Opracowanie szkieletowej biblioteki cyklicznych peptydów jako potencjalnych terapii przeciwpasożytniczych z wykorzystaniem promieniowania mikrofalowego

Summary

Przedstawiono prostą i ogólną metodę syntezy cyklicznych peptydów za pomocą promieniowania mikrofalowego. Procedura ta umożliwia syntezę cyklicznych peptydów szkieletowych ze zbiorem różnych konformacji przy zachowaniu łańcuchów bocznych i ugrupowań farmakoforycznych, a tym samym pozwala na badanie przesiewowe pod kątem konformacji bioaktywnej.

Abstract

Interakcje białko-białko (PPI) są ściśle związane z prawie wszystkimi procesami biologicznymi i są powiązane z wieloma chorobami ludzkimi. W związku z tym podejmowane są znaczne wysiłki na rzecz ukierunkowania IPP na badania podstawowe i w przemyśle farmaceutycznym. Interfejsy białko-białko są zwykle duże, płaskie i często pozbawione kieszeni, co komplikuje odkrycie małych cząsteczek, które celują w takie miejsca. Alternatywne podejścia do celowania z wykorzystaniem przeciwciał mają ograniczenia ze względu na słabą biodostępność po podaniu doustnym, niską przepuszczalność komórek i nieefektywność produkcji.

Używanie peptydów do atakowania interfejsów PPI ma kilka zalet. Peptydy mają wyższą elastyczność konformacyjną, zwiększoną selektywność i są na ogół niedrogie. Jednak peptydy mają swoje ograniczenia, w tym słabą stabilność i nieefektywność przenikania przez błony komórkowe. Aby przezwyciężyć takie ograniczenia, można przeprowadzić cyklizację peptydów. Wykazano, że cyklizacja poprawia selektywność peptydów, stabilność metaboliczną i biodostępność. Jednak przewidywanie bioaktywnej konformacji cyklicznego peptydu nie jest trywialne. Aby sprostać temu wyzwaniu, jednym z atrakcyjnych podejść jest badanie przesiewowe ukierunkowanej biblioteki do badań przesiewowych, w której wszystkie cykliczne peptydy szkieletowe mają tę samą sekwencję pierwotną, ale różnią się parametrami wpływającymi na ich budowę, takimi jak rozmiar pierścienia i położenie.

Opisujemy szczegółowy protokół syntezy biblioteki cyklicznych peptydów szkieletowych ukierunkowanych na określone pasożytnicze PPI. Stosując racjonalne podejście projektowe, opracowaliśmy peptydy pochodzące z białka rusztowania receptora Leishmania dla aktywowanej kinazy C (LACK). Postawiliśmy hipotezę, że sekwencje w LACK, które są konserwatywne u pasożytów, ale nie w homologu gospodarza ssaków, mogą reprezentować miejsca interakcji dla białek, które są krytyczne dla żywotności pasożytów. Cykliczne peptydy zsyntetyzowano przy użyciu promieniowania mikrofalowego w celu skrócenia czasu reakcji i zwiększenia wydajności. Opracowanie biblioteki cyklicznych peptydów szkieletowych o różnych rozmiarach pierścieni ułatwia systematyczne badanie przesiewowe w celu uzyskania najbardziej aktywnej biologicznie konformacji. Ta metoda zapewnia ogólny, szybki i łatwy sposób syntezy cyklicznych peptydów.

Introduction

Interakcje białko-białko (PPI) odgrywają kluczową rolę w większości procesów biologicznych, od wewnątrzkomórkowej transdukcji sygnału do śmierci komórki¹. W związku z tym ukierunkowanie na IPP ma fundamentalne znaczenie dla badań podstawowych i zastosowań terapeutycznych. IPP mogą być regulowane przez specyficzne i stabilne przeciwciała, ale przeciwciała są drogie i trudne do wytworzenia oraz mają słabą biodostępność. Alternatywnie, IPP mogą być celem małych cząsteczek. Małe cząsteczki są łatwiejsze do syntezy i niedrogie w porównaniu z przeciwciałami; Są one jednak stosunkowo mniej elastyczne i lepiej pasują do małych jam niż do dużych granic faz białko-białko^2,3. Różnorodne badania wykazały, że peptydy, które są prostsze i tańsze niż przeciwciała oraz bardziej elastyczne niż małe cząsteczki, mogą wiązać interfejsy białkowe i regulować IPP^4,5. Globalny rynek peptydów terapeutycznych został wyceniony na około piętnaście miliardów dolarów w 2013 roku i rośnie o 10,5% rocznie⁶. Ponadto istnieje ponad 50 peptydów dostępnych na rynku, około 270 peptydów w różnych fazach badań klinicznych i około 400 peptydów w zaawansowanych fazach przedklinicznych⁷. Chociaż wiele peptydów jest stosowanych jako leki, peptydy nadal stanowią kilka wyzwań, które ograniczają ich powszechne stosowanie, w tym słabą biodostępność i stabilność, nieefektywność w przekraczaniu błon komórkowych i elastyczność konformacyjną^8,9. Jedną z alternatyw przezwyciężenia tych wad jest zastosowanie różnych modyfikacji, takich jak ograniczenia lokalne (D-aminokwasy i N-alkilacja) i globalne (cyklizacja)^8,10-12. Modyfikacje te również zachodzą naturalnie. Na przykład cyklosporyna A, naturalny peptyd cykliczny o działaniu immunosupresyjnym, zawiera pojedynczy D-aminokwas i ulega modyfikacjom N-alkilacji^13,14.

