Ten protokół opisuje, jak przygotować i przeprowadzić przezroczystą elektroforezę uwięzienia frakcji płynnej z natywną żelową (CN-GELFrEE), natywną technikę separacji niekowalencyjnych zespołów biomolekularnych i białek z heterogenicznych próbek, która jest kompatybilna z różnymi technikami analizy białek.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
CN-GELFrEE - Przezroczysta, natywna, eluowana w żelu, elektroforeza z uwięzieniem frakcji cieczy
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Kompleksy białkowe pełnią szereg kluczowych funkcji komórkowych. Wyjaśnienie ich niekowalencyjnych oddziaływań i dynamiki ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia roli kompleksów w systemach biologicznych. Podczas gdy bezpośrednia charakterystyka zespołów biomolekularnych staje się coraz ważniejsza w ostatnich latach, natywne techniki frakcjonowania, które są kompatybilne z dalszymi technikami analizy, w tym spektrometrią mas, są niezbędne do dalszego rozszerzenia tych badań. Niemniej jednak w tej dziedzinie brakuje wysokoprzepustowej, szerokozakresowej i wymagającej wysokiego odzysku metody separacji natywnych zespołów białkowych. W tym miejscu przedstawiamy klarowną natywną elektroforezę uwięzienia frakcji ciekłej eluowanej żelem (CN-GELFrEE), która jest nową metodą separacji niekowalencyjnych zespołów białkowych. Skuteczność separacji CN-GELFrEE wykazano za pomocą kompleksów frakcjonujących wyekstrahowanych z serca myszy. Frakcje zbierano w ciągu 2 godzin i wyświetlano dyskretne pasma w zakresie od ~30 do 500 kDa. Zaobserwowano spójny wzorzec zwiększania szerokości pasm masy cząsteczkowej, z których każde mieściło się w zakresie ~100 kDa. Co więcej, późniejsza ponowna analiza frakcji natywnych za pomocą SDS-PAGE wykazała przesunięcia masy cząsteczkowej zgodne z denaturacją kompleksów białkowych. W związku z tym udowodniono, że CN-GELFrEE oferuje zdolność do przeprowadzania natywnych separacji o wysokiej rozdzielczości i wysokim odzysku na kompleksach białkowych z dużego zakresu masy cząsteczkowej, zapewniając frakcje, które są zgodne z dalszymi analizami białek.
Wprowadzenie
Większość procesów biologicznych zachodzących w komórce jest uważana za przeprowadzaną przez zespoły białek, a nie pojedyncze białka1. W związku z tym, aby wyjaśnić specyficzną rolę biologiczną podjednostki białka w komórce, konieczne jest zrozumienie jej interakcji strukturalnych z innymi białkami lub ligandami w kompleksach2. Jednak badanie białek natywnie, utrzymanie ich niekowalencyjnych interakcji i aktywności, pozostaje wyzwaniem. Jedną z wad badań nad białkami natywnymi jest odpowiednia technika separacji natywnej, która jest kompatybilna z różnymi technikami analizy białek na dalszych etapach. W związku z tym ostatnio gwałtownie wzrosło zainteresowanie technikami separacji zdolnymi do charakteryzowania niekowalencyjnych zespołów biomolekuł3.
Techniki separacji białek są niezbędne w biochemii, biofizyce i różnych innych badaniach. Obecne natywne techniki separacji mają wewnętrzne wady, które zmniejszają kompatybilność z dalszymi analizami, takie jak niska rozdzielczość, niska przepustowość, straty spowodowane wytrącaniem się i wymóg dużych ilości próbki początkowej. Tandemowe oczyszczanie powinowactwa jest powszechnie stosowane w badaniach interakcji białek, ale musi być przeprowadzane oddzielnie dla każdego docelowego białka, co powoduje, że jest niezgodne z analizą wysokoprzepustową4. Chromatografia wykluczania wielkości5, selektywne wytrącanie za pomocą chromatografii powinowactwa jonowego5 i separacja gradientu gęstości6 zapewniają natywne separacje, ale są z natury technikami o niskiej rozdzielczości i wymagają dużych początkowych ilości próbki.
