższej bioaktywności9,18.

Peptydy można syntetyzować zarówno w roztworze, jak i metodą syntezy peptydów na fazie stałej (SPPS), która jest obecnie bardziej rozpowszechnionym podejściem i zostanie omówiona szczegółowo. SPPS to proces, w którym transformacje chemiczne są przeprowadzane na nośniku stałym za pomocą łącznika w celu przygotowania szerokiego zakresu związków syntetycznych19. SPPS umożliwia składanie peptydów poprzez kolejne sprzęganie aminokwasów w sposób etapowy od końca C, który jest przyłączony do nośnika stałego, do końca N. Łańcuchy boczne N-α-aminokwasów muszą być maskowane grupami ochronnymi, które są stabilne w warunkach reakcji stosowanych podczas elongacji peptydów, aby zapewnić przyłączenie jednego aminokwasu w każdym kroku. W końcowym etapie peptyd jest uwalniany z żywicy, a grupy ochronne łańcuchów bocznych są jednocześnie usuwane. Podczas syntezy peptydów wszystkie rozpuszczalne odczynniki mogą być usuwane z matrycy peptyd-nośnik stały poprzez filtrację i wypłukiwane na koniec każdego etapu sprzęgania. Dzięki takiemu systemowi duża nadwyżka odczynników o wysokim stężeniu może doprowadzić reakcje sprzęgania do końca, a wszystkie etapy syntezy mogą być przeprowadzone w tym samym naczyniu bez konieczności przenoszenia materiału20 .

Mimo że SPPS posiada pewne ograniczenia, takie jak powstawanie niepełnych produktów reakcji, reakcje uboczne, zanieczyszczenia odczynników oraz trudności w monitorowaniu przebiegu syntezy21, zalety SPPS sprawiły, że metoda ta stała się „złotym standardem” w syntezie peptydów. Do zalet tych należą: możliwość wprowadzenia aminokwasów nienaturalnych, automatyzacja, łatwe oczyszczanie, zminimalizowane straty materiału oraz możliwość stosowania nadmiaru odczynników, co przekłada się na wysoką wydajność. Wykazano, że SPPS jest niezwykle użyteczna w syntezie trudnych sekwencji21,22, modyfikacji fluorescencyjnych23 oraz bibliotek peptydowych24,25. SPPS znajduje również zastosowanie w syntezie innych struktur polimerowych, takich jak oligonukleotydy26,27, oligosacharydy28,29 oraz kwasowe nukleidy peptydowe30,31. Co ciekawe, w niektórych przypadkach wykazano, że SPPS jest korzystniejsza przy syntezie małych cząsteczek, które tradycyjnie otrzymuje się w roztworze32,33. SPPS jest stosowana zarówno w małej skali do celów badawczych i dydaktycznych34,35, jak i w dużej skali w przemyśle36-38.

Dwiema strategiami syntezy najczęściej stosowanymi w metodologii SPPS do syntezy peptydów są strategia butylooksykarbonylowa (Boc) oraz 9-fluorenylometoksikarbonylowa (Fmoc). Pierwotną strategią wprowadzoną do SPPS była strategia Boc, która wymaga silnie kwasowych warunków w celu usunięcia grup ochronnych łańcuchów bocznych i odszczepienia peptydu od żywicy. Synteza peptydów oparta na Fmoc wykorzystuje natomiast umiarkowane warunki zasadowe i stanowi łagodniejszą alternatywę dla protokołu Boc wrażliwego na działanie kwasów39. Strategia Fmoc wykorzystuje ortogonalną ochronę łańcuchów bocznych za pomocą grup t-butylowych (tBu), które są usuwane w ostatnim etapie syntezy podczas odszczepiania peptydu od żywicy w warunkach kwasowych.

Ogólna zasada syntezy peptydów na nośniku stałym została przedstawiona na Rysunku 1. Pierwszy aminokwas, z maskującą tymczasową grupą ochronną na terminalu N-α, jest wiązany z żywicą od strony terminalu C. W razie potrzeby stosuje się również półtrwałą grupę ochronną do maskowania łańcucha bocznego (Rysunek 1, Krok 1). Synteza docelowego peptydu odbywa się od terminalu C do terminalu N poprzez powtarzalne cykle usuwania tymczasowej grupy ochronnej N-α (Rysunek 1, Krok 2) oraz sprzęgania kolejnego chronionego aminokwasu (Rysunek 1, Krok 3). Po przyłączeniu ostatniego aminokwasu (Rysunek 1, Krok 4), peptyd jest odcinany od nośnika w postaci żywicy, a półtrwałe grupy ochronne są usuwane (Rysunek 1, Krok 5).

Synteza peptydów w fazie stałej; schemat procesu chemicznego; etapy TPG, SPG, sprzęgania aminokwasów.
Rycina 1. Ogólny schemat syntezy peptydów w fazie stałej. Aminokwas z chronioną grupą N-α zostaje przytwierdzony do żywicy za pomocą grupy karboksylowej poprzez łącznik (Krok 1). Pożądany peptyd jest budowany liniowo od końca C do końca N poprzez powtarzalne cykle usuwania tymczasowej grupy ochronnej (TPG) z pozycji N-α (Krok 2) i sprzęgania aminokwasów (Krok 3). Po zakończeniu syntezy (Krok 4), półtrwałe grupy ochronne (SPG) są usuwane podczas odcinania peptydów (Krok 5). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Po zmontowaniu pełnego łańcucha peptydowego cyklizację można przeprowadzić na kilka sposobów: (A) cyklizacja „głowa-ogon” — jest to wygodna metoda, ale ograniczona, ponieważ oferuje tylko jedną opcję cyklizacji (Rysunek 2A), (B) cyklizacja z wykorzystaniem aminokwasów z badanej sekwencji, które zawierają bioaktywne grupy funkcyjne — jednak zastosowanie tych aminokwasów może wpływać na aktywność biologiczną (Rysunek 2B), oraz (C) cyklizacja poprzez dodanie aminokwasów (lub innych bloków budulcowych) bez zakłócania bioaktywnej sekwencji. Wprowadzanie tych cząsteczek jest powszechnie stosowane, ponieważ pozwala na tworzenie ukierunkowanych bibliotek bez modyfikowania badanej sekwencji (Rysunek 2C).