Modyfikacja naturalnych aminokwasów w celu wywołania lokalnych ograniczeń, takich jak D- i N-alkilowanie, często wpływa na aktywność biologiczną peptydu. Jednak cyklizacja, w której sekwencja zainteresowania może pozostać taka sama, z większym prawdopodobieństwem zachowa aktywność biologiczną. Cyklizacja jest bardzo atrakcyjnym sposobem ograniczania przestrzeni konformacyjnej peptydów poprzez zmniejszenie równowagi między różnymi konformacjami. Zwykle zwiększa aktywność biologiczną i selektywność poprzez ograniczenie peptydu do aktywnej konformacji, która pośredniczy tylko w jednej funkcji. Cyklizacja poprawia również stabilność peptydu, utrzymując peptyd w konformacji, która jest mniej rozpoznawana przez enzymy rozkładające. Rzeczywiście, wykazano, że cykliczne peptydy mają lepszą stabilność metaboliczną, biodostępność i selektywność w porównaniu z ich liniowymi odpowiednikami^15-17.

Jednak cyklizacja może być mieczem obosiecznym, ponieważ w niektórych przypadkach ograniczenie może uniemożliwić peptydom osiągnięcie konformacji bioaktywnej. Aby pokonać tę przeszkodę, można zsyntetyzować skoncentrowaną bibliotekę, w której wszystkie peptydy mają tę samą sekwencję pierwotną, a co za tym idzie, stałe farmakofory. Peptydy w bibliotece różnią się parametrami, które wpływają na ich strukturę, takimi jak rozmiar pierścienia i położenie, aby następnie przeprowadzić badania przesiewowe pod kątem najbardziej bioaktywnej konformacji^9,18.

Peptydy mogą być syntetyzowane zarówno w roztworze, jak i metodą syntezy peptydów w fazie stałej (SPPS), która jest obecnie bardziej rozpowszechnionym podejściem do syntezy peptydów i będzie dalej omawiana. SPPS to proces, w którym przemiany chemiczne są przeprowadzane na stałym podłożu za pośrednictwem łącznika w celu wytworzenia szerokiej gamy związków syntetycznych¹⁹. SPPS umożliwia składanie peptydów poprzez kolejne sprzęganie aminokwasów w sposób stopniowy od C-końca, który jest przymocowany do stałego nośnika, do N-końca. Łańcuchy boczne N-α-aminokwasów muszą być zamaskowane grupami ochronnymi, które są stabilne w warunkach reakcji stosowanych podczas wydłużania peptydów, aby zapewnić dodanie jednego aminokwasu na krok. W ostatnim etapie peptyd jest uwalniany z żywicy, a grupy ochronne łańcucha bocznego są jednocześnie usuwane. Podczas syntezy peptydu wszystkie rozpuszczalne odczynniki mogą zostać usunięte z matrycy nośnika peptydowo-stałego przez filtrację i wypłukane na końcu każdego etapu sprzęgania. Dzięki takiemu systemowi duży nadmiar odczynników w wysokim stężeniu może doprowadzić reakcje sprzęgania do końca, a wszystkie etapy syntezy mogą być przeprowadzone w tym samym naczyniu bez żadnego przenoszenia materiału²⁰ .

Chociaż SPPS ma pewne ograniczenia, takie jak produkcja niekompletnych reakcji, reakcje uboczne, zanieczyszczone odczynniki, a także trudności w monitorowaniu reakcji²¹, zalety SPPS sprawiły, że stał się on "złotym standardem" dla syntezy peptydów. Zalety te obejmują możliwość włączenia nienaturalnych aminokwasów, automatyzację, łatwe oczyszczanie, zminimalizowane straty fizyczne i użycie nadmiaru odczynników, co skutkuje wysokimi wydajnościami. Wykazano, że SPPS jest niezwykle przydatny w syntezie trudnych sekwencji^21,22, modyfikacji fluorescencyjnych²³ i bibliotek peptydowych^24,25. SPPS jest również bardzo przydatny dla innych zespołów wielołańcuchowych, takich jak oligonukleotydy^26,27, oligosacharydy^28,29 i peptydowe kwasy nukleinowe^30,31. Co ciekawe, w niektórych przypadkach wykazano, że SPPS jest korzystny w syntezie małych cząsteczek, które są tradycyjnie wytwarzane w roztworze^32,33. SPPS jest stosowany zarówno w małej skali do badań i dydaktyki^34,35, jak i na dużą skalę w przemyśle^36-38.

Dwie strategie syntezy, które są głównie używane w metodologii SPPS do syntezy peptydów, to butyloksykarbonyl (Boc) i 9-fluorenylmetoksykarbonyl (Fmoc). Pierwotną strategią wprowadzoną dla SPPS był Boc, który wymaga silnych kwaśnych warunków w celu usunięcia grup ochronnych łańcucha bocznego i rozszczepienia peptydu od żywicy. Synteza peptydów na bazie Fmoc wykorzystuje jednak umiarkowane warunki zasadowe i jest łagodniejszą alternatywą dla labilnego protokołu Boc³⁹. Strategia Fmoc wykorzystuje ortogonalną ochronę łańcucha bocznego t-butylu (tBu), która jest usuwana w ostatnim etapie syntezy podczas rozszczepiania peptydu od żywicy w warunkach kwaśnych.

Ogólna zasada syntezy peptydów na stałym podłożu jest przedstawiona na rysunku 1. Początkowy aminokwas, zamaskowany przez tymczasową grupę ochronną na końcu N-α, jest ładowany na żywicę z końca C. W razie potrzeby stosuje się również półtrwałą grupę ochronną do maskowania łańcucha bocznego (Rysunek 1, Krok 1). Synteza docelowego peptydu jest składana od C-końca do N-końca przez powtarzające się cykle deprotekcji N-α-tymczasowej grupy ochronnej (Figura 1, Krok 2) i sprzężenie następnego chronionego aminokwasu (Figura 1, Krok 3). Po załadowaniu ostatniego aminokwasu (Rysunek 1, Krok 4), peptyd jest odcinany od nośnika żywicy, a półtrwałe grupy ochronne są usuwane (Rysunek 1, Krok 5).