Alternatywnie, techniki oparte na żelu, takie jak Blue Native (BN) i Clear Native (CN) PAGE (zarówno 1-D, jak i 2-D), wyświetlają separację w wysokiej rozdzielczości. Ponadto, w przeciwieństwie do innych wymienionych technik, obie natywne separacje PAGE zachowują rozpuszczalność i natywną konformację szerokiego zakresu gatunków makrocząsteczek, w tym białek hydrofobowych. Zdolność ta dodatkowo poszerza pokrycie proteomu osiągnięte za pomocą tych metod7,8 i jest osiągana dzięki różnym badaniom chemicznym między CN i BN-PAGE. CN-PAGE powszechnie opiera się na miękko naładowanych detergentach jako cząsteczkach nośnikowych, zastępując barwnik Coomassie Blue w BN-PAGE. BN-PAGE, choć wiąże się z wyższą rozdzielczością, ma zastrzeżenia, takie jak zmniejszona aktywność enzymatyczna w oddzielonych białkach8 i tworzenie adduktów cząsteczek Coomassie, przy czym to ostatnie jest bardzo szkodliwe dla dalszych analiz MS9. Obie te metody są jednak tradycyjnie kojarzone z niską odzyskiem i wąskim pokryciem proteomu ze względu na ograniczenia związane z barwieniem i ekstrakcją żelu7.
Do badania zdenaturowanych białek istnieje kilka technik, które utrzymują rozpuszczalność makromolekuł, przeprowadzając frakcjonowanie w wysokiej rozdzielczości z wysokim odzyskiem białka i które są kompatybilne z różnymi technikami analizy białek po separacji. Elektroforeza z uwięzieniem frakcji ciekłej eluowanej w żelu (GELFrEE) jest jedną z technik frakcjonowania, które spełniają wszystkie te cechy. Metoda ta jest szeroko stosowana w wysokoprzepustowych badaniach proteomicznych typu top-down, co wskazuje, że jest szybka i wszechstronna. W GELFrEE białka są denaturowane i rozdzielane na podstawie masy cząsteczkowej za pomocą rurkowej matrycy żelowej, której porowatość można zmieniać w zależności od wymagań próbki i pożądanych wyników frakcjonowania. Frakcje są eluowane w fazie ciekłej, co zmniejsza ograniczenia odzyskiwania związane z SDS-PAGE przy zachowaniu wysokiej rozdzielczości. Podwielokrotności frakcji mogą być następnie analizowane przez 1-D PAGE w celu wyboru szerokości pasma masy cząsteczkowej11. Istnieje duże zapotrzebowanie na korzyści związane z GELFrEE w natywnych technikach separacji. Opisana tutaj metoda, Clear Native GELFrEE (CN-GELFrEE), jest natywną adaptacją GELFrEE. Aby być kompatybilnym z szerokim spektrum makrocząsteczek w ich stanie naturalnym, metoda ta opiera się nie tylko na miękkiej chemii CN-PAGE, ale także na separacji gradientu porowatości, która zmniejsza wytrącanie się białek poprzez eliminację ostrych przejść między porowatością występującą w nieciągłych układach żelowych9. Po zastosowaniu do frakcjonowanych kompleksów białkowych ekstrahowanych z serca myszy, eluowane frakcje wykazywały wysoki odzysk i uzyskano separację w wysokiej rozdzielczości w szerokim zakresie mas cząsteczkowych. Co więcej, otrzymane frakcje są zgodne z większością dalszych analiz biochemicznych i biofizycznych białek.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Uwaga: Niniejszy protokół wideo opiera się na powiązanej publikacji9. Konkretne odczynniki, materiały i sprzęt niezbędne do wykonania wszystkich kroków opisanych w tym protokole są wymienione w sekcji materiały. Przepisy i informacje dotyczące przygotowania wszystkich wymaganych roztworów wyszczególniono w Tabeli 1.