Schemat struktury chemicznej łańcuchów peptydowych pokazujący mostki dwusiarczkowe i sekwencje aminokwasowe.
Rycina 2. Alternatywne strategie cyklizacji peptydów. (A) cyklizacja od końca N do końca C poprzez wiązanie peptydowe między C-końcem a N-końcem; (B) cyklizacja między grupami funkcyjnymi, takimi jak mostek dwusiarczkowy między resztami cysteiny (1), lub wiązanie amidowe między łańcuchami bocznymi lizyny a kwasem asparaginowym/glutaminowym (2), lub łańcuchem bocznym a N- lub C-końcem (3-4); (C) cyklizacja poprzez dodanie dodatkowych aminokwasów, pochodnych aminokwasów lub małych cząsteczek, na przykład przed (R0) i po (R7) sekwencji bioaktywnej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Synteza wspomagana mikrofalowo wykorzystuje promieniowanie mikrofalowe do ogrzewania reakcji, co przyspiesza organiczne przemiany chemiczne40,41. Chemia mikrofalowa opiera się na zdolności odczynnika/rozpuszczalnika do pochłaniania energii mikrofal i przekształcania jej w ciepło42. Przed upowszechnieniem się tej technologii należało pokonać główne przeszkody, w tym kwestie sterowalności i powtarzalności protokołów syntezy oraz brak dostępnych systemów do odpowiedniej kontroli temperatury i ciśnienia43,44. Pierwszy raport dotyczący syntezy peptydów wspomaganej mikrofalowo opisany był z wykorzystaniem kuchennej mikrofalówki do syntezy kilku krótkich peptydów (7-10 aminokwasów), co przyniosło znaczną poprawę wydajności sprzęgania i czystości 45. Ponadto wykazano, że energia mikrofal zmniejsza agregację łańcuchów, ogranicza reakcje uboczne, ogranicza racemizację oraz zwiększa szybkość sprzęgania, co ma krytyczne znaczenie w przypadku sekwencji długich i trudnych46-53.

Obecnie promieniowanie mikrofalowe jest szeroko stosowane w syntezie peptydów lub związków pokrewnych na nośniku stałym, w tym w przypadku (A) syntezy w wodzie zamiast w rozpuszczalniku organicznym54; (B) syntezy peptydów z powszechnymi modyfikacjami potranslacyjnymi, takimi jak glikopeptydy55-58 lub fosfopeptydy59-61, których synteza jest zazwyczaj trudna ze względu na niską wydajność sprzęgania sterycznie utrudnionych pochodnych aminokwasów; (C) syntezy peptydów z modyfikacją szkieletu, takich jak azapeptydy, które mogą być tworzone poprzez zastąpienie C(α) reszty aminokwasu atomem azotu62, lub peptoidy, których łańcuch boczny jest połączony z azotem amidowym, a nie z atomem Cα63,64; (D) syntezy peptydów cyklicznych65-71; oraz (E) syntezy bibliotek kombinatorycznych51,72. W wielu przypadkach autorzy zgłaszali wyższą wydajność i skrócony czas syntezy przy użyciu promieniowania mikrofalowego w porównaniu z protokołem konwencjonalnym.

Stosując projektowanie racjonalne73-75, opracowaliśmy peptydy przeciwpasożytnicze pochodne z białka rusztowaniowego receptora aktywowanej kinazy C u Leishmania (LACK). LACK odgrywa istotną rolę w wczesnej fazie zakażenia Leishmania76. Pasożyty wykazujące niższy poziom LACK nie są w stanie zainfekować nawet myszy z niedoborami odporności77, ponieważ LACK uczestniczy w kluczowych procesach sygnalizacji i syntezy białek pasożyta78. W związku z tym LACK jest kluczowym białkiem rusztowaniowym79 i wartościowym celem terapeutycznym. Koncentrując się na sekwencjach w LACK, które są konserwatywne u pasożytów, ale nie u ssaczego homologu gospodarza RACK, zidentyfikowaliśmy 8-aminokwasowy peptyd (RNGQCQRK), który obniżył żywotność Leishmania sp. w hodowli.

W niniejszej pracy opisujemy protokół syntezy cyklicznych peptydów o szkieletowych wiązaniach, pochodnych sekwencji białka LACK opisanej powyżej. Peptydy syntetyzowano na podłożu stałym z wykorzystaniem ogrzewania mikrofalowego metodą SPPS zgodnie z protokołem Fmoc/tBu. W ramach procesu SPPS peptydy sprzęgano z peptydem nośnikowym TAT47-57 (YGRKKRRQRRR) poprzez wiązanie amidowe. Transport różnych ładunków do wnętrza komórek oparty na TAT jest stosowany od ponad 15 lat, a dostarczanie ładunku do organelli podkomórkowych zostało potwierdzone80. Do przeprowadzenia cyklizacji w celu wytworzenia łączników kwasowych o długości od dwóch do pięciu atomów węgla wykorzystano cztery różne łączniki: bezwodnik bursztynowy i glutarowy oraz kwas adypinowy i pimelowy. Cyklizację przeprowadzono z wykorzystaniem energii mikrofalowej, natomiast końcowe etapy odszczepiania i deprotekcji łańcuchów bocznych wykonano manualnie, bez użycia mikrofal. Zastosowanie zautomatyzowanego syntezatora mikrofalowego poprawiło czystość produktu, zwiększyło jego wydajność oraz skróciło czas syntezy. Ten ogólny protokół może zostać zastosowany w innych badaniach wykorzystujących peptydy do zrozumienia istotnych mechanizmów molekularnych in vitro oraz in vivo i dalszego opracowywania potencjalnych leków na choroby ludzkie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie sprzętu i odczynników

  1. Przygotowanie sprzętu
    1. Wszystkie czynności wewnątrz dygestorium należy wykonać, stosując odpowiednie środki ochrony osobistej.
    2. Chemicznie syntetyzować peptydy na stałym podłożu za pomocą mikrofalowego syntezatora peptydów z dodatkowym modułem Discover wyposażonym w światłowodową sondę temperatury do sterowania dostarczaniem mocy mikrofalowej w teflonowym naczyniu reakcyjnym (30 ml, z frytą szklaną) lub w jednorazowym kartuszu polipropylenowym (12 ml, z gruboziarnistą frytą).
    3. W celu prawidłowego wymieszania należy podłączyć dopływ azotu do naczynia reakcyjnego lub alternatywnie uszczelnić oba końce wkładu polipropylenowego i umieścić na wytrząsarce obrotowej.
    4. Aby spuścić mieszaniny reakcyjne lub myjki, podłącz do odkurzacza domowego za pomocą syfonu na odpady.
    5. Umieść sondę światłowodową w naczyniu reakcyjnym.
  2. Przygotowanie odczynników
    1. Przygotować żywicę, ważąc żywicę Rink Amide AM 100-200 mesh (0,204 mg), dodać 5 ml mieszaniny 1:1 N,N-dimetyloformamidu (DMF)/dichlorometanu (DCM) do naczynia reakcyjnego/wkładu polipropylenowego, aby zmyć żywicę, wstrząsać przez 2-4 godziny, aby prawidłowo spęczniały i odcedzić.
    2. Przygotować 0,2 M roztwory aminokwasów 9-fluorenylometoksykarbonylu (Fmoc), rozpuszczając odpowiedni aminokwas Fmoc w DMF i mieszać mieszaninę, aż aminokwasy się rozpuszczą (Tabela 1).
    3. Przygotować mieszaninę 0,45 M roztworu aktywatora, rozpuszczając 18,96 g O-(benzotriazol-1-ylo)-N,N,N′,N′-TETRAMETHYLURONIUM HEXAFLUOROPHOSPHATE (HBTU) W 100 ml DMF i mieszając mieszaninę aż do rozpuszczenia ciała stałego (tabela 1).
    4. Przygotować mieszaninę 2 M roztworu bazowego aktywatora, łącząc 34,8 ml N,N-diizopropyloetyloaminy (DIEA) z 65,2 ml 1-metylo-2-pirolidynonu (NMP) (Tabela 1).
    5. Przygotować 0,1 M mieszaninę roztworów deprotekcyjnych, rozpuszczając 3,37 g hydratu 1-hydroksybenzotriazolu (HOBt) w 250 ml 20% v/v roztworu piperydyny w DMF i mieszając mieszaninę aż do rozpuszczenia ciała stałego (Tabela 1).