Rysunek 1. Ogólny schemat syntezy peptydów w fazie stałej. Aminokwas chroniony przez N-α jest zakotwiczony za pomocą grupy karboksylowej za pośrednictwem łącznika z żywicą (krok 1). Pożądany peptyd jest składany w sposób liniowy od końca C do końca N przez powtarzające się cykle deprotekcji tymczasowej grupy ochronnej (TPG) przed N-α (krok 2) i sprzężenia aminokwasów (krok 3). Po zakończeniu syntezy (Krok 4), półtrwałe grupy ochronne (SPG) są dechronione podczas rozszczepienia peptydów (Krok 5). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Po złożeniu kompletnego łańcucha peptydowego, cyklizacja może być osiągnięta za pomocą kilku alternatyw: (A) cyklizacja od głowy do ogona — jest to wygodny sposób, ale ograniczony, ponieważ zapewnia tylko jedną opcję cyklizacji (Rysunek 2A), (B) cyklizacja przy użyciu aminokwasów z interesującej nas sekwencji, które zawierają bioaktywne grupy funkcyjne - jednak użycie tych aminokwasów może wpływać na aktywność biologiczną (Rysunek 2B) oraz (C) cyklizacja poprzez dodawanie aminokwasów (lub innych elementów budulcowych) bez naruszania sekwencji bioaktywnej. Wprowadzenie tych cząsteczek jest szeroko rozpowszechnione, ponieważ umożliwia tworzenie skoncentrowanych bibliotek bez modyfikowania sekwencji zainteresowania (ryc. 2C).

Rysunek 2. Alternatywne strategie cyklizacji peptydów. (A) cyklizacja od głowy do ogona, poprzez wiązanie peptydowe między C-końcem a N-końcem; (B) cyklizacja między grupami funkcyjnymi, taka jak wiązanie dwusiarczkowe między resztami cysteiny (1) lub wiązanie amidowe między łańcuchami bocznymi lizyny z kwasem asparaginowym/glutaminowym (2) lub łańcuch boczny z N- lub C-końcem (3-4); (C) cyklizacja poprzez dodanie dodatkowych aminokwasów lub pochodnych aminokwasów lub małych cząsteczek, na przykład przed (R0) i po (R7) sekwencji bioaktywnej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Synteza wspomagana mikrofalami wykorzystuje promieniowanie mikrofalowe do reakcji cieplnych, przyspieszając w ten sposób organiczne przemiany chemiczne^40,41. Chemia mikrofalowa opiera się na zdolności odczynnika/rozpuszczalnika do pochłaniania energii mikrofalowej i przekształcania jej w ciepło⁴². Zanim technologia ta stała się powszechna, trzeba było przezwyciężyć główne wady, w tym sterowalność i odtwarzalność protokołów syntezy oraz brak dostępnych systemów do odpowiedniej kontroli temperatury i ciśnienia^43,44. Pierwszy raport o syntezie peptydów wspomaganej mikrofalami został przeprowadzony przy użyciu kuchennej kuchenki mikrofalowej do syntezy kilku krótkich peptydów (7-10 aminokwasów) ze znaczną poprawą wydajności sprzężenia i czystości ⁴⁵. Co więcej, wykazano, że energia mikrofalowa zmniejsza agregację łańcuchów, redukuje reakcje uboczne, ogranicza racemizację i poprawia szybkości sprzęgań, które są krytyczne dla trudnych i długich sekwencji^46-53.

Obecnie zastosowanie promieniowania mikrofalowego do syntezy peptydów lub pokrewnych związków na stałym podłożu jest szeroko rozpowszechnione, włączając w to (A) syntezę w wodzie zamiast w rozpuszczalniku organicznym⁵⁴; (B) synteza peptydów z powszechnymi modyfikacjami potranslacyjnymi, takimi jak glikopeptydy^55-58 lub fosfopeptydy^59-61, których synteza jest zazwyczaj trudna ze względu na niską skuteczność sprzęgania pochodnych aminokwasów z utrudnioną sterylnie; C) synteza peptydów ze zmodyfikowaną modyfikacją w szkielecie, takich jak azapeptydy, które mogą powstawać przez zastąpienie C(α) reszty aminokwasowej atomem azotu⁶², lub peptoidy, których łańcuch boczny jest połączony z azotem amidowym, a nie z atomem Cα^63,64; (D) synteza cyklicznych peptydów^65-71; oraz (E) synteza bibliotek kombinatorycznych^51,72. W wielu przypadkach autorzy stwierdzili wyższą wydajność i skrócony czas syntezy przy użyciu promieniowania mikrofalowego w porównaniu z konwencjonalnym protokołem.

Korzystając z racjonalnego projektu^73-75, opracowaliśmy peptydy przeciwpasożytnicze, które pochodziły z receptora aktywowanej kinazy C (LACK) rusztowania L. eishmania. LACK odgrywa ważną rolę we wczesnej fazie zakażenia Leishmania⁷⁶. Pasożyty wyrażające niższe poziomy LACK nie pasożytują nawet na myszach z obniżoną odpornością⁷⁷, ponieważ LACK bierze udział w podstawowych procesach sygnalizacji pasożytów i syntezie białek⁷⁸. Dlatego LACK jest kluczowym białkiem rusztowania⁷⁹ i cennym celem dla leków. Koncentrując się na sekwencjach w LACK, które są konserwatywne w pasożytach, ale nie w homologu RACK ssaków gospodarza, zidentyfikowaliśmy peptyd 8-aminokwasowy (RNGQCQRK), który zmniejszył żywotność Leishmania sp. w hodowli.