1. Odlewanie żeli w probówkach gradientowych
- Montaż systemu do odlewania
- Używając podgrzanej nad płomieniem żyletki lub skalpela, przetnij pipetę serologiczną o pojemności 20 ml wzdłuż przekroju ortogonalnego, 10 cm od góry końcówki dozującej. Upewnij się, że powierzchnia cięcia jest gładka. Zachowaj dolną część (z końcówką), a górną utylizuj. Przymocuj pionowo dolną część pipety (stożkową końcówką skierowaną w dół) do statywu.
UWAGA: Nie dotykaj rozgrzanego metalu ostrza; używaj odpowiednich uchwytów lub szczypiec, aby uniknąć oparzeń. - Odetnij 3 cm elastycznego wężyka i podłącz go do przeciętej pipety, naciągając go na końcówkę dozującą. Na drugim końcu wężyka zamocuj zawór sterujący przepływem.
- Połącz dół zaworu z końcówką dozującą mieszalnika gradientowego za pomocą odcinka wężyka. Pozostaw zawór otwarty.
- Ustaw mieszalnik gradientowy na mieszadle magnetycznym. Włóż mieszadła magnetyczne do komór mieszających.
- Ustaw końcówkę dozującą mieszalnika gradientowego 5-10 cm powyżej górnej części fragmentu pipety, aby umożliwić wlewanie żelu siłą grawitacji.
- Przetestuj system pod kątem nieszczelności, używając wody dejonizowanej. Jeśli nie stwierdzono wycieków, przed kontynuacją osusz system, przedmuchując go powietrzem.
- Zaklej górną część fragmentu pipety dwiema lub większą liczbą warstw taśmy. Przebij otwór przez warstwy taśmy w centrum okrągłego otworu. Upewnij się, że otwór jest wystarczająco duży, aby szklana rurka przeszła przez niego ciasno.
- Wsuń szklaną rurkę, w której będzie odlewany żel, przez przebity otwór, naciągając taśmę tak, aby szkło przylegało ściśle. Wsuń szklaną rurkę tak, aby jej dno znajdowało się 2 mm nad dnem pipety.
- Po przygotowaniu systemu sprawdź, czy szklana rurka jest stabilnie utrzymana, wycentrowana i nie dotyka ścianki pipety. System jest teraz gotowy do odlewania.
- Używając podgrzanej nad płomieniem żyletki lub skalpela, przetnij pipetę serologiczną o pojemności 20 ml wzdłuż przekroju ortogonalnego, 10 cm od góry końcówki dozującej. Upewnij się, że powierzchnia cięcia jest gładka. Zachowaj dolną część (z końcówką), a górną utylizuj. Przymocuj pionowo dolną część pipety (stożkową końcówką skierowaną w dół) do statywu.
- Odlewanie żelu
- Przygotuj bufor do żelu, roztwory APS i Coomassie (roztwory 1-3, Tabela 1).
- Przygotuj roztwory żelu rozdzielczego 12% T (roztwór 4, Tabela 1) oraz 1% T (roztwór 5, Tabela 1). Do roztworu żelu rozdzielczego 12% T dodaj 10 µl roztworu Coomassie. APS i TEMED dodaj do obu roztworów bezpośrednio przed wlewaniem do mieszalnika gradientowego.
UWAGA: Poliakryloamid jest silnie neurotoksyczny i należy używać rękawiczek. - Upewnij się, że zawór dozujący mieszalnika gradientowego jest zamknięty. Wlej roztwór żelu rozdzielczego 12% T do komory mieszającej znajdującej się najdalej od końcówki dozującej. Otwórz zawór między obiema komorami i pozwól roztworowi przepłynąć do następnej komory.
- Zamknij zawór i pipetuj przemieszczony roztwór żelu rozdzielczego 12% T z powrotem do poprzedniej komory. Przeznaczeniem tego zabiegu jest uniknięcie pęcherzyków powietrza między komorami.