2. Sprzęgło aminokwasowe chronione przez Fmoc

  1. Sprzężenie aminokwasowe
    1. Dodać aminokwas (2,5 ml)/aktywator (1 ml)/aktywator (0,5 ml) do naczynia reakcyjnego/wkładu polipropylenowego i pozostawić reakcję na 300 sekund (25 W, 75 °C, tabela 2). Odcedź roztwór.
    2. Umyj żywicę za pomocą DMF. Dodaj DMF do żywicy na 120 sekund (7 ml, 0 W, RT) i spuść roztwór. Powtórz pięć razy.
  2. Ochrona Fmoc
    1. Dodać 7 ml 20% piperydyny w DMF z 0,1 M HOBt do naczynia reakcyjnego/wkładu polipropylenowego i inkubować przez 30 sekund (45 W, 75 °C, Tabela 2).
    2. Odcedzić mieszaninę reakcyjną.
    3. Dodać 7 ml 20% piperydyny w DMF z 0,1 M HOBt do naczynia reakcyjnego/wkładu polipropylenowego i inkubować przez 180 sekund (45 W, 75 °C, Tabela 2).
    4. Odcedzić mieszaninę reakcyjną.
    5. Umyj żywicę za pomocą DMF. Dodaj DMF do żywicy na 120 sekund (7 ml 0 W, rt) i odcedź roztwór. Powtórz pięć razy.
      Uwaga: Opcjonalnie wstrzymaj procedurę w tym miejscu i wznów ją w późniejszym terminie.
  3. Po etapie sprzęgania aminokwasów przemyć żywicę DCM i przechowywać przez co najmniej kilka dni w temperaturze 4 °C (przez dłuższy czas przechowywać żywicę w temperaturze -20 °C).
    1. Przenieść żywicę z naczynia reakcyjnego do wkładu polipropylenowego.
    2. Umyj żywicę za pomocą DCM. Dodaj DCM do żywicy na 120 sekund (7 ml, 0 W, rt) i spuść roztwór. Powtórz trzy razy.
    3. Szczelnie uszczelnij wkład polipropylenowy za pomocą górnej nakrętki i zaworu odcinającego.
    4. Przed rozpoczęciem nowej syntezy należy spęczniać żywicę przez 3-4 godziny w DMF (7 ml).
  4. Monitorowanie syntezy
    1. Użyj testu Kaisera (ninhydryny) lub testu Chloranilu, aby szybko określić postęp syntezy. Opcjonalnie należy przeprowadzić reakcję rozszczepienia na małą skalę, aby określić czystość i masę zsyntetyzowanego peptydu. Patrz punkt 9.
      Uwaga: Aby uzyskać więcej informacji na temat rozwiązywania problemów, patrz Tabela 3.
  5. Powtórz kroki 2.1 i 2.2 zgodnie z potrzebami, aby zsyntetyzować ukierunkowany peptyd: Arg(Pbf)-Asn(Trt)-Gly-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Mtt)-Gly-Gly-Tyr(But)-Gly-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf).

3. Sprzężenie bezwodnik/kwas

  1. Sprzęgło bezwodnikowe
    1. Umyj żywicę NMP. Dodaj NMP do żywicy na 120 sekund (7 ml, 0 W, rt) i odcedź roztwór. Powtórz trzy razy.
    2. Rozpuścić 10 równoważników odpowiedniego bezwodnika w NMP (5 ml), dodać 1 równoważnik 4-dimetyloaminopirydyny (DMAP) i 10 równoważników DIEA do roztworu (Tabela 1).
    3. Dodać mieszaninę bezwodnika/DMAP/DIEA w stosunku 10:10 do żywicy i inkubować przez 300 sekund (25 W, 75 °C, tabela 2). Odcedź roztwór.
    4. Umyj żywicę NMP. Dodaj NMP do żywicy na 120 sekund (7 ml, 0 W, rt) i odcedź roztwór. Powtórz trzy razy.
  2. Sprzężenie kwasowe
    1. Umyj żywicę za pomocą DMF. Dodaj DMF do żywicy na 120 sekund (7 ml, 0 W, rt) i spuść roztwór. Powtórz trzy razy.
    2. Rozpuścić 10 równoważników odpowiedniego kwasu dikarboksylowego w DMF (5 ml). Dodać 1 równoważny DMAP i 10 równoważnych N,N'-diizopropylokarbodimidu (DIC) do roztworu (Tabela 1).
    3. Wstępnie aktywuj mieszaninę, mieszając przez 30 minut.
    4. Dodać mieszaninę do żywicy i inkubować przez 300 sekund (25 W, 75 °C, tabela 2) i odcedzić roztwór.
    5. Umyj żywicę za pomocą DMF. Dodaj DMF do żywicy na 120 sekund (7 ml, 0 W, rt) i spuść roztwór. Powtórz krok trzy razy.

4. N-metylotrytyl (Mtt) Ochrona grupy Deprotection

Uwaga: Łańcuch boczny lizyny był chroniony N-metylotrytylem (Mtt)81, grupą ochronną, która może być selektywnie odbezpieczona w kwaśnych warunkach labilności82,83. Wyłącz ochronę grupy Mtt ręcznie na wytrząsarce bez energii mikrofalowej.

  1. Przenieś żywicę do wkładu polipropylenowego wyposażonego w zatyczkę i zawór odcinający.
  2. Umyj żywicę za pomocą DCM. Dodaj DCM do żywicy na 120 sekund (7 ml, 0 W, rt) i spuść roztwór. Powtórz trzy razy.
  3. Dodać 15-25 ml mieszaniny 1% kwasu trifluorooctowego (TFA), 5% triizopropylosilanu (TIS) i 94% DCM do wkładu polipropylenowego na jeden gram żywicy.
    Uwaga: TFA jest silnym kwasem i oraz jest niezwykle drażniący dla skóry, oczu i tkanki płucnej.
    1. Stężone roztwory TFA należy zawsze przechowywać w masce.
    2. Używaj odpowiednich środków ochrony osobistej (ochrona oczu, fartuch laboratoryjny i rękawice) i pracuj w dobrze wentylowanym kapturze. W przypadku kontaktu z TFA należy niezwłocznie zmienić rękawice i natychmiast usunąć wszelkie rozlane płyny. Jeśli skóra lub oczy wejdą w kontakt z kwasem, natychmiast spłucz dotknięty obszar wodą i myj przez dodatkowe 15 minut.
  4. Umieść wkład polipropylenowy na wytrząsarce i potrząsaj przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Spuść roztwór z wkładu polipropylenowego, stosując podciśnienie.
  6. Powtórz kroki 4.3-4.5 trzy razy.
  7. Umyj żywicę za pomocą DCM. Dodaj DCM do żywicy na 120 sekund (7 ml, 0 W, rt) i spuść roztwór. Powtórz pięć razy.