Tutaj opisujemy protokół syntezy cyklicznych peptydów szkieletowych pochodzących z sekwencji białka LACK opisanej powyżej. Peptydy zsyntetyzowano na stałym podłożu za pomocą ogrzewania mikrofalowego metodą SPPS z protokołem Fmoc/tBu. Peptydy sprzężono z peptydem nośnikowym TAT_47-57 (YGRKKRRQRRRR) poprzez wiązanie amidowe w ramach SPPS. Oparty na TAT transport różnych ładunków do komórek jest stosowany od ponad 15 lat, a dostarczanie ładunku do organelli subkomórkowych zostało potwierdzone⁸⁰. Cztery różne łączniki, bezwodnik bursztynowy i glutarowy, a także kwas adypinowy i pimelowy, zostały użyte do przeprowadzenia cyklizacji w celu wytworzenia łączników kwasu karboksylowego o dwóch do pięciu atomach węgla. Cyklizacja została wykonana przy użyciu energii mikrofalowej, a końcowe etapy rozszczepienia i deprotekcji łańcucha bocznego zostały wykonane ręcznie bez energii mikrofalowej. Zastosowanie zautomatyzowanego syntezatora mikrofalowego poprawiło czystość produktu, zwiększyło wydajność produktu i skróciło czas trwania syntezy. Ten ogólny protokół można zastosować do innych badań, które wykorzystują peptydy do zrozumienia ważnego mechanizmu molekularnego in vitro i in vivo oraz dalszego rozwoju potencjalnych leków na choroby ludzkie.

Protocol

1. Przygotowanie sprzętu i odczynników

1. Przygotowanie sprzętu
   1. Wszystkie czynności wewnątrz dygestorium należy wykonać, stosując odpowiednie środki ochrony osobistej.
   2. Chemicznie syntetyzować peptydy na stałym podłożu za pomocą mikrofalowego syntezatora peptydów z dodatkowym modułem Discover wyposażonym w światłowodową sondę temperatury do sterowania dostarczaniem mocy mikrofalowej w teflonowym naczyniu reakcyjnym (30 ml, z frytą szklaną) lub w jednorazowym kartuszu polipropylenowym (12 ml, z gruboziarnistą frytą).
   3. W celu prawidłowego wymieszania należy podłączyć dopływ azotu do naczynia reakcyjnego lub alternatywnie uszczelnić oba końce wkładu polipropylenowego i umieścić na wytrząsarce obrotowej.
   4. Aby spuścić mieszaniny reakcyjne lub myjki, podłącz do odkurzacza domowego za pomocą syfonu na odpady.
   5. Umieść sondę światłowodową w naczyniu reakcyjnym.
2. Przygotowanie odczynników
   1. Przygotować żywicę, ważąc żywicę Rink Amide AM 100-200 mesh (0,204 mg), dodać 5 ml mieszaniny 1:1 N,N-dimetyloformamidu (DMF)/dichlorometanu (DCM) do naczynia reakcyjnego/wkładu polipropylenowego, aby zmyć żywicę, wstrząsać przez 2-4 godziny, aby prawidłowo spęczniały i odcedzić.
   2. Przygotować 0,2 M roztwory aminokwasów 9-fluorenylometoksykarbonylu (Fmoc), rozpuszczając odpowiedni aminokwas Fmoc w DMF i mieszać mieszaninę, aż aminokwasy się rozpuszczą (Tabela 1).
   3. Przygotować mieszaninę 0,45 M roztworu aktywatora, rozpuszczając 18,96 g O-(benzotriazol-1-ylo)-N,N,N′,N′-TETRAMETHYLURONIUM HEXAFLUOROPHOSPHATE (HBTU) W 100 ml DMF i mieszając mieszaninę aż do rozpuszczenia ciała stałego (tabela 1).
   4. Przygotować mieszaninę 2 M roztworu bazowego aktywatora, łącząc 34,8 ml N,N-diizopropyloetyloaminy (DIEA) z 65,2 ml 1-metylo-2-pirolidynonu (NMP) (Tabela 1).
   5. Przygotować 0,1 M mieszaninę roztworów deprotekcyjnych, rozpuszczając 3,37 g hydratu 1-hydroksybenzotriazolu (HOBt) w 250 ml 20% v/v roztworu piperydyny w DMF i mieszając mieszaninę aż do rozpuszczenia ciała stałego (Tabela 1).