- Dodaj roztwór żelu rozdzielczego 1% T do komory mieszającej znajdującej się najbliżej końcówki dozującej. Włącz mieszadło magnetyczne.
- Otwórz oba zawory mieszalnika gradientowego jednocześnie, aby umożliwić zmieszanie roztworów żelu rozdzielczego i ich przepływ do pipety i szklanej rurki.
- Po wyczerpaniu roztworów żelu rozdzielczego w mieszalniku gradientowym, odłącz wężyk od mieszalnika i podłącz go do strzykawki 10 ml. Upewnij się, że koniec wężyka pozostaje powyżej poziomu cieczy w pipecie do momentu pewnego zamocowania strzykawki.
- Za pomocą strzykawki delikatnie wypchnij pozostały roztwór żelu rozdzielczego z wężyka do pipety i szklanej rurki. Zamknij zawór pipety, zanim do wnętrza dostaną się pęcherzyki powietrza.
- Delikatnie dodaj warstwę około 0,25 ml nasyconego wodą butanolu (roztwór 6, Tabela 1) na wierzch roztworu żelu wewnątrz szklanej rurki, aby odizolować reakcję polimeryzacji od tlenu z powietrza i spłaszczyć górny menisk.
- Niezwłocznie oczyść aparat do wlewania wodą dejonizowaną (nie używać detergentów).
- Odczekaj całą noc do całkowitej polimeryzacji żelu w temperaturze pokojowej.
- Odłączanie rurki z żelem z urządzenia i przechowywanie
- Następnego dnia ostrożnie odklej taśmę z góry urządzenia.
- Odłącz zawór od wężyka pod pipetą. Zwolnij pipetę z zacisku i wykonaj kroki 1.3.3. i 1.3.4. nad zlewem.
- Podłącz strzykawkę 10 ml wypełnioną wodą dejonizowaną do elastycznego wężyka. Wtłocz wodę przez wężyk do pipety, powoli wysuwając spolimeryzowany żel z pipety.
- Trzymaj pipetę poziomo i ostrożnie zabezpiecz żel wysuwający się z otwartego końca.
- Odetnij nadmiar poliakryloamidu pod szklaną rurką i wokół niej, używając żyletki. Upewnij się, że koniec żelu wewnątrz rurki jest gładki i zlicowany z końcówką szklanej rurki.
- Usuń pozostały butanol z górnej strony żelu i umieść rurkę z żelem w niezatykanej probówce wirówkowej 15 ml. Wymieszaj 0,5 ml buforu do żelu (roztwór 1, Tabela 1) z 4,5 ml wody ultrapure i dodaj około 2 ml roztworu zarówno na górną stronę (wewnątrz szklanej rurki), jak i na dolną stronę (w probówce wirówkowej) rurki z żelem.
- Zakryj całą górną część probówki wirówkowej, w tym otwór szklanej rurki, parafilmem, aby zapobiec odparowaniu buforu. Żele można przechowywać w temperaturze 4 °C przez około 2 tygodnie.
2. Przygotowanie próbek
- Zważyć dwa serca mysie i posiekać je w szalce Petriego za pomocą żyletki.
- Przenieść przetworzoną tkankę do moździerza i dodać wystarczającą ilość ciekłego azotu, aby pokryć próbkę. Rozetrzeć tkankę tłuczkiem, dodając więcej ciekłego azotu w miarę jego odparowywania.
- Po dokładnym rozdrobnieniu tkanki pozwolić azotowi odparować i dodać 1 ml buforu lizującego (roztwór 7, Tabela 1) w temperaturze 4 °C na każde 100 mg tkanki. Przenieść roztwór do probówki do wirowania.
- Wirować przy 2,000 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C. Ostrożnie zebrać nadsącz do nowej probówki i odrzucić osad. Oznaczyć stężenie białka w nadsączu metodą kwasu bicinchonininowego12 lub inną preferowaną metodą. Uwaga: Można przygotować natywne lizaty komórkowe lub frakcje subkomórkowe zgodnie z preferencjami. System CN-GELFrEE jest kompatybilny z różnymi rodzajami natywnych preparatów próbek.