5. Cyklizacja peptydu liniowego

  1. Umyj żywicę za pomocą DCM. Dodaj DCM do żywicy na 120 sekund (7 ml, 0 W, rt) i spuść roztwór. Powtórz pięć razy.
  2. W probówce polipropylenowej o pojemności 50 ml rozpuścić 5 równoważników heksafluorfosforanu benzotriazolu-1-ly-oksy-tris-pirolidynofosfonii (PyBOP) w dibromometanie (DBM, 5 ml) i dodać do roztworu 10 równoważników DIEA (Tabela 1).
  3. Dodać mieszaninę do żywicy i inkubować przez 300 sekund (25 W, 75 °C, tabela 2). Odcedź roztwór.
  4. Umyj żywicę za pomocą DCM. Dodaj DCM do żywicy na 120 sekund (7 ml, 0 W, rt) i spuść roztwór. Powtórz trzy razy.

6. Podział i deochrona grup łańcuchów bocznych

  1. Umyj żywicę DCM i eterem dietylowym.
    1. Dodaj DCM do żywicy na 120 sekund (7 ml, 0 W, rt) i spuść roztwór. Powtórz dwa razy.
    2. Dodaj eter dietylowy do żywicy na 120 sekund (7 ml, 0 W) i odcedź roztwór. Powtórz dwa razy.
  2. Suszyć żywicę w eksykatorze próżniowym w temperaturze pokojowej przez co najmniej 3 godziny na wodorotlenku potasu (KOH, 1-10 g).
  3. Zważ wysuszoną żywicę i przenieś ją do wkładu polipropylenowego.
  4. Dodać 10 ml wstępnie schłodzonego koktajlu rozszczepiającego z kwasem trifluorooctowym (TFA) (np. 90% TFA, 2,5% wody, 2,5% TIS i 5% fenolu) do każdego grama żywicy.
  5. Wstrząsaj przez 3 godziny w temperaturze pokojowej.
  6. Zebrać roztwór do rozszczepienia TFA, filtrując żywicę do probówki polipropylenowej o pojemności 50 ml. Do filtracji użyj fryty, która znajduje się w 12 ml wkładu polipropylenowym.
  7. Dodać zimny eter dietylowy (35 ml) do probówki.
  8. Wirować przez 5 minut w temperaturze 1,207 x g w temperaturze 4 °C.
  9. Zdekantować warstwę eteru.
  10. Powtórz kroki 6.7-6.9 pięć razy.

7. Suszenie cyklicznego peptydu szkieletowego

  1. Trzymaj wytrącony peptyd w tej samej probówce i susz go w kapturze przez 30 minut.
  2. Rozpuść peptyd w mieszaninie wody i acetonitrylu (ACN) w stosunku 1:1.
  3. Zamrozić roztwór produktu końcowego w ciekłym azocie.
  4. Liofilizacja produktu końcowego.

8. Charakterystyka cyklicznego peptydu szkieletowego

  1. Rozpuścić małą próbkę (1 mg) produktu w wodzie (400 μl).
  2. Wstrzyknąć rozpuszczony peptyd (10–200 μl) do systemu wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami (RP-HPLC) w celu zbadania czystości peptydu 34.
  3. Sprawdź masę peptydu za pomocą spektrometrii mas z desorpcją laserową wspomaganą matrycą jonizacji (MS-MALDI) 84.
    1. Zmieszać 1 μl (100 μM) peptydu w mieszaninie acetonitrylu i wody w stosunku 1:1 (v/v) z 1 μl matrycy (5 mg/ml, kwas α-cyjano-4-hydroksycynamonowy) w mieszaninie acetonitrylu i wody w stosunku 1:1 (v/v) z TFA (0,1%).
    2. Punktowo 1 μl na płytce MS-MALDI.
    3. Wysuszyć próbkę i umieścić ją w spektrometrze masowym.
  4. Zważyć peptyd i obliczyć procentową wydajność.
  5. Przechowywać w temperaturze -20 °C.

9. Monitorowanie syntezy

  1. Test Kaisera (ninhydryny) 85
    1. Przygotować roztwory odczynników.
      1. Przygotować roztwór A, rozpuszczając 16,5 mg cyjanku potasu (KCN) w 25 ml wody destylowanej. Rozcieńczyć 1 ml powyższego roztworu w 49 ml pirydyny.
      2. Przygotować roztwór B, rozpuszczając 1 g ninhydryny w 20 ml etanolu.
      3. Przygotować roztwór C, rozpuszczając 40 g fenolu w 20 ml etanolu.
    2. Użyj testu Kaisera, aby sprawdzić zakończenie sprzężenia aminokwasów lub deprotekcję grupy ochronnej.
      1. Przenieś kilka kulek z żywicy do probówki.
      2. Dodać trzy krople (~ 100 μl) każdego roztworu (A, B i C) i wymieszać.
      3. Podgrzej probówkę na bloku grzewczym w temperaturze 110 °C przez 5 min.
        Uwaga: Niebieskie kulki (wynik pozytywny) wskazują na niepełną reakcję sprzęgania lub deochronę grupy ochronnej Fmoc.
  2. Test chloranilu 86
    1. Do każdego testu należy przygotować świeże następujące odczynniki.
      1. Przygotować roztwór 2% chloranilu w DMF, roztwór A.
      2. Przygotować roztwór 2% aldehydu octowego w DMF, roztwór B.
    2. Wykonaj test chloranilu, aby sprawdzić, czy sprzężenie aminokwasów zostało zakończone lub czy grupa ochronna została odbezpieczona.
      1. Zmieszać 100 μl roztworu A ze 100 μl roztworu B w probówce o pojemności 1,5 ml.
      2. Wrzuć koraliki i delikatnie potrząsaj przez 5 min.
        Uwaga: Ciemnobrązowe kulki (wynik pozytywny) wskazują na brak ochrony grupy ochronnej Fmoc lub niepełną reakcję sprzęgania.
  3. Reakcja rozszczepienia na małą skalę
    1. Usuń niewielką ilość żywicy do 3 ml wkładu polipropylenowego wyposażonego w zatyczkę i zawór odcinający.
    2. Potraktuj 2 ml mieszaniny 95% TFA, 2,5% wody i 2,5% TIS.
    3. Potrząsaj mieszaniną przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Usunąć żywicę przez filtrację za pomocą frytki z wkładu polipropylenowego i odparować rozpuszczalniki za pomocą strumienia azotu.
    5. Rozpuścić pozostałość w wodzie i przeanalizować produkt za pomocą HPLC i/lub MS.