2. Sprzęgło aminokwasowe chronione przez Fmoc

1. Sprzężenie aminokwasowe
   1. Dodać aminokwas (2,5 ml)/aktywator (1 ml)/aktywator (0,5 ml) do naczynia reakcyjnego/wkładu polipropylenowego i pozostawić reakcję na 300 sekund (25 W, 75 °C, tabela 2). Odcedź roztwór.
   2. Umyj żywicę za pomocą DMF. Dodaj DMF do żywicy na 120 sekund (7 ml, 0 W, RT) i spuść roztwór. Powtórz pięć razy.
2. Ochrona Fmoc
   1. Dodać 7 ml 20% piperydyny w DMF z 0,1 M HOBt do naczynia reakcyjnego/wkładu polipropylenowego i inkubować przez 30 sekund (45 W, 75 °C, Tabela 2).
   2. Odcedzić mieszaninę reakcyjną.
   3. Dodać 7 ml 20% piperydyny w DMF z 0,1 M HOBt do naczynia reakcyjnego/wkładu polipropylenowego i inkubować przez 180 sekund (45 W, 75 °C, Tabela 2).
   4. Odcedzić mieszaninę reakcyjną.
   5. Umyj żywicę za pomocą DMF. Dodaj DMF do żywicy na 120 sekund (7 ml 0 W, rt) i odcedź roztwór. Powtórz pięć razy.
      Uwaga: Opcjonalnie wstrzymaj procedurę w tym miejscu i wznów ją w późniejszym terminie.
3. Po etapie sprzęgania aminokwasów przemyć żywicę DCM i przechowywać przez co najmniej kilka dni w temperaturze 4 °C (przez dłuższy czas przechowywać żywicę w temperaturze -20 °C).
   1. Przenieść żywicę z naczynia reakcyjnego do wkładu polipropylenowego.
   2. Umyj żywicę za pomocą DCM. Dodaj DCM do żywicy na 120 sekund (7 ml, 0 W, rt) i spuść roztwór. Powtórz trzy razy.
   3. Szczelnie uszczelnij wkład polipropylenowy za pomocą górnej nakrętki i zaworu odcinającego.
   4. Przed rozpoczęciem nowej syntezy należy spęczniać żywicę przez 3-4 godziny w DMF (7 ml).
4. Monitorowanie syntezy
   1. Użyj testu Kaisera (ninhydryny) lub testu Chloranilu, aby szybko określić postęp syntezy. Opcjonalnie należy przeprowadzić reakcję rozszczepienia na małą skalę, aby określić czystość i masę zsyntetyzowanego peptydu. Patrz punkt 9.
      Uwaga: Aby uzyskać więcej informacji na temat rozwiązywania problemów, patrz Tabela 3.
5. Powtórz kroki 2.1 i 2.2 zgodnie z potrzebami, aby zsyntetyzować ukierunkowany peptyd: Arg(Pbf)-Asn(Trt)-Gly-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Mtt)-Gly-Gly-Tyr(But)-Gly-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf).

3. Sprzężenie bezwodnik/kwas

1. Sprzęgło bezwodnikowe
   1. Umyj żywicę NMP. Dodaj NMP do żywicy na 120 sekund (7 ml, 0 W, rt) i odcedź roztwór. Powtórz trzy razy.
   2. Rozpuścić 10 równoważników odpowiedniego bezwodnika w NMP (5 ml), dodać 1 równoważnik 4-dimetyloaminopirydyny (DMAP) i 10 równoważników DIEA do roztworu (Tabela 1).
   3. Dodać mieszaninę bezwodnika/DMAP/DIEA w stosunku 10:10 do żywicy i inkubować przez 300 sekund (25 W, 75 °C, tabela 2). Odcedź roztwór.
   4. Umyj żywicę NMP. Dodaj NMP do żywicy na 120 sekund (7 ml, 0 W, rt) i odcedź roztwór. Powtórz trzy razy.
2. Sprzężenie kwasowe
   1. Umyj żywicę za pomocą DMF. Dodaj DMF do żywicy na 120 sekund (7 ml, 0 W, rt) i spuść roztwór. Powtórz trzy razy.
   2. Rozpuścić 10 równoważników odpowiedniego kwasu dikarboksylowego w DMF (5 ml). Dodać 1 równoważny DMAP i 10 równoważnych N,N'-diizopropylokarbodimidu (DIC) do roztworu (Tabela 1).
   3. Wstępnie aktywuj mieszaninę, mieszając przez 30 minut.
   4. Dodać mieszaninę do żywicy i inkubować przez 300 sekund (25 W, 75 °C, tabela 2) i odcedzić roztwór.
   5. Umyj żywicę za pomocą DMF. Dodaj DMF do żywicy na 120 sekund (7 ml, 0 W, rt) i spuść roztwór. Powtórz krok trzy razy.

4. N-metylotrytyl (Mtt) Ochrona grupy Deprotection

Uwaga: Łańcuch boczny lizyny był chroniony N-metylotrytylem (Mtt)⁸¹, grupą ochronną, która może być selektywnie odbezpieczona w kwaśnych warunkach labilności^82,83. Wyłącz ochronę grupy Mtt ręcznie na wytrząsarce bez energii mikrofalowej.

1. Przenieś żywicę do wkładu polipropylenowego wyposażonego w zatyczkę i zawór odcinający.
2. Umyj żywicę za pomocą DCM. Dodaj DCM do żywicy na 120 sekund (7 ml, 0 W, rt) i spuść roztwór. Powtórz trzy razy.
3. Dodać 15-25 ml mieszaniny 1% kwasu trifluorooctowego (TFA), 5% triizopropylosilanu (TIS) i 94% DCM do wkładu polipropylenowego na jeden gram żywicy.
   Uwaga: TFA jest silnym kwasem i oraz jest niezwykle drażniący dla skóry, oczu i tkanki płucnej.
   1. Stężone roztwory TFA należy zawsze przechowywać w masce.
   2. Używaj odpowiednich środków ochrony osobistej (ochrona oczu, fartuch laboratoryjny i rękawice) i pracuj w dobrze wentylowanym kapturze. W przypadku kontaktu z TFA należy niezwłocznie zmienić rękawice i natychmiast usunąć wszelkie rozlane płyny. Jeśli skóra lub oczy wejdą w kontakt z kwasem, natychmiast spłucz dotknięty obszar wodą i myj przez dodatkowe 15 minut.
4. Umieść wkład polipropylenowy na wytrząsarce i potrząsaj przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
5. Spuść roztwór z wkładu polipropylenowego, stosując podciśnienie.
6. Powtórz kroki 4.3-4.5 trzy razy.
7. Umyj żywicę za pomocą DCM. Dodaj DCM do żywicy na 120 sekund (7 ml, 0 W, rt) i spuść roztwór. Powtórz pięć razy.