- Przygotować roztwór buforu solubilizującego oraz roztwór do nakładania (roztwory 8 i 9, Tabela 1).
- Jeśli próbka jest w formie osadu, resuspender ją w 50-150 µl buforu solubilizującego. Próbkę przechowywać na lodzie przez 15 min.
- Przeprowadzić wymianę buforu resuspenderowanej próbki lub lizatu komórkowego na bufor solubilizujący, używając ultraodśrodkowego filtra o progu odcięcia 30 kDa-MWCO.
- Wirować próbkę białka w temperaturze 4 °C przy 10,000 x g przez 5-10 min lub do momentu, aż objętość frakcji zatrzymanej zmniejszy się do około 20 µl. Odrzucić filtrat.
- Dodać 400 µl buforu solubilizującego do frakcji zatrzymanej i wymieszać za pomocą pipety. Wirować w temperaturze 4 °C przy 10,000 x g przez 5-10 min lub do momentu, aż objętość frakcji zatrzymanej zmniejszy się do około 20 µl. Odrzucić filtrat.
- Powtórzyć krok 2.9 jeszcze dwa razy.
- Rozcieńczyć przefiltrowaną próbkę (około 20 µl) w 100 µl buforu solubilizującego.
- Dodać 20 µl roztworu do nakładania do próbki.
3. Urządzenie CN-GELFrEE
- Aby przeprowadzić frakcjonowanie CN-GELFrEE, należy zlecić wykonanie części urządzenia warsztatowi tokarskiemu. Części urządzenia powinny zostać wykonane z Teflonu. Wszystkie informacje niezbędne do wykonania części znajdują się na Rysunku 1, a liczba części potrzebnych do jednego urządzenia jest podana w Tabeli 2.
Środki bezpieczeństwa: Należy stosować odpowiednie środki ochrony indywidualnej. Należy zachować ostrożność w pobliżu zasilaczy wysokiego napięcia; wszystkie połączenia muszą być prawidłowo zamontowane. Nie wolno dotykać urządzenia ani żadnego przylegającego mokrego obszaru podczas włączonego napięcia; należy dbać, aby powierzchnia blatu wokół urządzenia pozostała sucha podczas elektroforezy. Ponadto zasilacz powinien być całkowicie wyłączony podczas manipulowania urządzeniem i/lub zbierania frakcji. - Przygotować bufor anodowy i bufor katodowy (roztwory 10-11, Tabela 1) i przechowywać je w temperaturze 4 °C lub w lodzie.
- Przez górny koniec rurki żelowej (koniec bez żelu) włożyć dystans, oring i drugi dystans, tworząc strukturę typu „kanapka”.
- Za drugim dystansem dołożyć komorę buforową (katodę), przełożyć śruby całkowicie przez otwory boczne, nałożyć i dokręcić nakrętki z obu stron. Należy upewnić się, że górny koniec rurki szklanej jest utwierdzony przed górnym otworem komory buforowej, a nie bezpośrednio pod nim lub za nim.
- Przez dolny koniec rurki żelowej włożyć dystans, oring, komorę zbieralną i drugi dystans.
- Za drugim dystansem dołożyć komorę buforową (anodę), przełożyć śruby całkowicie przez otwory boczne, nałożyć i dokręcić nakrętki z obu stron. Należy upewnić się, że dolny koniec rurki żelowej jest utwierdzony za górnym otworem komory buforowej, blisko tylnej ścianki, ale bez dotykania jej.
- Ustawić urządzenie CN-GELFrEE pionowo, z komorą buforową katody u góry, używając statywu z zaciskami.
- Dolać bufor anodowy do komory buforowej anody (na dole) i bufor katodowy do komory buforowej katody (na górze). Wszystkie bufory należy utrzymywać w temperaturze 4 °C.
- Usunąć pęcherzyki powietrza z wnętrza rurki szklanej poprzez delikatne opukanie rurki i sprawdzić system pod kątem nieszczelności.