10. Żywotność promastigotu Leishmania donovani w teście hodowlanym

  1. Leishmania donovani (L. donovani) warunki wzrostu i leczenia
    1. Kultura L. donovani promastigotes w modyfikacji pożywki orła (DMEM) firmy Dulbecco z 4,5 g/l glukozy, L-glutaminy i pirogronianu sodu w temperaturze 26 °C.
    2. Traktuj promastigoty L. donovani cyklicznymi peptydami (100 μM) przez 24 godziny w temperaturze 26 °C.
  2. Test żywotności Leishmania donovani (L. donovani)
    1. Oceń żywotność pasożyta za pomocą 20 μl alamarBlue zgodnie z protokołem producenta.
    2. Określić redukcję alamarBlue, mierząc fluorescencję (przy wzbudzeniu 570 nm i emisji 590 nm). Wyższe wartości fluorescencji wskazują na większą aktywność metaboliczną i zwiększoną żywotność pasożytów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszej pracy opisujemy opracowanie ukierunkowanej, niewielkiej biblioteki peptydów cyklicznych w szkielecie (backbone cyclic peptides), które specyficznie celują w kluczowe PPI pasożyta Leishmania i działają jako środki przeciwpasożytnicze (przegląd peptydów celujących w PPI jako środków przeciwpasożytniczych znajduje się w pozycji87). Poprzez syntezę nowych peptydów cyklicznych w szkielecie, farmakofory zostają zachowane w rusztowaniu o rozszerzalnym rozmiarze. Atut proponowanej tutaj ukierunko...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano syntezę skoncentrowanej biblioteki cyklicznych peptydów szkieletowych pochodzących z białka LACK pasożyta Leishmania przy użyciu w pełni zautomatyzowanego syntezatora mikrofalowego. Opracowano skoncentrowaną bibliotekę cyklicznych peptydów z konserwatywnymi farmakoforami i różnymi łącznikami. Dodanie różnych łączników, takich jak bezwodnik glutarowy, bezwodnik bursztynowy, kwas adypinowy, kwas pimelowy, lizyna, ornityna i inne elementy budulcowe, może być stosowane w celu zwiększenia różnorodności przest...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Lauren Van Wassenhove, Sunhee Hwang i Darii Mochly-Rosen za pomocne dyskusje. Prace były wspierane przez National Institutes of Health Grant NIH RC4 TW008781-01 C-IDEA (SPARK) dla N.Q. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
REAGENT
Solid support, żywica Rink Amide AM MLCBLBR-1330Ładowanie: 0,49 mmol/
g Fmoc-Ala-OHAdvanced ChemtechFA2100
Fmoc-Arg(Pbf)-OHAdvanced ChemtechFR2136
Fmoc-Asn(Trt)-OHAdvanced ChemtechFN2152
Fmoc-Asp(OBut)-OHZaawansowany ChemtechFD2192
Fmoc-Cys(Trt)-OHZaawansowany ChemtechFC2214
Fmoc-Gln(Trt)-OHZaawansowany ChemtechFQ2251
Fmoc-Glu(OtBu)-OHZaawansowany ChemtechFE2237
Fmoc-Gly-OHZaawansowany ChemtechFG2275
Fmoc-His(Trt)-OHZaawansowany ChemtechFH2316
Fmoc-Ile-OHZaawansowany ChemtechFI2326
Fmoc-Leu-OHZaawansowany ChemtechFL2350
Fmoc-Lys(Boc)-OHZaawansowany ChemtechFK2390
Fmoc-Met-OHZaawansowany ChemtechFM2400
Fmoc-Phe-OHZaawansowany ChemtechFF2425
Fmoc-Pro-OHZaawansowany ChemtechFP2450
Fmoc-Ser-(tBu)-OHZaawansowany ChemtechFS2476
Fmoc-Thr(tBu)-OHZaawansowany ChemtechFT2518
Fmoc-Trp(Boc)-OHZaawansowany ChemtechFW2527
Fmoc-Tyr(But)-OHZaawansowany ChemtechFY2563
Fmoc-Val-OHZaawansowany ChemtechFV2575
1-metylo-2-pirolidynon (NMP)Sigma328634Uwaga Toksyczny/Wysoce łatwopalny/drażniący.
N,N-dimetyloformamid (DMF)Alfa Aesar43465Uwaga Toxic.
Używaj wysokiej jakości DMF, aby wyeliminować reakcje uboczne, takie jak usunięcie Fmoc w wyniku śladów dimetyloaminy z rozkładu DMF.
Dichlorometan (DCM)SigmaD65100Uwaga Szkodliwy
dibromometan (DBM)SigmaD41868Ostrożny Szkodliwy
kwas trifluorooctowy (TFA)SigmaT62200Uwaga/toksyczny
kwas trifluorooctowy, klasa HPLC (TFA)Sigma91707Ostrożny/toksyczny
Eter dietylowySigma31690Uwaga Wysoce łatwopalny/szkodliwy
Triizopropylosilan (TIS)Sigma233781Ostrożny Woda drażniąca/łatwopalna
, klasa HPLCSigma270733
Acetonitroile, Klasa HPLC (ACN)Fisher ScientificA998-4Ostrożny Łatwopalny/Drażniący/Szkodliwy
N,N-Diizopropyloetyloamina (DIEA)Sigma3440Uwaga/wysoce łatwopalny
PiperydynaSigmaW290807Ostrożny Toksyczny/Wysoce łatwopalny
PirydynaSigma270970Uwaga Wysoce łatwopalny/Szkodliwy
Etanol (EtOH)Sigma459844Uwaga Wysoce łatwopalny/drażniący
Hydrat 1-hydroksybenzotriazolu (HOBt)Sigma157260Uwaga Wysoce łatwopalny/Drażniący/Szkodliwy
O-(Benzotriazol-1-ylo)-N,N,N′,N′ -tetrametylofluorofosforan (HBTU)Sigma12804Uwaga Drażniący/szkodliwy
Heksafluorfosforan benzotriazolu-1-ly-oksy-tris-pirolidinofosphonium (PyBOP)Zaawansowany ChemtechRC8602Uwaga Drażniący
NinhydrinSigma454044Uwaga Szkodliwy
PhenolSigmaP3653Caution/toksyczny
cyjanek potasu (KCN)Sigma11813Ostrożnie Bardzo toksyczny
Wodorotlenek potasu (KOH)Sigma221473Uwaga Toksyczny
N,N' -diizopropylokarbodimidymid (DIC)Sigma38370Uwaga Łatwopalny/ Toksyczny
4-dimetyloaminopirydyna (DMAP)Sigma522805Uwaga Toksyczny/drażniący
Bezwodnik glutarowySigmaG3806Uwaga Łatwopalny/Drażniący/Szkodliwy
Bezwodnik bursztynowySigma239690Uwaga Drażniący/Szkodliwy
Kwas adypinowySigmaA26357Uwaga Toksyczny/Drażniący
Kwas pimelowySigmaP45001Ostrożny Toksyczny/drażniący
ChloranilSigma23290Ostrożnie Toksyczny/Drażniący
Aldehyd octowySigma402788Uwaga Łatwopalny/
ToksycznySPRZĘT
WirówkaBeckman CoulterAllegra 6R
LiofilizatorLabconcofreezone 4.5
Pompa próżniowaFranklin Electricmodel 1101101416 z 3/4 HPAlcatel pompa z silnikiem Franklin 
Wkład polipropylenowy 12 mlZastosowana separacja2419
Zatyczka do wkładu polipropylenowego 12 mlZastosowana separacja8157
Wkład polipropylenowy 3 mlZastosowana separacja2413
Zatyczka do wkładu polipropylenowego 3 mlZastosowana separacja8054
Kurki odcinające PTFEZastosowane separacje2406
Probówki płaskie, 50 mlVWR21008-240
Kolektor ekstrakcyjny, 20 póz, rurki 16 x 100 mmWodaWAT200609
Shaker, BD Mikser nutatorowy AdamsFisher scientific22363152
Butelki Nalgene HDPE z wąską szyjką IP2, 125  mlFisher scientific03-312-8
Kolba ErlenmeyeraFisher ScientificFB-501, 500 ml
Blok grzewczyThermolyne1760 dri bath
Jednorazowe rurki ze szkła borokrzemianowego z gładkim końcemFisher Scientific14-961-25
Mikropipety i końcówki FinnpipetteThermo20– 200 oraz 100– 1,000 μ l
Fiolki HPLC - micro vl pp 400 i micro; l PK100   VWR69400-124
Fiolka HPLC - niebieska nasadka typu Snap-It VWR66030-600
Analityczna kolumna HPLCPeeke ScientificU1-5C18Q-JJultro 120 5 µ m C18Q, 4,6 mm ID 150 mm
Kolumna HPLC do przygotowania, XBridge WodyOBD C18 5 i mikro; m kolumna19 mm & razy; 150 mm
Spektrometr masowyApplied BiosystemsVoyager DE-RP 
Eksykator
butli
Analityczny system RP-HPLC Shimadzu LC-20wyposażony w: sterownik systemu CBM-20A, detektor SPD-20A, piec kolumnowy CTO-20A, 2 x zespół podawania rozpuszczalnika LC-20AD, autosampler SIL-20AC, odgazowywacz DGU-20A5 (Shimadzu, MD, USA).
Preparatywny system RP-HPLC Shimadzu LC-20wyposażony w: sterownik systemu CBM-20A, detektor SPD-20A, piec kolumnowy CTO-20A, 2 x zespół podawania rozpuszczalnika LC-6AD oraz kolektor frakcji FRC-10A (Shimadzu, MD, USA).
z azotem