5. Cyklizacja peptydu liniowego

1. Umyj żywicę za pomocą DCM. Dodaj DCM do żywicy na 120 sekund (7 ml, 0 W, rt) i spuść roztwór. Powtórz pięć razy.
2. W probówce polipropylenowej o pojemności 50 ml rozpuścić 5 równoważników heksafluorfosforanu benzotriazolu-1-ly-oksy-tris-pirolidynofosfonii (PyBOP) w dibromometanie (DBM, 5 ml) i dodać do roztworu 10 równoważników DIEA (Tabela 1).
3. Dodać mieszaninę do żywicy i inkubować przez 300 sekund (25 W, 75 °C, tabela 2). Odcedź roztwór.
4. Umyj żywicę za pomocą DCM. Dodaj DCM do żywicy na 120 sekund (7 ml, 0 W, rt) i spuść roztwór. Powtórz trzy razy.

6. Podział i deochrona grup łańcuchów bocznych

1. Umyj żywicę DCM i eterem dietylowym.
   1. Dodaj DCM do żywicy na 120 sekund (7 ml, 0 W, rt) i spuść roztwór. Powtórz dwa razy.
   2. Dodaj eter dietylowy do żywicy na 120 sekund (7 ml, 0 W) i odcedź roztwór. Powtórz dwa razy.
2. Suszyć żywicę w eksykatorze próżniowym w temperaturze pokojowej przez co najmniej 3 godziny na wodorotlenku potasu (KOH, 1-10 g).
3. Zważ wysuszoną żywicę i przenieś ją do wkładu polipropylenowego.
4. Dodać 10 ml wstępnie schłodzonego koktajlu rozszczepiającego z kwasem trifluorooctowym (TFA) (np. 90% TFA, 2,5% wody, 2,5% TIS i 5% fenolu) do każdego grama żywicy.
5. Wstrząsaj przez 3 godziny w temperaturze pokojowej.
6. Zebrać roztwór do rozszczepienia TFA, filtrując żywicę do probówki polipropylenowej o pojemności 50 ml. Do filtracji użyj fryty, która znajduje się w 12 ml wkładu polipropylenowym.
7. Dodać zimny eter dietylowy (35 ml) do probówki.
8. Wirować przez 5 minut w temperaturze 1,207 x g w temperaturze 4 °C.
9. Zdekantować warstwę eteru.
10. Powtórz kroki 6.7-6.9 pięć razy.

7. Suszenie cyklicznego peptydu szkieletowego

1. Trzymaj wytrącony peptyd w tej samej probówce i susz go w kapturze przez 30 minut.
2. Rozpuść peptyd w mieszaninie wody i acetonitrylu (ACN) w stosunku 1:1.
3. Zamrozić roztwór produktu końcowego w ciekłym azocie.
4. Liofilizacja produktu końcowego.

8. Charakterystyka cyklicznego peptydu szkieletowego

1. Rozpuścić małą próbkę (1 mg) produktu w wodzie (400 μl).
2. Wstrzyknąć rozpuszczony peptyd (10–200 μl) do systemu wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami (RP-HPLC) w celu zbadania czystości peptydu ³⁴.
3. Sprawdź masę peptydu za pomocą spektrometrii mas z desorpcją laserową wspomaganą matrycą jonizacji (MS-MALDI) ⁸⁴.
   1. Zmieszać 1 μl (100 μM) peptydu w mieszaninie acetonitrylu i wody w stosunku 1:1 (v/v) z 1 μl matrycy (5 mg/ml, kwas α-cyjano-4-hydroksycynamonowy) w mieszaninie acetonitrylu i wody w stosunku 1:1 (v/v) z TFA (0,1%).
   2. Punktowo 1 μl na płytce MS-MALDI.
   3. Wysuszyć próbkę i umieścić ją w spektrometrze masowym.
4. Zważyć peptyd i obliczyć procentową wydajność.
5. Przechowywać w temperaturze -20 °C.

9. Monitorowanie syntezy

1. Test Kaisera (ninhydryny) ⁸⁵
   1. Przygotować roztwory odczynników.
      1. Przygotować roztwór A, rozpuszczając 16,5 mg cyjanku potasu (KCN) w 25 ml wody destylowanej. Rozcieńczyć 1 ml powyższego roztworu w 49 ml pirydyny.
      2. Przygotować roztwór B, rozpuszczając 1 g ninhydryny w 20 ml etanolu.
      3. Przygotować roztwór C, rozpuszczając 40 g fenolu w 20 ml etanolu.
   2. Użyj testu Kaisera, aby sprawdzić zakończenie sprzężenia aminokwasów lub deprotekcję grupy ochronnej.
      1. Przenieś kilka kulek z żywicy do probówki.
      2. Dodać trzy krople (~ 100 μl) każdego roztworu (A, B i C) i wymieszać.
      3. Podgrzej probówkę na bloku grzewczym w temperaturze 110 °C przez 5 min.
         Uwaga: Niebieskie kulki (wynik pozytywny) wskazują na niepełną reakcję sprzęgania lub deochronę grupy ochronnej Fmoc.
2. Test chloranilu ⁸⁶
   1. Do każdego testu należy przygotować świeże następujące odczynniki.
      1. Przygotować roztwór 2% chloranilu w DMF, roztwór A.
      2. Przygotować roztwór 2% aldehydu octowego w DMF, roztwór B.
   2. Wykonaj test chloranilu, aby sprawdzić, czy sprzężenie aminokwasów zostało zakończone lub czy grupa ochronna została odbezpieczona.
      1. Zmieszać 100 μl roztworu A ze 100 μl roztworu B w probówce o pojemności 1,5 ml.
      2. Wrzuć koraliki i delikatnie potrząsaj przez 5 min.
         Uwaga: Ciemnobrązowe kulki (wynik pozytywny) wskazują na brak ochrony grupy ochronnej Fmoc lub niepełną reakcję sprzęgania.
3. Reakcja rozszczepienia na małą skalę
   1. Usuń niewielką ilość żywicy do 3 ml wkładu polipropylenowego wyposażonego w zatyczkę i zawór odcinający.
   2. Potraktuj 2 ml mieszaniny 95% TFA, 2,5% wody i 2,5% TIS.
   3. Potrząsaj mieszaniną przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
   4. Usunąć żywicę przez filtrację za pomocą frytki z wkładu polipropylenowego i odparować rozpuszczalniki za pomocą strumienia azotu.
   5. Rozpuścić pozostałość w wodzie i przeanalizować produkt za pomocą HPLC i/lub MS.