- Upewnić się, że elektrody platynowe mają kontakt z buforami w komorach oraz że oba końce rurki żelowej są zanurzone w buforze w każdej z komór.
- Podłączyć przewody zasilające z zasilacza do odpowiednich wtyków bananowych: ujemny do komory buforowej katody (góra) i dodatni do komory buforowej anody (dół).
- Za pomocą końcówki do nakładania żelu nanieść próbkę na górną powierzchnię żelu wewnątrz rurki żelowej.
- Prowadzić elektroforezę przy stałej mocy 1 W, aby uniknąć przegrzania, aż czoło barwnika czerwonego dotrze do dolnej części rurki żelowej.
UWAGA: Przed kontynuacją należy wyłączyć zasilacz. - Wylać bufory anodowy i katodowy.
- Odkręcić nakrętki przy komorze buforowej anody i zdemontować dolny dystans oraz komorę, pozostawiając dystans i oring. Umieścić dolny koniec rurki żelowej wewnątrz komory zbieralnej, przed górnym otworem, a nie za nim lub bezpośrednio pod nim. Przesunąć dystans i oring blisko komory zbieralnej.
- Wyciąć kawałek celulozowej membrany dializacyjnej i nawodnić go poprzez zanurzenie w buforze anodowym. Przykryć otwór między komorą zbieralną a dolnym dystansem za pomocą membrany dializacyjnej.
- Złożyć komorę buforową anody za drugim dystansem, dodać i dokręcić śruby oraz bolce.
- Położyć urządzenie poziomo nad naczyniem z lodem. Dolać świeże bufory anodowy i katodowy do komór buforowych i sprawdzić system pod kątem nieszczelności.
- Dodać 150 µl buforu anodowego do komory zbieralnej. Ponownie podłączyć przewody zasilające do odpowiednich wtyków bananowych.
- Włączyć zasilacz, ustawiając stały prąd 3 mA. Czoło barwnika powinno wówczas zacząć wypłukiwać się do buforu w komorze zbieralnej.
- Po wypłukaniu całego czoła barwnika wyłączyć zasilacz i zebrać pierwszą frakcję (0 min), przenosząc ją do probówki do mikrocentryfugi o niskim wiązaniu białek.
- Uzupełnić komorę zbieralną 150 µl buforu anodowego. Wszystkie zebrane frakcje przechowywać w lodzie.
- Zbierać frakcje w następujących odstępach czasu od zebrania pierwszej frakcji: 2 min, 4 min, 6 min, 8 min, 10 min, 15 min, 20 min, 25 min, 30 min, 45 min i 60 min. Nie wliczać czasu, w którym zasilacz był wyłączony. Należy pamiętać o wyłączeniu zasilacza przed pobieraniem frakcji oraz o uzupełnieniu komory zbieralnej 150 µl buforu anodowego pomiędzy próbkami. Po pobraniu frakcji ponownie włączyć zasilacz, aby rozpocząć wypłukiwanie kolejnej frakcji.
- Wylać bufory anodowy i katodowy i po 60 min dodać świeże roztwory do komór buforowych. Zebrać frakcje w 90 min i 120 min.
- Wymieniać bufory anodowy i katodowy co godzinę.
- Przeprowadzić elektroforezę PAGE w warunkach natywnych (clear native) lub nienatywnych (blue native) dla zebranych frakcji i zabarwić zgodnie z preferencjami. Postępować zgodnie z instrukcjami producenta lub preferowanym protokołem.
- Przeprowadzić redukującą elektroforezę SDS-PAGE i zabarwić zgodnie z preferencjami. Postępować zgodnie z instrukcjami producenta lub preferowanym protokołem.
- Oczyścić frakcje GELFrEE i poddać je analizom natywną spektrometrią mas, zgodnie z wcześniejszym opisem9.