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wells, J. A., McClendon, C. L. Reaching for high-hanging fruit in drug discovery at protein-protein interfaces. Nature. 450 (7172), 1001-1009 (2007).
  2. Arkin, M. R., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream. Nat Rev Drug Discov. (4), 301-317 (2004).
  3. Mandell, D. J., Kortemme, T. Computer-aided design of functional protein interactions. Nat. Chem. Biol. 5 (11), 797-807 (2009).
  4. Friedler, A., et al. Backbone cyclic peptide, which mimics the nuclear localization signal of human immunodeficiency virus type 1 matrix protein, inhibits nuclear import and virus production in nondividing cells. Biochemistry. 37 (16), 5616-5622 (1998).
  5. Brandman, R., Disatnik, M. H., Churchill, E., Mochly-Rosen, D. Peptides derived from the C2 domain of protein kinase C epsilon (epsilon PKC) modulate epsilon PKC activity and identify potential protein-protein interaction surfaces. J. Biol. Chem. 282 (6), 4113-4123 (2007).
  6. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J., Khrestchatisky, M. Synthetic therapeutic peptides: science and market. Drug discov today. 15 (1-2), 40-56 (2010).
  7. Marx, V. Watching Peptide Drugs Grow Up. Chemical & Engineering News. 83, American Chemical Society. 17-24 (2005).
  8. Denicourt, C., Dowdy, S. F. Medicine. Targeting apoptotic pathways in cancer cells. Science. 305 (5689), 1411-1413 (2004).
  9. Qvit, N., et al. Synthesis of a novel macrocyclic library: discovery of an IGF-1R inhibitor. J Comb Chem. 10 (2), 256-266 (2008).
  10. Patch, J. A., Barron, A. E. Mimicry of bioactive peptides via non-natural, sequence-specific peptidomimetic oligomers. Curr. Opin. Chem. Biol. 6 (6), 872-877 (2002).
  11. Kessler, H. Peptide Conformations .19. Conformation and Biological-Activity of Cyclic-Peptides. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 21 (7), 512-523 (1982).
  12. Gazal, S., Gelerman, G., Gilon, C. Novel Gly building units for backbone cyclization: synthesis and incorporation into model peptides. Peptides. 24 (12), 1847-1852 (2003).
  13. Fesik, S. W., et al. NMR studies of [U-13C]cyclosporin A bound to cyclophilin: bound conformation and portions of cyclosporin involved in binding. Biochemistry. 30 (26), 6574-6583 (1991).
  14. Kornfeld, O. S., et al. Mitochondrial Reactive Oxygen Species at the Heart of the Matter: New Therapeutic Approaches for Cardiovascular Diseases. Circ. Res. 116 (11), 1783-1799 (2015).
  15. Boguslavsky, V., Hruby, V. J., O'Brien, D. F., Misicka, A., Lipkowski, A. W. Effect of peptide conformation on membrane permeability. J. Pept. Res. 61 (6), 287-297 (2003).
  16. Eguchi, M., et al. Solid-phase synthesis and structural analysis of bicyclic beta-turn mimetics incorporating functionality at the i to i+3 positions. J. Am. Chem. Soc. 121 (51), 12204-12205 (1999).
  17. Altstein, M., et al. Backbone cyclic peptide antagonists, derived from the insect pheromone biosynthesis activating neuropeptide, inhibit sex pheromone biosynthesis in moths. J. Biol. Chem. 274 (25), 17573-17579 (1999).
  18. Cheng, M. F., Fang, J. M. Liquid-phase combinatorial synthesis of 1,4-benzodiazepine-2,5-diones as the candidates of endothelin receptor antagonism. J. Comb. Chem. 6 (1), 99-104 (2004).
  19. Merrifield, R. B. Solid Phase Peptide Synthesis I. the Synthesis of a Tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963).
  20. Pfeiffer, C. T., Schafmeister, C. E. Solid phase synthesis of a functionalized bis-peptide using 'safety catch' methodology. J Vis Exp. (63), e4112(2012).
  21. Coin, I., Beyermann, M., Bienert, M. Solid-phase peptide synthesis: from standard procedures to the synthesis of difficult sequences. Nat. Protoc. 2 (12), 3247-3256 (2007).
  22. Qvit, N., et al. Design and synthesis of backbone cyclic phosphorylated peptides: the IκB model. Biopolymers. 91 (2), 157-168 (2009).
  23. Sainlos, M., Imperiali, B. Tools for investigating peptide-protein interactions: peptide incorporation of environment-sensitive fluorophores through SPPS-based 'building block' approach. Nat. Protoc. 2 (12), 3210-3218 (2007).
  24. Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nat. Protoc. 2 (6), 1333-1349 (2007).
  25. Qi, X., Qvit, N., Su, Y. C., Mochly-Rosen, D. A novel Drp1 inhibitor diminishes aberrant mitochondrial fission and neurotoxicity. J. Cell Sci. 126 (Pt 3), 789-802 (2013).
  26. Beaucage, S. L. Solid-phase synthesis of siRNA oligonucleotides. Curr. Opin. Drug Discovery Dev. 11 (2), 203-216 (2008).
  27. Dhanawat, M., Shrivastava, S. K. Solid-Phase Synthesis of Oligosaccharide Drugs: A Review. Mini Rev Med Chem. 9 (2), 169-185 (2009).
  28. Seeberger, P. H., Werz, D. B. Synthesis and medical applications of oligosaccharides. Nature. 446 (7139), 1046-1051 (2007).
  29. Plante, O. J., Palmacci, E. R., Seeberger, P. H. Automated solid-phase synthesis of oligosaccharides. Science. 291 (5508), 1523-1527 (2001).
  30. Komiyama, M., Aiba, Y., Ishizuka, T., Sumaoka, J. Solid-phase synthesis of pseudo-complementary peptide nucleic acids. Nat. Protoc. 3 (4), 646-654 (2008).
  31. Christensen, L., et al. Solid-Phase synthesis of peptide nucleic acids. J. Pept. Sci. 1 (3), 175-183 (1995).
  32. Qvit, N., et al. Development of bifunctional photoactivatable benzophenone probes and their application to glycoside substrates. Biopolymers. 90 (4), 526-536 (2008).
  33. O'Neill, J. C., Blackwell, H. E. Solid-phase and microwave-assisted syntheses of 2,5-diketopiperazines: small molecules with great potential. Comb Chem High Throughput Screen. 10 (10), 857-876 (2007).