10. Żywotność promastigotu Leishmania donovani w teście hodowlanym

1. Leishmania donovani (L. donovani) warunki wzrostu i leczenia
   1. Kultura L. donovani promastigotes w modyfikacji pożywki orła (DMEM) firmy Dulbecco z 4,5 g/l glukozy, L-glutaminy i pirogronianu sodu w temperaturze 26 °C.
   2. Traktuj promastigoty L. donovani cyklicznymi peptydami (100 μM) przez 24 godziny w temperaturze 26 °C.
2. Test żywotności Leishmania donovani (L. donovani)
   1. Oceń żywotność pasożyta za pomocą 20 μl alamarBlue zgodnie z protokołem producenta.
   2. Określić redukcję alamarBlue, mierząc fluorescencję (przy wzbudzeniu 570 nm i emisji 590 nm). Wyższe wartości fluorescencji wskazują na większą aktywność metaboliczną i zwiększoną żywotność pasożytów.

Results

Tutaj opisujemy rozwój małej biblioteki cyklicznych peptydów szkieletowych, które są specyficznie ukierunkowane na ważne IPP pasożyta Leishmania i działają jako środki przeciwpasożytnicze (do wglądu w peptydy, które celują w IPP jako środki przeciwpasożytnicze⁸⁷). Poprzez syntezę nowych cyklicznych peptydów szkieletowych, farmakofory są konserwowane w rusztowaniu o rozciągliwych rozmiarach. Mocną stroną proponowanej tutaj skoncentrowanej biblioteki jest możliwość różnicowania rozmiarów rusztowań pepty...