Rysunek 1: Urządzenie CN-GELFrEE. (A) rysunki części urządzenia GELFrEE i (B) fotografia wykonanych części; (C) schemat montażu urządzenia CN-GELFrEE: (1) komora buforowa, (2) dystansor, (3) o-ring, (4) rurka żelowa, (5) komora zbiorcza oraz (6) membrana dializacyjna.
Tabela 1: Tabela roztworów.
Tabela 2: Tabela części urządzenia GELFrEE.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
200 µg białek wyekstrahowanych z kriogenicznie mielonych serc mysich poddano frakcjonowaniu w warunkach natywnych na 14 frakcji o objętości 150 µl każda, stosując metodę CN-GELFrEE w probówce z żelem T 1-12%. Alikwot 10 µl każdej frakcji naniesiono na żel płaski CN-PAGE i poddano barwieniu srebrem. Wyraźna ilustracja frakcjonowania i rozdzielczości uzyskanej za pomocą frakcjonowania CN-GELFrEE przedstawiona jest na Rycini 2A. Frakcje zbierano przez dwie godziny, a analiza...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
CN-GELFrEE wywodzi się z klarownego natywnego (CN) systemu buforowego PAGE, który wykorzystuje mieszaninę anionowych i neutralnych detergentów jako cząsteczki nośnikowe9 do frakcjonowania białek na podstawie masy cząsteczkowej przez matrycę żelową. Zastosowanie CN-GELFrEE do natywnego ekstraktu białka serca myszy pozwoliło na uzyskanie frakcji o niskiej złożoności z dyskretnymi szerokościami pasm przy jednoczesnym zachowaniu niekowalencyjnych oddziaływań zespołów biomolekularnych. Porównanie frakcji pomiędzy C...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Fundacja W. M. Keck hojnie przekazała fundusze na tę pracę. Niniejszy materiał oparty jest na pracach wspieranych przez grant badawczy FAPERJ 100.039/2014 rządu stanu Rio de Janeiro - Brazylia dla R.D.M., Stypendium Nauki bez Granic 88888.075416/2013-00 od Koordynacji na rzecz Doskonalenia Kadry Szkolnictwa Wyższego, przy rządzie Brazylii, dla H.S.S., National Science Foundation Graduate Research Fellowship w ramach stypendium numer 2014171659 dla OSS, oraz w ramach grantu badawczego CNPq 202011/2012-7 od rządu Brazylii dla L.H.F.D.V. P.C.H. jest laureatem nagrody Northwestern University's Chemistry of Life Processes Institute Postdoctoral Fellowship Award.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Reodczynniki | |||
| 30% roztwór akrylamidu/bis, 37,5:1 | Bio-Rad | 161-0158 | Ten roztwór jest neurotoksyczny. |
| Kwas 6-aminoheksanowy (kwas epsilonowy;-aminokapronowy) | Sigma-Aldrich | A2504 | Ta substancja chemiczna jest drażniąca. |
| Nadsiarczan amonu (APS) | Fisher Scientific | 7727-54-0 | Ta substancja chemiczna jest łatwopalna, toksyczna i. |
| Coomassie blue G250 | Bio-Rad | 161-0406 | |
| Dodecylmaltoside | Sigma-Aldrich | D4641 | Ta substancja chemiczna działa drażniąco. |
| Kwas tetraoctowy glikolu etylenowego (EGTA) | FLUKA | 3777 | Ta substancja chemiczna jest toksyczna. |
| Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) | Fisher Scientific | BP120 | Ta substancja chemiczna jest toksyczna. |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| Imidazol | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Ciekły azot | Dowolny dostawca | nie dotyczy | Przechowywać ciekły azot w pojemnikach przeznaczonych do płynów o niskiej temperaturze |
| Serce myszy | Biorekultywacja LLC | MSE-HEART | |
| n-butanol | Fisher Scientific | 71-36-3 | Ta substancja chemiczna jest łatwopalna i toksyczna. |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | BP103 | |