  34. Qvit, N., Barda, Y., Shalev, D., Gilon, C. A Laboratory Preparation of Aspartame Analogs Using Simultaneous Multiple Parallel Synthesis Methodology. J. Chem. Educ. 84 (12), 1988-1991 (2007).
  35. Truran, G. A., Aiken, K. S., Fleming, T. R., Webb, P. J., Markgraf, J. H. Solid phase organic synthesis and combinatorial chemistry: A laboratory preparation of oligopeptides. J. Chem. Educ. 79 (1), 85-86 (2002).
  36. Verlander, M. Industrial applications of solid-phase peptide synthesis - A status report. Int. J. Pept. Res. Ther. 13 (1-2), 75-82 (2007).
  37. Bray, B. L. Large-scale manufacture of peptide therapeutics by chemical synthesis. Nature reviews. Drug discovery. 2 (7), 587-593 (2003).
  38. Qvit, N. Development and therapeutic applications of oligonucleotides and peptides. chimica Oggi / CHEMISTRY today. 29 (2), 4-7 (2011).
  39. Carpino, L. A., Han, G. Y. 9-Fluorenylmethoxycarbonyl Amino-Protecting Group. J. Org. Chem. 37 (22), 3404-3409 (1972).
  40. Gedye, R., et al. The use of microwave ovens for rapid organic synthesis. Tetrahedron Lett. 27 (3), 279-282 (1986).
  41. Giguere, R. J., Bray, T. L., Duncan, S. M., Majetich, G. Application of commercial microwave ovens to organic synthesis. Tetrahedron Lett. 27 (41), 4945-4948 (1986).
  42. Kappe, C. O., Dallinger, D. The impact of microwave synthesis on drug discovery. Nature reviews. Drug discovery. 5 (1), 51-63 (2006).
  43. Kappe, C. O. Controlled microwave heating in modern organic synthesis. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 43 (46), 6250-6284 (2004).
  44. de la Hoz, A., Diaz-Ortiz, A., Moreno, A. Microwaves in organic synthesis. Thermal and non-thermal microwave effects. Chem. Soc. Rev. 34 (2), 164-178 (2005).
  45. Yu, H. M., Chen, S. T., Wang, K. T. Enhanced coupling efficiency in solid-phase peptide synthesis by microwave irradiation. J. Org. Chem. 57 (18), 4781-4784 (1992).
  46. Mingos, D. M. P., Baghurst, D. R. Tilden Lecture. Applications of microwave dielectric heating effects to synthetic problems in chemistry. Chem. Soc. Rev. 20 (1), 1-47 (1991).
  47. Gabriel, C., Gabriel, S., Grant, E. H., Halstead, B. S. J., Mingos, D. M. P. Dielectric parameters relevant to microwave dielectric heating. Chem. Soc. Rev. 27 (3), 213-224 (1998).
  48. Sabatino, G., Papini, A. M. Advances in automatic, manual and microwave-assisted solid-phase peptide synthesis. Curr. Opin. Drug Discovery Dev. 11 (6), 762-770 (2008).
  49. Banerjee, J., Hanson, A. J., Muhonen, W. W., Shabb, J. B., Mallik, S. Microwave-assisted synthesis of triple-helical, collagen-mimetic lipopeptides. Nat. Protoc. 5 (1), 39-50 (2010).
  50. Bacsa, B., Kappe, C. O. Rapid solid-phase synthesis of a calmodulin-binding peptide using controlled microwave irradiation. Nat. Protoc. 2 (9), 2222-2227 (2007).
  51. Murray, J. K., Gellman, S. H. Parallel synthesis of peptide libraries using microwave irradiation. Nat. Protoc. 2 (3), 624-631 (2007).
  52. Palasek, S. A., Cox, Z. J., Collins, J. M. Limiting racemization and aspartimide formation in microwave-enhanced Fmoc solid phase peptide synthesis. J Pept Sci. 13 (3), 143-148 (2007).
  53. Murray, J. K., Aral, J., Miranda, L. P. Solid-Phase Peptide Synthesis Using Microwave Irradiation. Methods Mol. Biol. 716, 73-88 (2011).
  54. Galanis, A. S., Albericio, F., Grotli, M. Solid-Phase Peptide Synthesis in Water Using Microwave-Assisted Heating. Organic Letters. 11 (20), 4488-4491 (2009).
  55. Rizzolo, F., Sabatino, G., Chelli, M., Rovero, P., Papini, A. M. A convenient microwave-enhanced solid-phase synthesis of difficult peptide sequences: Case study of Gramicidin A and CSF114(Glc). Int. J. Pept. Res. Ther. 13 (1-2), 203-208 (2007).
  56. Matsushita, T., Hinou, H., Kurogochi, M., Shimizu, H., Nishimura, S. Rapid microwave-assisted solid-phase glycopeptide synthesis. Org Lett. 7 (5), 877-880 (2005).
  57. Nagaike, F., et al. Efficient microwave-assisted tandem N- to S-acyl transfer and thioester exchange for the preparation of a glycosylated peptide thioester. Org Lett. 8 (20), 4465-4468 (2006).
  58. Naruchi, K., et al. Construction and structural characterization of versatile lactosaminoglycan-related compound library for the synthesis of complex glycopeptides and glycosphingolipids. J. Org. Chem. 71 (26), 9609-9621 (2006).
  59. Brandt, M., Gammeltoft, S., Jensen, K. J. Microwave heating for solid-phase peptide synthesis: General evaluation and application to 15-mer phosphopeptides. Int. J. Pept. Res. Ther. 12 (4), 349-357 (2006).
  60. Harris, P. W. R., Williams, G. M., Shepherd, P., Brimble, M. A. The Synthesis of Phosphopeptides Using Microwave-assisted Solid Phase Peptide Synthesis. Int. J. Pept. Res. Ther. 14 (4), 387-392 (2008).
  61. Qvit, N. Microwave-assisted Synthesis of Cyclic Phosphopeptide on Solid Support. Chem. Biol. Drug Des. 85 (3), 300-305 (2014).
  62. Kato, D., Verhelst, S. H., Sexton, K. B., Bogyo, M. A general solid phase method for the preparation of diverse azapeptide probes directed against cysteine proteases. Org Lett. 7 (25), 5649-5652 (2005).
  63. Olivos, H. J., Alluri, P. G., Reddy, M. M., Salony, D., Kodadek, T. Microwave-assisted solid-phase synthesis of peptoids. Org Lett. 4 (23), 4057-4059 (2002).
  64. Gorske, B. C., Jewell, S. A., Guerard, E. J., Blackwell, H. E. Expedient synthesis and design strategies for new peptoid construction. Org Lett. 7 (8), 1521-1524 (2005).
  65. Grieco, P., et al. Design and microwave-assisted synthesis of novel macrocyclic peptides active at melanocortin receptors: discovery of potent and selective hMC5R receptor antagonists. J. Med. Chem. 51 (9), 2701-2707 (2008).