Discussion

Opisano syntezę skoncentrowanej biblioteki cyklicznych peptydów szkieletowych pochodzących z białka LACK pasożyta Leishmania przy użyciu w pełni zautomatyzowanego syntezatora mikrofalowego. Opracowano skoncentrowaną bibliotekę cyklicznych peptydów z konserwatywnymi farmakoforami i różnymi łącznikami. Dodanie różnych łączników, takich jak bezwodnik glutarowy, bezwodnik bursztynowy, kwas adypinowy, kwas pimelowy, lizyna, ornityna i inne elementy budulcowe, może być stosowane w celu zwiększenia różnorodności przest...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENT
Solid support, żywica Rink Amide AM ML	CBL	BR-1330	Ładowanie: 0,49 mmol/
g Fmoc-Ala-OH	Advanced Chemtech	FA2100
Fmoc-Arg(Pbf)-OH	Advanced Chemtech	FR2136
Fmoc-Asn(Trt)-OH	Advanced Chemtech	FN2152
Fmoc-Asp(OBut)-OH	Zaawansowany Chemtech	FD2192
Fmoc-Cys(Trt)-OH	Zaawansowany Chemtech	FC2214
Fmoc-Gln(Trt)-OH	Zaawansowany Chemtech	FQ2251
Fmoc-Glu(OtBu)-OH	Zaawansowany Chemtech	FE2237
Fmoc-Gly-OH	Zaawansowany Chemtech	FG2275
Fmoc-His(Trt)-OH	Zaawansowany Chemtech	FH2316
Fmoc-Ile-OH	Zaawansowany Chemtech	FI2326
Fmoc-Leu-OH	Zaawansowany Chemtech	FL2350
Fmoc-Lys(Boc)-OH	Zaawansowany Chemtech	FK2390
Fmoc-Met-OH	Zaawansowany Chemtech	FM2400
Fmoc-Phe-OH	Zaawansowany Chemtech	FF2425
Fmoc-Pro-OH	Zaawansowany Chemtech	FP2450
Fmoc-Ser-(tBu)-OH	Zaawansowany Chemtech	FS2476
Fmoc-Thr(tBu)-OH	Zaawansowany Chemtech	FT2518
Fmoc-Trp(Boc)-OH	Zaawansowany Chemtech	FW2527
Fmoc-Tyr(But)-OH	Zaawansowany Chemtech	FY2563
Fmoc-Val-OH	Zaawansowany Chemtech	FV2575
1-metylo-2-pirolidynon (NMP)	Sigma	328634	Uwaga Toksyczny/Wysoce łatwopalny/drażniący.
N,N-dimetyloformamid (DMF)	Alfa Aesar	43465	Uwaga Toxic. Używaj wysokiej jakości DMF, aby wyeliminować reakcje uboczne, takie jak usunięcie Fmoc w wyniku śladów dimetyloaminy z rozkładu DMF.
Dichlorometan (DCM)	Sigma	D65100	Uwaga Szkodliwy
dibromometan (DBM)	Sigma	D41868	Ostrożny Szkodliwy
kwas trifluorooctowy (TFA)	Sigma	T62200	Uwaga/toksyczny
kwas trifluorooctowy, klasa HPLC (TFA)	Sigma	91707	Ostrożny/toksyczny
Eter dietylowy	Sigma	31690	Uwaga Wysoce łatwopalny/szkodliwy
Triizopropylosilan (TIS)	Sigma	233781	Ostrożny Woda drażniąca/łatwopalna
, klasa HPLC	Sigma	270733
Acetonitroile, Klasa HPLC (ACN)	Fisher Scientific	A998-4	Ostrożny Łatwopalny/Drażniący/Szkodliwy
N,N-Diizopropyloetyloamina (DIEA)	Sigma	3440	Uwaga/wysoce łatwopalny
Piperydyna	Sigma	W290807	Ostrożny Toksyczny/Wysoce łatwopalny
Pirydyna	Sigma	270970	Uwaga Wysoce łatwopalny/Szkodliwy
Etanol (EtOH)	Sigma	459844	Uwaga Wysoce łatwopalny/drażniący
Hydrat 1-hydroksybenzotriazolu (HOBt)	Sigma	157260	Uwaga Wysoce łatwopalny/Drażniący/Szkodliwy
O-(Benzotriazol-1-ylo)-N,N,N′,N′ -tetrametylofluorofosforan (HBTU)	Sigma	12804	Uwaga Drażniący/szkodliwy
Heksafluorfosforan benzotriazolu-1-ly-oksy-tris-pirolidinofosphonium (PyBOP)	Zaawansowany Chemtech	RC8602	Uwaga Drażniący
Ninhydrin	Sigma	454044	Uwaga Szkodliwy
Phenol	Sigma	P3653	Caution/toksyczny
cyjanek potasu (KCN)	Sigma	11813	Ostrożnie Bardzo toksyczny
Wodorotlenek potasu (KOH)	Sigma	221473	Uwaga Toksyczny
N,N' -diizopropylokarbodimidymid (DIC)	Sigma	38370	Uwaga Łatwopalny/ Toksyczny
4-dimetyloaminopirydyna (DMAP)	Sigma	522805	Uwaga Toksyczny/drażniący
Bezwodnik glutarowy	Sigma	G3806	Uwaga Łatwopalny/Drażniący/Szkodliwy
Bezwodnik bursztynowy	Sigma	239690	Uwaga Drażniący/Szkodliwy
Kwas adypinowy	Sigma	A26357	Uwaga Toksyczny/Drażniący
Kwas pimelowy	Sigma	P45001	Ostrożny Toksyczny/drażniący
Chloranil	Sigma	23290	Ostrożnie Toksyczny/Drażniący
Aldehyd octowy	Sigma	402788	Uwaga Łatwopalny/
ToksycznySPRZĘT
Wirówka	Beckman Coulter	Allegra 6R
Liofilizator	Labconco	freezone 4.5
Pompa próżniowa	Franklin Electric	model 1101101416 z 3/4 HP	Alcatel pompa z silnikiem Franklin
Wkład polipropylenowy 12 ml	Zastosowana separacja	2419
Zatyczka do wkładu polipropylenowego 12 ml	Zastosowana separacja	8157
Wkład polipropylenowy 3 ml	Zastosowana separacja	2413
Zatyczka do wkładu polipropylenowego 3 ml	Zastosowana separacja	8054
Kurki odcinające PTFE	Zastosowane separacje	2406
Probówki płaskie, 50 ml	VWR	21008-240
Kolektor ekstrakcyjny, 20 póz, rurki 16 x 100 mm	Woda	WAT200609
Shaker, BD Mikser nutatorowy Adams	Fisher scientific	22363152
Butelki Nalgene HDPE z wąską szyjką IP2, 125  ml	Fisher scientific	03-312-8
Kolba Erlenmeyera	Fisher Scientific	FB-501, 500 ml
Blok grzewczy	Thermolyne	1760 dri bath
Jednorazowe rurki ze szkła borokrzemianowego z gładkim końcem	Fisher Scientific	14-961-25
Mikropipety i końcówki Finnpipette	Thermo	20– 200 oraz 100– 1,000 μ l
Fiolki HPLC - micro vl pp 400 i micro; l PK100	VWR	69400-124
Fiolka HPLC - niebieska nasadka typu Snap-It VWR		66030-600
Analityczna kolumna HPLC	Peeke Scientific	U1-5C18Q-JJ	ultro 120 5 µ m C18Q, 4,6 mm ID 150 mm
Kolumna HPLC do przygotowania, XBridge	Wody	OBD C18 5 i mikro; m kolumna	19 mm & razy; 150 mm
Spektrometr masowy	Applied Biosystems	Voyager DE-RP
Eksykator
butli
Analityczny system RP-HPLC Shimadzu LC-20			wyposażony w: sterownik systemu CBM-20A, detektor SPD-20A, piec kolumnowy CTO-20A, 2 x zespół podawania rozpuszczalnika LC-20AD, autosampler SIL-20AC, odgazowywacz DGU-20A5 (Shimadzu, MD, USA).
Preparatywny system RP-HPLC Shimadzu LC-20			wyposażony w: sterownik systemu CBM-20A, detektor SPD-20A, piec kolumnowy CTO-20A, 2 x zespół podawania rozpuszczalnika LC-6AD oraz kolektor frakcji FRC-10A (Shimadzu, MD, USA).