| Koktajl inhibitorów proteazy | Thermo Fisher Scientific | 78430 | Ta substancja chemiczna jest toksyczna. |
| Deoksycholan sodu | Sigma-Aldrich | 30970 | Ta substancja chemiczna jest drażniąca. |
| Sacharoza | JTBaker | 4097 | |
| Tetrametyloetylenodiamina (TEMED) | Bio-Rad | 161-0800 | Ta substancja chemiczna łatwopalna i drażniąca. |
| Tris-HCl | Amresco | M151 | |
| Trycine | Bio-Rad | 161-071 | |
| Wyposażenie | |||
| Mieszalnik gradientowy | Hoefer | SG15 | |
| Mieszadło magnetyczne | Dowolny dostawca | nie dotyczy | |
| Pręty magnetyczne | Każdy dostawca | nie dotyczy | Wystarczająco mały, aby zmieścić się w komorach mieszalnika gradiet. |
| Zasilanie | Bio-Rad | 164-5056 | Napięcie do 1 500 V |
| Wirówka z chłodzeniem | Eppendorf | 022622552 | Do 15 000 x g |
| Materiały | |||
| 15 ml Probówka stożkowa | Dowolny dostawca | nie dotyczy | |
| 30 kDa-MWCO ultra filtr odśrodkowy | Millipore | UFC503096 | |
| Elastyczny przewód | Saint-Gobain B000FOV1J0 | Długość około 1 m | |
| Wiadro na lód | Dowolny dostawca | nie dotyczy | |
| Zawór cieczowy/powietrzny, metalowy lub plastikowy. (np. zawór dźwigniowy sterowania przepływem powietrza/wody w akwarium) | Każdy dostawca | Nie dotyczy | Zawory akwariowe są kompatybilne. |
| Moździerz i tłuczek | Dowolny dostawca | nie dotyczy | |
| Native PAGE 3-12% T żel do płyt | Invitrogen | BN1003 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Szalka Petriego | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Rurka białkowa o niskim poziomie wiązania 1,5 ml | Eppendorf | 022431081 | |
| Żyletka | IDL Tools | TE05-091C | |
| Regenerowane rurki do dializy z celulozy 3,500 MWCO | Fisher Scientific | 21-152-9 | |
| Żel SDS-PAGE do dowolnych | Bio-Rad | 456-9036 | |
| (25 ml) | VWR | 89130-900 | |
| (10 ml) | Dowolny dostawca | nie dotyczy |
Bibliografia
- Alberts, B. The Cell as a Collection of Protein Machines: Preparing the Next Generation of Molecular Biologists. Cell. 92 (3), 291-294 (1998).
- Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (8), 645-654 (2007).
- Gavin, A. C., Bösche, M., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
- Puig, O., Caspary, F., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Cremer, K. D., Hulle, M. V., et al. Fractionation of vanadium complexes in serum, packed cells and tissues of Wistar rats by means of gel filtration and anion-exchange chromatography. JBIC J. Biol. Inorg. Chem. 7 (7-8), 884-890 (2002).
- Tanese, N. Small-Scale Density Gradient Sedimentation to Separate and Analyze Multiprotein Complexes. Methods. 12 (3), 224-234 (1997).
- Bunai, K., Yamane, K. Effectiveness and limitation of two-dimensional gel electrophoresis in bacterial membrane protein proteomics and perspectives. J. Chromatogr. B. 815 (1-2), 227-236 (2005).
- Wittig, I., Schägger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. PROTEOMICS. 5 (17), 4338-4346 (2005).
- Skinner, O. S., Do Vale, L. H. F., et al. Native GELFrEE: A New Separation Technique for Biomolecular Assemblies. Anal. Chem. 87 (5), 3032-3038 (2015).
- Nijtmans, L. G. J., Henderson, N. S., Holt, I. J. Blue Native electrophoresis to study mitochondrial and other protein complexes. Methods. 26 (4), 327-334 (2002).
- Tran, J. C., Doucette, A. A. Gel-Eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis: An Electrophoretic Method for Broad Molecular Weight Range Proteome Separation. Anal. Chem. 80 (5), 1568-1573 (2008).
- Smith, P. K., Krohn, R. I., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