  66. Boutard, N., Jamieson, A. G., Ong, H., Lubell, W. D. Structure-Activity Analysis of the Growth Hormone Secretagogue GHRP-6 by alpha- and beta-Amino gamma-Lactam Positional Scanning. Chem. Biol. Drug Des. 75 (1), 40-50 (2010).
  67. Jamieson, A. G., et al. Positional scanning for peptide secondary structure by systematic solid-phase synthesis of amino lactam peptides. J. Am. Chem. Soc. 131 (22), 7917-7927 (2009).
  68. Hossain, M. A., Bathgate, R. A. D., Tregear, G., Wade, J. D. De Novo Design and Synthesis of Cyclic and Linear Peptides to Mimic the Binding Cassette of Human Relaxin. Annals of the New York Academy of Sciences. 1160, 16-19 (2009).
  69. Fowler, S. A., Stacy, D. M., Blackwell, H. E. Design and synthesis of macrocyclic peptomers as mimics of a quorum sensing signal from Staphylococcus aureus. Org Lett. 10 (12), 2329-2332 (2008).
  70. Cemazar, M., Craik, D. J. Microwave-assisted Boc-solid phase peptide synthesis of cyclic cysteine-rich peptides. J Pept Sci. 14 (6), 683-689 (2008).
  71. Miles, S. M., Leatherbarrow, R. J., Marsden, S. P., Coates, W. J. Synthesis and bio-assay of RCM-derived Bowman-Birk inhibitor analogues. Org Biomol Chem. 2 (3), 281-283 (2004).
  72. Murray, J. K., et al. Efficient synthesis of a beta-peptide combinatorial library with microwave irradiation. J. Am. Chem. Soc. 127 (38), 13271-13280 (2005).
  73. Churchill, E. N., Qvit, N., Mochly-Rosen, D. Rationally designed peptide regulators of protein kinase. C. Trends Endocrinol. Metab. 20 (1), 25-33 (2009).
  74. Mochly-Rosen, D., Qvit, N. Peptide inhibitors of protein-protein interactions. chimica Oggi / CHEMISTRY today. 28 (1), 14-16 (2010).
  75. Qvit, N., Mochly-Rosen, D. Highly specific modulators of protein kinase C localization: applications to heart failure. Drug Discov. Today Dis. Mech. 7 (2), e87-e93 (2010).
  76. Mougneau, E., et al. Expression cloning of a protective Leishmania antigen. Science. 268 (5210), 563-566 (1995).
  77. Kelly, B. L., Stetson, D. B., Locksley, R. M. Leishmania major LACK antigen is required for efficient vertebrate parasitization. J. Exp. Med. 198 (11), 1689-1698 (2003).
  78. Choudhury, K., et al. Trypanosomatid RACK1 orthologs show functional differences associated with translation despite similar roles in Leishmania pathogenesis. PLoS One. 6 (6), e20710(2011).
  79. Gonzalez-Aseguinolaza, G., Taladriz, S., Marquet, A., Larraga, V. Molecular cloning, cell localization and binding affinity to DNA replication proteins of the p36/LACK protective antigen from Leishmania infantum. Eur. J. Biochem. 259 (3), 909-916 (1999).
  80. Gump, J. M., Dowdy, S. F. TAT transduction: the molecular mechanism and therapeutic prospects. Trends Mol. Med. 13 (10), 443-448 (2007).
  81. Aletras, A., Barlos, K., Gatos, D., Koutsogianni, S., Mamos, P. Preparation of the very acid-sensitive Fmoc-Lys(Mtt)-OH. Application in the synthesis of side-chain to side-chain cyclic peptides and oligolysine cores suitable for the solid-phase assembly of MAPs and TASPs. Int. J. Pept. Protein Res. 45 (5), 488-496 (1995).
  82. Li, D., Elbert, D. L. The kinetics of the removal of the N-methyltrityl (Mtt) group during the synthesis of branched peptides. J. Pept. Res. 60 (5), 300-303 (2002).
  83. Bourel, L., Carion, O., Gras-Masse, H., Melnyk, O. The deprotection of Lys(Mtt) revisited. J Pept Sci. 6 (6), 264-270 (2000).
  84. Tran, H., Gael, S. L., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. Solid-phase submonomer synthesis of peptoid polymers and their self-assembly into highly-ordered nanosheets. J Vis Exp. (57), e3373(2011).
  85. Kaiser, E., Colescot, R. L., Bossinge, C. D., Cook, P. I. Color Test for Detection of Free Terminal Amino Groups in Solid-Phase Synthesis of Peptides. Anal. Biochem. 34 (2), 595-598 (1970).
  86. Christensen, T. Qualitative Test for Monitoring Coupling Completeness in Solid-Phase Peptide-Synthesis Using Chloranil. Acta Chem. Scand. Ser.B-Org. Chem. Biochem. 33 (10), 763-766 (1979).
  87. Qvit, N., Crapster, J. A. Peptides that Target Protein-Protein Interactions as an Anti-Parasite Strategy. chimica Oggi / CHEMISTRY today. 32 (6), 62-66 (2014).
  88. Byk, G., et al. Synthesis and biological activity of NK-1 selective, N-backbone cyclic analogs of the C-terminal hexapeptide of substance P. J. Med. Chem. 39 (16), 3174-3178 (1996).
  89. King, D. S., Fields, C. G., Fields, G. B. A cleavage method which minimizes side reactions following Fmoc solid phase peptide synthesis. Int. J. Pept. Protein Res. 36 (3), 255-266 (1990).
  90. Pedersen, S. L., Tofteng, A. P., Malik, L., Jensen, K. J. Microwave heating in solid-phase peptide synthesis. Chemical Society Reviews. 41 (5), 1826-1844 (2012).
  91. Colangelo, A. M., et al. A new nerve growth factor-mimetic peptide active on neuropathic pain in rats. J. Neurosci. 28 (11), 2698-2709 (2008).
  92. Mesfin, F. B., Andersen, T. T., Jacobson, H. I., Zhu, S., Bennett, J. A. Development of a synthetic cyclized peptide derived from alpha-fetoprotein that prevents the growth of human breast cancer. J. Pept. Res. 58 (3), 246-256 (2001).
  93. Mizejewski, G. J., Muehlemann, M., Dauphinee, M. Update of alpha fetoprotein growth-inhibitory peptides as biotherapeutic agents for tumor growth and metastasis. Chemotherapy. 52 (2), 83-90 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Cykliczne peptydy z wi zaniem w szkielecieoddzia ywania bia ko bia koreceptor Leishmaniacyklizacja peptyd wsynteza na fazie sta ejspektrometria masanaliza HPLCr norodno konformacyjna

Powiązane artykuły